CN1754965A - 用于测定核酸分子碱基序列的方法和设备 - Google Patents

Abstract

本文公开了一种用于测定核酸分子碱基序列的方法和设备，通过切割目标核酸分子，同时控制切割位点，在切割步骤之后，测定核酸分子中出现的质量变化，并从质量变化数据中获取被切割的核酸分子的碱基信息。该方法和设备基于一种完全不同于常规技术的原理。

Description

用于测定核酸分子碱基序列的方法和设备

技术领域

本发明涉及确定核酸分子碱基序列的技术。更具体地，本发明涉及根据经过切割处理的核酸分子的质量变化信息，来确定核酸分子碱基序列的方法和设备。

背景技术

近来已提出了几种用于测定核酸分子(如DNA)碱基序列的技术。正在尝试自动、快速、更准确地实施上述技术。以下简单描述了用于测定碱基序列的主要技术。

第一种是由Sanger等提出的双脱氧测序方法(或链终止方法或Sanger方法)。该方法用于测定单链DNA分子的碱基序列。在该方法中，以目标单链DNA为模板，在存在四种双脱氧核糖核苷酸中一种的情况下，从Klenow片段合成互补DNA，所述双脱氧核糖核苷酸防止合成完整的DNA，而是导致产生长度不同的DNA片段。该反应用所有四种双脱氧核糖核苷酸重复进行，生成的DNA片段采用可以分辨单个碱基差别的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。这种DNA测序技术被视为适合于对具有好几百个碱基的每个DNA片段进行测序。

第二种是全基因组鸟枪测序法(whole-genome shotgun sequencingmethod)，其用于测定基因组长链DNA的碱基序列。该方法是：利用限制酶将所有DNA切割为具有适当长度的片段，在每个DNA片段的两端解码碱基序列，并在序列重叠的位置通过采用计算机将DNA片段剪接在一起。目前，该方法主要用于测定微生物基因组的碱基序列。顺便提及的是，已报道Celera Genomic Corp.采用该方法完成了果蝇基因组的测序。

第三种是连续克隆鸟枪测序法(clone-by-clone shotgun sequencingmethod)，其也用于测定基因组的长链DNA的碱基序列。其步骤是：将DNA切割为片段，采用多种限制酶测定切割位点的位置，制备基因组DNA，并将DNA片段切割为更小的片段，从而测定碱基序列。与全基因组鸟枪测序法相比，该方法解码需要花费较长的时间和较多的劳力；然而，由于其解码精度高而被用于人类基因组和水稻基因组。

下面给出的专利文献1-3中公开了其它的测序方法，其基于涉及核酸的反应所引起的质量变化。专利文献1涉及一种技术，其可利用压电元件(piezoelectric element)来检测当供应到体系中的dNTP与DNA样品结合时出现的质量变化，该压电元件相应于质量变化而改变共振频率，从而检测引物是否伸长。专利文献2涉及一种通过测定悬臂固有频率的变化来检测杂交的技术。专利文献3涉及一种设备，该设备采用表面声波设备来读取目标DNA当DNA杂交时发生性质改变的碱基序列。

[专利文献1]特开2004-16171号公报

[专利文献2]特开2004-125706号公报

[专利文献3]特开平6-245754号公报

发明概述

本发明实施例提供了一种新技术，其完全不同于常规技术，用于可靠地测定核酸分子的碱基序列。

本发明涉及一种用于测定核酸分子碱基序列的方法，该方法包括：第一步，切割目标核酸分子，同时控制切割位点；第二步，继第一步之后，测定在核酸分子中出现的质量变化；以及第三步，从在第二步测定的数据中获取被切割的核酸分子的碱基信息。

顺便提及的是，本发明所用的术语“目标核酸分子”表示一种核苷酸链，其碱基序列将要被解码。目标核酸不局限于单链或双链，并且不限制链长度(或碱基数)。

本发明的方法基于以下原理：碱基种类不同的个体核酸分子具有其自身的质量，并有可能从目标核酸分子的质量(M₁)和被切割的核酸分子的质量(M₂)之间的差别(Δm)，获得有关目标核酸分子碱基种类或碱基序列方面的信息，其中，Δm＝M₁-M₂。

根据本发明，如果目标核酸分子具有长核苷酸链(例如，寡核苷酸和多核苷酸)，上述第一步到第三步可以根据需要重复多次，从而可能有效地测定目标核酸中所有碱基的序列。

用于切割目标核酸分子的第一步可以采用任何方法实现，只要在可控条件下在预期的切割位点切割目标核酸分子即可。例如，这种切割可以采用酶分解反应实现。具体地说，实施例可以通过采用核酸酶(如核酸外切酶)实现，其在靠近末端的位点开始切割。

在上述第一步中，目标核酸分子被切割，例如，从目标核酸分子的末端侧开始，每次切割一个核苷酸单位。测定每次切割后的质量变化。可以根据所得数据(Δm，质量差)确定被切割的核酸分子的碱基种类和碱基序列。

第一步可应用于保持初始链长度而未被分割的目标核酸分子。然而，第一步也可应用于已被限制酶分割(或正在被分割)的目标核酸分子。

也可以平行测定多个被分割的核酸并平行确定其碱基序列。这将节省所需的测序时间。采用这种技术，单个被分割的核酸分子的碱基序列以规定的顺序排列，从而逐步确定目标核酸分子的完整碱基序列。

本发明的方法和设备可以利用碱基种类不同的单个核酸的质量参考数据，有效地解码目标核酸分子的碱基序列。

生成参考数据的目标核酸分子可以是，由相同种类的碱基组成的寡核酸分子(仅由AAAA...、TTTT...、GGGG...或CCCC...组成的DNA)或多核酸分子。所述核酸进行第一步和第三步，从而，为每个核酸分子收集与碱基种类对应的质量差别数据。将该数据与测定的(检测的)数据对比或对照，以便利用程序(procedure)对目标核酸分子的碱基序列解码，以自动判断碱基种类和碱基组合。

以下给出了具体说明。假定每个仅由A、G、C或T组成的脱氧核糖核酸分子的质量差分别为Δma、Δmg、Δmc或Δmt。也假定当碱基序列未知的目标核酸分子每次切割一个核酸分子单位时，测出的质量变化为Δma、Δmc、Δmt、Δmg、Δmc和Δmt。然后，可以确定目标核酸分子具有碱基序列“ACTGCT”。

根据本发明，目标核酸分子的一端固定到固相表面，如石英振荡器(quartz oscillator)和压电元件(表面声波设备)。利用所述设备，可以根据共振频率的变化测定在第一步之后出现的质量变化。以这种方式，可以对目标核酸分子的碱基序列解码。

本发明也涉及一种用于测定核酸分子碱基序列的设备，该设备包括：给反应区提供在该反应区切割目标核酸分子时所用的物质的单元，检测核酸分子经过切割处理后的质量变化的单元，对该检测单元测出的数据进行分析的单元，以及发送分析单元的分析结果的单元。

可以将上述数据分析单元构造成，将检测的数据与先前存储的单个碱基种类的参考数据对照，并随后鉴定从目标核酸分子切出的核酸分子的碱基种类。同样，可以将上述检测单元构造成，检测悬臂的振幅，该悬臂可允许目标核酸分子被固定到其末端表面。

顺便提及的是，在本发明中，术语“核酸”指由嘌呤或嘧啶碱基与糖通过糖苷键相互连接而成的核苷酸链或核苷磷酸酯聚合物。它广义上包括寡核苷酸和多核苷酸(包括探针DNA)、由嘌呤核苷酸和嘧啶核苷酸组成的完整DNA或其片段、通过反转录获得的cDNA(c探针DNA)、RNA，以及核苷酸的聚酰胺衍生物(PNA)。

本发明通过测定切割后的质量改变，使准确快速地测定核酸(或核苷酸链)的碱基序列成为可能。

附图说明

图1示意图说明本发明方法的第一步的基本概念；

图2的示意图说明，采用石英振荡器进行测量期间，当目标核酸分子被切割时出现的振动变化；

图3的方块图说明本发明的设备(U)的基本结构；以及

图4的简图说明可用于本发明设备的悬臂(1)的结构。

优选实施例的详细说明

参照附图，将更加详细地描述本发明的优选实施例。附图中显示的实施例仅用于说明根据本发明方法和设备的概念和典型例子。它们不应当被解释为用于限制本发明的范围。

图1的示意图说明本发明方法的第一步的基本概念。

为了进行第一步，有必要制备目标核酸分子样品(由规定长度的核苷酸链组成)，从而使核苷酸链(N)的末端固定到固相表面(F)上(为方便说明，假定核苷酸链由10个分子组成)。所述样品可通过采用任何已知的固定技术制备。随后，通过适当选取的核酸酶切割目标核酸分子，从而在靠近其自由端的适当受控位点开始切割。

下面说明一些公知的固定技术。检测器用链霉亲和素进行表面处理后，适于固定生物素化的DNA探针的末端。检测器用巯基(SH)进行表面处理后，适于通过二硫键(-S-S-)固定用巯基进行末端修饰的探针DNA(待测的)。

图1中符号N所示目标核酸分子可以用核酸外切酶切割(未示出)，这种酶是一种核酸酶，它在游离末端侧逐个地切割核酸。

图1中符号N₁表示，切掉末端1个核酸分子(n₁)后仍保留的9个分子所组成的核酸残基。残基中的分子数比开始时的目标核酸的分子数减少1个。同样，图1中符号N₂表示，切掉末端2个核酸分子(n₂)后仍保留的8个分子所组成的核酸残基。残基中的分子数比开始时的目标核酸的分子数减少2个。顺便提及的是，本发明对目标核酸分子的碱基数(或分子数)(如符号N所示)没有特殊限制。

切割(或分解)目标核酸分子(N)的过程按如下进行。目标核酸分子(N)开始时的质量为M_N，切割1个核酸分子n₁之后，减去了相当于该被切割的核酸分子的质量，减少后的质量为M_N1。经过第二次切割，减去了相当于被切割的两个核酸n₁和n₂的质量之和，由第一次减少后的质量M_N1变为第二次减少后的质量M_N2。

由于每一核酸根据其碱基种类的不同都有其固有的质量，因此，采用适宜手段在每次切割步骤之后依次测定质量差(Δm)，有可能测定由切割(或分解)生成的核酸分子(n₁和n₂)的碱基种类。

例如，在以DNA(或脱氧核糖核酸)作为目标核酸分子的情况下，碱基成分为腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)。在本发明中，为方便起见，相应于这些碱基种类，将作为切割产物(或分解产物)的脱氧核糖核苷酸分子用dA、dG、dC和dT表示。顺便提及的是，这些作为切割产物的脱氧核糖核苷酸dA、dG、dC和dT可以分为在5’端具有磷酸基团的那些和在3’端具有磷酸基团的那些；然而，在本发明中未进行区分。

假定脱氧核糖核苷酸dA、dG、dC和dT的固有质量分别为MdA、MdG、MdC和MdT，如果测定的质量差(Δm)相应于固有质量MdA，可确定由切割生成的脱氧核糖核苷酸为dA。

同样，如果测定的质量差(Δm)相应于固有质量MdG，可确定由切割生成的脱氧核糖核苷酸为dG，如果测定的质量差(Δm)相应于固有质量MdC，则由切割生成的脱氧核糖核苷酸为dC，如果测定的质量差(Δm)相应于固有质量MdT，则由切割生成的脱氧核糖核苷酸为dT。

在本发明中，对切割目标核酸分子的核酸酶没有严格限制。它包括作用于单链或双链DNA的脱氧核糖核酸酶、作用于RNA的核糖核酸酶、作用于DNA和RNA的核酸酶、主要作用于双链DNA和RNA的NNase-I和NNase-II、ATP依赖性NNase、RNase-III、作用于单链DNA和RNA的核酸酶S₁、核酸酶P₁、exoNNase I、RNase II、碱基特异性RNase T₁、RNase U₂、RNase A、T4-核酸内切酶、RNase H(其被视为可识别核酸的高级结构)、RNase P以及各种限制酶。

上述实施例举例说明，本发明的方法(或设备)将目标核酸分子按照每次切割一个核酸分子的方式逐一切割(或分解)为单个核酸分子。也可以修改该实施例，从而每次切割生成不止一个核酸分子单位。用于切割目标核酸分子的方法或手段不局限于核酸酶；任何方法或手段，只要能切割本发明目标核酸分子，均可采用。

第二步如下述进行，以测定目标核酸分子被切割后出现的质量变化。

该步骤可以采用任何方法或手段，不作专门限制，只要其能够准确测定待测序的核酸分子的质量变化即可。目前可满足该要求的一种典型方法是，测定压电元件(压力-电力变换器，pressure-electricity transducer)中出现的共振频率变化。

已知当石英晶体、罗谢尔(Rochelle)盐、电气石等被施加可引起电极化的电压时会发生变形，而当它们在压力下变形时通过电极化产生电压。这种现象被称为压电效应。石英(SiO₂)由于其杰出的压电性能、化学性质和热稳定性而广为人知。

上述压电效应可以如下加以利用。在石英板两端连上电极，当施加电压使其变形时，产生剪切振动(shearing vibration)。移走施加的电压后，其恢复原形。如果施加的电压(作为交流电场)与剪切振动的共振频率同步，石英板随后以其固有频率发生共振，如同振荡器一样。

上述石英振荡器在微小物体连到其电极上时频率降低。频率变化与微小物体重量之间存在相关性，用以下Sauerbrey公式(1)表示。该公式表示电极上的质量变化与频率变化成正比。

$\mathrm{\ΔF}=-\frac{2F_0^2}{A{\left({\mathrm{\μ}}_q{\mathrm{\ρ}}_q\right)}^{1/2}}\mathrm{\Δm}...\left(1\right)$

其中，

Δm...质量变化

ΔF...基频变化

F₀...基频(fundamental frequency)

A...电极面积

μq...石英的剪切应力(2.947×10¹⁰kgm^-1s^-1)

ρq...石英的密度(2648kgm^-3)

已经证实，具有27MHz的基频(F₀)的石英振荡器，在微小物体连接到电极时(约0.62ng/cm²)，频率下降1Hz。基于该原理的石英振荡器被称为石英晶体微量天平(QCM)。它非常灵敏，即使是吸附到电极上的单分子层的重量也可以测出。因此，原则上，它可以检出相当于一个核酸分子的质量变化。

本发明采用了基于前述原理的方法或设备。也就是说，待测序的核酸具有事先固定到石英振荡器表面(对应于图1所示固相表面(F))的末端。根据第一步中在该表面上切割时的频率变化(ΔF)来测定核酸分子的质量变化(Δm)。

换句话说，核酸分子的质量变化(Δm)本身表现为频率变化(ΔF)，如图2所示。在上述按照每次切割一个核酸分子单位的方式切割目标核酸分子的实施例中，依次测定的频率变化(ΔF)相应于被切割的一个核酸的质量变化(质量下降)。

假定图2所示频率变化(ΔF₁、ΔF₂、ΔF₃和ΔF₄)相应于被切割的脱氧核糖核苷酸dA、dG、dC和dT的固有质量，则所测数据提示碱基序列AGCT。顺便提及的是，从所测数据获取核酸(或切割的脱氧核糖核苷酸)的序列信息的过程相应于本发明的第三步。

根据本发明，对于具有指定核苷酸链长的目标核酸分子(寡核苷酸或多核苷酸)，通过按所需次数重复上述第一步到第三步，有可能有效地测定目标核酸分子的完整碱基序列。

上述实施例可以进行改变，从而同时对多个被切割的核酸进行平行测序。采用这种方式，有可能减少测定碱基序列所需的时间。采用这种方式测定的被切割的核酸分子的碱基序列最后以一定顺序逐个剪接，从而确定目标核酸分子的完整碱基序列。

图3的方块图说明了本发明测序设备(U)的基本结构。

用于测定碱基序列的测序设备(U)至少具有：单元(1)，其用于将物质(E)供应到反应区(R)，所述物质例如是在反应区切割目标核酸分子的核酸酶，其中所述目标核酸分子的末端被固定到固相表面(F)；单元(2)，其用于检测已被切割的核酸分子的质量变化；单元(3)，其用于分析由所述检测单元(2)检测的数据；以及单元(4)，其用于发送由所述数据分析单元(3)完成的分析结果。

数据分析单元(3)将检测数据与先前已存储在储存器(storage)中的每种碱基的参考数据对比和比较，从而鉴定从目标核酸分子(N)中切割出的核酸分子(n)的碱基种类。

将要存储在设备(U)数据分析单元(3)的储存器中的参考数据可以是，例如，与对应于每个碱基种类的一个核酸分子单位的质量变化相关的频率变化。这种有关质量变化的数据从目标核酸分子(N)获得，所述目标核酸分子是由同种碱基组成的寡核酸分子或多核酸分子。

例如，参考数据可以是频率变化ΔFdA、ΔFdG、ΔFdC和ΔFdT，分别对应于脱氧核糖核苷酸dA、dG、dC和dT的固有质量。先前已获得的参考数据与测定的数据(ΔF₁、ΔF₂、ΔF₃和ΔF₄)自动进行对比和比较，以测定目标核酸分子的碱基序列。

根据本发明，目标核酸分子的质量变化(Δm)可以用能测定固有频率变化的悬臂部件来完成。图4显示了优选的悬臂(5)。悬臂5具有与其末端51连接的压电振荡器，并且振荡器表面被构造成能够固定目标核酸分子。悬臂(5)还设有激发其振动的驱动源(未示出)以及检测其振幅的检测单元(2)(图3所示)。

悬臂(5)由频率连续改变(sequentially varied)的驱动源(或AC源)激发。与谐振幅度相应的电流被转化为由电阻产生的电压，并且电压由电压表(未示出)读取。当AC源的频率与悬臂(5)的固有频率一致时，悬臂(5)的共振振幅达到最大值。

顺便提及的是，悬臂可以由锆钛酸铅(PZT)和钽酸锶铋(SBT)等具有压电特性的铁电物质形成。

本发明可以应用到测定核酸分子(核苷酸链)的碱基序列的技术(包括方法、设备和系统)中。

Claims (15)

1.测定核酸分子碱基序列的方法，所述方法包括：第一步，切割目标核酸分子，同时控制切割位点；第二步，测定在第一步之后核酸分子的质量变化；以及第三步，从第二步所测数据获取被切割核酸分子的碱基信息。

2.  权利要求1的测定碱基序列的方法，其中，重复第一步到第三步以测定目标核酸分子的全部碱基序列。

3.  权利要求1的测定碱基序列的方法，其中，第一步使用至少一种核酸酶。

4.权利要求2的测定碱基序列的方法，其中，所述核酸酶为核酸外切酶。

5.权利要求1的测定碱基序列的方法，其中，目标核酸分子为单链核酸分子。

6.权利要求1的测定碱基序列的方法，其中，第一步被设计成以一个核酸分子为单位来切割目标核酸分子。

7.权利要求1的测定碱基序列的方法，其中，在使目标核酸分子成为片段后开始第一步。

8.权利要求7的测定碱基序列的方法，其中，同时平行测定成为片段的核酸分子的碱基序列。

9.权利要求7的测定碱基序列的方法，其中，在仅由同种碱基组成的寡核酸分子或多核酸分子上进行第一步和第二步，以便获得相应于每个碱基种类的一个核酸分子单位的质量信息，并用所得信息确定目标核酸分子的碱基序列。

10.权利要求1的测定碱基序列的方法，其中，目标核酸分子的一端固定到固相表面。

11.权利要求10的测定碱基序列的方法，其中，第二步涉及测定压电元件的共振频率变化。

12.权利要求11的测定碱基序列的方法，其中，所述压电元件为石英振荡器。

13.测定核酸分子碱基序列的设备，所述设备包括：将可在反应区内切割目标核酸分子的物质供应到所述反应区的单元，检测已被切割的核酸分子的质量变化的单元，对所述检测单元检测的数据进行分析的单元，以及发送所述分析单元完成的分析结果的单元。

14.权利要求13的测定碱基序列的设备，其中，所述分析单元被构造成，可以将检测数据与先前储存的个体碱基种类的参考数据对比。

15.权利要求13的测定碱基序列的设备，其中，所述检测单元被构造成，可以检测悬臂的振幅，所述悬臂的末端表面可固定目标核酸分子。

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