JP5465008B2 - ヘモグロビン及びヘモグロビン誘導体の測定方法、測定キット - Google Patents

Description

本発明は、血液試料中のヘモグロビン及びヘモグロビン誘導体の測定方法、それに用いる試薬組成物、測定キット、分析デバイス、及び分析システムに関するものであり、より迅速かつ正確にヘモグロビンとヘモグロビン誘導体を測定する技術に関するものである。

また、本発明は、タンパク質に生物学的物質を結合させる方法に関するものである。得られるリガンド−タンパク質複合体は、イムノアッセイにおける凝集試薬として有用である。

ヘモグロビン誘導体の一つであるヘモグロビンＡ１ｃは、食事による血糖値変動の影響を排除した通常時の血糖レベルの判定が可能なこともあって、生活習慣病の早期発見のためによく測定される項目である。ヘモグロビンＡ１ｃは、赤血球の中に含まれるヘモグロビンにグルコースが結合したものであり、ヘモグロビンに対してヘモグロビンＡ１ｃが存在する比率（％）で、数値化される。よって、ヘモグロビンＡ１ｃが存在する比率を測定するためには、ヘモグロビンとヘモグロビンＡ１ｃを個別に測定する必要がある。ヘモグロビンの測定は、ヘモグロビン特有の光吸収特性を利用して、４１５ｎｍ近傍の波長もしくは５４０ｎｍ近傍の波長で測定する方法が一般的である。５４０ｎｍ近傍の波長で測定する方法としては、シアンメトヘモグロビン法やＳＬＳヘモグロビン法が広く知られている。また、ヘモグロビンＡ１ｃを免疫法で測定する為には、血液試料を溶血させることによって、赤血球からヘモグロビンを外に取りだした後、ヘモグロビンが非糖化ヘモグロビンであるかヘモグロビンＡ１ｃであるかを判別するために、ヘモグロビンの立体構造を変化させることによって、ヘモグロビンの糖化された部分をその立体構造の中から外に露出させる処理が必要である。これを変性と呼ぶが、さらに、糖化された部分を特異的に認識する抗体と反応させることによって、免疫学的にヘモグロビンＡ１ｃ量を測定することが可能となる。

なお、本発明の先行技術文献としては、国際公開第２００６／１１２３３９号パンフレット（ＷＯ２００６／１１２３３９Ａ１）が公開されており、ヘモグロビンＡ１ｃ測定時の変性方法に関しても、この中に記載されている。この方法は血液成分を含む試料を、非イオン性界面活性剤と酸化剤とで処理して前記試料中のヘモグロビンを変性させるようにしたヘモグロビン誘導体の測定方法である。

また、近年、臨床検査において、各種疾病の進行度合いを検査するために、様々な検査方法が利用されてきており、血液等の生物学的試料と分析試薬とを反応させ、生物学的試料中の様々な成分を定量可能な大型の自動分析装置が実用化されており、医療分野においては無くてはならない存在となっている。そのような背景の中、近年市場からは、低コスト、試料液の少量化、短時間測定、装置の小型化、多項目同時測定など、より高精度で、より運用の自由度が高い分析装置や分析方法の登場が望まれている。

運用の自由度が高い分析装置や分析方法の一つとして、抗原抗体反応を基本とした測定原理が一般的に知られており、免疫比濁法、免疫比朧法、ラテックス免疫凝集法、免疫凝集阻止法、ラテックス免疫凝集阻止法、蛍光免疫測定法、化学発光免疫測定法、電気化学免疫測定法、蛍光偏光免疫測定法、免疫クロマト法などのイムノアッセイがある。

粒子凝集反応に基づくイムノアッセイにおいて、生物学的試料中の特定の成分に対する定性的または定量的な測定は、遊離状態の抗分析対象物抗体または、水懸濁性粒子に結合している抗分析対象物抗体の凝集の有無及びその程度によって決められる。この水懸濁性粒子として最も一般的に使用されているのはラテックス粒子と呼ばれるものである。

粒子凝集反応に基づくイムノアッセイのうち、免疫学的粒子凝集阻止反応を利用する測定方法が知られている。抗分析対象物抗体とこの抗体に特異的な凝集試薬とを混合すると、凝集試薬が抗分析対象物抗体を認識し、凝集が起こるのであるが、ここに分析対象物が存在すると、この凝集が阻害されるので、この凝集の程度を光学的に測定または計数することによって、分析対象物を定量的に検出することができる。この測定方法は、様々な分析対象物に適用可能であり、広く利用できる。凝集反応において、凝集試薬の濃度は反応に大きな影響を及ぼす。

なお、イムノアッセイで用いる凝集試薬に関する先行技術文献情報として、リガンド−ポリマー複合体の製造方法が知られており、一般的によく用いられている（例えば、特開平１−１５５２７２号公報参照）。具体的には、生物学的試料中の特定の成分、特にヘモグロビンＡ１ｃを測定するために用いる凝集試薬であるリガンド−ポリマー複合体に関して公開されており、ポリアスパラギン酸などのポリマー材料上にリガンドを共有結合させるリガンド−ポリマー複合体について記載されている。図１４は、従来のリガンド−ポリマー複合体である凝集試薬のイメージ図であり、従来の凝集試薬４は、ポリペプチド（担体）５、リンカー２、リガンド３から成る。リガンド３に、リンカー２を介して、ポリペプチド（担体）５を結合させることによって製造する。

国際公開第２００６／１１２３３９号パンフレット 特開平１−１５５２７２号公報

前述したヘモグロビン誘導体を測定する方法は、免疫反応に悪影響を及ぼさない非イオン性界面活性剤と酸化剤を使用することが特徴である。この方法では、ヘモグロビンを変性した後に、まずヘモグロビン誘導体に対する抗体を標識したラテックス試薬を混合し、次に凝集多価抗原と混合させることによって、ヘモグロビン誘導体を測定することが可能である。ここで、ヘモグロビン中にヘモグロビン誘導体が存在する比率を正確に測定する為には、血液試料中の全ヘモグロビンを確実に変性した後でヘモグロビンを測定し、免疫法によるヘモグロビン誘導体の測定を行うことが必要である。とりわけ、より迅速なヘモグロビン誘導体の測定を実現する為には、最初の工程であるヘモグロビンの変性を効率良く短時間で進める必要があるが、過度にタンパク変性効果が強い試薬を使用することによって、後に続く免疫測定で使用する抗体にダメージを与えることがあってはならない。

しかしながら、前述の従来技術である国際公開第２００６／１１２３３９号パンフレット（ＷＯ２００６／１１２３３９Ａ１）に記載の方法によれば、非イオン性界面活性剤と酸化剤は、抗体へのダメージが無いものの、ヘモグロビンを変性させる工程に約３分間を要していた。これはペプシンや、イオン性界面活性剤などによる一般的なヘモグロビン誘導体の測定方法におけるヘモグロビン処理時間と比較しても、ごく平均的な時間である。しかしながら、より迅速なヘモグロビン誘導体の測定を行う為にはヘモグロビンの変性工程の時間を短縮する必要があった。

また、前記特開平１−１５５２７２号公報に記載の方法によれば、制御しうる数のリガンドとポリマー材料との結合によって生成されるリガンド−ポリマー複合体では、そのリガンド−ポリマー複合体を用いたイムノアッセイによる生物学的試料中の特定成分の測定において、反応性における感度向上や高い再現性についての技術向上がなされているものの、その測定に要される時間や、リガンド−ポリマー複合体の室温保存については考慮されていなかった。つまり、従来のリガンド−ポリマー複合体を用いたイムノアッセイでは、凝集反応速度が遅いため、測定に長い時間を要する。また、室温での保存が不安定なため、冷蔵での保存が必要となる。

本発明は、免疫反応に悪影響を与えることなく、より迅速かつ確実にヘモグロビンを変性することにより、迅速かつ正確にヘモグロビン及びヘモグロビン誘導体を測定し、ヘモグロビン中のヘモグロビン誘導体の存在する比率を測定するヘモグロビン及びヘモグロビン誘導体の測定方法、それに用いる試薬組成物、測定キット、分析デバイス、及び分析システムを提供することを目的とするものである。

また、本発明は、前記従来の課題を解決するもので、免疫反応に悪影響を与えることなく、イムノアッセイによる生物学的試料中の特定成分に対する測定時間の短縮と凝集試薬の保存安定性の向上を実現することを目的とするものである。

前記従来の課題を解決するために、本発明は免疫反応への影響を最小限に抑えつつ、迅速かつより確実なヘモグロビンの変性効果を有するものである。

特に本発明の請求項１にかかるヘモグロビンの測定方法は、血液成分を含む試料を、非イオン性界面活性剤と酸化剤と金属塩とで処理して前記試料中のヘモグロビンを変性させる工程、および前記変性されたヘモグロビンを検出する工程を含み、前記金属塩として、Ｎａ、Ｋ、Ｍｇ、Ｃａの何れかの金属を含む、ことを特徴とするものである。

また、本発明の請求項２にかかるヘモグロビン誘導体の測定方法は、血液成分を含む試料を、非イオン性界面活性剤と酸化剤と金属塩とで処理して前記試料中のヘモグロビンを変性させる工程、および前記変性されたヘモグロビンを検出する工程、および変性されたヘモグロビン誘導体の変性部位に対して特異的に結合する抗体を用いてヘモグロビン誘導体の免疫測定を行う工程を含み、
前記金属塩として、Ｎａ、Ｋ、Ｍｇ、Ｃａの何れかの金属を含む、ことを特徴とするものである。

また、本発明の請求項３にかかるヘモグロビン誘導体の測定方法は、請求項２に記載のヘモグロビン誘導体の測定方法において、前記金属塩の濃度は、ヘモグロビン誘導体の免疫測定を有意に妨害しない濃度であることを特徴とするものである。

また、本発明の請求項４にかかるヘモグロビン誘導体の測定方法は、請求項２に記載のヘモグロビン誘導体の測定方法において、前記試料に含まれるヘモグロビンを測定する工程と、前記試料に含まれるヘモグロビン誘導体の免疫測定を行う工程と、前記ヘモグロビン中のヘモグロビン誘導体が存在する比率を算出する工程とを含むことを特徴とするものである。

また、本発明の請求項５にかかるヘモグロビン誘導体の測定方法は、請求項４に記載の
ヘモグロビン誘導体の測定方法において、前記ヘモグロビン誘導体がヘモグロビンＡ１ｃ
であることを特徴とするものである。

また、本発明の請求項６にかかる試薬組成物は、血液成分を含む試料中のヘモグロビンを測定するときに試料を処理する試薬組成物であって、少なくとも、ヘモグロビンを変性させる非イオン性界面活性剤と酸化剤と金属塩とを含み、
前記金属塩として、Ｎａ、Ｋ、Ｍｇ、Ｃａの何れかの金属を含む、ことを特徴とするものである。

また、本発明の請求項７にかかる試薬組成物は、血液成分を含む試料中のヘモグロビンとヘモグロビン誘導体とを測定するときに試料を処理する試薬組成物であって、少なくとも、ヘモグロビンとヘモグロビン誘導体を変性させる非イオン性界面活性剤と酸化剤と金属塩とを含み、さらに変性されたヘモグロビン誘導体の変性部位に対して特異的に結合する抗体を含み、
前記金属塩として、Ｎａ、Ｋ、Ｍｇ、Ｃａの何れかの金属を含む、ことを特徴とするものである。

また、本発明の請求項８にかかる試薬組成物は、請求項７に記載の試薬組成物において、前記金属塩の濃度は、ヘモグロビン誘導体の免疫測定を有意に妨害しない濃度であることを特徴とするものである。

また、本発明の請求項９にかかる試薬組成物は、請求項７に記載の試薬組成物において、前記ヘモグロビン誘導体がヘモグロビンＡ１ｃであることを特徴とするものである。

また、本発明の請求項１０にかかる測定キットは、血液成分を含む試料中のヘモグロビンを測定するときに用いる測定キットであって、少なくとも、ヘモグロビンを変性させる非イオン性界面活性剤と酸化剤と金属塩とを含む試薬組成物を保持してなり、
前記金属塩として、Ｎａ、Ｋ、Ｍｇ、Ｃａの何れかの金属を含む、ことを特徴とするものである。

また、本発明の請求項１１にかかる測定キットは、血液成分を含む試料中のヘモグロビンとヘモグロビン誘導体とを測定するときに用いる測定キットであって、少なくとも、ヘモグロビンとヘモグロビン誘導体を変性させる非イオン性界面活性剤と酸化剤と金属塩とを含む試薬組成物と、前記試薬組成物により変性されたヘモグロビン誘導体の変性部位に対して特異的に結合する抗体とを保持してなり、
前記金属塩として、Ｎａ、Ｋ、Ｍｇ、Ｃａの何れかの金属を含む、ことを特徴とするものである。

また、本発明の請求項１２にかかる測定キットは、請求項１１に記載の測定キットにおいて、前記金属塩の濃度は、ヘモグロビン誘導体の免疫測定を有意に妨害しない濃度であることを特徴とするものである。

また、本発明の請求項１３にかかる測定キットは、請求項１１に記載の測定キットにおいて、前記ヘモグロビン誘導体がヘモグロビンＡ１ｃであることを特徴とするものである。

本発明によれば、非イオン性界面活性剤と酸化剤と金属塩とを使用することによって、ヘモグロビンの変性をより迅速かつ確実に行うことができる。

また、特に非イオン性界面活性剤は、ヘモグロビン誘導体を免疫法で測定する時に、免疫測定への阻害効果が少ないことが大きな特徴である。この特徴によって、例えば、イオン性界面活性剤でヘモグロビンを変性処理した時に必要とされる、変性処理溶液の希釈操作が不要になり、希釈バラツキによって、測定精度が低下する問題を排除することが可能である。また、希釈操作を必要としないので、より簡素な形態の免疫測定系を構築することが可能となる。

また、ヘモグロビンとヘモグロビン誘導体とを同時に測定することによって、ヘモグロビンに対するヘモグロビン誘導体の存在比率を算出することが可能である。

また、試薬組成物の形態は液体状、固体状、液体を乾燥した状態のいずれでもよいが、試薬組成物とヘモグロビン誘導体を含む試料液とを混合することによって、ヘモグロビン誘導体を変性し、かつ測定することが可能である。

また、ヘモグロビン誘導体の測定に必要な試薬や、採血器具、使用説明書などを詰め合わせた測定キットの形状をとることによって、専門的な知識を保有していなくとも、より簡便なヘモグロビン誘導体の測定が可能となる。

また、さらにはヘモグロビン誘導体の測定に必要な試薬を担持した分析デバイスを設計し、専用の分析装置と組み合わせた分析システムを構築することによって、手技の影響を受けにくい、簡便かつ迅速なヘモグロビン誘導体の測定が可能である。

本発明の実施の形態４における分析システムの構成を示す図 本発明の実施の形態４における、図１に示した分析システムで用いる分析デバイスの詳細な構成を示す図であり、図２（ａ）はその分解斜視図、図２（ｂ）はその分析デバイスに試薬を添加した状態を示す斜視図 本発明の実施の形態４における分析システムの別の構成を示す図 本発明の実施の形態４における、図３に示した分析システムで用いる分析デバイスの詳細な構成を示す図であり、図４（ａ）はその分解斜視図、図４（ｂ）〜（ｄ）は、分析デバイスにおける測定手順を示す図 それぞれ本発明の実施例１における、非イオン性界面活性剤と酸化剤に各種金属塩を添加することによるヘモグロビンの吸収特性の経時的な変化を示し、図５（ａ）は金属塩としてＫＣｌを添加した場合を示すもの、図５（ｂ）は金属塩としてＮａＣｌを添加した場合を示すもの、図５（ｃ）は金属塩としてＮａ_２ＳＯ_４を添加した場合を示すもの それぞれ本発明の実施例１における、非イオン性界面活性剤と酸化剤に各種金属塩を添加することによるヘモグロビンの吸収特性の経時的な変化を示し、図６（ａ）は金属塩としてＭｇＣｌ_２を添加した場合を示すもの、図６（ｂ）は金属塩としてＭｇＳＯ_４を添加した場合を示すもの、図６（ｃ）は金属塩としてＣａＣｌ_２を添加した場合を示すもの 本発明の実施例１における、ＳＬＳ−ヘモグロビン法と非イオン性界面活性剤と酸化剤と金属塩とで処理する方法におけるヘモグロビンの吸収特性との関係を示す図 本発明の実施例２における、各金属塩が免疫反応に及ぼす影響を説明する図 本発明の実施例３における分析システムと自動糖化ヘモグロビン分析計で、血液検体Ａ、Ｂを測定した結果を示す図 本発明の凝集試薬のイメージ図 凝集試薬濃度と吸光度変化の関係を示したグラフ 凝集試薬の種類による凝集速度の違いを示したグラフ 凝集試薬の種類による保存安定性の違いを示したグラフ 従来の凝集試薬のイメージ図

以下に本発明にかかるヘモグロビンあるいはヘモグロビン誘導体の測定方法を、詳細に説明する。

（実施の形態１）
本発明の実施の形態１では、血液成分を含む試料を非イオン性界面活性剤と酸化剤と金属塩とで処理し、前記試料中のヘモグロビンを変性させる工程を含む、ヘモグロビンの測定方法とヘモグロビン誘導体の測定方法について説明する。

前記ヘモグロビン（以後、「Ｈｂ」とも表記。）とは、α鎖と非α鎖（β、γ、δ鎖）のグロビンがヘムと結合し、会合して形成される四量体構造を基本とするものである。特に糖が結合したＨｂＡ１や、飲酒によるアセトアルデヒド化Ｈｂ、透析患者などで見られるカルバミル化Ｈｂなどその種類は多岐に亘る。その中でも、ヘモグロビンのβ鎖Ｎ末端に血液中のグルコースが結合したヘモグロビンＡ１ｃは、過去２〜３ヶ月間の血液中のグルコース濃度を反映する指標として、広く知られている。このように、本実施の形態１のヘモグロビン誘導体とは、前述したようなヘモグロビンの一部の領域が修飾され、構造が異なるものをいうものとする。

また、本実施の形態１のヘモグロビン誘導体を測定する際には、該ヘモグロビン誘導体のわずかに異なる領域を区別・認識して、それぞれのヘモグロビン誘導体を同定・定量する必要がある。そして、そのヘモグロビン誘導体の異なる部分、すなわちヘモグロビン誘導体の特異的な箇所をタンパク質の構造内から構造外へ出す（露出させる）ことを、本実施の形態１では“変性”といい、また、そのタンパク質の構造内から露出された部位を“変性された部位”という。

そして、本実施の形態１では、この変性処理を、非イオン性界面活性剤と酸化剤と金属塩とを用いて行う。ここで、酸化剤はヘモグロビンを酸化してメトヘモグロビンの形態に変化させる作用を持ち、非イオン性界面活性剤はメトヘモグロビンを変性させる作用を、金属塩はこれらの作用を促進する効果がある。従って、本発明によるヘモグロビンの変性とは、ヘモグロビンがメトヘモグロビンの形態に変化していることも含む。

また金属塩は、ヘモグロビン誘導体の免疫測定において、重要な役割を果たす試薬でもある。すなわち、タンパク質の立体構造や抗原抗体反応は、水素結合、静電気力、ファンデルワールス力、疎水結合に依存しており、それらを適切に機能させる為には、適切な金属塩濃度の溶媒を準備することが必要である。よって、ヘモグロビンの変性を促進する効果があり、かつ抗原抗体反応に適した金属塩濃度で、試料液を処理することが非常に重要である。

前述の非イオン性界面活性剤と酸化剤については、国際公開第２００６／１１２３３９号パンフレット（ＷＯ２００６／１１２３３９Ａ１）に記載されているものが使用可能である。また金属塩としては、Ｎａ、Ｋ、Ｍｇ、Ｃａなどの金属イオンを含有する試薬が挙げられる。これらの試薬としては、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＳＯ_４、Ｎａ_２ＳＯ_４、ＭｇＣｌ_２、ＣａＣｌ_２などが挙げられるが、アルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩などの金属塩であれば、これらに限定されない。また、ここでは、アルカリ金属塩は第１族元素、アルカリ土類金属塩は第２族元素から構成される化合物を指す。また、金属塩の濃度は、ヘモグロビン誘導体の免疫測定を有意に妨害しない濃度であるものとする。

また、本実施の形態１において、“非イオン性界面活性剤と酸化剤と金属塩とで処理”するとは、所望の変性効果を得るための条件を満たす非イオン性界面活性剤と酸化剤と金属塩とを含む溶液を調整して、ヘモグロビンを含む検体に加える、あるいは、前記所望の変性効果を得るための条件を満たす非イオン性界面活性剤と酸化剤と金属塩とを含む溶液に対して、血液検体を入れることをいう。なお、非イオン性界面活性剤と酸化剤と金属塩とを含む溶液に対して血液検体を加える場合、該非イオン性界面活性剤には、変性効果だけでなく、赤血球膜を破壊し、ヘモグロビンを溶出する（「溶血」という）効果も兼ねる。

さらに、非イオン性界面活性剤と酸化剤と金属塩とで処理する方法には、非イオン性界面活性剤と酸化剤と金属塩とからなる固形の試薬を、所望の変性効果を得るための条件を満たすように、前記ヘモグロビン誘導体を含む検体、もしくは血液検体に直接加える方法も含まれる。

なお、前記“固形の”とは、乾燥物であってもよく、乾燥方法としては、風乾、熱乾燥、真空乾燥、真空凍結乾燥等が挙げられる。

そして、前述したようにして、ヘモグロビン誘導体を含む検体あるいは血液検体を、非イオン性界面活性剤と酸化剤と金属塩とで処理して、試料中のヘモグロビンを変性させた後、５４０ｎｍ近傍の波長で全ヘモグロビンを測定し、該変性されたヘモグロビン誘導体については、変性によりヘモグロビンの構造外に出した領域を認識する抗体を用いて免疫アッセイにより測定する。これにより、試料中のヘモグロビンに対するヘモグロビン誘導体の存在比率を算出することが可能となる。

ここで、本実施の形態１におけるヘモグロビン誘導体の測定方法の大きなメリットは、免疫反応への影響を最小限におさえつつ、非イオン性界面活性剤と酸化剤と金属塩とで処理したヘモグロビン誘導体の変性部位に対する特異的な抗体を利用した免疫測定を行えることにある。すなわち、本実施の形態１では、該免疫反応への影響を最小限におさえつつ、ヘモグロビン誘導体を決める特異な領域（変性部位）を、ヘモグロビンの構造外に出すことができるので、より特異的な測定を実施でき、且つ、抗原抗体反応に伴う複合体の形成において、立体的な障害が少なくなるため、抗原抗体反応の反応効率も向上させることができる。

本実施の形態１における免疫測定とは、抗原抗体反応を基本とした測定原理であればよく、一般的に知られている、免疫比濁法、免疫比朧法、ラテックス免疫凝集法、免疫凝集阻止法、ラテックス免疫凝集阻止法、蛍光免疫測定法、化学発光免疫測定法、電気化学免疫測定法、蛍光偏光免疫測定法、免疫クロマト法のいずれであってもよい。

そして、前述したヘモグロビン誘導体においてよく測定がなされるのは、ヘモグロビンＡ１ｃであり、近年、三大成人病の一つとして問題になっている糖尿病患者を管理するための指標になるもので、１〜３ヶ月間の長期血糖コントロールの目安となるものである。

以上のように、本実施の形態１によるヘモグロビンあるいはヘモグロビン誘導体の測定方法によれば、血液成分を含む試料を、非イオン性界面活性剤と酸化剤と金属塩とで処理し、前記試料中のヘモグロビンを変性させる工程を含むようにしたので、試料中のヘモグロビンを迅速且つ確実に変性させることができる。

また、本実施の形態１では、有害性のある試薬を使用しないので、より安全なヘモグロビン誘導体の測定が可能となる。また、前記非イオン性界面活性剤と酸化剤と金属塩は、免疫反応への阻害効果が少ないため、変性処理後に免疫反応によりヘモグロビン誘導体の量を測定する際、該変性処理後の溶液に対する希釈操作が不要となり、希釈による測定精度の低下を防止できるとともに、ユーザの操作性もはるかに向上させることができる。特に、非イオン性界面活性剤と酸化剤と金属塩とからなる固形の試薬は、乾燥状態で安定な試薬であるので、分析デバイスとして使用するにも適している。

（実施の形態２）
本実施の形態２は、少なくとも非イオン性界面活性剤と酸化剤と金属塩とを含む、ヘモグロビンあるいはヘモグロビン誘導体を測定するための試薬組成物についてのものである。ここで、ヘモグロビン誘導体の一例として、実施の形態１で説明したように、ヘモグロビンＡ１ｃについて測定をするものとする。

この試薬組成物は、液体状であっても、固体の混合物であってもよく、前記液体状の試薬組成物を乾燥させたものであってもよい。この試薬組成物を、ヘモグロビンを含む試料溶液と混合するだけで、ヘモグロビンを変性させることが可能である。よって非イオン性界面活性剤と酸化剤と金属塩とを含む試薬組成物は、簡易にヘモグロビン及びヘモグロビン誘導体を測定するための最も基本的な要素になりうる。ここで、金属塩は、アルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩であるものとする。また、金属塩の濃度は、ヘモグロビン誘導体の免疫測定を有意に妨害しない濃度であるものとする。

また、非イオン性界面活性剤と酸化剤と金属塩は、液体状もしくは固体状のいずれの場合においても、混合状態もしくは個々の試薬単独で準備してもよい。少なくともヘモグロビンを測定する前にこれらの３種類の試薬が試料液に溶け込む構成であればよい。

この試薬組成物を溶液状態で使用する場合は、冷蔵するか、遮光することによって、より試薬の安定性を向上させることが可能となる。

なお、乾燥させた試薬組成物は、溶液状態の試薬組成物よりも保存性が良く、長期の保存が可能である。

試薬組成物を乾燥させる場合には、風乾、熱乾燥、真空乾燥、真空凍結乾燥などの工法をとることが可能であり、特に凍結乾燥する場合は、該試薬組成物を凍らす容器の形状によって、さまざまなデザインの試薬組成物を作製することが可能である。また、真空凍結乾燥をすれば、溶解性をより向上させることができる。

また、酸化剤としてフェリシアン化カリウムを使用する場合は、遮光すること、及び乾燥状態で保存することによって、より長期間安定な試薬組成物を作製することが可能となる。

以上のように、本実施の形態２のヘモグロビンあるいはヘモグロビン誘導体の測定方法に用いる試薬組成物によれば、少なくとも非イオン性界面活性剤と酸化剤と金属塩とを含むようにしたので、前記ヘモグロビンの変性処理を迅速且つ確実に行うことができる。

さらに、前記試薬組成物が、前記ヘモグロビン誘導体の変性された部位に対して特異的な抗体をさらに含むようにしたので、前記試薬組成物と前記試料とを混合させることでヘモグロビン誘導体を検出することができ、ユーザの操作性を向上できるという効果がある。
（実施の形態３）
本実施の形態３は、少なくとも非イオン性界面活性剤及び酸化剤と金属塩とを含む試薬組成物を保持し、該試薬組成物によりヘモグロビンとヘモグロビン誘導体を測定するための測定キットについてのものである。ここで、ヘモグロビン誘導体の一例として、実施の形態１で説明したように、ヘモグロビンＡ１ｃについて測定をするものとする。

測定キットとは、ヘモグロビンとヘモグロビン誘導体の測定に必要な試薬や部材を詰め合わせたものを示す。具体的には、ヘモグロビンとヘモグロビン誘導体の測定に必要な試薬と、使用説明書、ランセットもしくは注射器等の採血用具、採血前後に必要な消毒用品、試薬の添加に用いるディスペンサやスポイトなどの秤量器具などの部材を詰め合わせたものであり、これらの試薬及び部材を用いて、検査対象となる試料を採血して定量希釈し、該試料の変性処理等を行った後、臨床用の自動測定機、もしくは分光光度計等を使用して、簡便にヘモグロビンとヘモグロビン誘導体を測定することができるようにしたものである。

測定キットでは、ヘモグロビンの変性、さらにはその測定までの方法が手順化されているので、使用説明書に従えば専門的な知識を保有していなくとも簡便に使用することが可能である。また、前述のヘモグロビンとヘモグロビン誘導体の測定に必要な試薬とは、少なくとも非イオン性界面活性剤と酸化剤と金属塩とを含む試薬であり、これによってヘモグロビンの変性を、迅速且つ確実に行わせることができる。ここで、金属塩は、アルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩であるものとする。また、金属塩の濃度は、ヘモグロビン誘導体の免疫測定を有意に妨害しない濃度であるものとする。

さらに、前記測定キットは、ヘモグロビン誘導体に特異的な抗体を担持するものであってもよい。すなわち、ヘモグロビンを溶血・変性させる非イオン性界面活性剤と酸化剤と金属塩とを含む試薬組成物と、ヘモグロビン誘導体を検出するための、前記ヘモグロビン誘導体の変性された部位に特異的な抗体を保有する試薬、例えばラテックス凝集阻止反応を使用する場合は、ラテックス標識抗体と凝集多価抗原である凝集試薬と、から構成される測定キットが考えられる。これらの試薬類をそれぞれ容器に封入し、ヘモグロビン誘導体の溶血及び変性操作、さらには免疫アッセイ操作を手順化することによって、より簡便にヘモグロビン誘導体を測定することができる。なお、ここではラテックス凝集阻止反応を例として挙げたが、ヘモグロビンを変性し、該変性されたヘモグロビン誘導体量を、該ヘモグロビン誘導体の変性された部位に対して特異的な抗体を用いて免疫測定する方法であれば、上記に限定しない。

また、前記測定キットに保持させる前記試薬組成物と前記抗体とは、別々に保持してもよいし、該抗体を試薬組成物に含めて保持してもよい。

以上のように、本実施の形態３の測定キットによれば、試料中のヘモグロビンあるいはヘモグロビン誘導体の測定に必要な試薬の一部あるいは全てがそれぞれ容器等に封入されるようにしたので、あらかじめ定められた手順にのっとって、溶血とヘモグロビンの変性を行い、さらには変性したヘモグロビン誘導体を特異的に認識する試薬を用いて、変性したヘモグロビン誘導体量を測定することを可能としたものであり、ユーザが専門的な知識を保有していなくとも、より簡便にヘモグロビンあるいはヘモグロビン誘導体の測定を行うことができる。

（実施の形態４）
本実施の形態４は、少なくとも試料を添加する試料添加部と、非イオン性界面活性剤と酸化剤と金属塩とによって前記試料中のヘモグロビンを変性させる変性部と、該変性されたヘモグロビンを検出する検出部と、変性されたヘモグロビン誘導体の変性部位に対して特異的に結合する抗体を担持し、ヘモグロビン誘導体を検出する検出部を有する、ヘモグロビン及びヘモグロビン誘導体を測定するための分析デバイスについてのものである。ここで、ヘモグロビン誘導体の一例として、実施の形態１で説明したように、ヘモグロビンＡ１ｃについて測定をするものとする。

分析デバイスについては、該分析デバイスを評価する測定装置とセットにして、分析システムの形態をとることが可能である。この形態をとることによって、より簡便かつ迅速にヘモグロビン及びヘモグロビン誘導体の測定が可能となる。

本実施の形態４の分析デバイスは、非イオン性界面活性剤と酸化剤と金属塩とを担持すると共に、ヘモグロビン誘導体の変性された部位に特異的な試薬と凝集試薬とを担持した形態をとるものであり、さらには、それらを別々な箇所に担持した形態をとることも可能である。

ここで、金属塩は、アルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩であるものとする。また、金属塩の濃度は、ヘモグロビン誘導体の免疫測定を有意に妨害しない濃度であるものとする。

測定の順序としては、まず、血液検体と、非イオン性界面活性剤及び酸化剤と金属塩とを反応させるヘモグロビンの変性工程の後、ヘモグロビンを測定し、該変性されたヘモグロビン誘導体と、該ヘモグロビン誘導体の変性された部位に対して特異的な試薬、例えばヘモグロビン誘導体に対する特異的な抗体をラテックスに標識したラテックス標識抗体及び凝集試薬、とを反応させる工程がある。

非イオン性界面活性剤及び酸化剤と金属塩で処理した試料溶液に、前記ラテックス標識抗体と凝集試薬とを同時に反応させてもよいが、ラテックス標識抗体と反応させた後に凝集試薬と反応させる方法、もしくは凝集試薬と混合した後にラテックス試薬と反応させる方法であってもよい。

そして、このように試薬を反応させた後に、反応液の吸光度の変化を測定することによって、ヘモグロビン誘導体の量を算出する。

これによって、ヘモグロビンに対するヘモグロビン誘導体の存在比を算出することが可能である。

分析デバイスの形状としては、前述した一連の反応、及び測定が、スムーズに進められることが重要である。

分析デバイスの一例としては、例えば、遠心力と毛細管力を利用したものが考えられ、分析デバイス内に形成したチャンバー（空間）とチャンバーの間に形成した流路を通して、液体試料を自由に移送させることによって、測定の順序や試薬容量、反応時間等を制御することが可能である。そして、このような構成の分析デバイスを評価する装置の一例としては、前記分析デバイスを回転させ得る回転機構と、吸光度測定が可能な光学測定機能とを搭載したものが挙げられる。

以下、図１、図２を用いて、前述した分析デバイス及び該分析デバイスを含む分析システムの一構成例について説明する。

図１は、本発明の実施の形態４における分析システムの構成を示す図である。分析システム１００は、分析デバイス１０１と、該分析デバイス１０１に対して光源１０２から光を照射し、透過光をディテクタ１０３で検出する測定部１１０と、該分析デバイス１０１をその一部をくり抜いた箇所に固定する回転基板１０４と、該回転基板１０４を回転させるモータ１０５とを備える構成となっている。なお、図１中、モータ１０５の駆動機構や、光源１０２、ディテクタ１０３につながる回路構成については割愛する。

図２（ａ）、図２（ｂ）は、前記分析デバイス１０１の詳細な構成を示す図であり、図２（ａ）はその分解斜視図であり、図２（ｂ）は、試薬を添加した状態を示す図である。

分析デバイス１０１は、下基板２０１と、上基板２１３と、表裏両面に接着効果を保有する接着層２０２とからなり、これらを貼り合わせることにより形成される。前記下基板２０１は、透明な樹脂基板が用いられ、射出成形等によって、精度よくさまざまな形状の空間を形成している。詳述すると、前記下基板２０１には、ヘモグロビン誘導体を変性させる変性部位である希釈攪拌部２０３と、希釈液保持部２０４と、添加されたヘモグロビンの量を検出する検出部Ａ２０５と、該変性されたヘモグロビン誘導体の量を検出する検出部位である検出部Ｂ２０６とを形成するための凹部が、その上面に射出成形により成形されている。さらに、前記下基板２０１の樹脂の素材としては、光を透過する材質であればよく、一例として、ポリカーボネートやポリスチレンやアクリルなどのプラスチック樹脂が挙げられる。

また、接着層２０２には、前記希釈攪拌部２０３、希釈液保持部２０４、検出部Ａ２０５、検出部Ｂ２０６のパターン形状に加えて、それぞれを接続する流路２０７のパターン形状が切り抜かれている。さらに、前記検出部Ａ２０５、及び検出部Ｂ２０６の手前の流路２０７は、その一部を広げるように切り抜かれており、これにより、前記検出部Ａ２０５、及び検出部Ｂ２０６へ移送する液量を定量する定量部Ａ２０８、及び定量部Ｂ２０９を形成するものとする。接着層２０２の接着効果を得る材料としては、接着剤の他、加熱によって接着可能なホットメルトシートなどが使用でき、前記上基板２１３は、透明な樹脂基板から構成されている。

前記分析デバイス１０１は、前記下基板２０１と前記接着層２０２とを貼り合せた後、前記上基板２１３を貼り合わせる前に、図２（ｂ）に示すように、前記下基板２０１の希釈攪拌部２０３に、非イオン性界面活性剤と酸化剤と金属塩とからなる変性試薬２１０を、また前記下基板２０１と接着層２０２とで形成した定量チャンバーＢ２０９に、ヘモグロビン誘導体の変性された部位に対して特異的に反応することが可能なラテックス試薬２１１を、さらに前記検出部Ｂ２０６にはヘモグロビン誘導体の特異的なエピトープ構造を複数結合させた合成多価抗原よりなる凝集試薬２１２を、それぞれ担持した後、真空凍結乾燥により乾燥させ、さらにその後、前記上基板２１３を、前記接着層２０２の上面に貼り合わせる。また、前記下基板２０１、前記接着層２０２、前記上基板２１３の順に貼り合わせることにより形成される、該接着層２０２に切り抜かれた流路２０７の２つの開口部は、それぞれ、検体注入口２１５と希釈液注入口２１６となる。

次に、前記分析システム１００の動作について説明する。

試料の分析においては、例えばディスペンサ等を使用して、分析デバイス１０１の検体注入口２１５より血液を１μＬ注入すると共に、希釈液注入口２１６より、希釈液を５００μＬ注入する。これにより、血液は検体注入口２１５内側の流路内に、また希釈液は希釈液保持部２０４に保持される。

次に、前記回転基板１０４の刳り抜かれた箇所に、血液と希釈液とが注入された分析デバイス１０１をセットし、モータ１０５により所定の回転数で一定時間回転する。この回転により、希釈液と血液は前記希釈攪拌部２０３へ移送され混合されて希釈試料液となり、非イオン性界面活性剤と酸化剤と金属塩との作用により溶血し、その後ヘモグロビンの変性を引き起こす。

次に、回転基板１０４の回転を停止することによって、該試料液を毛細管現象により流路２０７を通じて、定量部Ａ２０８と定量部Ｂ２０９まで移送させる。

前記定量部Ｂ２０９に移送された試料液は、該定量部Ｂ２０９において、予め保持されていたラテックス試薬２１１と混合し、ラテックス試薬２１１と該試料液中のヘモグロビン誘導体とが結合する。

この後、再度前記回転基板１０４をモータ１０５により所定の回転数で一定時間回転すると、定量部Ａ２０８に移送された試料液は検出部Ａ２０５へ、一方、前記定量部Ｂ２０９でラテックス試薬２１１と混合された試料液は検出部Ｂ２０６へ移送される。

前記検出部Ｂ２０６に担持した凝集試薬２１２は、ヘモグロビン誘導体と結合していないラテックス試薬と結合し、ヘモグロビン誘導体の濃度に応じたラテックス凝集阻止反応が発生する。一定時間後に、検出部Ｂ２０６の透過光測定を実施することによって、ラテックス凝集阻止反応を検出する。

また同時に、検出部Ａ２０５を測定することによって、ヘモグロビンの吸収を測定し、ヘモグロビン濃度を算出できる。

前記検出部Ｂ２０６におけるラテックス凝集阻止反応の測定は、６００ｎｍ近傍の波長で測定可能であり、前記検出部Ａ２０５におけるヘモグロビンの測定は５４０ｎｍ近傍のヘモグロビン吸収を測定することで可能である。

いずれにしても、あらかじめ決まった濃度のヘモグロビンと、ヘモグロビン誘導体の測定結果を基に、検量線を作成しておけば、その検量線を利用して、ヘモグロビンとヘモグロビン誘導体の濃度をそれぞれ算出できるし、そのヘモグロビンの濃度とヘモグロビン誘導体の濃度を関連づけて、ヘモグロビン誘導体の存在比を算出することが可能である。

ここでは一例として、分析デバイス１０１がチップ状であって、遠心力と毛細管力を利用した液体移送により、測定系の順序や試薬量、反応時間等を制御する分析デバイスを有する分析システムを一例に挙げたが、測定系の順序や試薬量、反応時間が制御できる形状であれば、この構成及び方法に限定されるものではなく、液体移送については、例えば、ポンプを使用して圧力で液体移送する方法などを用いるようにしてもよい。また、前記分析デバイスは、例えば、クロマト形態でもよいし、より単純には、直方体のプラスチック製のセルの形状であっても、試薬の担持方法を工夫することによって十分使用できる。

以下、図３及び図４を用いて、より単純な構成の分析デバイス及び該分析デバイスを用いた分析システムについて説明する。

図３は、本実施の形態４における分析システムの別の構成を示す図である。分析システム３００は、該分析デバイス３０１に対して、光源３０８から光を照射し、透過光を受光部３０９で検出する測定部３１０を備える。なお、図３においては、光源３０８と受光部３０９とをつなげる回路構成、あるいは該分析デバイス３０１を前記分析システム中にセットするための構成については割愛する。

図４（ａ）〜（ｄ）は、前記分析デバイス３０１の詳細な構成を示す図であり、図４（ａ）はその分解斜視図、図４（ｂ）〜（ｄ）は前記分析デバイス３０１における、試薬の変性処理手順を示す図である。

分析デバイス３０１は、血液検体が注入される注入口３０６を備えた下部ケース３０２ｂと、該下部ケース３０２ｂの開放された底面を密閉するための溶液試薬用シール３０５と、上部ケース３０２ａと、前記注入口３０６を密閉するためのケース用シール３０７とからなり、前記上部ケース３０２ａと下部ケース３０２ｂの互いの開放された底面を接着剤で貼り合わせることにより形成される。

前記下部ケース３０２ｂは、底面が開放されたプラスチック製の直方体ケースであり、図４Ｂに示されるように、非イオン性界面活性剤と酸化剤と金属塩び凝集試薬からなる試薬に、前記ヘモグロビン誘導体の変性された部位に対して特異的な抗体が添加された試薬３０４が、溶液試薬用シール３０５にて密封されて保持されている。

前記上部ケース３０２ａは、前記下部ケース３０２ｂとほぼ同じ形状の、底面が開放されたプラスチック製の直方体ケースであり、その上端には、図４Ｂに示されるように、ヘモグロビン誘導体に特異的に反応することが可能なラテックス試薬３０３が真空凍結乾燥されて担持されている。

次に、前記分析システム３００の動作について説明する。

試料の分析においては、例えばディスペンサ等を使用して、下部ケース３０２ｂに、非イオン性界面活性剤、酸化剤、金属塩及び凝集試薬を含む試薬３０４を注入して、前記溶液試薬用シール３０５で該下部ケース３０２ｂを密閉した後、図４（ｂ）に示すように、該下部ケース３０２ｂと、前記ラテックス試薬が担持された上部ケース３０２ａとを接着剤で貼り合わせる。前記溶液試薬用シール３０５を剥がした後に、例えばディスペンサ等を使用して、前記注入口３０６より血液検体を０．５μＬ注入し、図４（ｃ）に示すように、ケース用シール３０７で前記注入口３０６を密閉する。そして前記上部ケース３０２ａの上端に担持されたラテックス試薬３０３に、前記試薬３０４がかからないよう前記血液検体と試薬３０４とを穏やかに混合して所定時間放置する。なお、ヘモグロビン濃度も算出する場合は、この時点で、前記分析デバイス３０１を図３に示すように分析システム３００中にセットし、測定部３１０によって５４０ｎｍ近傍の吸光度を測定するようにする。

次に、図４（ｄ）に示すように、前記分析デバイス３０１の下部ケース３０２ｂが上方にくるようにし、前記ラテックス試薬３０３を血液検体が添加された試薬３０４中に混合させ、所定時間放置する。

所定時間経過後、前記分析デバイス３０１を、図３に示すように、分析システム３００中にセットし、測定部３１０によって、６００ｎｍ近傍の吸光度を測定することによって、ヘモグロビン誘導体の濃度を算出する。

以上のように、本実施の形態４の分析デバイスによれば、ヘモグロビン誘導体の測定に必要な試薬を担持するようにしたので、手技の影響をうけにくい、簡便且つ迅速なヘモグロビン及びヘモグロビン誘導体の測定を行うことができる。

また、本実施の形態４の分析システムによれば、前記分析システムと、該分析デバイス専用の測定部と組みあわせるようにしたので、手技の影響をうけにくい、簡便且つ迅速なヘモグロビン及びヘモグロビン誘導体の測定を行うことができる。

（実施例１）
以下に、ヘモグロビン誘導体の代表的検査項目であるヘモグロビンＡ１ｃを測定する場合の実施例の詳細を記す。

まず、ヘモグロビンの変性とヘモグロビン濃度の測定について説明する。

精製水にて２５０倍に希釈した血液４００μＬと、０．３％スクロースモノラウレート及び０．５％フェリシアン化カリウムに対して、０〜１Ｍまでの種々の濃度のアルカリ金属塩を溶解させた変性試薬液４００μＬとを光路長１ｃｍのプラスチックセル内で攪拌し、５３５ｎｍの波長にて、ヘモグロビンの経時的な吸光度変化を観察した。その結果を図５（ａ）〜（ｃ）、図６（ａ）〜（ｃ）に示す。この結果によれば、スクロースモノラウレートとフェリシアン化カリウムのみで血液処理を行う場合と比較して、金属塩を添加することにより、明らかにヘモグロビンの吸光度が安定するまでの時間が短縮されることが明らかになった。従来の方法では、ヘモグロビンの吸収特性が安定化するまでに２分近い時間が必要であったのに対し、図５（ａ）〜（ｃ）および図６（ａ）〜（ｃ）にそれぞれ示すように、ＫＣｌ、ＮａＣｌ、Ｎａ_２ＳＯ_４、ＭｇＣｌ_２、ＭｇＳＯ_４、ＣａＣｌ_２を添加することにより、またその塩濃度が高くなるのに依存してヘモグロビンの吸収特性が安定化する時間が短縮される傾向が確認された。また、試薬の種類によって、ヘモグロビンの吸収を安定化させる時間に差があることが判明した。すなわち、図５（ａ）のＫＣｌ、図５（ｂ）のＮａＣｌ、図５（ｃ）のＮａ_２ＳＯ_４を添加した場合に示されるように、ＫとＮａの一価の金属塩が３０秒以内にヘモグロビンの吸収を安定化させるために０．２Ｍ以上の濃度を要したのに対し、図６（ａ）のＭｇＣｌ_２、図６（ｂ）のＭｇＳＯ_４、図６（ｃ）のＣａＣｌ_２を添加した場合に示されるように、Ｍｇは０．１Ｍ、Ｃａは０．０５Ｍの濃度で３０秒以内にヘモグロビンの吸収が安定化した。ＣａとＭｇは二価の金属塩であるが、一価の金属塩に対してより少ない濃度でヘモグロビンの吸収を安定化させる効果があることが判明した。

また既知のヘモグロビン濃度の検体に対して、ＳＬＳ−ヘモグロビン法である「ヘモグロビンＢ テストワコー」（和光純薬株式会社製）を使用して、５３５ｎｍで測定したヘモグロビン濃度と、０．１５％スクロースモノラウレートと０．２５％フェリシアン化カリウムと０．２Ｍ ＮａＣｌで同じ検体を処理して３０秒後に５３５ｎｍでヘモグロビンを測定した方法とを比較した結果、図７に示すように非常に良好な相関性を確認することができた。以上の結果から、スクロースモノラウレートとフェリシアン化カリウムに金属塩を加えることによって、迅速にヘモグロビンの変性が生じ、その結果ヘモグロビンの吸収特性が安定化される時間が短縮されるとともに、ＳＬＳ−ヘモグロビン法と同等の正確なヘモグロビン測定が実現可能であることが判明した。

（実施例２）
次に、金属塩がラテックス凝集反応に与える影響を確認した。

０．１５％のスクロースモノラウレートと０．２５％フェリシアン化カリウムを含むラテックス試薬溶液に、それぞれ種々の濃度のＫＣｌ、ＮａＣｌ、Ｎａ_２ＳＯ_４、ＭｇＣｌ_２、ＭｇＳＯ_４、ＣａＣｌ_２を加えた後に、凝集多価抗原からなる凝集試薬を加え、１分後の５５０ｎｍの吸光度の変化量を測定した。その結果を図８に示す。

この結果によれば、ラテックス凝集反応は金属塩の濃度が高いほど凝集反応性が高く、塩濃度が一定濃度以上になると凝集反応性が安定することが判明した。特にヘモグロビンの吸収特性が迅速に安定する各種塩濃度においては、凝集反応性が低下する傾向は確認されず、金属塩による免疫反応への悪影響は確認されなかった。以上の結果から、スクロースモノラウレートとフェリシアン化カリウムに金属塩を加えることによって、免疫測定系が阻害されることはなく、正確なヘモグロビン誘導体の測定が可能であることが判明した。

（実施例３）
以下、図３に示す分析システムを用いた、ヘモグロビン及びヘモグロビン誘導体の測定について説明する。
（ａ）分析デバイスの作製
まず、図４（ａ）に示すような底面が開放された、縦０．５ｃｍ×横０．５ｃｍ×高さ２ｃｍのプラスチック製の上部ケース３０２ａの上端に、図４（ｂ）に示すように、ヘモグロビンＡ１ｃに特異的に結合可能なラテックス試薬と５％スクロースとを含む溶液からなるラテックス試薬３０３を真空凍結乾燥により担持させる。

次に、図４（ａ）に示すような前記上部ケース３０２ａと同じ形状のプラスチック製の下部ケース３０２ｂに、図４（ｂ）に示すように、試薬３０４として、０．１５％スクロースモノラウレートと０．２５％フェリシアン化カリウムと０．１５Ｍ塩化ナトリウムからなる溶液０．２ｍＬと、凝集試薬として使用する合成多価ヘモグロビンＡ１ｃ抗原とを注入し、溶液試薬用シール３０５にて密封した後、前記上部ケース３０２ａと前記下部ケース３０２ｂとを、互いの開放された底面を合わせるように接着剤で張り合わせることで、分析デバイス３０１を形成した。

（ｂ）分析
まず、溶液試薬用シール３０５を剥がし、分析デバイス３０１の注入口３０６より０．５μＬの血液検体を注入し、図４（ｃ）に示すように、該注入口３０６にケース用シール３０７を貼ることによって、分析デバイス３０１を密閉する。

次に、前記上部ケース３０２ａに担持されたラテックス試薬３０３に、試薬３０４がかからないよう穏やかに血液検体と試薬３０４とを混合し、この状態で３０秒間放置後、図３に示すように、分析デバイス３０１を分析システム３００内にセットし、前記測定部３１０によって、５３５ｎｍの吸光度を測定する。

次に、図４（ｄ）に示すように、分析デバイス３０１を反転させて、前記上部ケース３０２ａのラテックス試薬３０３と試薬３０４とを混和させて溶かした後、図３に示すように、前記分析デバイス３０１を分析システム３００の中にセットし、前記ラテックス試薬３０３を溶かしてから１分後に、測定部３１０によって５５０ｎｍの吸光度を測定する。

測定部３１０については詳細な説明を省くが、光源３０８から分析デバイス３０１に光を照射し、透過光を受光部３０９で検出する。なお、測定部３１０の一例としては、分光光度計の機能を用いれば十分使用可能であるので、詳細な説明は割愛する。なお、ここでは、５３５ｎｍによって、シアンメトヘモグロビンを測定し、５５０ｎｍによって、ラテックス凝集を測定している。この一連の測定動作を、２種類の血液検体Ａ及びＢについて行う。

この後、前記分析システム３００を用いて、既知の濃度のヘモグロビン及びヘモグロビンＡ１ｃ溶液を利用してあらかじめ作成しておいたシアンメトヘモグロビンの検量線、及びヘモグロビンＡ１ｃのラテックス凝集阻止反応の検量線に、前述のようにして得た吸光度値を代入することによって、前記血液検体Ａ、Ｂそれぞれの、ヘモグロビン濃度及びヘモグロビンＡ１ｃ濃度を求めた。

図９は、血液検体Ａ、Ｂそれぞれの、ヘモグロビンＡ１ｃ濃度及びヘモグロビン濃度、さらにヘモグロビンＡ１ｃの存在比を示す図である。

図９に示すように、本分析システム３００にて、ヘモグロビンＡ１ｃの占める割合を測定した結果は、血液検体Ａで４．９、血液検体Ｂで１０．３であり、あらかじめ東ソー社の自動糖化ヘモグロビン分析計（ＨＬＣ−７２３ＧＨｂＶ）にて、ヘモグロビンＡ１ｃの占める割合を測定した結果の、血液検体Ａの５．０、血液検体Ｂの１０．５とそれぞれ非常に近く、本分析システム３００によって、正確なヘモグロビンＡ１ｃ濃度の測定が可能であることが確認された。

次に、本発明の凝集試薬製造方法及び凝集試薬を用いた分析対象物測定方法の実施の形態、及びその試験キット、分析デバイスについて、詳細に説明する。
（実施の形態５）
本発明の実施の形態５では、凝集試薬製造方法及び凝集試薬を用いたヘモグロビンＡ１ｃ測定方法について説明する。

Ａ．リガンドの製造
本発明のリガンドは、特異的なタンパク質を認識し、それを結合相手とする物質であれば、いかなるものであってもよい。この代表的な例として、ハプテンが挙げられる。本実施の形態５では、ヘモグロビンＡ１ｃ中のペプチド配列に対応する糖化ペプチドとして、バリン−ヒスチジン−ロイシン−トレオニン−システインの配列でアミノ酸を結合させたペプチド（以下、ＶＨＬＴＣという）を、凝集試薬のリガンドとして用いる。このリガンドを用いることによって、ヘモグロビンＡ１ｃ認識抗体に特異的に結合することができる。また、このリガンドを変えることによって、様々な抗体を特異的に認識するリガンドを作製することができる。

Ｂ．凝集試薬の製造
本発明の凝集試薬は、制御された数のリガンドを、分子量６万以上の高次構造を持つタンパク質に、官能基を有するリンカーを介して化学的に結合させたものである。また、この凝集試薬は、タンパク質１個当たり、１０個以上のリガンドが結合した複合体である。

ここで、タンパク質は、６万以上の分子量のものであれば、いかなるものであってもよい。この代表的なタンパク質の例としては、ガンマグロブリン、チログロブリン、アルブミンなどのグロブリン様タンパクがあげられるが、これらのタンパク質に限定されるものではない。より望ましくは、６万〜３０万程度の分子量のものがよい。

ここで、タンパク質として、６万以上の分子量のものが好ましい理由は、以下の通りである。すなわち、分子量が６万より小さいタンパク質は、リンカーが化学結合する部位であるアミノ基の数が少ない為、１０個以上のリガンドが結合することができず、水懸濁性粒子の凝集反応性が低下するという欠点がある。これに対して、分子量が６万以上のタンパク質は、リンカーが化学結合する部位であるアミノ基の数が多い為、１０個以上のリガンドが結合することができ、その結果として、水懸濁性粒子の凝集反応性が高いという利点があるからである。

官能基を有するリンカーの長さは、１５Å以下であることが望ましい。リンカーは、官能基を有するものであれば、いかなる所望のものであってもよく、直鎖構造あるいは平面構造を有するものであってもよい。代表的なリンカーの例としては、Ｎ−（６−Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｃａｐｒｏｙｌｏｘｙ）ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ （以下ＥＭＣＳという）、Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−ｔｒａｎｓ−４−（Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｙｌｍｅｔｈｙｌ）ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−１−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ （以下ＳＭＣＣという）、Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙ（４−ｉｏｄｏａｃｅｔｙｌ）ａｍｉｎｏｂｅｎｚｏａｔｅ （以下ＳＩＡＢという）などが用いられる。

図１０は、本発明の実施の形態５における凝集試薬のイメージ図である。

図１０において、本発明の凝集試薬４は、分子量６万以上のタンパク質（担体）１、官能基を有するリンカー２、ＶＨＬＴＣ（リガンド）３からなる。この凝集試薬４は、リガンド（ＶＨＬＴＣ）３を、官能基を有するリンカー２を介して、タンパク質（担体）１に結合させることによって製造される。このとき、担体１個当たり、２０個程度のリガンド３を結合させておく。このリガンド３が特異的な抗体を認識し、抗体と結合する。１つの凝集試薬の２つ以上のリガンド３に抗体が結合すると、これらの抗体同士が凝集試薬を介して結合し、次々に凝集していく。

このようにして製造されたリガンド−タンパク質複合体は、イムノアッセイにおける凝集試薬として用いられる。

Ｃ．ラテックス標識抗体の製造
ポリスチレンラテックス粒子に、抗ｈｕｍａｎ ＨｂＡ１ｃ抗体を過剰量加えて結合させ、さらに、ウシ血清アルブミン（以下ＢＳＡという）でブロッキングすることにより、ラテックス標識抗体を作製する。この抗ｈｕｍａｎ ＨｂＡ１ｃ抗体が、試験試料中のヘモグロビンＡ１ｃ及び凝集試薬のリガンド（ＶＨＬＴＣ）３を認識し、結合する。また、この抗体を変えることによって、様々な試験試料中の成分及び凝集試薬を認識するラテックス標識抗体を作製することができる。

Ｄ．ラテックス免疫凝集阻止法を用いた被検試料中の分析対象物の測定
血液検体中のヘモグロビン及びヘモグロビンＡ１ｃを測定する為に、まず血液検体を希釈し、非イオン性界面活性剤と酸化剤とを含む変性試薬を用いて、希釈された血液検体と混合させ、血液検体中のヘモグロビンをメト化及び変性させる。このようにヘモグロビンをメト化することによって、ヘモグロビンを５４０ｎｍ付近の吸光度で測定することが可能となる。その後、前記希釈及び変性させた検体について、５４０ｎｍ近傍の波長で吸光度を測定し、全ヘモグロビン量をメトヘモグロビン法を用いて算出する。ただし、ＳＬＳヘモグロビン法などの、その他のヘモグロビン測定法を用いてもよい。

次に、ヘモグロビンＡ１ｃ測定の為に、変性させた検体を抗ｈｕｍａｎ ＨｂＡ１ｃ抗体を標識したラテックス標識抗体に加える。ここで、このラテックスに標識された抗ｈｕｍａｎ ＨｂＡ１ｃ抗体と、血液検体中のヘモグロビンＡ１ｃの変性された部位の間で抗原抗体反応が起こる。その後、ラテックス標識抗体と反応した検体に、凝集試薬を加えると、血液検体中のヘモグロビンＡ１ｃが結合していない、残りの抗ｈｕｍａｎ ＨｂＡ１ｃ抗体に凝集試薬が結合する。その結果、凝集試薬が結合した部分で次々に凝集反応が起こり、凝集塊ができる。反応液中に発生する凝集塊の量は、ヘモグロビンＡ１ｃの濃度に反して発生するのであるが、この反応をラテックス免疫凝集阻止反応という。

次に、一定時間後に、この反応液中に発生した凝集塊による濁度を光学的測定によって検出するために、測定部の吸光度（Ａ）を測定する。また、凝集試薬を加える前に、あらかじめ、測定部のブランク吸光度（Ａ１）も測定する。これらの吸光度の差（Ａ−Ａ１）により、吸光度変化を算出する。

吸光度変化＝Ａ−Ａ１
この吸光度変化より、血液検体中のヘモグロビンＡ１ｃ量を算出する。

これらの結果より、血液検体中のヘモグロビンに対するヘモグロビンＡ１ｃの量、つまり存在比率の検出が可能となる。

このような本実施の形態５の凝集試薬によれば、制御された数のリガンドを、分子量６万以上の高次構造を持つタンパク質に、官能基を有するリンカーを介して化学的に結合させることにより製造したので、タンパク質の高次構造により、水懸濁性粒子に結合している抗分析対象物抗体間の凝集反応速度を速めることができ、凝集制御イムノアッセイの測定時間を短縮することが可能となる。さらに、凝集試薬の保存安定性を向上させ、室温での保存が可能となるので、冷蔵での保存が不要となる。

（実施の形態６）
本発明の実施の形態６では、少なくとも凝集試薬及びラテックス標識抗体及び変性試薬を保持し、これらの試薬によりヘモグロビンとヘモグロビンＡ１ｃを測定するための試験キットについて説明する。

試験キットとは、ヘモグロビンとヘモグロビンＡ１ｃの測定に必要な試薬や部材を詰め合わせたものを示す。具体的には、ヘモグロビンとヘモグロビンＡ１ｃの測定に必要な試薬と、使用説明書、ランセットもしくは注射器等の採血用具、採血前後に必要な消毒用品、試薬の添加に用いるディスペンサやスポイト等の秤量器具などの部材を詰め合わせたものであり、これらの試薬及び部材を用いて、検査対象となる試料を採血して定量・希釈・変性等を行った後、臨床用の自動測定機、もしくは分光光度計等を使用して、簡便にヘモグロビンとヘモグロビンＡ１ｃを測定することができるようにしたものである。

試験キットでは、採血から測定までの方法が手順化されているので、使用説明書に従えば専門的な知識を保有していなくとも簡便に使用することが可能である。また、前述のヘモグロビンとヘモグロビンＡ１ｃの測定に必要な試薬とは、少なくとも凝集試薬及びラテックス標識抗体及び変性試薬を含む試薬であり、これによってヘモグロビンＡ１ｃの測定を迅速且つ確実に行うことができる。

また、前記試験キットに保持させる前記ラテックス標識抗体と前記変性試薬とは、別々に保持してもよいし、該変性試薬をラテックス標識抗体に含めて保持してもよい。

以上のように、本実施の形態６の試験キットによれば、試料中のヘモグロビンＡ１ｃの測定に必要な試薬の全てがそれぞれ容器等に封入されて備えるようにしたので、使用者はあらかじめ定められた手順にしたがって、ヘモグロビン及びヘモグロビンＡ１ｃの測定を容易に行うことができる。

（実施の形態７）
本発明の実施の形態７では、少なくとも、分析試料を注入する注入口と、希釈液を保持する希釈液収容室と、注入された分析試料を希釈・変性させる希釈・変性室と、該希釈・変性されたヘモグロビンを検出するヘモグロビン測定室と、該希釈・変性された分析試料をラテックス標識抗体と反応させるラテックス反応室と、前記ラテックス標識抗体と反応した分析試料を凝集試薬と反応させる凝集室及び分析試料中の分析対象物を測定する測定室とから構成されるヘモグロビン及びヘモグロビンＡ１ｃを測定するための分析デバイスについて説明する。

分析デバイスについては、該分析デバイスを評価する測定装置とセットにして、分析システムの形態をとることが可能である。この形態をとることによって、より簡便かつ迅速にヘモグロビンＡ１ｃの測定が可能となる。

本実施の形態７の分析デバイスは、凝集試薬及びラテックス標識抗体及び変性試薬を別々な箇所に担持したものである。

以下に、本実施の形態７の分析デバイスの測定方法について説明する。

まず、血液検体と、変性試薬とを混合し、血液検体の希釈・変性を行い、その後、前記希釈及び変性させた血液検体について、所定の波長の光を照射して、全ヘモグロビンを測定する。次に、希釈・変性した血液検体とラテックス標識抗体とを混合し、抗原抗体反応を行い、測定部のブランク吸光度の測定を行う。その後、これらの混合溶液を凝集試薬と混合し、抗分析対象物抗体同士を凝集させ、その凝集により生じた凝集塊の吸光度を測定する。これらの測定によって、実施例の形態５に記載した式を用いて、ヘモグロビンＡ１ｃを算出する。これらのヘモグロビンとヘモグロビンＡ１ｃの測定によって、試料中のヘモグロビンに対するヘモグロビンＡ１ｃの量、つまり存在比率を算出することにより濃度検出が可能となる。

なお、血液検体の希釈・変性を行うと同時にラテックス標識抗体と抗原抗体反応をすることも可能である。

これらの分析デバイスの形状としては、前述した一連の反応、及び測定が、スムーズに進められることが重要である。

分析デバイスの一例としては、例えば、遠心力と毛細管力を利用したものが考えられ、分析デバイス内に形成した複数のチャンバー（空間）と該チャンバー間に形成した流路を通して、液体試料を自由に移送させることによって、測定の順序や試薬容量、反応時間等を制御することが可能である。そして、このような構成の分析デバイスを評価する装置の一例としては、前記分析デバイスを回転させ得る回転機構と、吸光度測定が可能な光学測定機能とを搭載したものが挙げられる。

以下、図１、図２を用いて、前述した分析デバイス及び該分析デバイスを含む分析システムの一構成例について説明する。

図１は、分析システムの構成を示す図である。分析システム１００は、分析デバイス１０１と、該分析デバイス１０１に対して光源１０２から光を照射し、透過光をディテクタ１０３で検出する測定部１１０と、該分析デバイス１０１をその一部を刳り抜いた箇所に固定する回転基板１０４と、該回転基板１０４を回転させるモータ１０５とを備える構成となっている。なお、図１において、モータ１０５の駆動機構や、光源１０２、ディテクタ１０３につながる回路構成については割愛する。

図２は、前記分析デバイスの詳細な構成を示す図であり、図２（ａ）はその分解斜視図であり、図２（ｂ）は、試薬を添加した状態を示す図である。

分析デバイス１０１は、下部基板２０１と、上部基板２１３とを、表裏両面に接着効果を保有する接着層２０２で貼り合わせることにより形成されたものである。基板の材料としては、透明な樹脂基板が用いられ、射出成形等によって、精度よくさまざまな形状の空間を形成している。詳述すると、前記下基板２０１には、検体を希釈・変性させる部位である希釈・変性室２０３と、希釈液収容室２０４と、検体中のヘモグロビンを検出する検出部Ａ２０５と、ヘモグロビンＡ１ｃを検出する検出部Ｂ２０６とを形成するための凹部が、その上面に射出成形により成形されている。なお、前記上部基板２１３及び前記下部基板２０１の樹脂の素材としては、ポリカーボネートやポリスチレンやアクリルなどのプラスチック樹脂など、光を透過する材質であれば、特にこれに制限されない。

また、接着層２０２には、前記希釈・変性室２０３、希釈液収容室２０４、検出部Ａ２０５、検出部Ｂ２０６のパターン形状に加えて、それぞれを接続する流路２０７のパターン形状が切り抜かれている。さらに、前記検出部Ａ２０５、及び検出部Ｂ２０６の手前の流路２０７は、その一部を広げるように切り抜かれており、これにより、前記検出部Ａ２０５、及び検出部Ｂ２０６へ移送する液量を定量する定量部Ａ２０８、及び定量部Ｂ２０９を形成するものとする。接着層２０２の接着効果を得る材料としては、接着剤の他、加熱によって接着可能なホットメルトシートなどが使用できる。

前記分析デバイス１０１は、前記下部基板２０１と前記接着層２０２とを貼り合わせた後、前記上部基板２１３を貼り合わせる前に、図２（ｂ）に示すように、前記下部基板２０１の希釈・変性室２０３に、変性試薬２１０を、また前記下部基板２０１と接着層２０２で形成した定量チャンバーＢ２０９に、ラテックス標識抗体２１１を、さらに前記検出部Ｂ２０６には凝集試薬２１２を、それぞれ担持した後、乾燥させ、さらにその後、前記上部基板２１３を、前記接着層２０２の上面に貼り合わすことによって、形成される。また、前記上部基板２１３と前記接着層２０２と前記下部基板２０１とを貼り合わせることにより形成される、該接着層２０２に切り抜かれた流路２０７の２つの開口部は、それぞれ、検体注入口２１５と希釈液注入口２１６となる。

以下に、分析システム１００の動作について説明する。

試料の分析においては、例えばディスペンサ等を使用して、分析デバイス１０１の検体注入口２１５より血液を１μＬ注入すると共に、希釈液注入口２１６より、希釈液を５００μＬ注入する。これにより、血液は検体注入口２１５内側の流路内に、また希釈液は希釈液収容室２０４に保持される。

次に、前記回転基板１０４の刳り抜かれた箇所に、血液と希釈液とが注入された分析デバイス１０１をセットし、モータ１０５により所定の回転数で一定時間回転する。この回転により、希釈液と血液とは前記希釈・変性室２０３へ移送され混合されて希釈試料液となり、変性試薬により、ヘモグロビンのメト化及び変性を行う。

次に、回転基板１０４の回転を停止することによって、メト化及び変性された該試料液を毛細管現象により、流路２０７を通じて、定量部Ａ２０８と定量部Ｂ２０９に移送させる。

前記定量部Ｂ２０９に移送されたメト化及び変性された試料液は、該定量部Ｂ２０９において、予め保持されていたラテックス試薬２１１と混合し、ラテックス試薬２１１と該試料液中のヘモグロビンＡ１ｃとが結合する。

この後、再度前記回転基板１０４をモータ１０５により所定の回転数で一定時間回転すると、定量部Ａ２０８に移送されたメト化及び変性された試料液は検出部Ａ２０５へ、一方、前記定量部Ｂ２０９でラテックス試薬２１１と混合された試料液は検出部Ｂ２０６へ移送される。

前記検出部Ｂ２０６に担持した凝集試薬２１２は、ヘモグロビンＡ１ｃと結合していないラテックス試薬と結合し、ヘモグロビンＡ１ｃの濃度に応じたラテックス凝集阻止反応が発生する。一定時間後に、検出部Ｂ２０６の透過光測定を実施することによって、ラテックス凝集阻止反応を検出する。

また同時に、検出部Ａ２０５を測定することによって、ヘモグロビンの吸収を測定し、ヘモグロビン濃度を算出できる。

前記検出部Ｂ２０６におけるラテックス凝集阻止反応の測定は、６００ｎｍ近傍の波長で測定可能であり、前記検出部Ａ２０５におけるヘモグロビンの測定は５４０ｎｍ近傍のヘモグロビン吸収を測定する方法が可能である。

いずれにしても、あらかじめ決まった濃度のヘモグロビンと、ヘモグロビンＡ１ｃの測定結果を基に、検量線を作成しておけば、その検量線を利用して、ヘモグロビンとヘモグロビンＡ１ｃの濃度をそれぞれ算出でき、それらの濃度より、ヘモグロビンＡ１ｃの存在比を算出することが可能である。

ここでは一例として、分析デバイス１０１がチップ状で、遠心力と毛細管力を利用した液体移送により、測定系の順序や試薬量、反応時間等を制御する分析システムを一例に挙げたが、測定系の順序や試薬量、反応時間が制御できる形状であれば、この構成及び方法に限定されるものではなく、液体移送については、例えば、ポンプを使用して圧力で液体移送する方法なども十分可能である。また、前記分析デバイスは、例えば、クロマトグラフィーを利用した形態でもよいし、より単純には、直方体のプラスチック製のセルの形状であっても、試薬の担持方法を工夫することによって十分使用できる。

以上のように、本実施の形態７によれば、ヘモグロビンＡ１ｃの測定に必要な試薬を担持した分析デバイスを設計すると共に、該分析デバイス専用の測定部と組みあわせた分析システムを構築するようにしたので、手技の影響をうけにくい、簡便且つ迅速なヘモグロビンＡ１ｃの測定を行うことができる。

（実施例４）
以下に、凝集試薬の製造方法及びラテックス標識抗体の製造方法についての実施例の詳細を記す。

凝集試薬の製造方法としては、担体としてチキンガンマグロブリン（以下、ＣＧＧという）、リンカーとしてＥＭＣＳ、リガンドとしてＶＨＬＴＣを用いた。ＥＭＣＳのＮ末端とＶＨＬＴＣのシステインを結合し、さらに、ＥＭＣＳのＣ末端とＣＧＧのアミノ基を結合させることにより、凝集試薬を製造した。このとき、ＣＧＧ１個当たり、２０個程度のＶＨＬＴＣを結合した。

また、ラテックス標識抗体の製造方法としては、平均粒径０．１２μｍのポリスチレンラテックス粒子（積水化学社製）に抗ｈｕｍａｎ ＨｂＡ１ｃ抗体を過剰量加え、物理吸着によって結合した。該ラテックス粒子抗体複合体に０．５％のウシ血清アルブミン（以下、ＢＳＡという）を加えてブロッキングし、ラテックス標識抗体を作製した。なお、ラテックスの粒径はこれに限らず、０．０５μｍ〜１．０μｍのものであればいずれでもよい。

（実施例５）
以下に、第２の凝集試薬の製造方法についての実施例の詳細を記す。

凝集試薬の製造方法としては、担体としてＩｇＹ（ＣＧＧの主成分である免疫グロブリンＧのみを精製したもの）、リンカーとしてＥＭＣＳ、リガンドとしてＶＨＬＴＣを用いた。ＥＭＣＳのＮ末端とＶＨＬＴＣのシステインを結合し、さらに、ＥＭＣＳのＣ末端とＩｇＹのアミノ基を結合させることにより、凝集試薬を製造した。このとき、ＩｇＹ１個当たり、２０個程度のＶＨＬＴＣを結合した。この凝集試薬は担体としてＣＧＧを用いた場合と比べ、担体のロット間差が小さいため、ロット間差の小さい凝集試薬を製造することが可能となる。

（実施例６）
以下に、ラテックス免疫凝集阻止法を用いた被検試料中の分析対象物の測定方法についての実施例の詳細を記す。

まず、精製水にて２５０倍希釈した血液４００μＬと、０．３％スクロースモノラウレート及び０．５％フェリシアン化カリウムからなる変性試薬４００μＬとを混合し、血液中のヘモグロビンをメト化及び変性させた。なお、ヘモグロビンのメト化及び変性させる工程で用いる試薬はこれらに限らず、非イオン性界面活性剤と酸化剤が含まれていれば、いかなるものでもよい。前記希釈及び変性させた血液について５３５ｎｍの波長で吸光度を測定し、全ヘモグロビン濃度を算出した。

次に、ヘモグロビンＡ１ｃ測定の為に、前記希釈・変性血液を真空凍結乾燥した実施例１のラテックス標識抗体に加え、抗原抗体反応をさせた。これを真空凍結乾燥した本発明の凝集試薬に加え、３７℃で凝集反応させた。なお、ラテックス標識抗体及び凝集試薬について、真空凍結乾燥を用いたが、乾燥物を作るものであればいかなる工法でもよく、風乾、熱乾燥、真空乾燥などの方法を用いることもできる。また、本発明の凝集試薬は免疫反応を妨害するような性質はなく、抗原抗体反応において従来の凝集試薬と根本的な変わりはない。

この凝集塊による濁度を光学的測定によって検出するために、６２５ｎｍの波長で吸光度（Ａ）を測定した。また、凝集試薬を加える前の６２５ｎｍの波長での吸光度（Ａ１）も測定した。これらの吸光度の差により、吸光度変化（Ａ−Ａ１）を算出した。

あらかじめ決まった濃度のヘモグロビンと、ヘモグロビンＡ１ｃの測定結果を基に、作成しておいた検量線を利用して、ヘモグロビンとヘモグロビンＡ１ｃの濃度をそれぞれ算出し、それらの濃度より、ヘモグロビンＡ１ｃの存在比を算出した。

（比較例）
担体としてＣＧＧ、リンカーとしてＥＭＣＳ、リガンドとしてＶＨＬＴＣとで構成された本発明の凝集試薬と、担体としてポリリジン、リンカーとしてＥＭＣＳ、リガンドとしてＶＨＬＴＣとで構成された従来の凝集試薬とを用い、それぞれ比較実験を行った。

（ａ）凝集試薬の濃度と吸光度変化との関係
図１１は、ラテックス標識抗体と凝集試薬とのラテックス凝集反応において、測定された吸光度変化と添加した凝集試薬の濃度との関係を示している。横軸は凝集試薬の濃度、縦軸は凝集試薬を加えてから１分後の吸光度変化である。図１１によれば、従来の凝集試薬と本発明の凝集試薬とも、凝集試薬の濃度が高くなるにしたがって、凝集物が増加していき、吸光度の測定値が高くなっていくが、凝集試薬の濃度があるレベルを超えた場合、つまり吸光度変化の最大値を越えると、反応液中の抗原が過多の状態になるため、凝集形成が抑制され、見かけ上の吸光度の測定値が逆に低くなる。例えば、従来の凝集試薬では、１μｇ／ｍＬ以上の濃度範囲、また、本発明の凝集試薬では、５μｇ／ｍＬ以上の濃度範囲が、吸光度の測定値が低くなる領域となり、一般に、この領域をプロゾーン領域と呼び、また、この現象はプロゾーン現象と称される。この濃度域の凝集試薬を用いることによって、凝集試薬の濃度変動の反応性への影響を小さくすることができる。また、凝集試薬が過多となるため、凝集反応速度を速くすることができる。この結果より、本発明の凝集試薬のほうが、ダイナミックレンジが大きいことが判明した。ダイナミックレンジが大きいことによって、検量線の傾きが大きくなり、測定精度がよくなる。

また、この時用いた凝集試薬の担体あたりのリガンド量は、本発明の凝集試薬（ＣＧＧ）で０．１１μｍｏｌ／ｍｇ、従来の凝集試薬（ｐｏｌｙ−Ｌｙｓ）で０．９６μｍｏｌ／ｍｇであった。
（ｂ）各プロゾーン領域の凝集試薬濃度における、凝集反応完了率と経時変化との関係
図１２は、各プロゾーン領域の濃度の凝集試薬を用いたラテックス凝集阻止反応において、凝集反応完了率の経時変化を示している。横軸は凝集試薬を加えてからの時間、縦軸は凝集試薬を加えて１７０秒後を１００％凝集したと仮定した場合の凝集反応完了率である。図１２に示すように、本発明の凝集試薬を用いた場合では、１７０秒後において吸光度が安定してきているが、従来の凝集試薬を用いた場合では、グラフの傾きからわかるように、１７０秒後においてもまだ反応が進み、吸光度が上昇している。１７０秒後を１００％凝集したと仮定しても、明らかに、本発明の凝集試薬の方が、凝集速度が速く、凝集反応完了率が高いことがわかる。これは、例えば、凝集開始から６０秒後において比較すると、従来の凝集試薬では、６０％凝集反応が完了しているのに対し、本発明の凝集試薬では７５％凝集反応が完了している。

この結果より、本発明の凝集試薬を用いた方が、凝集反応速度が速く、短時間で反応が完了することが分かる。本発明の凝集試薬を用いたアッセイでは、凝集反応開始から３分以内に反応が完了している。一方、従来の凝集試薬では、同程度の凝集反応が完了する為には、約２倍の時間が必要である。

（ｃ）凝集試薬の保存安定性
図１３は、凝集試薬の保存安定性を示している。凝集試薬を真空凍結乾燥し、４０℃環境下で保存した。この凝集試薬を用いて、ラテックス凝集阻止反応を行い、分光器を用いて吸光度を測定し、反応前との吸光度の差より、凝集試薬の反応性を確認した。横軸は保存日数、縦軸は凝集反応測定時のレファレンスとの吸光度変化比である。なお、レファレンスとして、−８０℃に凍結保存した凝集試薬を用いた。図１３に示すように、従来凝集試薬では、３ヶ月保存後の吸光度変化がレファレンスの半分程度の吸光度変化しか示さないが、本発明の凝集試薬では、３ヶ月保存後もレファレンスと同程度の吸光度変化を示し、反応性が安定している傾向があることがわかる。

この結果より、従来の凝集試薬では４０℃、１ヶ月経過時点での反応性の低下が見られるのと比較して、本発明の凝集試薬では４０℃、３ヶ月経過時点においても、保存が安定であり、明らかに保存安定性がアップしていることが判明した。

なお、本実験は日立製分光器（Ｕ２８００）にて行った。

本発明によれば、迅速かつ確実に試料液中のヘモグロビンを変性させることができるので、迅速かつ正確なヘモグロビン及びヘモグロビン誘導体の測定が可能となる。

また、本発明によれば、凝集反応の時間を短縮することができるので、迅速かつ正確な測定が可能となるとともに、凝集試薬の保存安定性がアップする為、室温での保存が可能となる。室温での保存の実現により、イムノアッセイを利用した試料分析片の取り扱いが簡便になる。

Claims (13)

1. 血液成分を含む試料を、非イオン性界面活性剤と酸化剤と金属塩とで処理して前記試料中のヘモグロビンを変性させる工程、および前記変性されたヘモグロビンを検出する工程を含み、
   前記金属塩として、Ｎａ、Ｋ、Ｍｇ、Ｃａの何れかの金属を含む、
   ことを特徴とするヘモグロビンの測定方法。
2. 血液成分を含む試料を、非イオン性界面活性剤と酸化剤と金属塩とで処理して前記試料中のヘモグロビンを変性させる工程、および前記変性されたヘモグロビンを検出する工程、および変性されたヘモグロビン誘導体の変性部位に対して特異的に結合する抗体を用いてヘモグロビン誘導体の免疫測定を行う工程を含み、
   前記金属塩として、Ｎａ、Ｋ、Ｍｇ、Ｃａの何れかの金属を含む、
   ことを特徴とするヘモグロビン誘導体の測定方法。
3. 前記金属塩の濃度は、ヘモグロビン誘導体の免疫測定を有意に妨害しない濃度である、ことを特徴とする請求項２に記載のヘモグロビン誘導体の測定方法。
4. 前記試料に含まれるヘモグロビンを測定する工程と、前記試料に含まれるヘモグロビン誘導体の免疫測定を行う工程と、前記ヘモグロビン中のヘモグロビン誘導体が存在する比率を算出する工程とを含む、ことを特徴とする請求項２に記載のヘモグロビン誘導体の測定方法。
5. 前記ヘモグロビン誘導体がヘモグロビンＡ１ｃである、ことを特徴とする請求項４に記載のヘモグロビン誘導体の測定方法。
6. 血液成分を含む試料中のヘモグロビンを測定するときに試料を処理する試薬組成物であって、少なくとも、ヘモグロビンを変性させる非イオン性界面活性剤と酸化剤と金属塩とを含み、
   前記金属塩として、Ｎａ、Ｋ、Ｍｇ、Ｃａの何れかの金属を含む、
   ことを特徴とする試薬組成物。
7. 血液成分を含む試料中のヘモグロビンとヘモグロビン誘導体とを測定するときに試料を処理する試薬組成物であって、少なくとも、ヘモグロビンとヘモグロビン誘導体を変性させる非イオン性界面活性剤と酸化剤と金属塩とを含み、さらに変性されたヘモグロビン誘導体の変性部位に対して特異的に結合する抗体を含み、
   前記金属塩として、Ｎａ、Ｋ、Ｍｇ、Ｃａの何れかの金属を含む、
   ことを特徴とする試薬組成物。
8. 前記金属塩の濃度は、ヘモグロビン誘導体の免疫測定を有意に妨害しない濃度である、ことを特徴とする請求項７に記載の試薬組成物。
9. 前記ヘモグロビン誘導体がヘモグロビンＡ１ｃである、ことを特徴とする請求項７に記載の試薬組成物。
10. 血液成分を含む試料中のヘモグロビンを測定するときに用いる測定キットであって、少なくとも、ヘモグロビンを変性させる非イオン性界面活性剤と酸化剤と金属塩とを含む試薬組成物を保持してなり、
    前記金属塩として、Ｎａ、Ｋ、Ｍｇ、Ｃａの何れかの金属を含む、
    ことを特徴とする測定キット。
11. 血液成分を含む試料中のヘモグロビンとヘモグロビン誘導体とを測定するときに用いる測定キットであって、少なくとも、ヘモグロビンとヘモグロビン誘導体を変性させる非イオン性界面活性剤と酸化剤と金属塩とを含む試薬組成物と、前記試薬組成物により変性されたヘモグロビン誘導体の変性部位に対して特異的に結合する抗体とを保持してなり、
    前記金属塩として、Ｎａ、Ｋ、Ｍｇ、Ｃａの何れかの金属を含む、
    ことを特徴とする測定キット。
12. 前記金属塩の濃度は、ヘモグロビン誘導体の免疫測定を有意に妨害しない濃度である、ことを特徴とする請求項１１に記載の測定キット。
13. 前記ヘモグロビン誘導体がヘモグロビンＡ１ｃである、ことを特徴とする請求項１１に記載の測定キット。

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