JP5519088B2 - 核酸分子塩基配列の決定方法及び決定装置 - Google Patents

Description

本発明は、核酸分子の塩基配列を決定するための技術に関する。より詳しくは、切断処理を施した核酸分子の質量変化情報に基づいて、核酸分子の塩基配列を決定するための方法及び装置に関する。

近年、ＤＮＡなどの核酸分子の塩基配列を決定する技術が幾つか提案されており、その自動化、高速化、並びに高精度化などが進展している。以下、主要な塩基配列決定技術を簡潔に説明する。

まず、サンガーらによって提案されたジデオキシ法（ＮeiＮeoxy chain termination methoＮ）は、サンガー法あるいはチェーンターミネーター法とも称される方法である。この方法は、一本鎖ＤＮＡ分子の配列を決定する方法であり、目的の１本鎖ＤＮＡを鋳型としてクレノー断片（Klenow fragment）と４種のデオキシリボヌクレオチドを用いて相補ＤＮＡを合成する際、４種のうち１種のジデオキシリボヌクレオチドを加えてＤＮＡ合成を阻害し、様々な長さのフラグメントを合成する。この反応をそれぞれ上記の４種類について行って、１塩基の差で分けられる分解能を有するポリアクリルアミド電気泳動装置で分離して、ＤＮＡ配列を決定するという技術である。この技術は、数百塩基程度の長さのＤＮＡ断片の塩基配列決定に適していると考えられている。

次に、全ゲノムショットガン法（Whole-Genome Shotgun Sequencing , whole genome shotgun sequencing ）は、ゲノムの長鎖ＤＮＡの塩基配列決定法であり、すべてのＤＮＡを制限酵素によって適当な断片に切断する。各々のＤＮＡ断片の両端の塩基配列を読んで、わずかな配列の重なりをコンピューターでつなぎ合わせていく方法である。現在、微生物のゲノム塩基配列決定では主流の方法になっており、最近では、この方法によって、Celera Genomic社がショウジョウバエのゲノム解析を達成したとの報告がある。

階層化ショットガン法（clone-by-clone shotgun sequencing）もゲノムの長鎖ＤＮＡの塩基配列決定法の一つであり、ＤＮＡを切断して断片化し、複数の制限酵素による切断部位の位置を決定して、ゲノムＤＮＡの地図を作成し、これらのＤＮＡ断片をさらに細かくして配列を決定するという方法である。この方法は、解読速度が全ゲノムショットガン法よりも遅く、また、労力もかかるという課題を抱えるが、解読精度が高いので、ヒトゲノム解析、イネゲノム解析などに用いられている。

その他、核酸分子が係わる反応などを質量変化に基づいて検出する技術が開示された文献として、次の特許文献１〜３がある。より詳しくは、特許文献１は、供給されたｄＮＴＰがＤＮＡサンプルに結合したときの質量変化を圧電素子の共振数変化として検出し、プライマーが伸長した否かを分析する技術であり、特許文献２は、ハイブリダイゼーションの有無をカンチレバーの固有振動数変化で検出する技術である。また、特許文献３には、読み取り目的のＤＮＡとのハイブリダイゼーションによって生ずる弾性波素子特性の変化を測定して、当該ＤＮＡ中の塩基配列を読み取る装置が開示されている。
特開２００４−１６１７１号公報。 特開２００４−１２５７０６号公報。 特開平６−２４５７５４号公報。

本発明は、従来の塩基配列決定技術とは、全く異なる手法によって、核酸分子の塩基配列を確実に決定可能な新規技術を提供することを課題とする。

本発明の核酸分子の塩基配列決定方法では、圧電素子に一末端部位が固定化された対象核酸分子を、遊離末端側から一核酸分子単位で切断する第１工程と、第１工程前の核酸分子の質量（Ｍ _１ ）と切断後の核酸分子の質量（Ｍ _２ ）との質量差分（Δｍ＝Ｍ _１ −Ｍ _２ ）に対応する前記圧電素子の振動数変化量（ΔＦ）を測定する第２工程と、前記第２工程で求めた振動数変化量（ΔＦ）を、塩基種ごとのリファレンスデータと比較又は照合して、前記第１工程で切断された一核酸分子の塩基種を特定する第３工程と、を少なくとも行う。

なお、本発明において、「対象核酸分子」とは、塩基配列解読の対象とされるヌクレオチド鎖を意味し（以下、同様）、この対象核酸分子は、一本鎖、二本鎖のどちらか一方に狭く限定されず、鎖長（塩基数）も限定されない。

本発明に係る上記方法は、塩基種の異なる核酸一分子が、それぞれに特有の質量を持つことに基づいて、対象核酸分子の質量（Ｍ_１とする）と核酸分子が切断された後の核酸分子の質量（Ｍ_２とする）の質量変化（質量差分）Δｍ（＝Ｍ_１−Ｍ_２）を検出可能な測定を実行し、この測定データ（Δｍ）から当該核酸分子の塩基種あるいは塩基配列に係わる情報を得ることを基本的な特徴としている。

本発明では、特に長いヌクレオチド鎖の対象核酸分子（例えば、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド）について、上記の第１工程から第３工程を必要回数繰り返すことによって、対象核酸分子の全塩基配列を効率よく決定することが可能となる。

対象核酸分子の切断を担う前記第１工程では、切断部位が制御可能な条件や構成により、対象核酸分子の切断を行うことができる方法であれば採用可能である。例えば、この切断は、酵素分解反応を用いて行うことができ、より具体的には、末端側から切断するエキソヌクレアーゼ（exonuclease）などの核酸分解酵素（nuclease）を用いて行うことができる。

上記第１工程での対象核酸分子の切断は、例えば、対象核酸分子の末端側から一核酸分子単位で順次切断していき、逐次その切断前後の質量変化を測定して、各測定で得られた質量差分データΔｍから切断された核酸分子の塩基種や塩基配列を決定していくようにする。

次に、本発明では、対象核酸分子を一切断片化せず、初期鎖長のままで第１工程にかけてもよいが、必要に応じて、この対象核酸分子を、たとえば制限酵素等を用いて断片化処理した後に前記第１工程へ移行したり、断片化処理しながら前記第１工程を行ったりするようにしてもよい。

更には、断片化された複数の核酸分子を同時並行的に測定にかけ、各断片化核酸分子の各塩基配列を同時並行的に決定していくことによって、塩基配列解読時間の高速化を図ってもよい。このような手法では、最終的には、断片化された各核酸分子の塩基配列を所定の順番に並べて、前記対象核酸分子の全塩基配列を特定する。

本発明に係る方法や装置を実施するに際し、塩基種の異なる核酸一分子のそれぞれに特有の質量に相関する測定データを得ておき、これらの測定データを、対象核酸分子の塩基配列の解読のためのリファレンスデータとして利用することができる。

例えば、同一の塩基種のみからなるオリゴ核酸分子（ＤＮＡであれば、ＡＡＡＡ・・・、ＴＴＴＴ・・・、ＧＧＧＧ・・・、ＣＣＣＣ・・・）、あるいはポリ核酸分子をリファレンスデータ作成用の対象核酸分子として採用する。この対象核酸分子を第１工程及び第２工程にかけて得られた測定情報から、それぞれの塩基種に対応する一核酸分子単位の質量差分データを予め得ておき、この質量差分データと測定データ（検出データ）とを比較又は照合することによって、塩基の種類や塩基の組み合わせ等を自動判定する手順を実行することにより、対象核酸分子の塩基配列の解読を行なうことができる。

より具体的には、塩基Ａ，Ｇ、Ｃ、Ｔそれぞれのデオキシリボ核酸一分子単位の質量差分データが、それぞれΔｍａ、Δｍｇ、Δｍｃ、Δｍｔであったと仮定し、さらに、塩基配列が未知である対象核酸分子を一核酸分子単位で切断する毎に得られた質量変化（質量差分）が、時系列でΔｍａ、Δｍｃ、Δｍｔ、Δｍｇ、Δｍｃ、Δｍｔであったと仮定すれば、当該対象核酸分子の塩基配列は、「ＡＣＴＧＣＴ」であったと決定することができる。

本発明では、対象核酸分子の一末端部位を固相表面に固定化しておくようにしておけば、例えば、第１工程前後の質量差分の測定を、水晶発振子、表面弾性波素子などの圧電素子（piezoelectric element）の共振周波数変化を測定することによって、対象核酸分子の塩基配列を解読することができる（以下の装置においても同様）。

次に、本発明では、反応領域中に存在する対象核酸分子の切断に用いる物質を、前記反応領域へ供給する物質供給部と、前記対象核酸分子の質量に対する前記切断処理後の核酸分子の質量変化を検出するための検出部と、前記検出部で得られた検出データを解析するデータ解析部と、前記解析部の解析結果を出力する出力部と、を少なくとも備える塩基配列決定装置を提供する。

前記データ解析部は、予め記憶されている塩基種ごとのリファレンスデータと前記検出データとを比較対照し、その結果から、対象核酸分子から切断された核酸分子の塩基種を特定する構成としてもよい。また、前記検出部は、前記対象核酸分子を固定化可能な端面構成を備えるカンチレバーの振動振幅を検出する構成であってもよい。

なお、本発明において「核酸」とは、プリンまたはピリミジン塩基と糖がグリコシド結合したヌクレオシドのリン酸エステルの重合体（ヌクレオチド鎖）を意味し、プローブＤＮＡを含むオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、プリンヌクレオチドとピリミジンヌクレオチオドが重合したＤＮＡ（全長あるいはその断片）、逆転写により得られるｃＤＮＡ（ｃプローブＤＮＡ）、ＲＮＡ、ポリアミドヌクレオチド誘導体（ＰＮＡ）等を広く含む。

本発明によれば、切断処理前後の核酸分子（ヌクレオチド鎖）の質量変化を測定することによって、当該核酸分子の塩基配列を正確かつ迅速に決定することができる。

以下、本発明を実施するための好適な形態について、添付図面を参照しながら説明する。なお、添付図面に示された各実施形態は、本発明に係わる物や方法の代表的な概念や実施形態の一例を示したものであって、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。

まず、添付した図１は、本発明に係る方法を構成する第１工程の基本的な概念の一例を示す図である。

この第１工程の好適な例は、所定長のヌクレオチド鎖からなる対象核酸分子（ここでは、説明の便宜上１０分子）Ｎの末端部位が、固相表面Ｆに固定化された状態を、公知の固定化技術を用いて予め形成しておき、続いて、この対象核酸分子Ｎの遊離末端側から、適宜選択した核酸分解酵素を用いて、切断部位を制御しながら対象核酸分子を切断する。

ここで、前記した公知の固定化技術の例を挙げれば、ストレプトアビジンによって表面処理された検出表面の場合では、ビオチン化されたＤＮＡプローブ末端の固定に適している。あるいは、チオール（ＳＨ）基によって表面処理された検出表面の場合では、チオール基が末端に修飾されたプローブＤＮＡ等の検出用物質Ｎをジスルフィド結合（−Ｓ−Ｓ−結合）により固定することに適している。

図１において符号Ｎで示された対象核酸分子の切断は、この図１に示されている例のように、核酸分解酵素の一種であるエキソヌクレアーゼ（exonuclease、図示せず。）を用いて、一核酸分子ずつ、遊離末端側から分解していく工程又は手段を採用することができる。

図１中の符号Ｎ_１は、末端の一核酸分子ｎ_１が切断（分解）され、開始時の対象核酸分子Ｎよりも一核酸分子少ない、計９分子から構成された核酸分子残基が生成している様子を模式的に示している。さらに、図１中の符号Ｎ_２は、さらに一核酸分子Ｎ_２が切断され、開始時の対象核酸分子Ｎよりも二核酸分子少ない、計８分子から構成された核酸分子残基を示している。なお、本発明では、対象核酸分子Ｎの塩基数（分子数）は、特に限定されない。

対象核酸分子Ｎの切断過程（分解過程）において、開始時の対象核酸分子Ｎの初期質量Ｍ_Ｎは、切断された一核酸分子ｎ_１の質量だけ減少したＭ_Ｎ１へ変化し、続いて、切断された核酸分子ｎ_１とＮ_２の質量和分だけ減少したＭ_Ｎ２へ変化する。

核酸分子は、その塩基種に応じた固有の質量を有することから、質量変化の各過程で得られる質量差分Δｍを、適宜の手段で逐次又は順次測定することによって、切断産物（分解産物）である核酸分子ｎ_１、ｎ_２の塩基種を決定することが可能となる。

例えば、対象核酸分子ＮがＤＮＡ（デオキシリボ核酸）である場合を想定すれば、その塩基成分は、基本的には、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）の４種類である。本発明では、各塩基種に対応する切断産物（分解産物）であるデオキシリボヌクレオチド一分子をｄＡ、ｄＧ、ｄＣ、ｄＴと便宜上表記する。なお、切断産物であるデオキシリボヌクレオチドｄＡ、ｄＧ、ｄＣ、ｄＴは、核酸分解酵素の種類によって、５’末端にリン酸基を持つものと、３’末端にリン酸基を持つ場合があるが、本発明では、これらのいずれも排除しない。

また、デオキシリボヌクレオチドｄＡ、ｄＧ、ｄＣ、ｄＴのそれぞれに固有の質量をＭｄＡ、ＭｄＧ、ＭｄＣ、ＭｄＴと便宜上表記すれば、測定によって取得された質量差分Δｍに係わるデータが前記ＭｄＡに対応するデータであれば、切断産物であるデオキシリボヌクレオチドはｄＡであると決定できる。

同様に、測定によって取得された質量差分Δｍに係わるデータが前記ＭｄＧに対応するデータであれば、切断産物であるデオキシリボヌクレオチドはｄＧであり、質量差分Δｍに係わるデータが前記ＭｄＣに対応するデータであれば、切断産物である核酸分子はｄＣであり、質量差分Δｍに係わるデータが前記ＭｄＴに対応するデータであれば、切断産物である核酸分子はｄＴであると決定できる。

対象核酸分子Ｎの切断処理を、酵素分解処理により行う場合において、核酸分解酵素は、本発明の解釈にあたり、狭く限定されない。対象核酸分子Ｎの種類、性状（例えば、一本鎖、二本鎖）あるいは切断処理の構成や測定系の内容に応じて、ＤＮＡに作用するデオキシリボヌクレアーゼ、ＲＮＡに作用するリボヌクレアーゼ、両方に作用するヌクレアーゼ、主として二本鎖のＤＮＡやＲＮＡに作用するＮＮアーゼＩ、ＮＮアーゼＩＩ、ＡＴＰ依存性ＮＮアーゼ、ＲＮアーゼＩＩＩ、あるいは、一本鎖のＤＮＡやＲＮＡに作用するヌクレアーゼＳ_１、ヌクレアーゼＰ_１、エキソＮＮアーゼＩ、ＲＮアーゼＩＩ、あるいは、特定の塩基を認識して分解する塩基特異的なＲＮアーゼＴ_１、ＲＮアーゼＵ_２、ＲＮアーゼＡ、Ｔ4-エンドヌクレアーゼなど、核酸の高次構造を認識すると考えられるＲＮアーゼＨ、ＲＮアーゼＰ、あるいは制限酵素などを広く利用できる。

また、上記した例では、対象核酸分子Ｎを一核酸分子ずつ切断（分解）していく方法又は手段を代表例として説明したが、複数の核酸分子を切断単位とする工程や手段を目的に応じて採用するのは自由である。また、対象核酸分子Ｎの切断方法又は切断手段は、核酸分解酵素を用いる酵素分解の例に限定されず、本発明の目的に沿うように対象核酸分子Ｎを切断できればよい。

次に、切断処理が施される前後の対象核酸分子Ｎの質量変化を測定する工程（第２工程）の好適な例を説明する。

この工程は、塩基配列解読対象の対象核酸分子Ｎの質量変化を高精度に測定することができる方法や手段であれば採用可能であり、特に限定されない。現在において採用可能な代表例を挙げるとすれば、圧電素子（圧力-電気変換を直接に行う素子）の共振周波数変化を測定することによって、対象核酸分子Ｎの質量変化を測定する方法又は手段である。

水晶、ロッシェル塩、電気石などの結晶に電圧を加えて電気分極させると、その結晶は歪みを生じ、逆に圧力を加えて結晶を歪ませると、電気分極が生じて電圧を発生する。このような現象は、圧電効果(piezoelectric effect)と呼ばれている。特に水晶（石英、quartz ;SiO2）が、圧電特性、化学的性質、熱的安定性に優れていることが知られている。

従って、この圧電効果を利用して水晶板の両面に電極を取り付けたものに電圧をかけてひずみを生じさせた後に印加電圧を解除すると、水晶板はずり振動を生じてから元に戻る現象を示す。このときの印加電圧を交流電場としてずり方向の共振周波数に同期させると、水晶板は発振子としてその水晶板のもつ固有振動数で共振振動する。

このような水晶発振子は、該水晶発振子の電極上への物質の付着が振動数の減少を引き起こし、この振動数変化と付着物質の質量との関係は、以下の数式（数１）の「Sauerbrey式」によって表される。このSauerbrey式に基づけば、電極上での質量変化は、振動数変化と比例関係にあることがわかる。なお、下記数式１中のΔｍは質量変化、ΔＦは基本振動数の変化量、Ｆ_０は基本振動数、Ａは電極面積、μｑは水晶の剪断応力（2.947×10¹⁰ｋｇｍ^-１ｓ^-１）、ρｑは水晶の密度（2648ｋｇｍ^−３）を示している。

例えば、基本振動数Ｆ_０(Ｈｚ)が２７ＭＨｚの水晶発振子では、電極１ｃｍ^２あたりに約０．６２ｎｇの物質が付着すると１Ｈｚ振動数が減少することが確かめられている。この測定原理は、原子の単分子層吸着をも測定できるほどの高感度であることから微量天秤もしくはＱＣＭ(Quartz-crystal microbalance)と呼ばれており、原理的に、一核酸分子レベルの質量変化を検出することが可能である。

従って、本発明では、水晶発振子の表面（図１の固相表面Ｆに対応）に、塩基配列解読のターゲットとなる対象核酸分子Ｎの末端部位を予め固定化しておき（図１参照）、該表面上の領域において上記第１工程を進行させることによって、該対象核酸分子Ｍの質量変化Δｍを、振動数変化（ΔＦ）として測定するという方法又は手段を採用できる。

即ち、対象核酸分子Ｎの質量変化（Δｍ）は、図２に示すような振動数変化（ΔＦ）として測定することができる。上記したように、一核酸分子単位で対象核酸分子を切断していくような実施形態の場合では、順次測定される振動数変化（ΔＦ）は、切断された一核酸分子分の質量変化（質量減少）に対応する振動数変化である。

図２に示したような振動数変化ΔＦ_１、ΔＦ_２、ΔＦ_３、ΔＦ_４が、順に、切断されたデオキシリボヌクレオチドｄＡ、ｄＧ、ｄＣ、ｄＴのそれぞれに固有の質量に相当する振動数変化であると仮定するならば、この測定データ情報によって得られた塩基配列情報は、ＡＧＣＴである。なお、このように測定データ情報に基づいて、切断されたデオキシリボヌクレオチドなどの核酸分子の塩基情報を取得する工程は、本発明に係る第３工程に相当する。

本発明では、所定のヌクレオチド鎖長の対象核酸分子Ｎ（例えば、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド）について、上記の第１工程から第３工程を必要回数繰り返すことによって、対象核酸分子Ｎの全塩基配列を効率よく、決定することができる。

更には、断片化処理を施した複数の核酸分子の各塩基配列を同時並行的に決定していくことによって、塩基配列解読時間の高速化を図ることもできる。このような手法では、最終的には、断片化された各核酸分子の塩基配列を所定の順番につなぎ合わせて、前記対象核酸分子の全塩基配列を特定する。

次に、図３は、本発明に係る塩基配列決定装置Ｕの基本構成を示すブロック図である。

この塩基配列決定装置Ｕは、反応領域（固相表面Ｆ上の領域）に存在する対象核酸分子、例えば、固相表面Ｆにその末端が固定化されている対象核酸分子Ｎの切断に用いる物質Ｅ（例えば、核酸分解酵素）を、前記反応領域Ｒへ供給する物質供給部１と、前記対象核酸分子Ｎの質量に対する前記切断処理後の核酸分子の質量変化を検出するための検出部２と、該検出部２で得られた検出データを解析するデータ解析部３と、このデータ解析部３の解析結果を出力する出力部と、を少なくとも備えている。

ここで、前記データ解析部３は、該解析部３の記憶部に予め記憶されている塩基種ごとのリファレンスデータと前記検出データとを比較対照することによって、対象核酸分子Ｎから切断された核酸分子ｎの塩基種を特定する。

ここで、同一の塩基種のみからなるオリゴ核酸分子又はポリ核酸分子を対象核酸分子Ｎとして採用し、これらの対象核酸分子Ｎから得られた測定情報から各塩基種に対応する一核酸分子単位の質量変化に相関する測定データ（例えば、振動数変化）を予め求めておき、これをリファレンスデータとして、装置Ｕを構成するデータ解析部３の記憶部に予め記憶しておくようにする。

例えば、デオキシリボヌクレオチドｄＡ、ｄＧ、ｄＣ、ｄＴのそれぞれに固有の質量に相当する振動数変化である、ΔＦｄＡ、ΔＦｄＧ、ΔＦｄＣ、ΔＦｄＴを求めておき、これらのリファレンスデータと測定によって得られたデータ（ΔＦ_１、ΔＦ_２、ΔＦ_３、ΔＦ_４）とを、自動的に比較対照判定することによって、対象核酸分子の塩基配列決定を行うようにしてもよい。

また、本発明では、対象核酸分子の質量変化（Δｍ）を、固有振動数変化を測定可能なカンチレバー手段を用いて行うようにしてもよい。好適に採用できるカンチレバー５は、図４に示すような形態をなすものであり、その端面５１には圧電素子材料からなる振動子を有し、この振動子の表面に対象核酸分子Ｎを固定化できる構成を備える。さらに、このカンチレバー５を振動励起する駆動源（図示せず。）を設け、該カンチレバー５の振動振幅を検出部２（図３参照）で検出する。

例えば、カンチレバー５の駆動源となる交流電源によって周波数を変化させながらカンチレバー５を振動励起する。そして、共振振幅に関連した電流を抵抗で電圧変換し、この電圧を電圧計（図示せず。）で計測する。なお、カンチレバー５の共振振幅は、交流電源の周波数が該カンチレバー５の固有振動数と一致したときに最大となる。

なお、カンチレバーとしては、例えば、ジルコン酸チタン酸鉛（ＰＺＴ）やタンタル酸ストロンチウムビスマス（ＳＢＴ）等の圧電性を有する強誘電体を用いることができる。

本発明は、核酸分子（ヌクレオチド鎖）の塩基配列を解読するための技術（方法、装置、システム）として利用することができる。

本発明に係る方法を構成する第１工程の基本的な概念の一例を示す図である。 水晶発振子原理を用いた測定の場合の対象核酸分子の切断処理に伴う振動数変化を模式的に示す図である。 本発明に係る装置（Ｕ）の基本構成を示すブロック図である。 同装置で採用可能なカンチレバー（１）の構成を簡略に示す図である。

符号の説明

１ 物質供給部
２ 検出部
３ データ解析部
４ 出力部
５ カンチレバー
Ｆ 固相表面（例えば、水晶板など）
Ｎ 対象核酸分子
ｎ（ｎ_１，ｎ_２）切断（分解）された一核酸分子
ΔＦ 振動数変化
Ｕ 塩基配列決定装置

Claims (11)

1. 圧電素子に一末端部位が固定化された対象核酸分子を、遊離末端側から一核酸分子単位で切断する第１工程と、
   第１工程前の核酸分子の質量（Ｍ _１ ）と切断後の核酸分子の質量（Ｍ _２ ）との質量差分（Δｍ＝Ｍ _１ −Ｍ _２ ）に対応する前記圧電素子の振動数変化量（ΔＦ）を測定する第２工程と、
   前記第２工程で求めた振動数変化量（ΔＦ）を、塩基種ごとのリファレンスデータと比較又は照合して、前記第１工程で切断された一核酸分子の塩基種を特定する第３工程と、
   を少なくとも行う核酸分子の塩基配列決定方法。
2. 前記第１工程から第３工程を繰り返すことによって、前記対象核酸分子の全塩基配列を決定することを特徴とする請求項１記載の塩基配列決定方法。
3. 前記第１工程を、核酸分解酵素（nuclease）を少なくとも用いて行うことを特徴とする請求項１記載の塩基配列決定方法。
4. 前記核酸分解酵素は、エキソヌクレアーゼ（exonuclease）であることを特徴とする請求項３記載の塩基配列決定方法。
5. 前記対象核酸分子は、一本鎖核酸分子であることを特徴とする請求項１記載の塩基配列決定方法。
6. 前記対象核酸分子を断片化した後に、前記第１工程へ移行することを特徴とする請求項１記載の塩基配列決定方法。
7. 断片化核酸分子の各塩基配列を、同時並行的に決定することを特徴とする請求項６記載の塩基配列決定方法。
8. 予め、同一の塩基種のみからなるオリゴ核酸分子又はポリ核酸分子を対象として前記第１工程及び第２工程を行って、各塩基種に対応する一核酸分子単位の質量変化に相関する振動数変化を求めておき、これを塩基種ごとのリファレンスデータとして用いるとを特徴とする請求項１記載の塩基配列決定方法。
9. 前記圧電素子は、水晶発振子であることを特徴とする請求項１記載の塩基配列決定方法。
10. 圧電素子の反応領域中に固定化された対象核酸分子を一核酸分子単位で切断する物質を、前記反応領域へ供給する物質供給部と、
    切断前の核酸分子の質量（Ｍ _１ ）と切断後の核酸分子の質量（Ｍ _２ ）との質量差分（Δｍ＝Ｍ _１ −Ｍ _２ ）に対応する圧電素子の振動数変化量（ΔＦ）を検出するための検出部と、
    予め記憶されている塩基種ごとのリファレンスデータと、前記検出部で検出された振動数変化量（ΔＦ）とを比較又は照合して、前記対象核酸分子から切断された一核酸分子の塩基種を特定するデータ解析部と、
    前記解析部の解析結果を出力する出力部と、
    を少なくとも備える塩基配列決定装置。
11. 前記圧電素子は、前記対象核酸分子を固定化可能な端面構成を備えるカンチレバーであり、前記検出部は、該カンチレバーの振動振幅を検出することを特徴とする請求項１０記載の塩基配列決定装置。