JP2013076713A - 凝集試薬の製造方法、それによって生成される凝集試薬または生成物、およびそれを用いた分析対象物測定方法、ならびに試験キットおよび分析デバイス - Google Patents

Abstract

【課題】免疫反応に悪影響を与えることなく、イムノアッセイによる生物学的試料中の特定成分に対する測定時間の短縮と凝集試薬の保存安定性の向上を実現する。
【解決手段】制御された数のリガンド３を、分子量６万以上の高次構造を持つタンパク質１に、化学的に結合させる凝集試薬の製造方法であって、前記リガンド３を、官能基を有するリンカー２を介して、前記タンパク質１に結合させる。
【選択図】図１

Description

本発明は、タンパク質に生物学的物質を結合させる方法に関するものである。得られるリガンド−タンパク質複合体は、イムノアッセイにおける凝集試薬として有用である。

近年、臨床検査において、各種疾病の進行度合いを検査するために、様々な検査方法が利用されてきており、血液等の生物学的試料と分析試薬とを反応させ、生物学的試料中の様々な成分を定量可能な大型の自動分析装置が実用化されており、医療分野においては無くてはならない存在となっている。そのような背景の中、近年市場からは、低コスト、試料液の少量化、短時間測定、装置の小型化、多項目同時測定など、より高精度で、より運用の自由度が高い分析装置や分析方法の登場が望まれている。

運用の自由度が高い分析装置や分析方法の一つとして、抗原抗体反応を基本とした測定原理が一般的に知られており、免疫比濁法、免疫比朧法、ラテックス免疫凝集法、免疫凝集阻止法、ラテックス免疫凝集阻止法、蛍光免疫測定法、化学発光免疫測定法、電気化学免疫測定法、蛍光偏光免疫測定法、免疫クロマト法などのイムノアッセイがある。

粒子凝集反応に基づくイムノアッセイにおいて、生物学的試料中の特定の成分に対する定性的または定量的な測定は、遊離状態の抗分析対象物抗体または、水懸濁性粒子に結合している抗分析対象物抗体の凝集の有無及びその程度によって決められる。この水懸濁性粒子として最も一般的に使用されているのはラテックス粒子と呼ばれるものである。

粒子凝集反応に基づくイムノアッセイのうち、免疫学的粒子凝集阻止反応を利用する測定方法が知られている。抗分析対象物抗体とこの抗体に特異的な凝集試薬とを混合すると、凝集試薬が抗分析対象物抗体を認識し、凝集が起こるのであるが、ここに分析対象物が存在すると、この凝集が阻害されるので、この凝集の程度を光学的に測定または計数することによって、分析対象物を定量的に検出することができる。この測定方法は、様々な分析対象物に適用可能であり、広く利用できる。凝集反応において、凝集試薬の濃度は反応に大きな影響を及ぼす。

なお、イムノアッセイで用いる凝集試薬に関する先行技術文献情報として、リガンド−ポリマー複合体の製造方法が知られており、一般的によく用いられている（例えば、特許文献１参照）。具体的には、生物学的試料中の特定の成分、特にヘモグロビンＡ１ｃを測定するために用いる凝集試薬であるリガンド−ポリマー複合体に関して公開されており、ポリアスパラギン酸などのポリマー材料上にリガンドを共有結合させるリガンド−ポリマー複合体について記載されている。図７は、従来のリガンド−ポリマー複合体である凝集試薬のイメージ図であり、従来の凝集試薬４は、ポリペプチド（担体）５、リンカー２、リガンド３から成る。リガンド３に、リンカー２を介して、ポリペプチド（担体）５を結合させることによって製造する。

特開平１−１５５２７２号公報

しかしながら、前記特許文献１に記載の方法によれば、制御しうる数のリガンドとポリマー材料との結合によって生成されるリガンド−ポリマー複合体では、そのリガンド−ポリマー複合体を用いたイムノアッセイによる生物学的試料中の特定成分の測定において、反応性における感度向上や高い再現性についての技術向上がなされているものの、その測定に要される時間や、リガンド−ポリマー複合体の室温保存については考慮されていなかった。つまり、従来のリガンド−ポリマー複合体を用いたイムノアッセイでは、凝集反応速度が遅いため、測定に長い時間を要する。また、室温での保存が不安定なため、冷蔵での保存が必要となる。

本発明は、前記従来の課題を解決するもので、免疫反応に悪影響を与えることなく、イムノアッセイによる生物学的試料中の特定成分に対する測定時間の短縮と凝集試薬の保存安定性の向上を実現することを目的とするものである。

前記課題を解決するために、本発明の請求項１に記載の凝集試薬の製造方法は、制御された数のリガンドを、分子量６万以上の高次構造を持つタンパク質に、化学的に結合させる凝集試薬の製造方法であって、前記リガンドを、官能基を有するリンカーを介して、前記タンパク質に結合させる、ことを特徴とする。

また、本発明の請求項２に記載の凝集試薬の製造方法は、請求項１に記載の凝集試薬の製造方法において、前記タンパク質が、グロブリン様タンパクである、ことを特徴とする。

また、本発明の請求項３に記載の凝集試薬の製造方法は、請求項１に記載の凝集試薬の製造方法において、前記官能基を有するリンカーの長さが、１５Å以下である、ことを特徴とする。

また、本発明の請求項４に記載の凝集試薬の製造方法は、請求項１に記載の凝集試薬の製造方法において、前記リンカーが直鎖構造を有する、ことを特徴とする。

また、本発明の請求項５に記載の凝集試薬の製造方法は、請求項１に記載の凝集試薬の製造方法において、前記リンカーが平面構造を有する、ことを特徴とする。

また、本発明の請求項６に記載の凝集試薬の製造方法は、請求項１に記載の凝集試薬の製造方法において、前記リガンドが、特異的なタンパクを認識し、結合相手とする物質である、ことを特徴とする。

また、本発明の請求項７に記載の凝集試薬の製造方法は、請求項１に記載の凝集試薬の製造方法において、前記リガンドがハプテンである、ことを特徴とする。

また、本発明の請求項８に記載の凝集試薬の製造方法は、請求項１に記載の凝集試薬の製造方法において、前記凝集試薬が、タンパク質１個当たり、１０個以上のリガンドが結合した複合体である、ことを特徴とする。

また、本発明の請求項９に記載の凝集試薬または生成物は、請求項１〜８のいずれかに記載の凝集試薬の製造方法によって生成される、ことを特徴とする。

また、本発明の請求項１０に記載の分析対象物測定方法は、粒子凝集制御イムノアッセイを行って試験試料中の分析対象物を測定する測定方法において、水懸濁性粒子に結合している抗分析対象物抗体と試験試料とを混合し、該試験試料中に含まれる分析対象物に前記抗分析対象物抗体を結合させる工程と、前記水懸濁性粒子に結合している抗分析対象物抗体と試験試料とが混合された溶液と、前記抗分析対象物抗体に対する特異的な結合部位を有するリガンドを、官能基を有するリンカーを介して分子量６万以上の高次構造を持つタンパク質に化学的に結合させてなる凝集試薬とを混合し、前記試験試料中に含まれる分析対象物と結合していない抗分析対象物抗体を前記凝集試薬により凝集させる工程と、前記抗分析対象物抗体と凝集試薬との反応により生じる凝集塊を検出し、前記試験試料中の分析対象物を定量する工程とを含む、ことを特徴とする。

また、本発明の請求項１１に記載の分析対象物測定方法は、請求項１０に記載の分析対象物測定方法において、前記分析対象物がヘモグロビンＡ１ｃであり、前記リガンドが、ヘモグロビンＡ１ｃ中のペプチド配列に対応する糖化ペプチドである、ことを特徴とする。

また、本発明の請求項１２に記載の分析対象物測定方法は、請求項１０に記載の分析対象物測定方法において、前記凝集試薬を抗原過多となる量（プロゾーン領域）で使う、ことを特徴とする。

また、本発明の請求項１３に記載の分析対象物測定方法は、請求項１０に記載の分析対象物測定方法において、前記凝集塊の濁度を光学的測定によって検出する、ことを特徴とする。

また、本発明の請求項１４に記載の分析対象物測定方法は、請求項１０に記載の分析対象物測定方法において、前記凝集塊を計数することによって検出する、ことを特徴とする。

また、本発明の請求項１５に記載の試験キットは、粒子凝集制御イムノアッセイを行って試験試料中の分析対象物を測定する試験キットにおいて、水懸濁性粒子に結合している抗分析対象物抗体と、抗分析対象物抗体に対する特異的な結合部位を有するリガンドを、官能基を有するリンカーを介して分子量６万以上の高次構造を持つタンパク質に化学的に結合させてなる凝集試薬と、を保持する、ことを特徴とする。

また、本発明の請求項１６に記載の試験キットは、請求項１５に記載の試験キットにおいて、前記水懸濁性粒子に結合している抗分析対象物抗体及び前記凝集試薬が、乾燥状態で担持されている、ことを特徴とする。

また、本発明の請求項１７に記載の分析デバイスは、粒子凝集制御イムノアッセイによって試験試料中の分析対象物を測定する分析デバイスにおいて、前記試験試料を注入する試料注入部と、前記試料注入部に連結され、前記注入された試料に、水懸濁性粒子に結合している抗分析対象物抗体と、前記抗分析対象物抗体に対する特異的な結合部位を有するリガンドを、官能基を有するリンカーを介して分子量６万以上の高次構造を持つタンパク質に化学的に結合させてなる凝集試薬とを混合し、前記試料中に含まれる分析対象物と結合していない抗分析対象物抗体を前記凝集試薬により凝集させる凝集部と、前記凝集部に連結され、前記抗分析対象物抗体と前記凝集試薬との反応により生じる凝集塊を検出し、前記試験試料中の分析対象物を定量する測定部、とを備えたことを特徴とする。

また、本発明の請求項１８に記載の分析デバイスは、請求項１７に記載の分析デバイスにおいて、前記分析対象物が、ヘモグロビンＡ１ｃであり、前記リガンドが、ヘモグロビンＡ１ｃ中のペプチド配列に対応する糖化ペプチドである、ことを特徴とする。

また、本発明の請求項１９に記載の分析デバイスは、請求項１７に記載の分析デバイスにおいて、前記凝集試薬を抗原過多となる量（プロゾーン領域）で担持した、ことを特徴とする。

また、本発明の請求項２０に記載の分析デバイスは、請求項１７に記載の分析デバイスにおいて、前記水懸濁性粒子に結合している抗分析対象物抗体または、前記凝集試薬が、乾燥状態で担持されている、ことを特徴とする。

また、本発明の請求項２１に記載の分析デバイスは、請求項１７に記載の分析デバイスにおいて、前記測定部で、前記凝集塊の濁度を光学的測定によって検出する、ことを特徴とする。

また、本発明の請求項２２に記載の分析デバイスは、請求項１７に記載の分析デバイスにおいて、前記測定部で、前記凝集塊を計数することによって検出する、ことを特徴とする。

また、本発明の請求項２３に記載の分析デバイスは、請求項１７に記載の分析デバイスにおいて、前記測定部と前記凝集部とが一体に形成された、ことを特徴とする。

本発明の凝集試薬によれば、タンパク質の高次構造により、水懸濁性粒子に結合している抗分析対象物抗体と、抗分析対象物抗体に対する特異的な結合部位を有するリガンドを、官能基を有するリンカーを介して分子量６万以上の高次構造を持つタンパク質に化学的に結合させてなる凝集試薬とが凝集する凝集反応速度が速くなり、凝集制御イムノアッセイの測定時間を短縮することができる。また、凝集試薬の保存安定性が向上し、室温での保存が可能となるので、冷蔵での保存が不要となる。

本発明の凝集試薬のイメージ図 本発明の実施の形態３における分析システムの構成を示す図 本発明の実施の形態４における、図１に示した分析システムで用いる分析デバイスの詳細な構成を示す図であり、図３（ａ）はその分解斜視図、図３（ｂ）はその分析デバイスに試薬を添加した状態を示す斜視図 凝集試薬濃度と吸光度変化の関係を示したグラフ 凝集試薬の種類による凝集速度の違いを示したグラフ 凝集試薬の種類による保存安定性の違いを示したグラフ 従来の凝集試薬のイメージ図

以下に、本発明の凝集試薬製造方法及び凝集試薬を用いた分析対象物測定方法の実施の形態、及びその試験キット、分析デバイスについて、詳細に説明する。
（実施の形態１）
本発明の実施の形態１では、凝集試薬製造方法及び凝集試薬を用いたヘモグロビンＡ１ｃの測定方法について説明する。

Ａ．リガンドの製造
本発明のリガンドは、特異的なタンパク質を認識し、それを結合相手とする物質であれば、いかなるものであってもよい。この代表的な例として、ハプテンが挙げられる。本実施の形態１では、ヘモグロビンＡ１ｃ中のペプチド配列に対応する糖化ペプチドとして、バリン−ヒスチジン−ロイシン−トレオニン−システインの配列でアミノ酸を結合させたペプチド（以下、ＶＨＬＴＣという）を、凝集試薬のリガンドとして用いる。このリガンドを用いることによって、ヘモグロビンＡ１ｃ認識抗体に特異的に結合することができる。また、このリガンドを変えることによって、様々な抗体を特異的に認識するリガンドを作製することができる。

Ｂ．凝集試薬の製造
本発明の凝集試薬は、制御された数のリガンドを、分子量６万以上の高次構造を持つタンパク質に、官能基を有するリンカーを介して化学的に結合させたものである。また、この凝集試薬は、タンパク質１個当たり、１０個以上のリガンドが結合した複合体である。

ここで、タンパク質は、６万以上の分子量のものであれば、いかなるものであってもよい。この代表的なタンパク質の例としては、ガンマグロブリン、チログロブリン、アルブミンなどのグロブリン様タンパクがあげられるが、これらのタンパク質に限定されるものではない。より望ましくは、６万〜３０万程度の分子量のものがよい。

ここで、タンパク質として、６万以上の分子量のものが好ましい理由は、以下の通りである。すなわち、分子量が６万より小さいタンパク質は、リンカーが化学結合する部位であるアミノ基の数が少ない為、１０個以上のリガンドが結合することができず、水懸濁性粒子の凝集反応性が低下するという欠点がある。これに対して、分子量が６万以上のタンパク質は、リンカーが化学結合する部位であるアミノ基の数が多い為、１０個以上のリガンドが結合することができ、その結果として、水懸濁性粒子の凝集反応性が高いという利点があるからである。

官能基を有するリンカーの長さは、１５Å以下であることが望ましい。リンカーは、官能基を有するものであれば、いかなる所望のものであってもよく、直鎖構造あるいは平面構造を有するものであってもよい。代表的なリンカーの例としては、Ｎ−（６−Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｃａｐｒｏｙｌｏｘｙ）ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ （以下ＥＭＣＳという）、Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−ｔｒａｎｓ−４−（Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｙｌｍｅｔｈｙｌ）ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−１−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ （以下ＳＭＣＣという）、Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙ（４−ｉｏｄｏａｃｅｔｙｌ）ａｍｉｎｏｂｅｎｚｏａｔｅ （以下ＳＩＡＢという）などが用いられる。

図１は、本発明の実施の形態５における凝集試薬のイメージ図である。
図１において、本発明の凝集試薬４は、分子量６万以上のタンパク質（担体）１、官能基を有するリンカー２、ＶＨＬＴＣ（リガンド）３からなる。この凝集試薬４は、リガンド（ＶＨＬＴＣ）３を、官能基を有するリンカー２を介して、タンパク質（担体）１に結合させることによって製造される。このとき、担体１個当たり、２０個程度のリガンド３を結合させておく。このリガンド３が特異的な抗体を認識し、抗体と結合する。１つの凝集試薬の２つ以上のリガンド３に抗体が結合すると、これらの抗体同士が凝集試薬を介して結合し、次々に凝集していく。

このようにして製造されたリガンド−タンパク質複合体は、イムノアッセイにおける凝集試薬として用いられる。

Ｃ．ラテックス標識抗体の製造
ポリスチレンラテックス粒子に、抗ｈｕｍａｎ ＨｂＡ１ｃ抗体を過剰量加えて結合させ、さらに、ウシ血清アルブミン（以下ＢＳＡという）でブロッキングすることにより、ラテックス標識抗体を作製する。この抗ｈｕｍａｎ ＨｂＡ１ｃ抗体が、試験試料中のヘモグロビンＡ１ｃ及び凝集試薬のリガンド（ＶＨＬＴＣ）３を認識し、結合する。また、この抗体を変えることによって、様々な試験試料中の成分及び凝集試薬を認識するラテックス標識抗体を作製することができる。

Ｄ．ラテックス免疫凝集阻止法を用いた被検試料中の分析対象物の測定
血液検体中のヘモグロビン及びヘモグロビンＡ１ｃを測定する為に、まず血液検体を希釈し、非イオン性界面活性剤と酸化剤とを含む変性試薬を用いて、希釈された血液検体と混合させ、血液検体中のヘモグロビンをメト化及び変性させる。このようにヘモグロビンをメト化することによって、ヘモグロビンを５４０ｎｍ付近の吸光度で測定することが可能となる。その後、前記希釈及び変性させた検体について、５４０ｎｍ近傍の波長で吸光度を測定し、全ヘモグロビン量を、メトヘモグロビン法を用いて算出する。ただし、ＳＬＳヘモグロビン法などの、その他のヘモグロビン測定法を用いてもよい。

次に、ヘモグロビンＡ１ｃ測定の為に、変性させた検体を抗ｈｕｍａｎ ＨｂＡ１ｃ抗体を標識したラテックス標識抗体に加える。ここで、このラテックスに標識された抗ｈｕｍａｎ ＨｂＡ１ｃ抗体と、血液検体中のヘモグロビンＡ１ｃの変性された部位の間で抗原抗体反応が起こる。その後、ラテックス標識抗体と反応した検体に、凝集試薬を加えると、血液検体中のヘモグロビンＡ１ｃが結合していない、残りの抗ｈｕｍａｎ ＨｂＡ１ｃ抗体に凝集試薬が結合する。その結果、凝集試薬が結合した部分で次々に凝集反応が起こり、凝集塊ができる。反応液中に発生する凝集塊の量は、ヘモグロビンＡ１ｃの濃度に反して発生するのであるが、この反応をラテックス免疫凝集阻止反応という。

次に、一定時間後に、この反応液中に発生した凝集塊による濁度を光学的測定によって検出するために、測定部の吸光度（Ａ）を測定する。また、凝集試薬を加える前に、あらかじめ、測定部のブランク吸光度（Ａ１）も測定する。これらの吸光度の差（Ａ−Ａ１）により、吸光度変化を算出する。

吸光度変化＝Ａ−Ａ１
この吸光度変化より、血液検体中のヘモグロビンＡ１ｃ量を算出する。

これらの結果より、血液検体中のヘモグロビンに対するヘモグロビンＡ１ｃの量、つまり存在比率の検出が可能となる。

このような本実施の形態１の凝集試薬によれば、制御された数のリガンドを、分子量６万以上の高次構造を持つタンパク質に、官能基を有するリンカーを介して化学的に結合させることにより製造したので、タンパク質の高次構造により、水懸濁性粒子に結合している抗分析対象物抗体間の凝集反応速度を速めることができ、凝集制御イムノアッセイの測定時間を短縮することが可能となる。さらに、凝集試薬の保存安定性を向上させ、室温での保存が可能となるので、冷蔵での保存が不要となる。

（実施の形態２）
本発明の実施の形態２では、少なくとも凝集試薬及びラテックス標識抗体及び変性試薬を保持し、これらの試薬によりヘモグロビンとヘモグロビンＡ１ｃを測定するための試験キットについて説明する。

試験キットとは、ヘモグロビンとヘモグロビンＡ１ｃの測定に必要な試薬や部材を詰め合わせたものを示す。具体的には、ヘモグロビンとヘモグロビンＡ１ｃの測定に必要な試薬と、使用説明書、ランセットもしくは注射器等の採血用具、採血前後に必要な消毒用品、試薬の添加に用いるディスペンサやスポイト等の秤量器具などの部材を詰め合わせたものであり、これらの試薬及び部材を用いて、検査対象となる試料を採血して定量・希釈・変性等を行った後、臨床用の自動測定機、もしくは分光光度計等を使用して、簡便にヘモグロビンとヘモグロビンＡ１ｃを測定することができるようにしたものである。

試験キットでは、採血から測定までの方法が手順化されているので、使用説明書に従えば専門的な知識を保有していなくとも簡便に使用することが可能である。また、前述のヘモグロビンとヘモグロビンＡ１ｃの測定に必要な試薬とは、少なくとも凝集試薬及びラテックス標識抗体及び変性試薬を含む試薬であり、これによってヘモグロビンＡ１ｃの測定を迅速且つ確実に行うことができる。

また、前記試験キットに保持させる前記ラテックス標識抗体と前記変性試薬とは、別々に保持してもよいし、該変性試薬をラテックス標識抗体に含めて保持してもよい。

以上のように、本実施の形態２の試験キットによれば、試料中のヘモグロビンＡ１ｃの測定に必要な試薬の全てがそれぞれ容器等に封入されて備えるようにしたので、使用者はあらかじめ定められた手順にしたがって、ヘモグロビン及びヘモグロビンＡ１ｃの測定を容易に行うことができる。

（実施の形態３）
本発明の実施の形態３では、少なくとも、分析試料を注入する注入口と、希釈液を保持する希釈液収容室と、注入された分析試料を希釈・変性させる希釈・変性室と、該希釈・変性されたヘモグロビンを検出するヘモグロビン測定室と、該希釈・変性された分析試料をラテックス標識抗体と反応させるラテックス反応室と、前記ラテックス標識抗体と反応した分析試料を凝集試薬と反応させる凝集室及び分析試料中の分析対象物を測定する測定室とから構成されるヘモグロビン及びヘモグロビンＡ１ｃを測定するための分析デバイスについて説明する。

分析デバイスについては、該分析デバイスを評価する測定装置とセットにして、分析システムの形態をとることが可能である。この形態をとることによって、より簡便かつ迅速にヘモグロビンＡ１ｃの測定が可能となる。

本実施の形態３の分析デバイスは、凝集試薬及びラテックス標識抗体及び変性試薬を別々な箇所に担持したものである。

以下に、本実施の形態３の分析デバイスの測定方法について説明する。
まず、血液検体と、変性試薬とを混合し、血液検体の希釈・変性を行い、その後、前記希釈及び変性させた血液検体について、所定の波長の光を照射して、全ヘモグロビンを測定する。次に、希釈・変性した血液検体とラテックス標識抗体とを混合し、抗原抗体反応を行い、測定部のブランク吸光度の測定を行う。その後、これらの混合溶液を凝集試薬と混合し、抗分析対象物抗体同士を凝集させ、その凝集により生じた凝集塊の吸光度を測定する。これらの測定によって、実施例の形態１に記載した式を用いて、ヘモグロビンＡ１ｃを算出する。これらのヘモグロビンとヘモグロビンＡ１ｃの測定によって、試料中のヘモグロビンに対するヘモグロビンＡ１ｃの量、つまり存在比率を算出することにより濃度検出が可能となる。

なお、血液検体の希釈・変性を行うと同時にラテックス標識抗体と抗原抗体反応をすることも可能である。

これらの分析デバイスの形状としては、前述した一連の反応、及び測定が、スムーズに進められることが重要である。

分析デバイスの一例としては、例えば、遠心力と毛細管力を利用したものが考えられ、分析デバイス内に形成した複数のチャンバー（空間）と該チャンバー間に形成した流路を通して、液体試料を自由に移送させることによって、測定の順序や試薬容量、反応時間等を制御することが可能である。そして、このような構成の分析デバイスを評価する装置の一例としては、前記分析デバイスを回転させ得る回転機構と、吸光度測定が可能な光学測定機能とを搭載したものが挙げられる。

以下、図２、図３を用いて、前述した分析デバイス及び該分析デバイスを含む分析システムの一構成例について説明する。

図２は、分析システムの構成を示す図である。分析システム１００は、分析デバイス１０１と、該分析デバイス１０１に対して光源１０２から光を照射し、透過光をディテクタ１０３で検出する測定部１１０と、該分析デバイス１０１をその一部を刳り抜いた箇所に固定する回転基板１０４と、該回転基板１０４を回転させるモータ１０５とを備える構成となっている。なお、図２において、モータ１０５の駆動機構や、光源１０２、ディテクタ１０３につながる回路構成については割愛する。

図３は、前記分析デバイスの詳細な構成を示す図であり、図３（ａ）はその分解斜視図であり、図３（ｂ）は、試薬を添加した状態を示す図である。

分析デバイス１０１は、下部基板２０１と、上部基板２１３とを、表裏両面に接着効果を保有する接着層２０２で貼り合わせることにより形成されたものである。基板の材料としては、透明な樹脂基板が用いられ、射出成形等によって、精度よくさまざまな形状の空間を形成している。詳述すると、前記下基板２０１には、検体を希釈・変性させる部位である希釈・変性室２０３と、希釈液収容室２０４と、検体中のヘモグロビンを検出する検出部Ａ２０５と、ヘモグロビンＡ１ｃを検出する検出部Ｂ２０６と、を形成するための凹部が、その上面に射出成形により成形されている。なお、前記上部基板２１３及び前記下部基板２０１の樹脂の素材としては、ポリカーボネートやポリスチレンやアクリルなどのプラスチック樹脂など、光を透過する材質であれば、特にこれに制限されない。

また、接着層２０２には、前記希釈・変性室２０３、希釈液収容室２０４、検出部Ａ２０５、検出部Ｂ２０６のパターン形状に加えて、それぞれを接続する流路２０７のパターン形状が切り抜かれている。さらに、前記検出部Ａ２０５、及び検出部Ｂ２０６の手前の流路２０７は、その一部を広げるように切り抜かれており、これにより、前記検出部Ａ２０５、及び検出部Ｂ２０６へ移送する液量を定量する定量部Ａ２０８、及び定量部Ｂ２０９を形成するものとする。接着層２０２の接着効果を得る材料としては、接着剤の他、加熱によって接着可能なホットメルトシートなどが使用できる。

前記分析デバイス１０１は、前記下部基板２０１と前記接着層２０２とを貼り合わせた後、前記上部基板２１３を貼り合わせる前に、図３（ｂ）に示すように、前記下部基板２０１の希釈・変性室２０３に、変性試薬２１０を、また前記下部基板２０１と接着層２０２で形成した定量チャンバーＢ２０９に、ラテックス標識抗体２１１を、さらに前記検出部Ｂ２０６には凝集試薬２１２を、それぞれ担持した後、乾燥させ、さらにその後、前記上部基板２１３を、前記接着層２０２の上面に貼り合わすことによって、形成される。また、前記上部基板２１３と前記接着層２０２と前記下部基板２０１とを貼り合わせることにより形成される、該接着層２０２に切り抜かれた流路２０７の２つの開口部は、それぞれ、検体注入口２１５と希釈液注入口２１６となる。

以下に、分析システム１００の動作について説明する。
試料の分析においては、例えばディスペンサ等を使用して、分析デバイス１０１の検体注入口２１５より血液を１μｌ注入すると共に、希釈液注入口２１６より、希釈液を５００μｌ注入する。これにより、血液は検体注入口２１５内側の流路内に、また希釈液は希釈液収容室２０４に保持される。

次に、前記回転基板１０４の刳り抜かれた箇所に、血液と希釈液とが注入された分析デバイス１０１をセットし、モータ１０５により所定の回転数で一定時間回転する。この回転により、希釈液と血液とは前記希釈・変性室２０３へ移送され混合されて希釈試料液となり、変性試薬により、ヘモグロビンのメト化及び変性を行う。

次に、回転基板１０４の回転を停止することによって、メト化及び変性された該試料液を毛細管現象により、流路２０７を通じて、定量部Ａ２０８と定量部Ｂ２０９に移送させる。

前記定量部Ｂ２０９に移送されたメト化及び変性された試料液は、該定量部Ｂ２０９において、予め保持されていたラテックス試薬２１１と混合し、ラテックス試薬２１１と該試料液中のヘモグロビンＡ１ｃとが結合する。

この後、再度前記回転基板１０４をモータ１０５により所定の回転数で一定時間回転すると、定量部Ａ２０８に移送されたメト化及び変性された試料液は検出部Ａ２０５へ、一方、前記定量部Ｂ２０９でラテックス試薬２１１と混合された試料液は検出部Ｂ２０６へ移送される。

前記検出部Ｂ２０６に担持した凝集試薬２１２は、ヘモグロビンＡ１ｃと結合していないラテックス試薬と結合し、ヘモグロビンＡ１ｃの濃度に応じたラテックス凝集阻止反応が発生する。一定時間後に、検出部Ｂ２０６の透過光測定を実施することによって、ラテックス凝集阻止反応を検出する。

また同時に、検出部Ａ２０５を測定することによって、ヘモグロビンの吸収を測定し、ヘモグロビン濃度を算出できる。

前記検出部Ｂ２０６におけるラテックス凝集阻止反応の測定は、６００ｎｍ近傍の波長で測定可能であり、前記検出部Ａ２０５におけるヘモグロビンの測定は５４０ｎｍ近傍のヘモグロビン吸収を測定する方法が可能である。

いずれにしても、あらかじめ決まった濃度のヘモグロビンと、ヘモグロビンＡ１ｃの測定結果を基に、検量線を作成しておけば、その検量線を利用して、ヘモグロビンとヘモグロビンＡ１ｃの濃度をそれぞれ算出でき、それらの濃度より、ヘモグロビンＡ１ｃの存在比を算出することが可能である。

ここでは一例として、分析デバイス１０１がチップ状で、遠心力と毛細管力を利用した液体移送により、測定系の順序や試薬量、反応時間等を制御する分析システムを一例に挙げたが、測定系の順序や試薬量、反応時間が制御できる形状であれば、この構成及び方法に限定されるものではなく、液体移送については、例えば、ポンプを使用して圧力で液体移送する方法なども十分可能である。また、前記分析デバイスは、例えば、クロマトグラフィーを利用した形態でもよいし、より単純には、直方体のプラスチック製のセルの形状であっても、試薬の担持方法を工夫することによって十分使用できる。

以上のように、本実施の形態３によれば、ヘモグロビンＡ１ｃの測定に必要な試薬を担持した分析デバイスを設計すると共に、該分析デバイス専用の測定部と組みあわせた分析システムを構築するようにしたので、手技の影響をうけにくい、簡便且つ迅速なヘモグロビンＡ１ｃの測定を行うことができる。

（実施例１）
以下に、凝集試薬の製造方法及びラテックス標識抗体の製造方法についての実施例の詳細を記す。

凝集試薬の製造方法としては、担体としてチキンガンマグロブリン（以下、ＣＧＧという）、リンカーとしてＥＭＣＳ、リガンドとしてＶＨＬＴＣを用いた。ＥＭＣＳのＮ末端とＶＨＬＴＣのシステインを結合し、さらに、ＥＭＣＳのＣ末端とＣＧＧのアミノ基を結合させることにより、凝集試薬を製造した。このとき、ＣＧＧ１個当たり、２０個程度のＶＨＬＴＣを結合した。

また、ラテックス標識抗体の製造方法としては、平均粒径０．１２μｍのポリスチレンラテックス粒子（積水化学社製）に抗ｈｕｍａｎ ＨｂＡ１ｃ抗体を過剰量加え、物理吸着によって結合した。該ラテックス粒子抗体複合体に０．５％のウシ血清アルブミン（以下、ＢＳＡという）を加えてブロッキングし、ラテックス標識抗体を作製した。なお、ラテックスの粒径はこれに限らず、０．０５μｍ〜１．０μｍのものであればいずれでもよい。

（実施例２）
以下に、第２の凝集試薬の製造方法についての実施例の詳細を記す。

凝集試薬の製造方法としては、担体としてＩｇＹ（ＣＧＧの主成分である免疫グロブリンＧのみを精製したもの）、リンカーとしてＥＭＣＳ、リガンドとしてＶＨＬＴＣを用いた。ＥＭＣＳのＮ末端とＶＨＬＴＣのシステインを結合し、さらに、ＥＭＣＳのＣ末端とＩｇＹのアミノ基を結合させることにより、凝集試薬を製造した。このとき、ＩｇＹ１個当たり、２０個程度のＶＨＬＴＣを結合した。この凝集試薬は担体としてＣＧＧを用いた場合と比べ、担体のロット間差が小さいため、ロット間差の小さい凝集試薬を製造することが可能となる。

（実施例３）
以下に、ラテックス免疫凝集阻止法を用いた被検試料中の分析対象物の測定方法についての実施例の詳細を記す。

まず、精製水にて２５０倍希釈した血液４００μｌと、０．３％スクロースモノラウレート及び０．５％フェリシアン化カリウムからなる変性試薬４００μｌとを混合し、血液中のヘモグロビンをメト化及び変性させた。なお、ヘモグロビンのメト化及び変性させる工程で用いる試薬はこれらに限らず、非イオン性界面活性剤と酸化剤が含まれていれば、いかなるものでもよい。前記希釈及び変性させた血液について５３５ｎｍの波長で吸光度を測定し、全ヘモグロビン濃度を算出した。

次に、ヘモグロビンＡ１ｃ測定の為に、前記希釈・変性血液を真空凍結乾燥した実施例１のラテックス標識抗体に加え、抗原抗体反応をさせた。これを真空凍結乾燥した本発明の凝集試薬に加え、３７℃で凝集反応させた。なお、ラテックス標識抗体及び凝集試薬について、真空凍結乾燥を用いたが、乾燥物を作るものであればいかなる工法でもよく、風乾、熱乾燥、真空乾燥などの方法を用いることもできる。また、本発明の凝集試薬は免疫反応を妨害するような性質はなく、抗原抗体反応において従来の凝集試薬と根本的な変わりはない。

この凝集塊による濁度を光学的測定によって検出するために、６２５ｎｍの波長で吸光度（Ａ）を測定した。また、凝集試薬を加える前の６２５ｎｍの波長での吸光度（Ａ１）も測定した。これらの吸光度の差により、吸光度変化（Ａ−Ａ１）を算出した。

あらかじめ決まった濃度のヘモグロビンと、ヘモグロビンＡ１ｃの測定結果を基に、作成しておいた検量線を利用して、ヘモグロビンとヘモグロビンＡ１ｃの濃度をそれぞれ算出し、それらの濃度より、ヘモグロビンＡ１ｃの存在比を算出した。

（比較例）
担体としてＣＧＧ、リンカーとしてＥＭＣＳ、リガンドとしてＶＨＬＴＣとで構成された本発明の凝集試薬と、担体としてポリリジン、リンカーとしてＥＭＣＳ、リガンドとしてＶＨＬＴＣとで構成された従来の凝集試薬とを用い、それぞれ比較実験を行った。

（ａ）凝集試薬の濃度と吸光度変化との関係
図４は、ラテックス標識抗体と凝集試薬とのラテックス凝集反応において、測定された吸光度変化と添加した凝集試薬の濃度との関係を示している。横軸は凝集試薬の濃度、縦軸は凝集試薬を加えてから１分後の吸光度変化である。図４によれば、従来の凝集試薬と本発明の凝集試薬とも、凝集試薬の濃度が高くなるにしたがって、凝集物が増加していき、吸光度の測定値が高くなっていくが、凝集試薬の濃度があるレベルを超えた場合、つまり吸光度変化の最大値を越えると、反応液中の抗原が過多の状態になるため、凝集形成が抑制され、見かけ上の吸光度の測定値が逆に低くなる。例えば、従来の凝集試薬では、１μｇ／ｍｌ以上の濃度範囲、また、本発明の凝集試薬では、５μｇ／ｍｌ以上の濃度範囲が、吸光度の測定値が低くなる領域となり、一般に、この領域をプロゾーン領域と呼び、また、この現象はプロゾーン現象と称される。この濃度域の凝集試薬を用いることによって、凝集試薬の濃度変動の反応性への影響を小さくすることができる。また、凝集試薬が過多となるため、凝集反応速度を速くすることができる。この結果より、本発明の凝集試薬のほうが、ダイナミックレンジが大きいことが判明した。ダイナミックレンジが大きいことによって、検量線の傾きが大きくなり、測定精度がよくなる。

また、この時用いた凝集試薬の担体あたりのリガンド量は、本発明の凝集試薬（ＣＧＧ）で０．１１μｍｏｌ／ｍｇ、従来の凝集試薬（ｐｏｌｙ−Ｌｙｓ）で０．９６μｍｏｌ／ｍｇであった。

（ｂ）各プロゾーン領域の凝集試薬濃度における、凝集反応完了率と経時変化との関係
図５は、各プロゾーン領域の濃度の凝集試薬を用いたラテックス凝集阻止反応において、凝集反応完了率の経時変化を示している。横軸は凝集試薬を加えてからの時間、縦軸は凝集試薬を加えて１７０秒後を１００％凝集したと仮定した場合の凝集反応完了率である。図５に示すように、本発明の凝集試薬を用いた場合では、１７０秒後において吸光度が安定してきているが、従来の凝集試薬を用いた場合では、グラフの傾きからわかるように、１７０秒後においてもまだ反応が進み、吸光度が上昇している。１７０秒後を１００％凝集したと仮定しても、明らかに、本発明の凝集試薬の方が、凝集速度が速く、凝集反応完了率が高いことがわかる。これは、例えば、凝集開始から６０秒後において比較すると、従来の凝集試薬では、６０％凝集反応が完了しているのに対し、本発明の凝集試薬では７５％凝集反応が完了している。

この結果より、本発明の凝集試薬を用いた方が、凝集反応速度が速く、短時間で反応が完了することが分かる。本発明の凝集試薬を用いたアッセイでは、凝集反応開始から３分以内に反応が完了している。一方、従来の凝集試薬では、同程度の凝集反応が完了する為には、約２倍の時間が必要である。

（ｃ）凝集試薬の保存安定性
図６は、凝集試薬の保存安定性を示している。凝集試薬を真空凍結乾燥し、４０℃環境下で保存した。この凝集試薬を用いて、ラテックス凝集阻止反応を行い、分光器を用いて吸光度を測定し、反応前との吸光度の差より、凝集試薬の反応性を確認した。横軸は保存日数、縦軸は凝集反応測定時のレファレンスとの吸光度変化比である。なお、レファレンスとして、−８０℃に凍結保存した凝集試薬を用いた。図６に示すように、従来凝集試薬では、３ヶ月保存後の吸光度変化がレファレンスの半分程度の吸光度変化しか示さないが、本発明の凝集試薬では、３ヶ月保存後もレファレンスと同程度の吸光度変化を示し、反応性が安定している傾向があることがわかる。

この結果より、従来の凝集試薬では４０℃、１ヶ月経過時点での反応性の低下が見られるのと比較して、本発明の凝集試薬では４０℃、３ヶ月経過時点においても、保存が安定であり、明らかに保存安定性がアップしていることが判明した。

なお、本実験は日立製分光器（Ｕ２８００）にて行った。

本発明によれば、凝集反応の時間を短縮することができるので、迅速かつ正確な測定が可能となるとともに、凝集試薬の保存安定性がアップする為、室温での保存が可能となる。室温での保存の実現により、イムノアッセイを利用した試料分析片の取り扱いが簡便になる。

１ タンパク質（担体）
２ リンカー
３ ＶＨＬＴＣ（リガンド）
４ 凝集試薬
１００ 分析システム
１０１ 分析デバイス
１０２ 光源
１０３ ディテクタ
１０４ 回転基板
１０５ モータ
１１０ 測定部
２０１ 下部基板
２０２ 接着層
２０３ 希釈・変性室
２０４ 希釈液収容室
２０５ 検出部Ａ
２０６ 検出部Ｂ
２０７ 流路
２０８ 定量部Ａ
２０９ 定量部Ｂ
２１０ 変性試薬
２１１ ラテックス標識抗体
２１２ 凝集試薬
２１３ 上部基板
２１５ 検体注入口
２１６ 希釈液注入口

Claims (23)

1. 制御された数のリガンドを、分子量６万以上の高次構造を持つタンパク質に、化学的に結合させる凝集試薬の製造方法であって、
   前記リガンドを、官能基を有するリンカーを介して、前記タンパク質に結合させる、
   ことを特徴とする凝集試薬の製造方法。
2. 前記タンパク質が、グロブリン様タンパクである、
   ことを特徴とする請求項１に記載の凝集試薬の製造方法。
3. 前記官能基を有するリンカーの長さが、１５Å以下である、
   ことを特徴とする請求項１に記載の凝集試薬の製造方法。
4. 前記リンカーが、直鎖構造を有する、
   ことを特徴とする請求項１に記載の凝集試薬の製造方法。
5. 前記リンカーが、平面構造を有する、
   ことを特徴とする請求項１に記載の凝集試薬の製造方法。
6. 前記リガンドが、特異的なタンパクを認識し、結合相手とする物質である、
   ことを特徴とする請求項１に記載の凝集試薬の製造方法。
7. 前記リガンドが、ハプテンである、
   ことを特徴とする請求項１に記載の凝集試薬の製造方法。
8. 前記凝集試薬が、タンパク質１個当たり、１０個以上のリガンドが結合した複合体である、
   ことを特徴とする請求項１に記載の凝集試薬の製造方法。
9. 請求項１〜８のいずれかに記載の凝集試薬の製造方法によって生成される、
   ことを特徴とする凝集試薬または生成物。
10. 粒子凝集制御イムノアッセイを行って試験試料中の分析対象物を測定する測定方法において、
    水懸濁性粒子に結合している抗分析対象物抗体と試験試料とを混合し、該試験試料中に含まれる分析対象物に前記抗分析対象物抗体を結合させる工程と、
    前記水懸濁性粒子に結合している抗分析対象物抗体と試験試料とが混合された溶液と、前記抗分析対象物抗体に対する特異的な結合部位を有するリガンドを、官能基を有するリンカーを介して分子量６万以上の高次構造を持つタンパク質に化学的に結合させてなる凝集試薬とを混合し、前記試験試料中に含まれる分析対象物と結合していない抗分析対象物抗体を前記凝集試薬により凝集させる工程と、
    前記抗分析対象物抗体と凝集試薬との反応により生じる凝集塊を検出し、前記試験試料中の分析対象物を定量する工程とを含む、
    ことを特徴とする分析対象物測定方法。
11. 前記分析対象物がヘモグロビンＡ１ｃであり、前記リガンドが、ヘモグロビンＡ１ｃ中のペプチド配列に対応する糖化ペプチドである、
    ことを特徴とする請求項１０に記載の分析対象物測定方法。
12. 前記凝集試薬を、抗原過多となる量のプロゾーン領域で使う、
    ことを特徴とする請求項１０に記載の分析対象物測定方法。
13. 前記凝集塊の濁度を光学的測定によって検出する、
    ことを特徴とする請求項１０に記載の分析対象物測定方法。
14. 前記凝集塊を計数することによって検出する、
    ことを特徴とする請求項１０に記載の分析対象物測定方法。
15. 粒子凝集制御イムノアッセイを行って試験試料中の分析対象物を測定する試験キットにおいて、
    水懸濁性粒子に結合している抗分析対象物抗体と、
    抗分析対象物抗体に対する特異的な結合部位を有するリガンドを、官能基を有するリンカーを介して分子量６万以上の高次構造を持つタンパク質に化学的に結合させてなる凝集試薬と、を保持する、
    ことを特徴とする試験キット。
16. 前記水懸濁性粒子に結合している抗分析対象物抗体及び前記凝集試薬が、乾燥状態で担持されている、
    ことを特徴とする請求項１５に記載の試験キット。
17. 粒子凝集制御イムノアッセイによって試験試料中の分析対象物を測定する分析デバイスにおいて、
    前記試験試料を注入する試料注入部と、
    前記試料注入部に連結され、前記注入された試料に、水懸濁性粒子に結合している抗分析対象物抗体と、前記抗分析対象物抗体に対する特異的な結合部位を有するリガンドを、官能基を有するリンカーを介して分子量６万以上の高次構造を持つタンパク質に化学的に結合させてなる凝集試薬とを混合し、前記試料中に含まれる分析対象物と結合していない抗分析対象物抗体を前記凝集試薬により凝集させる凝集部と、
    前記凝集部に連結され、前記抗分析対象物抗体と前記凝集試薬との反応により生じる凝集塊を検出し、前記試験試料中の分析対象物を定量する測定部と、を備えた、
    ことを特徴とする分析デバイス。
18. 前記分析対象物が、ヘモグロビンＡ１ｃであり、前記リガンドが、ヘモグロビンＡ１ｃ中のペプチド配列に対応する糖化ペプチドである、
    ことを特徴とする請求項１７に記載の分析デバイス。
19. 前記凝集試薬を、抗原過多となる量のプロゾーン領域で担持した、
    ことを特徴とする請求項１７に記載の分析デバイス。
20. 前記水懸濁性粒子に結合している抗分析対象物抗体または、前記凝集試薬が、乾燥状態で担持されている、
    ことを特徴とする請求項１７に記載の分析デバイス。
21. 前記測定部で、前記凝集塊の濁度を光学的測定によって検出する、
    ことを特徴とする請求項１７に記載の分析デバイス。
22. 前記測定部で、前記凝集塊を計数することによって検出する、
    ことを特徴とする請求項１７に記載の分析デバイス。
23. 前記測定部と前記凝集部とが一体に形成された、
    ことを特徴とする請求項１７に記載の分析デバイス。

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