JP5461959B2

JP5461959B2 - 神経膠腫予後予測方法、およびそれに用いるキット

Info

Publication number: JP5461959B2
Application number: JP2009252022A
Authority: JP
Inventors: 菊也加藤; 充章白畑
Original assignee: DNA Chip Research Inc
Current assignee: DNA Chip Research Inc
Priority date: 2008-10-31
Filing date: 2009-11-02
Publication date: 2014-04-02
Anticipated expiration: 2029-11-02
Also published as: JP2010131006A

Description

本発明は、神経膠腫患者の術後予後を予測する方法に関する。

３大成人病の一つである癌において、癌の一種である脳腫瘍は悪性となってしまう恐れが高い腫瘍の一つである。この脳腫瘍は、脳組織自体から発生する原発性脳腫瘍と、他の臓器の癌が脳に転移してきた転移性脳腫瘍との２種類に分類される。

この原発性脳腫瘍の中で最も発生し易い腫瘍が神経膠腫であり、悪性の神経膠腫は最も予後不良な悪性腫瘍の一つとされている。神経膠腫は、脳実質に浸潤する特徴があるため、腫瘍を完全に摘出するのは非常に困難である。そのため、術後に放射線療法や化学療法を追加することが多いが、５年生存率は３８．６％と原発性脳腫瘍全体の５年生存率（７５．７％）の約半分となっており、中でも最も悪性型である膠芽腫（グレードＩＶ）に限れば、その５年生存率は１０％以下になってしまう。

従来、このような神経膠腫の術後予後を予測するために、予後関連分子を分類し、病理的に予後を診断しているが、他の予後因子と比較して臨床的有効性を確認する手法は確立されていない。なお、神経膠腫の予後を予測する方法としては特許文献１等が知られている。

特願２００８−５４５９２９

本発明は、このような状況を鑑みてなされたものであり、神経膠腫患者の術後予後を予測する方法を提供することを目的とする。

本発明者等は、上記課題を解決するため、鋭意研究を重ねた結果、本発明を成し得たものである。具体的には、本発明者らは、神経膠腫患者１５２症例、３４５６遺伝子の発現量をアダプター付加競合ＰＣＲ法で測定した。そして、このデータマトリックスは主成分分析による特徴抽出が有効であり、コックス回帰を用いたｓｕｐｅｒｖｉｓｅｄＰＣＡにより５８遺伝子からなる予後診断方法を確立できることを見出した。

すなわち、本願発明の第１の主要な観点によれば、
神経膠腫患者の術後予後を予測するための方法であって、（ａ）前記神経膠腫患者由来の腫瘍組織又は腫瘍細胞における表１中の任意の遺伝子群の発現量を測定する工程と、（ｂ）前記測定した発現量を標準化し、この標準化した発現量から術後予後予測スコアを計算する工程と、（ｃ）前記計算した術後予後予測スコアが０以下の場合に予後良好と決定し、前記計算した術後予後予測スコアが０以上の場合に予後不良と決定する工程とから成ることを特徴とする方法が提供される。

このような構成によれば、所定の遺伝子の発現量から術後予後予測スコアを計算することにしたため、神経膠腫患者の術後予後を、当該患者由来の組織または細胞における遺伝子の発現量を元に予測することができる。

本発明の一の実施形態によれば、この方法において、前記術後予後予測スコアは、以下の式Ｉによって計算されるものである。

また本発明の他の実施形態によれば、この方法は、表１中の任意の１０個以上の遺伝子を使用するものである。

別の実施形態によれば、この方法は、表１中の任意の２０個以上の遺伝子を使用するものである。

さらに別の実施形態によれば、この方法は、表１中の任意の３０個以上の遺伝子を使用するものである。

さらに別の実施形態によれば、この方法は、表１中の任意の４０個以上の遺伝子を使用するものである。

また更なる別の実施形態によれば、この方法は、表１中の任意の５０個以上の遺伝子を使用するものである。

また別の実施形態によれば、この方法は、表１中の５８個全ての遺伝子を使用するものである。

また別の実施形態によれば、この方法は、表３に示す遺伝子の３０個全てを使用するものである。

また、この発明の第２の主要な観点によれば、神経膠腫患者の術後予後を予測するために用いるキットであって、表１中の任意の遺伝子群の少なくとも一部の塩基配列から成るポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドを有することを特徴とするキットが提供される。

このような構成によれば、上述の神経膠腫患者の術後予後を予測する方法を行うためのキットが提供される。

本発明の一の実施形態によれば、このキットにおいて、前記ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドは標識されているものである。

また他の実施形態によれば、このキットは、表１中の任意の１０個以上の遺伝子セットを有するものである。

また別の実施形態によれば、このキットは、表１中の任意の３０個以上の遺伝子セットを有するものである。

さらに別の実施形態によれば、このキットは、表１中の遺伝子の５８個全ての遺伝子セットを有するものである。

さらに別の実施形態によれば、このキットは、表３中の遺伝子の３０個全ての遺伝子セットを有するものである。

なお、上記した以外の本発明の特徴及び顕著な作用・効果は、次の発明の実施形態の項及び図面を参照することで、当業者にとって明確となる。

図１は、本発明に係る方法の各構成要素の作用を示すフローチャートである。

図２は、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒａｎａｌｙｓｉｓの結果を示すグラフである。

図３は、ＭＧＨ（ＭａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓＧｅｎｅｒａｌＨｏｓｐｉｔａｌ）及びＭＤＡ（ＭＤＡｎｄｅｒｓｏｎ）のデータセットを用いた場合のＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒａｎａｌｙｓｉｓの結果を示すグラフである。

図４は、表３に示される３０遺伝子を用いた場合の、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒａｎａｌｙｓｉｓの結果を示すグラフである。

以下、本願発明の一実施形態および実施例を、添付図面を参照して説明する。
本発明は、上述したように、神経膠腫患者の術後予後を予測するための方法であって、（ａ）前記神経膠腫患者由来の腫瘍組織又は腫瘍細胞における表１中の任意の遺伝子群の発現量を測定する工程と、（ｂ）前記測定した発現量を標準化し、この標準化した発現量から術後予後予測スコアを計算する工程と、（ｃ）前記計算した術後予後予測スコアが０以下の場合に予後良好と決定し、前記計算した術後予後予測スコアが０以上の場合に予後不良と決定する工程とから成ることを特徴とする方法である。すなわち、本発明の要旨は、所定の工程を経ることによって、神経膠腫患者由来の腫瘍組織又は腫瘍細胞から当該神経膠腫患者の術後予後を予測することにある。

具体的には、本発明は、図１に示すフローチャートに従って行われる。

図１は、本発明に係る方法の各構成要素の作用を示すフローチャートである。なお、図中の各符号Ｓ１〜Ｓ７は、以下の説明中の各ステップＳ１〜ステップＳ７に対応するものである。

まず、ステップＳ１において、神経膠腫患者から腫瘍組織又は腫瘍細胞が採取される。なお、当該腫瘍組織又は腫瘍細胞は従来周知の方法によって採取されることができ、採取されるサンプル数、大きさ、等は特に限定されるものではない。

その後、この採取された腫瘍組織又は腫瘍細胞における下記表１中の遺伝子の発現量が、従来周知の遺伝子発現量測定方法によって測定される（ステップＳ２）。次にステップＳ３において、この測定された遺伝子発現量が標準化される。ステップ４では、この標準化された遺伝子発現量と回帰係数であるＣｏｘＢｅｔａとを用いて術後予後予測スコアを示すＰＣ１スコアを算出する。なお、各遺伝子についてのＣｏｘＢｅｔａは表１中に示した。

そして、このステップ４で算出したＰＣ１スコアが０以下の場合、当該神経膠腫患者の術後予後は良好と決定し、ＰＣ１スコアが０以上の場合、当該神経膠腫患者の術後予後は不良と決定する（ステップＳ５〜ステップＳ７）。

なお、上述したような神経膠腫患者の術後予後を予測する方法は、通常の演算処理能力を有するＰＣ等によって実行されることもできる。例えば、上述した式Ｉの計算をソフトウェアプログラムとして有する演算処理装置を用いて、上記したＰＣ１スコア出力することができる。

また、例えば、上記したＰＣ１スコアは、上述した式Ｉの計算を実行できるソフトウェアプログラム等を組み込んだＰＣに、上述の標準化遺伝子発現量を入力し、又は発現解析および標準化が終了次第、自動的に当該ＰＣがその発現量を受信することによって、出力するようにしても良い。さらに、当該ＰＣは、上記のようにして出力したＰＣ１スコアを、その数値に基づいて、自動的に予後良好か予後不良かに分類するようにしておいても良い。なお、この場合、出力されたＰＣ１スコアがどの症例に係るものなのかを関連づけて記憶しておく構成を備えていても良い。

以下に、本実施形態に係る実施例を説明する。

本実施例において、京都大学脳神経外科主導の第二相臨床試験（ｔｈｅＫＮＯＧｓｔｕｄｙ）の症例を用いた。１５２症例、３４５６遺伝子の発現量をアダプター付加競合ＰＣＲ法で測定した。このデータマトリックスは主成分分析による特徴抽出が有効であり、コックス回帰を用いたｓｕｐｅｒｖｉｓｅｄＰＣＡにより５８遺伝子からなる予後診断システムを開発した（以下、５８−ｇｅｎｅｐｒｏｆｉｌｅと称する）。

このシステムでは５８遺伝子の標準化された発現量からＰＣ１スコアを計算し、０を閾値として予後良好群と不良群に分類した。各遺伝子とＰＣ１スコア計算方法とについては表１に示した。

表１には、回帰係数を示すＣｏｘＢｅｔａ、単変量解析値を示すＣｏｘＰ、ＧＳｎｕｍｂｅｒ、ＧｅｎｅＳｙｍｂｏｌ、ＲｅｆＳｅｑＩＤ、ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎを示した。

図２はＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒａｎａｌｙｓｉｓの結果を示すグラフである（Ａはすべての神経膠腫、ＢはグレードＩＶのみ）。縦軸はｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ−ｆｒｅｅｓｕｒｖｉｖａｌを示す。Ｂのグラフから、従来のグレード分類よりも予後を反映した分類法であることがわかった。なお、この図２は学習データセット（１１０症例）を示すが、テストデータセット（４２症例）でも同様の結果が得られた。

次にコックス回帰分析により他の強力な予後因子、すなわち手術摘出度、年齢、グレード分類と比較した。ＰＦＳについては５８−ｇｅｎｅｐｒｏｆｉｌｅが唯一の強力な予後因子であった。Ｏｖｅｒａｌｌｓｕｒｖｉｖａｌについては単変量解析では手術摘出度、年齢、５８−ｇｅｎｅｐｒｏｆｉｌｅが有意であったが、多変量解析では手術摘出度と５８−ｇｅｎｅｐｒｏｆｉｌｅが独立した予後因子であった。詳細は表２に示した。

次に、既に公表されている他のグループの発現データを用いて５８−ｇｅｎｅｐｒｏｆｉｌｅの有効性を検討した。ＭＧＨ（ＭａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓＧｅｎｅｒａｌＨｏｓｐｉｔａｌ）及びＭＤＡ（ＭＤＡｎｄｅｒｓｏｎ）の両者のデータセットともにグレード分類よりも予後と高い相関を示した（図３）。

神経膠腫の予後関連分子分類の論文は過去にもあったが、他予後因子と比較し臨床的有効性を確立したのは、本発明が初めてである。今回の成果は、遺伝子発現による分類法が従来の病理分類よりすぐれた診断法になる可能性を強く示している。

同様にして、表１に記載される５８遺伝子から任意に選択された３０遺伝子を用いて、その標準化された発現量からＰＣ１スコアを計算し、０を閾値として予後良好群と不良群とに分類した。選択された３０遺伝子を表３に示す。

表３に記載された３０遺伝子群を用いて、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒａｎａｌｙｓｉｓを行った結果が図４である。図２と同様、縦軸はｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ−ｆｒｅｅｓｕｒｖｉｖａｌである。図４は３７症例の術後予後を予測した結果を示すが、本発明に係る方法を用いて行った分子分類では、ｐ値が０．００３を示しており、従来の組織分類の０．０４０４よりも低い値を示すことがわかる。

このことは、表１に記載された遺伝子群のうち、任意に選択された３０遺伝子を用いて本発明に係る方法を実施しても５８遺伝子を用いた場合と同様の結果を得ることができることを示すものである。

（変形例、用語の説明）
本願発明において、「遺伝子の発現」とは、ＲＮＡ又はタンパク質等の遺伝子産物を当該遺伝子自身が産生することを意味する。従って、遺伝子の発現量は、遺伝子から転写されたｍＲＮＡ、又は当該ｍＲＮＡから翻訳されたタンパク質の量を測定することによって行うことができる。本発明に係る方法において、腫瘍組織または腫瘍細胞における遺伝子の発現量は、当業者に公知の任意の方法・手段で測定することが出来る。

また、本発明の方法に用いられる遺伝子群は、アミノ酸配列により特定される各遺伝子産物と実質的に同一の生物学的機能を有するものであれば、公知のアミノ酸配列において、１個ないし数個のアミノ酸が置換、挿入、又は欠失した変異アミン酸配列を有する遺伝子産物であっても差し支えない。

例えば、発現したｍＲＮＡ量の測定としては、ＤＮＡマイクロアレイ（又は、ＤＮＡチップ）、オリゴヌクレオチドマイクロアレイ、ノザンハイブリダイゼーション、Ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション、または逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）等を用いることができるが、これらの測定手段に限定されるものではなく、当業者が利用可能な方法であればいかなる手法を用いてもよい。

一方、タンパク質量の測定としては、ウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡアッセイ、免疫組織染色、またはイーストツーハイブリッド（ＹｅａｓｔＴｗｏＨｙｂｒｉｄ）等の方法を採用することができる。

また本発明に係るキットは、腫瘍組織または腫瘍細胞における遺伝子及び／若しくは当該遺伝子がコードするタンパク質の発現量を測定する方法・手段に応じて、適当な構成をとることができる。例えば、本発明キットに含まれる表１中の任意の遺伝子の少なくとも一部の塩基配列から成るポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドの長さは数十塩基対であっても良く、それらの塩基配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ等の各種のデータベースから容易に入手できる情報に基づいて、当業者が適宜選択・設計して調製することができる。

また、それらはＤＮＡチップ又はノーザンブロッティングにおけるプロ−ブ、ＰＣＲにおけるプライマー等の形態で使用することができる。更に、必要に応じて、ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドは放射性物質、蛍光物質、色素等の適当な標識物質によって標識されていても良い。

上記キットには、その構成・使用目的などに応じて、当業者に公知の他の要素又は成分、例えば、各種試薬、酵素、緩衝液、反応プレート（容器）等が含まれる。

その他、この発明は、上述した一実施形態に限定されるものではなく、発明の要旨を変更しない範囲で種々変形可能であることは言うまでもない。

Claims

神経膠腫患者の術後予後を予測するための方法であって、
（ａ）前記神経膠腫患者由来の腫瘍組織又は腫瘍細胞における表１に示す遺伝子の５８個全て、または表３に示す遺伝子の３０個全ての遺伝子群の発現量を測定する工程と、
（ｂ）前記測定した発現量を標準化し、この標準化した発現量から術後予後予測スコアを計算する工程と、
（ｃ）前記計算した術後予後予測スコアが０以下の場合に予後良好と決定し、前記計算した術後予後予測スコアが０以上の場合に予後不良と決定する工程と
を有し、前記術後予後予測スコアは以下の式Ｉによって計算されるものであり、

式中、各遺伝子のＣｏｘＢｅｔａは表１に示すものであることを特徴とする方法。
神経膠腫患者の術後予後を予測するために用いるキットであって、
表１中の遺伝子の５８個全て、または表３中の遺伝子の３０個全ての遺伝子群のそれぞれ少なくとも一部の塩基配列から成り、当該遺伝子群に対するプローブまたはプライマーとして使用し得るポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドを有することを特徴とするキット。
前記ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドが標識されていることを特徴とする、請求項２記載のキット。