JP5525774B2 - 細胞画像解析装置 - Google Patents

Description

本発明は、複数種類の細胞を含む試料を撮像した細胞画像を自動的に解析し、それぞれの細胞種類に分類する細胞画像解析装置に関し、特に、神経細胞のニューロン・アストロサイトを夫々異なる蛍光色素で染色して撮像した蛍光細胞画像の色を解析することで、ニューロン・アストロサイトなどの複数の細胞種類に分類する細胞画像解析装置に関する。

例えば、神経幹細胞を適当な条件下で培養すると、ニューロン・アストロサイトなどの複数の細胞種類に分化していく。このとき、適当な化合物等を加えることによって、分化を誘導することができ、例えば、ニューロンに分化する薬剤を添加して培養を行うことで、ニューロンに分化する割合が増えることが知られている。
このような分化誘導の作用がある化合物、薬剤等のスクリーニングのために、複数の細胞を含んだ試料をマイクロプレートなどの特定の容器中に培養しあるいは移し替え、蛍光色素を染色し、顕微鏡撮像装置などを用いて撮像し、撮像した画像を、細胞画像解析装置を用いて解析することが行われている。

細胞の染色は、細胞種類に応じて、特異的な染色手段を用いて行う。即ち、細胞は、その種類に対応して異なる染色手段で染色する。また、細胞核も、ＤＡＰＩ（4',6-diamino-2-phenylindole）などの適当な化合物を用いて、それぞれ染色する。細胞画像の撮像は、細胞の染色ごと（チャネルごと）に行う。例えば、図８に示すように、複数種類の細胞（細胞１、細胞２）が混在している場合、それぞれの細胞（細胞質）に特異的な染色手段で染色して撮像する。撮像した細胞画像を解析し、各チャネルで染色された細胞が存在する個数や割合等を検出する。

撮像においては、容器内における複数の位置での蛍光顕微鏡画像を取得する。例えば、容器を載置した電動ステージを動かすことによって複数位置での細胞画像を取得する。細胞画像を取得したときの容器（電動ステージ）の位置として、顕微鏡の撮像光学系の光軸に対して垂直なＸＹ座標上の所定位置を記録する。

撮像した細胞画像を、細胞画像解析装置を用いて解析し、各容器あるいは撮像された画像中の細胞数を、それぞれの種類ごとに集計し、さらにはその集計値を用いて、総数・特定のグループの数に対する割合などを算出する。
従来、この種の細胞画像解析装置としては、例えば、次の非特許文献１に記載のものがある。

取り扱い説明書、「ＣＥＬＡＶＩＥＷ ＲＳ１００ 解析ソフトウェア操作編」、ver1.4、ページ4-13、発行者：オリンパス株式会社

細胞画像の解析に際しては、次のような場合が想定される。
(1)特定種類の細胞のみを１色の蛍光色素で染色し、試料中には染色されないその他の種類の細胞を含む場合。この場合は、細胞画像から染色された細胞の個数を検出する。
(2)複数種類の細胞に対応して複数の蛍光色素で染め分け、かつ細胞密度が低い場合。この場合は、チャネルごとに異なる１色で染色し、チャネルごとに細胞画像を解析する。
(3)複数種類の細胞が存在し、かつ細胞密度が高い場合。この場合、特に、密集・隣接している細胞に対しては、細胞種類を判断するために所定の相対的な基準を用いる必要がある。

ところで、細胞の分類を、細胞画像解析装置を用いて自動的に行うことは、処理時間の短縮化や大量の解析ができるといった大きな意義があり、特に化合物のスクリーニングなどを行う際には自動化が必要である。
しかるに、従来の細胞画像解析装置では、特定種類の細胞を１色で染色した場合において、その細胞が染色されているか、いないかの判定に問題がある。
具体的には、細胞質の形状は所定の広がりを持っているため、細胞の辺縁部分が他の細胞に重なる、特に、神経細胞の場合、細胞の足となる突起が伸びて、他の細胞と重なっている場合が多い。
例えば、図９(a)に示す細胞１と細胞２とが別種類の細胞である場合において、細胞１のみチャネル１の蛍光色素で染色して撮像し、蛍光細胞画像解析の際に細胞核領域１，２上のチャネル１の蛍光のみを用いて細胞種類の判定を行うと、図９(b)に示すように、細胞１のみならず、細胞２もチャネル１に対応した細胞１と同じ種類の細胞であると誤って判定されてしまい易い。

また、相対的な基準を用いて細胞種類を判定する方法として、通常用いられている方法としては、細胞核と細胞核周辺のマスク上での各チャネルの蛍光量（総蛍光量や平均輝度）を用いて判定する方法などがあるが、この方法は、細胞質が他の細胞に重なっているような場合には用いることができない。この方法の一例を図１０を用いて説明する。
この方法では、例えば、図１０(a)に示すように、まず、細胞の核領域を検出する。次いで、図１０(b)に示すように、核領域の境界線を機械的に数ピクセル幅で広げるなどの方法を用い、その核領域を広げた領域で細胞質を定義する。次いで、定義した細胞質の輝度情報に基づいて細胞種類を判定する。図１０の例では、細胞１の細胞質の輝度が細胞２の細胞質の輝度に比べて明るく、輝度に応じて細胞１と、細胞２を分類できるようになっているものとする。
しかし、この方法では、図９に示した場合と同様、図１０(c)に示すように、例えば、明るい細胞１と暗い細胞２が近接して重なっている場合には、図１０(d)に示すように、細胞２の細胞核が細胞１における定義された細胞質の範囲に入り、細胞２の細胞核の領域が細胞１としての輝度を満たす明るさに検出されるため、細胞２をチャネル１に対応した細胞（即ち、細胞１と同じ種類の細胞）であると誤って判定されてしまい易い。

また、そもそも、複数種類の細胞が密集している場合、細胞画像から細胞種類を分類することは難しい。
細胞密度が少ない状態であれば、細胞画像から種類ごとの細胞の自動解析が比較的容易であるが、例えば、神経細胞など、孤立した状態では死滅するなどの問題がある細胞については、細胞密度を下げた状態で観察することができない。
このため、神経細胞などについては、細胞密度がある程度高い状態において、自動解析を行わざるを得ないが、他の細胞の細胞質が重なるなどして、個々の細胞の見極めが非常に難しい。

本発明は、このような従来の問題点に鑑みてなされたものであり、神経細胞のニューロン・アストロサイトなど、細胞密度が高い状態で存在する種類の異なる細胞を、適切に自動分類することの可能な細胞画像解析装置を提供することを目的としている。

上記目的を達成するため、本発明による細胞画像解析装置は、細胞種類に応じて特異的な蛍光色素が染色された、複数種類の細胞を含む試料についての複数チャネルの蛍光細胞画像を用いて、細胞の分類を行う、コンピュータを備えた細胞画像解析装置であって、前記コンピュータを、前記各チャネルの蛍光細胞画像における細胞核領域及び細胞質領域を特定する領域特定手段、前記領域特定手段を介して特定された、前記細胞核領域及び前記細胞質領域についての形態の特徴を検出する形態特徴検出手段、前記形態特徴検出手段を介して検出された、前記細胞核領域及び前記細胞質領域についての形態の特徴に対応して、細胞種類を分類する細胞分類手段を有し、前記領域特定手段が、前記各チャネルの蛍光細胞画像における細胞核領域を特定し、該細胞核領域の周辺領域での蛍光分布を解析して、該周辺領域での細胞質の輝度を検出し、該細胞核領域の周辺領域での細胞質の輝度に対応して、細胞体中心部付近の細胞質領域を特定することを特徴としている。

また、本発明の細胞画像解析装置においては、前記形態特徴検出手段が、前記領域特定手段を介して特定された、前記細胞質領域についての中心位置を検出するとともに、該細胞質領域の中心位置と前記細胞核の位置との相対的な位置関係を検出し、前記細胞分類手段が、前記形態特徴検出手段を介して検出された、前記細胞質領域の中心位置と前記細胞核の位置との相対的位置関係に対応して、特定の細胞種類に自動的に分類するのが好ましい。

また、本発明の細胞画像解析装置においては、前記形態特徴検出手段が、前記領域特定手段を介して特定された、前記細胞質領域から細胞体を構成している中心領域を検出し、該細胞体を構成している中心領域と前記細胞核領域との重なり具合を定量化し、前記細胞分類手段が、前記形態特徴検出手段を介して定量化された、前記細胞体を構成している中心領域と前記細胞核領域との重なり具合に対応して、特定の細胞種類に自動的に分類するのが好ましい。

また、本発明の細胞画像解析装置においては、前記形態特徴検出手段が、前記領域特定手段を介して特定された、前記細胞質領域と前記細胞核領域とが重なり合う領域を検出し、前記細胞分類手段が、前記形態特徴検出手段を介して検出された、前記細胞質領域と前記細胞核領域とが重なり合う領域の大小関係に対応して、特定の細胞種類に自動的に分類するのが好ましい。

本発明によれば、神経細胞のニューロン・アストロサイトなど、細胞密度が高い状態で存在する種類の異なる細胞を、適切に自動分類することの可能な細胞画像解析装置が得られる。

本発明の一実施形態にかかる細胞画像解析装置の概略構成を示すブロック図である。 細胞画像の撮像から本実施形態の細胞画像解析装置を用いた細胞画像の解析までの全体の解析手順を示すフローチャートである。 本発明の実施例２にかかる細胞画像解析装置を用いた細胞種類の判定方法の一例を示す説明図で、(a)はもとの細胞画像を示す図、(b)は(a)の画像から細胞質領域を特定した状態を示す図、(c)は(b)の細胞質領域の中心を検出した状態を示す図、(d)は(c)の細胞質領域の中心と(a)の核領域とを関連付けた状態を示す図である。 実施例２の細胞画像解析装置を用いた細胞種類の判定方法の他の例を示す説明図で、(a)はもとの細胞画像を示す図、(b)は(a)の画像から細胞核領域を特定した状態を示す図、(c)は(a)の画像からチャネル１の蛍光画像における細胞質領域の中心を特定した状態を示す図、(d)は(a)の画像からチャネル２の蛍光画像における細胞質領域の中心を特定した状態を示す図、(e)は(c)のチャネル１の蛍光画像における細胞質領域の中心、(d)のチャネル２の蛍光画像における細胞質領域の中心と(b)の核領域とを関連付けた状態を示す図である。 本発明の実施例３にかかる細胞画像解析装置による細胞分類の方法を示す説明図で、(a)は種類の異なる細胞が重なった状態を示す図、(b)は(a)の状態から細胞核領域を検出した状態を示す図、(c)は(a)の状態からチャネル１の蛍光細胞画像における細胞質領域を検出した状態を示す図、(d)は(a)の状態からチャネル２の蛍光細胞画像における細胞質領域を検出した状態を示す図、(e)は(a)における一つの細胞核領域とチャネル１の蛍光細胞画像における細胞質領域との重なり領域を示す図、(f)は(a)における(e)と同じ細胞核領域とチャネル２の蛍光細胞画像における細胞質領域との重なり領域を示す図である。 本発明の実施例４にかかる細胞画像解析装置による細胞分類の方法を示す説明図で、(a)は細胞質の全領域を示す図、(b)は(a)から細胞体を構成している中心領域を特定した状態を示す図である。 実施例５の比較例にかかる細胞画像解析装置による細胞質領域の特定方法を示す説明図で、(a)は明るさの異なる２つの細胞が重なった状態の細胞画像を示す図、(b)は暗い細胞を基準として(a)の細胞画像を二値化したときの細胞質領域を示す図、(c)は明るい細胞を基準として(a)の細胞画像を二値化したときの細胞質領域を示す図である。 複数種類の細胞（細胞１、細胞２）が混在している場合において細胞（細胞質）に特異的な染色手段で染色した状態を示す図である。 複数種類の細胞が存在する試料において一種類の細胞を染色したときの問題を示す説明図で、(a)は種類の異なる２つの細胞が、夫々の核が一方の細胞質領域上に位置するように重なった状態において２つの細胞のうち、一方の細胞のみを染色した状態を示す図、(b)は２つの細胞における核領域上の蛍光のみを用いて細胞種類の判定を行ったときの状態を示す説明図である。 細胞核と細胞核周辺のマスク上での各チャネルの蛍光量を用いて細胞種類を判定する方法を示す説明図で、(a)は細胞の核領域を検出した状態を示す図、(b)は核領域を広げた領域で細胞質を定義した状態を示す図、(c)は明るい細胞１と暗い細胞２が近接して重なっている状態において、(b)と同様に核領域を広げた領域で細胞質を定義した状態を示す図、(d)は(c)を用いて細胞を分類した状態を示す図である。

図１は本発明の一実施形態にかかる細胞画像解析装置の全体構成を示すブロック図である。図２は細胞画像の撮像から本実施形態の細胞画像解析装置を用いた細胞画像の解析までの全体の解析手順を示すフローチャートである。
本実施形態の細胞画像解析装置１は、領域特定手段１ａ、形態特徴検出手段１ｂ、細胞分類手段１ｃとして機能させ、さらに、細胞特徴量抽出手段１ｄ、統計・出力手段１ｅとして機能させる画像解析ソフトウェアと、画像解析ソフトウェアを備えるコンピュータとで構成されている。

領域特定手段１ａは、細胞種類に応じて特異的な蛍光色素が染色された、複数種類の細胞を含む試料についての各チャネルの蛍光細胞画像における細胞核領域及び細胞質領域を特定する。
形態特徴検出手段１ｂは、領域特定手段１ａを介して特定された、細胞核領域及び細胞質領域についての形態の特徴を検出する。
細胞分類手段１ｃは、形態特徴検出手段１ｂを介して検出された、細胞核領域及び細胞質領域についての形態の特徴に対応して、細胞種類を分類する。
細胞特徴量抽出手段１ｄは、分類された各細胞の明るさ、形態などの細胞の特徴量を抽出する。
統計・出力手段１ｅは、撮像された画像中の細胞数をそれぞれの種類ごとに集計し、さらにはその集計値を用いて、総数・特定のグループの数に対する割合などを算出する。また、グループごとの細胞特徴量の平均化、比較などの統計処理や処理結果の出力を行う。

このように構成された本実施形態の細胞画像解析装置を用いた細胞の解析は、図２に示すような手順で行う。

なお、細胞解析の準備段階として、細胞を、細胞種類に応じて特異的な染色方法、即ち、細胞種類に対応して異なる染色方法で染色する。また、細胞核も、ＤＡＰＩ（4',6-diamino-2-phenylindole）などの適当な化合物を用いて、それぞれ染色する。

図示しない顕微鏡撮像装置を用いて、染色ごと（チャネルごと）に細胞画像の撮像を行う（ステップＳ１）。即ち、図示しない電動ステージを介して容器内における複数のＸＹ
位置ごとに、核領域の画像、第１（チャネル１）の蛍光画像、第２（チャネル２）の蛍光画像などの複数の画像を撮像する。

撮像した細胞画像を、本実施形態の細胞画像解析装置を用いて解析する。
まず、領域特定手段１ａが、細胞種類に応じて特異的な蛍光色素が染色された、複数種類の細胞を含む試料についての各チャネルの蛍光細胞画像における細胞核領域及び細胞質領域を特定する（ステップＳ２）。図２の例では、細胞核領域、第１（チャネル１）の蛍光画像における細胞質領域、第２（チャネル２）の蛍光画像における細胞質領域を特定する。
次いで、各細胞核領域の細胞種類を特定する（ステップＳ３）。細胞種類の特定に際しては、まず、形態特徴検出手段１ｂが、領域特定手段１ａを介して特定された、細胞核領域及び細胞質領域についての形態の特徴を検出する。次いで、細胞分類手段１ｃが、形態特徴検出手段１ｂを介して検出された、細胞核領域及び細胞質領域についての形態の特徴に対応して、細胞種類を分類する。
次いで、分類した細胞種類ごとに解析結果を出力する（ステップＳ４）。まず、細胞特徴量抽出手段１ｄが、分類された各細胞の明るさ、形態などの細胞の特徴量を抽出する。また、統計・出力手段１ｉが、撮像された画像中の細胞数をそれぞれの種類ごとに集計し、さらにはその集計値を用いて、総数・特定のグループの数に対する割合などを算出する。また、グループごとの細胞特徴量の平均化、比較などの統計処理や処理結果の出力を行う。
本発明の細胞画像解析装置は、領域特定手段１ａ、形態特徴検出手段１ｂ、及び細胞分類手段１ｃによる処理に特徴がある。具体的な処理の内容を以下の実施例を用いて説明する。

実施例１（一般例：形態的特徴に基づく細胞種類の分類例）
実施例１の細胞画像解析装置は、領域特定手段１ａが、ＸＹ座標位置における細胞核領域の特定、第１（チャネル１）の蛍光画像での細胞質領域、第２（チャネル２）の蛍光画像での細胞質領域の特定を行う。次いで、形態特徴検出手段１ｂ、及び細胞分類手段１ｃが、領域特定手段１ａを介して特定されたこれらの情報を用いて、細胞種類を判定する。

細胞核領域の特定
領域特定手段１ａは、まず、細胞核画像の解析を行い、細胞核画像中における細胞核の位置、細胞核領域の特定を行う。例えば、細胞核画像に対して単純に閾値を設定して細胞核領域を特定する。

細胞質領域の特定
また、領域特定手段１ａは、第１（チャネル１）の蛍光画像、第２（チャネル２）の蛍光画像に対しても、細胞核画像の解析と同様の解析を行い、夫々の細胞質領域を特定する。

細胞種類の判定
次いで、形態特徴検出手段１ｂは、まず、領域特定手段１ａを介して特定された細胞核領域に、夫々「１，２，３・・・」のように、各細胞核領域を区別するための番号（識別子）を割り当てる。次いで、個々の細胞核領域に対して、第１（チャネル１）の細胞質領域、第２（チャネル２）の細胞質領域とを関連付ける等して、形態の特徴を検出する。
次いで、細胞分類手段１ｃは、形態特徴検出手段１ｂを介して検出された、形態の特徴に対応して細胞種類の判定を行う。

実施例２（形態情報として細胞質領域の重心点（中心位置）を用いた細胞種類の分類例）
図３は本発明の実施例２にかかる細胞画像解析装置を用いた細胞種類の判定方法の一例を示す説明図で、(a)はもとの細胞画像を示す図、(b)は(a)の画像から細胞質領域を特定した状態を示す図、(c)は(b)の細胞質領域の中心を検出した状態を示す図、(d)は(c)の細胞質領域の中心と(a)の核領域とを関連付けた状態を示す図である。図４は実施例２の細胞画像解析装置を用いた細胞種類の判定方法の他の例を示す説明図で、(a)はもとの細胞画像を示す図、(b)は(a)の画像から細胞核領域を特定した状態を示す図、(c)は(a)の画像からチャネル１の蛍光画像における細胞質領域の中心を特定した状態を示す図、(d)は(a)の画像からチャネル２の蛍光画像における細胞質領域の中心を特定した状態を示す図、(e)は(c)のチャネル１の蛍光画像における細胞質領域の中心、(d)のチャネル２の蛍光画像における細胞質領域の中心と(b)の核領域とを関連付けた状態を示す図である。

実施例２の細胞画像解析装置は、例えば、図３、図４に示すように、各チャネルの各細胞質領域の形態情報として、各細胞質領域の重心点（中心位置）を用いて、細胞種類を分類する。
詳しくは、領域特定手段１ａは、図３(a)に示す細胞画像から、細胞種類に応じて特異的な蛍光色素が染色された、複数種類の細胞を含む試料についての各チャネルの蛍光細胞画像における細胞核領域（図示省略）及び細胞質領域（図３(b)参照）を特定する。
形態特徴検出手段１ｂは、図３(c)に示すように、領域特定手段１ａを介して特定された細胞質領域について、その中心位置を検出するとともに、図３(d)に示すように、その細胞質領域の中心位置と細胞核の位置との相対的な位置関係を検出する。
細胞分類手段１ｃは、形態特徴検出手段１ｂを介して検出された、細胞質領域の中心位置と細胞核の位置との相対的位置関係に対応して、細胞種類の判定を行う。そして、各チャネルの蛍光細胞画像における細胞質領域の中心、重心点が、特定の細胞核領域上に位置する場合、当該細胞核領域に、そのチャネルを関連付ける。

また、図４に示すように、複数チャネルに対して同様の処理を行ってもよい。これにより、個々の細胞核に対して、その細胞核領域上に細胞質領域の中心、重心点が存在する蛍光細胞画像のチャネルが割り当てられる。
図４の例では、チャネル１で染色した細胞（実線で示す）と、チャネル２で染色した細胞（破線で示す）の２種類で染色した場合を示している。
領域特定手段１ａは、図４(a)に示すように、チャネル１、チャネル２のそれぞれの蛍光細胞画像から、細胞種類に応じて特異的な蛍光色素が染色された、複数種類の細胞を含む試料についての各チャネルの蛍光細胞画像における細胞核領域（図４(b)参照）及び細胞質領域（図示省略）を特定する。
形態特徴検出手段１ｂは、図４(c)、図４(d)に示すように、領域特定手段１ａを介して特定された、各チャネル（ここではチャネル１、２）の蛍光細胞画像における細胞質領域についての中心位置を検出するとともに、図４(e)に示すように、夫々の細胞質領域の中心位置と細胞核の位置との相対的な位置関係を検出する。
細胞分類手段１ｃは、形態特徴検出手段１ｂを介して検出された、細胞質領域の中心位置と細胞核の位置との相対的位置関係に対応して、細胞種類の判定を行う。図４(e)の例では、チャネル１の細胞の細胞核領域が判定された例を示している。
その他の構成及び作用は、実施例１の細胞画像解析装置と略同じである。

実施例２の変形例
実施例２の細胞画像解析装置は、細胞質領域の中心位置（重心点）を用いて細胞種の分類を行う構成であるが、実施例２の細胞画像解析装置に似た方法で、細胞種類の分類を行うように構成された変形例を説明する。
実施例２の細胞画像解析装置は、細胞画像において、チャネル１の蛍光細胞画像における細胞質領域の中心点とチャネル２の蛍光細胞画像における細胞質領域の中心点が、各細胞領域に１つずつ存在することを前提としている。
しかし、細胞画像によっては、細胞が密集し、異なるチャネルの蛍光細胞画像における細胞質領域の中心点が、１個の細胞核領域上に存在する場合が考えられる。
本変形例の細胞画像解析装置は、このような場合を想定したものである。

本変形例の細胞画像解析装置は、形態特徴検出手段１ｂが、次のようにして、細胞核領域へのチャネルの関連付けを行うように構成されている。
即ち、形態特徴検出手段１ｂは、細胞核領域、チャネル１の蛍光細胞画像における細胞質領域、チャネル２の蛍光細胞画像における細胞質領域の夫々の領域における中心点を求め、次いで、チャネル１の蛍光細胞画像における細胞質領域の中心点、チャネル２の蛍光細胞画像における細胞質領域の中心点のうち、細胞核領域の中心点に最も近い中心点を細胞質領域の中心点とする。
以後、実施例２の細胞画像解析装置と同様、形態特徴検出手段１ｂは、その細胞質領域の中心点と細胞核の位置との相対的な位置関係を検出する。また、細胞分類手段１ｃも、実施例２の細胞画像解析装置と同様、形態特徴検出手段１ｂを介して検出された、細胞質領域の中心位置と細胞核の位置との相対的位置関係に対応して、細胞種類の判定を行う。

変形例の細胞画像解析装置によれば、形態情報として細胞核領域の中心点に最も近い点を細胞質領域の中心点とするように、領域を代表させる点を取るようにしたので、細胞が密集し異なるチャネルの蛍光細胞画像における細胞質領域の中心点が１個の細胞核領域上に存在していても、各細胞に対し蛍光のチャネルを１対１に割り当てることができる。

実施例３（一つの細胞核領域と各チャネルの細胞質領域との重なり領域を用いた細胞種類の分類例）
図５は本発明の実施例３にかかる細胞画像解析装置による細胞分類の方法を示す説明図で、(a)は種類の異なる細胞が重なった状態を示す図、(b)は(a)の状態から細胞核領域を検出した状態を示す図、(c)は(a)の状態からチャネル１の蛍光細胞画像における細胞質領域を検出した状態を示す図、(d)は(a)の状態からチャネル２の蛍光細胞画像における細胞質領域を検出した状態を示す図、(e)は(a)における一つの細胞核領域とチャネル１の蛍光細胞画像における細胞質領域との重なり領域を示す図、(f)は(a)における(e)と同じ細胞核領域とチャネル２の蛍光細胞画像における細胞質領域との重なり領域を示す図である。
実施例３の細胞画像解析装置は、実施例１の細胞画像解析装置とは基本構成が同じであって、実施例２の細胞画像解析装置とは別の形態情報として、一つの細胞核領域と各チャネルの蛍光細胞画像における細胞質領域との重なり領域を用いて判定する構成となっている。
即ち、実施例３の細胞画像解析装置では、形態特徴検出手段１ｂは、領域特定手段１ａを介して特定された、細胞質領域と細胞核領域とが重なり合う領域を検出する。
また、細胞分類手段１ｃは、形態特徴検出手段１ｂを介して検出された、細胞質領域と細胞核領域とが重なり合う領域の大小関係に対応して、特定の細胞種類に自動的に分類する。

このように構成された実施例３の細胞画像解析装置を用いて図５(a)に示す細胞１と細胞２が重なっている状態の細胞画像から細胞１と細胞２を分類する手順について説明する。
実施例３の細胞画像解析装置においても、各チャネルの蛍光細胞画像における細胞質領域を特定するまでの処理は実施例１の細胞画像解析装置と略同じである。即ち、領域特定手段１ａが、細胞核領域を特定（図５(b)）するとともに、チャネル１の蛍光細胞画像における細胞質領域、チャネル２の蛍光細胞画像における細胞質領域をそれぞれ特定する（図５(c)、図５(d)）。
次いで、形態特徴検出手段１ｂが、各チャネルの蛍光細胞画像における細胞質領域のうち、共通の細胞核領域と重なる領域をＡＮＤ処理で特定して、各チャネルの蛍光細胞画像における細胞質領域の「重なり領域」を特定する。（図５(e)、図５(f)）。
次いで、細胞分離手段１ｃが、重なり領域の面積を比較し、より大きく重なるもの、重なり領域が大きくなるチャネル、を決定し、当該チャネルに細胞核を関連付ける。図５の例では、図５(e)に示す共通の細胞核領域とチャネル１の蛍光細胞画像における細胞質領域とが重なる領域（「重なり領域１」）が、図５(f)に示す共通の細胞核領域とチャネル２の蛍光細胞画像における細胞質領域とが重なる領域（「重なり領域２」）よりも面積が大きいので、共通の細胞核をチャネル１に関連付ける。
他の細胞核領域についても、同様の処理を行うことで、細胞核領域、細胞質領域が、それぞれ、各チャネルに対応付けられる。これにより、細胞種類が分類される。

実施例４（細胞体（細胞質の中心領域）を用いた細胞種類の分類例）
図６は本発明の実施例４にかかる細胞画像解析装置による細胞分類の方法を示す説明図で、(a)は細胞質の全領域を示す図、(b)は(a)から細胞体を構成している中心領域を特定した状態を示す図である。
実施例４の細胞画像解析装置は、実施例３の細胞画像解析装置のように細胞質領域と細胞核領域の重なり領域を用いて細胞種類を分類するための前段階として、細胞の突起部分を除き、細胞質の中心付近の領域を特定するように構成されている。
即ち、実施例４の細胞画像解析装置では、形態特徴検出手段１ｂは、領域特定手段１ａを介して特定された、細胞質領域から細胞体を構成している中心領域を検出し、細胞体を構成している中心領域と細胞核領域との重なり具合を定量化する。細胞分類手段１ｃは、形態特徴検出手段１ｂを介して定量化された、細胞体を構成している中心領域と細胞核領域との重なり具合に対応して、例えば、実施例３と同様、重なり領域の大小関係に対応して、特定の細胞種類に自動的に分類する。

図６の例では、形態特徴検出手段１ｂは、図６(a)に示す細胞質領域に対して、周辺の突起状の形態をもった部分を除外し、その中心領域を細胞体として検出する。例えば、基準となる半径などで「太さ」のパラメタを予め設定しておき、半径が「太さ」パラメタの設定値以上である円を細胞質領域上で取り、その半径以上の内接円に含まれない細い突起領域を除外する一方、その半径以上の内接円に含まれる領域を細胞体とする。

実施例４の細胞画像解析装置によれば、細胞の中心により近い領域に、細胞質領域を設定して、絞りこみを行うことになるので細胞分類の判定精度が上がる。

実施例５（細胞核領域を使った細胞質領域の決定例）
実施例５の細胞画像解析装置は、細胞質領域の特定を行う際に、事前に決定された細胞核領域の情報を用いるように構成されている。
詳しくは、領域特定手段１ａが、各チャネルの蛍光細胞画像における細胞核領域を特定し、細胞核領域の周辺での蛍光分布を解析して、周辺領域での細胞質の輝度を検出し、細胞核領域の周辺領域での細胞質の輝度に対応して、細胞体中央部付近の細胞質領域を特定する。

図７は実施例５の比較例にかかる細胞画像解析装置による細胞質領域の特定方法を示す説明図で、(a)は明るさの異なる２つの細胞が重なった状態の細胞画像を示す図、(b)は暗い細胞を基準として(a)の細胞画像を二値化したときの細胞質領域を示す図、(c)は明るい細胞を基準として(a)の細胞画像を二値化したときの細胞質領域を示す図である。
図７(a)は２つの細胞が重なっている例を示している。一方の細胞（細胞１）は明るく、その足が他方の細胞（細胞２）の領域に重なっている。細胞２は、細胞１と比較して非常に暗くなっている。
これらの細胞における明るさの違いは、染色等の問題によるもので、通常よく起こる問題である。

この場合、明るい細胞１を基準に（細胞質の閾値として）二値化すると、２つの細胞は、図７(c)に示すように、一つの細胞質に支配されるものとして定義される。つまり、暗い細胞は存在しないことになる。
これとは逆に、暗い細胞を基準に（細胞質の閥値として）二値化すると、図７(c)に示すように暗い細胞も検出することができるが、この方法では細胞密度が高いサンプル画像については、解析することができなくなる。二値化される領域が本来の領域より広く検出されるため、細胞同士の境界を識別することができなくなる。

これに対して、実施例５の細胞画像解析装置では、領域特定手段１ａが、まず、細胞核領域を特定する。
次いで、各チャネルの蛍光細胞画像における細胞核領域に対して、最適な細胞質輝度を求める。例えば、細胞核領域及びその周辺での細胞質蛍光の分布に基づき、その最も典型的な値をこの分布の中央値で代表させる。その典型的な値を細胞核周辺の細胞質領域の輝度として、それぞれ検出する。
次いで、細胞核領域の周辺領域での細胞質の輝度に対応して、細胞体中央部付近の細胞質領域を特定する。
これにより、暗い細胞の細胞質領域、及び明るい細胞の細胞質領域が、それぞれ決定される。
形態特徴検出手段１ｂ、細胞分類手段１ｃは、実施例１〜４のいずれの細胞画像解析装置における形態特徴検出手段１ｂ、細胞分類手段１ｃと同じ構成が採用されている。
実施例５の細胞画像解析装置における形態特定手段の構成を用いても、実施例１〜４の細胞画像解析装置と同様、細胞を適切に分類することができる。

本発明の細胞画像解析装置は、細胞画像の自動解析分野、特に神経細胞の自動解析分野に有用である。

１ 細胞画像解析装置
１ａ 領域特定手段
１ｂ 形態特徴検出手段
１ｃ 細胞分類手段
１ｄ 細胞特徴量抽出手段
１ｅ 統計・出力手段

Claims (4)

1. 細胞種類に応じて特異的な蛍光色素が染色された、複数種類の細胞を含む試料についての複数チャネルの蛍光細胞画像を用いて、細胞の分類を行う、コンピュータを備えた細胞画像解析装置であって、
   前記コンピュータを、
   前記各チャネルの蛍光細胞画像における細胞核領域及び細胞質領域を特定する領域特定手段、
   前記領域特定手段を介して特定された、前記細胞核領域及び前記細胞質領域についての形態の特徴を検出する形態特徴検出手段、
   前記形態特徴検出手段を介して検出された、前記細胞核領域及び前記細胞質領域についての形態の特徴に対応して、細胞種類を分類する細胞分類手段を有し、
   前記領域特定手段が、前記各チャネルの蛍光細胞画像における細胞核領域を特定し、該細胞核領域の周辺領域での蛍光分布を解析して、該周辺領域での細胞質の輝度を検出し、該細胞核領域の周辺領域での細胞質の輝度に対応して、細胞体中心部付近の細胞質領域を特定することを特徴とする細胞画像解析装置。
2. 前記形態特徴検出手段が、前記領域特定手段を介して特定された、前記細胞質領域についての中心位置を検出するとともに、該細胞質領域の中心位置と前記細胞核の位置との相対的な位置関係を検出し、
   前記細胞分類手段が、前記形態特徴検出手段を介して検出された、前記細胞質領域の中心位置と前記細胞核の位置との相対的位置関係に対応して、特定の細胞種類に自動的に分類することを特徴とする請求項１に記載の細胞画像解析装置。
3. 前記形態特徴検出手段が、前記領域特定手段を介して特定された、前記細胞質領域から細胞体を構成している中心領域を検出し、該細胞体を構成している中心領域と前記細胞核領域との重なり具合を定量化し、
   前記細胞分類手段が、前記形態特徴検出手段を介して定量化された、前記細胞体を構成している中心領域と前記細胞核領域との重なり具合に対応して、特定の細胞種類に自動的に分類することを特徴とする請求項１に記載の細胞画像解析装置。
4. 前記形態特徴検出手段が、前記領域特定手段を介して特定された、前記細胞質領域と前記細胞核領域とが重なり合う領域を検出し、
   前記細胞分類手段が、前記形態特徴検出手段を介して検出された、前記細胞質領域と前記細胞核領域とが重なり合う領域の大小関係に対応して、特定の細胞種類に自動的に分類することを特徴とする請求項１に記載の細胞画像解析装置。

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