JP5323710B2

JP5323710B2 - ヒトに適合するモノクローナル抗体に使用するための方法

Info

Publication number: JP5323710B2
Application number: JP2009534854A
Authority: JP
Inventors: チエン，シツオング; ツアオ，シヤンロング
Original assignee: ヤンセンバイオテツク，インコーポレーテツド
Priority date: 2006-10-26
Filing date: 2007-10-25
Publication date: 2013-10-23
Anticipated expiration: 2027-10-25
Also published as: JP2010508290A; US20090137403A1; ES2410886T3; WO2008052108A3; DK2094728T3; PT2094728E; SI2094728T1; EP2094728A4; EP2094728B1; EP2094728A2; WO2008052108A2; US8093068B2

Description

発明の分野
本発明は、齧歯の抗体のような非ヒトモノクローナル抗体をヒトへ適合させるために使用するヒト可変領域フレイムワークの選択法に関する。

発明の背景
抗体のヒトへの適合化（ａｎｔｉｂｏｄｙｈｕｍａｎａｄａｐｔａｔｉｏｎ）は、ヒトの治療用標的に対して異種のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を操作して、ヒト抗体配列の抗原結合特異性を保存しつつ、異種配列をヒト抗体配列に最大限置き換えることを説明する一般用語である。この目的はこれら抗体の免疫原性を下げて、それらの治療的特性および価値を向上させることである。生成する操作した抗体は当該技術分野ではヒト化またはＣＤＲグラフティング（ＣＤＲ−ｇｒａｆｔｅｄ）抗体としても知られている。

現在、抗体のヒトへの適合に最も広く使用されている技術は“ＣＤＲグラフティング”として知られている。この技術の科学的基礎は、抗体の結合特異性が主に抗体の軽鎖および重鎖可変領域（Ｖ−領域）の相補性決定領域（ＣＤＲ）として知られている３つの超可変性ループ内にあり、一方、より保存されたフレイムワーク領域（フレイムワーク、ＦＷ：フレイムワーク領域、ＦＲ）は、構造支持機能を提供するという点である。ＣＤＲを正しく選択されたＦＷに移植することにより、幾らか、またはすべての抗体結合活性を、生じた組換え抗体に移すことができる。ＣＤＲグラフティングによる特異性の転移の最初の証明は、ハプテンであるニトロフェノール（ＮＰ）に関するものであった（非特許文献１）。

ＣＤＲを規定するための方法論は十分に確立されてきたので、ＣＤＲグラフティングに対して鍵となるのは移植に最適なヒト抗体受容体の選択である。供与体のＣＤＲまたは供与体のＦＷのアミノ酸配列に、または供与体の構造に最高の類似性のもつヒト抗体受容体を選択するために、様々な方法が開発された。これらすべての「ベストフィット（ｂｅｓｔｆｉｔ）」法は大変合理的に見えるが、実際には１つの仮定、すなわち元の抗体に最も類似している（アミノ酸配列または構造において）組換え抗体を生じることが元の抗原結合活性を最もよく保存するということに基づいている。これらの方法はすべて治療用抗体の作成に成功裏に応用されてきた（例えば、非特許文献２、３、４）が、元となる仮説が厳密に試験されたことはない。

ベストフィット法の１つの潜在的問題点は、ベストフィットの基準が数学的であり、必ずしも生物学的ではない点である。相同性の程度により測定される適合性（ｆｉｔｎｅｓｓ）は、例えば同一、相同的、および非類似のアミノ酸残基または核酸配列に割り当てられた数値の和である。これらの割当値は多くの他の相同性評価系でおおざっぱに確認されてきたが、他の系には重要ではないかもしれないわずかな差異が、抗体のヒトへの適合化においてベストフィットを算出するために重要となる可能性がある。

関連する問題は、供与体に関して全適合性（ｔｏｔａｌｆｉｔｎｅｓｓ）が同一かまたは程度が大変近い２つの受容体と仮定すると、それらの異なるＦＲ中での位置的適合性は異なるかもしれない。１つの領域がもう１つの領域よりも重要となり得るのか？それをどのように定めるのか？手短に述べると、数学的モデルは抗体工学の供与体−受容体の関係においてベストフィットを算出する要件を満たすことについて今まで検証されてこなかった。

さらに複雑なことは抗体の２つの鎖間の相互作用に関係する：それはベストフィットする重鎖受容体およびベストフィットする軽鎖受容体が、供与体の結合活性を最も良く保存するためには互いに合わないかもしれない点である。鎖間の適合性を評価するために利用できる道具はない。研究者達はより良い対合を見いだすために、同じエピトープに対して幾つかの抗体の重鎖および軽鎖を合わせた。しかしこれは抗体のヒトへの適合化に試みられてこなかった。

理論的にすべてのヒト生殖細胞系配列がシークエンシングされ、そして抗体のＦＷの調査に利用することができる。しかし実際には、これまで抗体のヒト化に使用されてきたヒトＶ領域のほとんどが成熟抗体遺伝子、しばしば黒色腫タンパク質に由来する。それらは体細胞突然変異を含む可能性がある。これらの突然変異は再配列された遺伝子が由来する個体に独自であり、したがって他の個体にとっては外来と見られるであろう。生殖細胞系のデータベース配列は、これらの視点からの抗体のヒト化により適するものとなる。しかし全ＦＷをコードする生殖細胞系のデータベース配列は抗体のヒト化に直ちに利用できず、そしてそれらは未処理（ｒａｗ）のＶおよびＪ遺伝子配列の組み合わせにより作成され得るだけである。

受容体のＦＷに成熟抗体遺伝子を使用する別の問題は、軽鎖用に有力なＶ−Ｊの組み合わせ、または重鎖用にＶ−Ｄ−Ｊの組み合わせのすべてが成熟遺伝子で表されるわけではないという点である。すなわち極めて合ったＶ遺伝子があまり合わないＪセグメントに連結されるという状況も生じ得る。非特許文献５に記載されるマウス抗−Ｔａｃモノクローナル抗体のヒト化が一例である。ＮＢＲＦ−ＰＩＲデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｓｃ．ｅｄｕ／ｇｅｎｅｒａｌ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｐａｃｋａｇｅｓ／ｎｂｒｆ−ｐｉｒ／ｎｂｒｆ．ｈｔｍｌ）に対して抗−ＴａｃＶ_Ｈ領域を比較することにより、ヒト黒色腫タンパク質ＥｕのＶ_Ｈ領域が最高度の相同性を有することが示された（ＶＤＪ_Ｈにわたり５７％同一）。しかしＥｕＶ_Ｈ領域のフレイムワーク４は、恐らくＥｕＪ_Ｈセグメントによりコードされる幾つかのアミノ酸を有し、これはヒトＪ_Ｈセグメントに典型的ではない。これはＥｕフレイムワーク４と抗−Ｔａｃのフレイムワーク４との間で良くない対合をもたらした（図１）。既知の機能的なヒトＪ_Ｈセグメントのアミノ酸配列（その中に６つある：図２参照）に対する抗−ＴａｃＪ_Ｈ領域（フレイムワーク４およびフレイムワーク４−ＣＤＲ３の近位末端）の選別した（ｓｅｐａｒａｔｅ）比較では、ヒトＪ_Ｈ４がＥｕＪ_Ｈよりも良い対合であることを示す。この例はＶおよびＪ要素の選別比較が、齧歯類とヒトとの間の抗体配列の全可変領域の比較よりも有利であることを示唆している。現在、この種の選別比較のためのツールは直ぐに利用できない。

ＣＤＲ中のすべてのアミノ酸が抗原の結合に関与しているわけではない。すなわち抗原−抗体の相互作用に重要な残基のみ（いわゆる特異性決定残基の移植：ＳＤＲ移植）を移植することは、生じる組換え抗体中のヒト抗体配列の含量をさらに上げるだろうと提案されてきた（非特許文献６、７）。この方法の応用には抗体構造ならびに抗体−抗原接触残基に関する情報が必要であり、これらは利用できないことが多い。たとえそのような情報を利用することができても、ＳＤＲを確かに同定するために利用できる系統的方法がなく、そしてＳＤＲ移植はこれまで多くが基本的な研究レベルに留まっている。

最近、「ヒトフレイムワークシャッフリング（ｈｕｍａｎｆｒａｍｅｗｏｒｋｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）」と呼ばれる新規な方法が開発された（非特許文献８）。この技術はＣＤＲをコードするＤＮＡフラグメントをヒトＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４をコードするＤＮＡフラグメントに連結し、これにより供与体ＣＤＲとヒトＦＲとの間のすべての組み合わせのライブラリーを作成することにより働く。この方法は成功裏に応用されてきたが、２つの潜在的問題がある。第１に、生じる抗体のＦＲは、すべてがヒト起源であ
るものの、非連続的ＦＷに由来する可能性があり、したがって不自然である。これらの不自然なＦＷがヒトにおいて免疫原性であるかどうかを確かめることが必要である。第２に理論的にライブラリーはひどく大きくなる可能性があり、スクリーニングおよびアッセイに多くの資源が必要がある。

このようにヒトに適合した抗体を作成するために改善された方法が必要である。

Ｊｏｎｅｓｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３２１：５２２−５２５（１９８６）Ｔｅｍｐｅｓｔｅｔａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．９：２６６−７１（１９９１）Ｇｏｒｍａｎｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：４１８１−４１８５（１９９１）Ｃｏｅｔａｌ．，ＪＩｍｍｕｎｏｌ．１５２：２９６８−７６（１９９４）Ｑｕｅｅｎｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：１００２９−１００３３（１９８９）Ｋａｓｈｍｉｒｉｅｔａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ．３６：２５−３４（２００５）Ｇｏｎｚａｌｅｓｅｔａｌ．，ＭｏｌＩｍｍｕｎｏｌ．４０：３３７−４９（２００４）Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａｅｔａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ３６：４３−６０（２００５）

発明の要約
本発明の１つの観点は、ヒトに適合した抗体の作成に使用するためのヒト抗体のフレイムワークの選択法であり、この方法は：
ａ．非ヒト抗体の可変領域のペプチド配列を得；
ｂ．非ヒト可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）およびフレイムワーク領域のペプチド配列を線引きし；
ｃ．ヒト生殖細胞系遺伝子によりコードされるヒト抗体のフレイムワーク１、２、３および４領域のペプチド配列のライブラリーを構築し；
ｄ．非ヒト成熟抗体のフレイムワーク領域と同一の長さを有するライブラリーからヒトペプチド配列のメンバーのサブセットを選択し；
ｅ．選択したヒトペプチド配列と非ヒトフレイムワーク領域のペプチド配列のフレイム領域の配列類似性を比較し；
ｆ．選択したヒトペプチド配列と非ヒトフレイムワーク領域のペプチド配列との間のＣＤＲ１およびＣＤＲ２の長さの適合性を比較し；
ｇ．選択したヒトペプチド配列の第２のサブセットを選択し、ここで選択したペプチド配列は同一性閾値よりも大きなフレイム領域類似性を有し、そしてＣＤＲ１およびＣＤＲ２の長さの差異の和がＣＤＲ１２の長さの適合性閾値より小さいか、またはそれに等しく；そして
ｈ．ライブラリーのサイズ値およびフレイムワーク領域の重複値に基づき、工程ｇ）の第２のサブセットから、代表的なフレイムワークを選択する、
工程を含んでなる。

本発明の別の観点はヒトに適合した抗体の作成法であって、この方法は：
ａ．非ヒト抗体の可変領域のペプチド配列を得；
ｂ．非ヒト可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）およびフレイムワーク領域のペプチド配列を線引きし；
ｃ．ヒト生殖細胞系遺伝子によりコードされるヒト抗体のフレイムワーク１、２、３および４領域のペプチド配列のライブラリーを構築し；
ｄ．非ヒト成熟抗体のフレイムワーク領域と同一の長さを有するライブラリーからヒトペプチド配列のメンバーのサブセットを選択し；
ｅ．選択したヒトペプチド配列と非ヒトフレイムワーク領域のペプチド配列とのフレイム領域の配列類似性を比較し；
ｆ．選択したヒトペプチド配列と非ヒトフレイムワーク領域のペプチド配列との間のＣＤＲ１およびＣＤＲ２の長さの適合性を比較し；
ｇ．選択したヒトペプチド配列の第２のサブセットを選択し、ここで選択したペプチド配列は同一性閾値よりも大きなフレイム領域類似性を有し、そしてＣＤＲ１およびＣＤＲ２の長さの差異の和がＣＤＲ１２の長さの適合性閾値より小さいか、またはそれに等しく；ｈ．ライブラリーのサイズ値およびフレイムワーク領域の重複値に基づき、工程ｇ）の第２のサブセットから、代表的なフレイムワークを選択し；そして
ｉ．非ヒト可変領域からの各ＣＤＲ領域および工程ｈ）で選択されたヒト重鎖および軽鎖の代表的フレイムワークの少なくとも１つのメンバーからのフレイムワーク領域を含むキメラ分子を構築し、ここでキメラ分子は非ヒト抗体が結合する抗原と同じ抗原に結合するヒトに適合した抗体または抗体フラグメントである、
工程を含んでなる。

抗−ＴａｃＪＨ領域の比較を表す。ヒトＪＨセグメントのアミノ酸配列を表す。フレイムワークライブラリーのアルゴリズムの流れ図を表す。Ｖ、Ｄ、Ｊ遺伝子フラグメントから可変ＦＲ／ＣＤＲを表す。重鎖可変領域に関するアミノ酸配列および対応するマウス抗−ＴＬＲ３ｍＡｂ１０６８のＦＲ／ＣＤＲを表す。１０６８軽鎖可変領域に関するアミノ酸配列および対応するマウス抗−ＴＬＲ３ｍＡｂ１０６８のＦＲ／ＣＤＲを表す。重鎖ＦＷライブラリー配列のアライメントを表す。軽鎖ＦＷライブラリー配列のアライメントを表す。図９Ａ、Ｂ、ＣおよびＤはヒトに適合した抗−ＴＬＲ３ｍＡｂのｈＴＬＲ３への結合をＥＬＩＳＡアッセイで表す。

発明の詳細な説明
限定するわけではないが特許および特許出願を含め、本明細書に引用するすべての刊行物は参照により完全に説明されているように編入する。

本明細書および特許請求の範囲で使用するように、単数形“ａ”、“ａｎｄ”および“ｔｈｅ”は、内容が明らかにそうではなことを記載する場合を除いて、複数形を含む。すなわち例えば「ペプチド鎖（ａｐｅｐｔｉｄｅｃｈａｉｎ）」とは、１もしくは複数のペプチド鎖を指し、そして当業者に知られているそれらの等価物を含む。

他に定義しない限り、本明細書で使用するすべての技術的および科学的用語は本発明が属する分野の当業者が通常理解している意味と同じ意味を有する。本明細書に記載する方法に類似または等価の方法を本発明の実施または試験に使用することができるが、本明細書では例示的方法として記載している。

用語「抗体」は免疫グロブリンまたは抗体分子および抗体フラグメントを意味する。一般に、抗体は特異的抗原に結合特異性を表すタンパク質またはポリペプチドである。無傷（ｉｎｔａｃｔ）な抗体は２つの同一軽鎖および２つの同一重鎖からなるヘテロ四量体の糖タンパク質である。典型的には各軽鎖が１つの共有ジスルフィド結合により重鎖に連結され、一方、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間のジスルフィド結合の数は変動する。各重鎖および軽鎖は規則正しく間隔を空けた鎖内ジスルフィド架橋も有する。各重鎖は１端に可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）、続いて幾つかの定常ドメインを有する。各軽鎖は１端に可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）およびもう１端に定常ドメインを有し；軽鎖の定常ドメインは重鎖の第１の定常ドメインに並び、そして軽鎖可変ドメインは重鎖の可変ドメインに並ぶ。脊椎動物種の抗体軽鎖は、２つの明らかに異なる型、すなわちカッパ（κ）およびラムダ（λ）の１つに、それら定常ドメインのアミノ酸配列に基づき割り当てることができる。

免疫グロブリンは重鎖定常ドメインのアミノ酸配列に依存して５つの主要なクラス、すなわちＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭに分類できる。さらにＩｇＡおよびＩｇＧはアイソタイプＩｇＡ_１、ＩｇＡ_２、ＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３およびＩｇＧ_４に再分類される（ｓｕｂ−ｃｌａｓｓｉｆｉｅｄ）。

抗体は形質細胞により構成的に発現され、そして分泌される分泌型のタンパク質である。また抗体はハイブリドーマ生産のような標準的方法により不死化された形質細胞を使用して、または抗体重鎖および／もしくは軽鎖遺伝子の不死化Ｂ細胞、例えば黒色腫細胞もしくは他の細胞型、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、植物細胞および昆虫細胞へのトランスフェクションにより生産することもできる。

用語「抗体フラグメント」は、無傷な抗体の一部、一般に無傷な抗体の抗原結合または可変領域を意味する。抗体フラグメントの例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２およびＦｖフラグメント、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、単鎖抗体分子、例えばｓｃＦｖ分子を含み、ここで可変重鎖および可変軽鎖は１つのポリペプチド鎖にリンカーにより連結され、そして少なくとも２つの無傷な抗体から多重特異性（ｍｕｌｔｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗体が形成される。

ヒト化、ヒトに適合したおよびＣＤＲグラフト化抗体は、ヒト以外の種に由来するＣＤＲおよびヒト抗体に由来する可変領域フレイムワーク領域および定常領域を含むキメラモノクローナル抗体である。

本発明は新規抗体のヒトへの適合化法を提供する。この方法はヒト生殖細胞系ＶおよびＪ遺伝子を受容体ＦＷ配列の供給源として使用し、すべての受容体ＦＷを非ヒト抗体とヒト生殖細胞系配列との間のＦＷの類似性および他の基準に基づき順位付けし、そして代表的なヒトに適合した抗体のライブラリーを作成する（図３の流れ図を参照にされたい）。本発明の方法で使用するアルゴリズムを以下に記載する。

１．仮想のヒトＦＷデータベースの作成
生殖細胞系のＶおよびＪ遺伝子配列はＶＢａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｖｂａｓｅ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／）のデータベースからダウンロードした。ＶＢａｓｅは、ＧｅｎｂａｎｋおよびＥＭＢＬデータライブラリーから現在公開されているものを含め、数千の公開配列から編集されたすべてのヒト生殖細胞系可変領域配列の包括的ディレクトリーである。このデータベースは、ヒト抗体遺伝子のシークエンシングおよびマッピングに関する作業の延長として、タンパク質工学のＭＲＣセンター（ＭＲＣＣｅｎｔｒｅ
ｆｏｒＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）で数年間かけて開発された。

ＦＷは４つの短いフレイムワーク領域（ＦＲ）からなる。図４から分かるように、ＦＲ１、ＦＲ２およびＦＲ３は生殖細胞系のＶ遺伝子フラグメントによりコードされ、一方、ＦＲ４は生殖細胞系Ｊ遺伝子フラグメントによりコードされる。ＶＢａｓｅデータベースでは、各生殖細胞系Ｖ遺伝子がＦＲおよびＣＤＲ領域に設定された。本発明のフレイムワークライブラリー法を実施するために、仮想のＦＷデータベースをＶおよびＪ遺伝子配列から作成した。仮想のＦＷデータベース中の各記録は、４つのフィールド、すなわちＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４からなり、そしてＦＲの網羅的なＶ／Ｊ組み合わせにより作成される。例えば重鎖では、６つのＪＨフラグメントがあるが、それらは４つの独自なＦＲ４フラグメントをコードするだけである（同じＦＲ４をコードするＪＨ１、ＪＨ４およびＪＨ５により）（図２を参照にされたい）。各ＪＨ配列に由来する最後の１１残基はＦＲ４に対応する。重鎖生殖細胞系Ｖ遺伝子に由来するすべてのＦＲ１−ＦＲ２−ＦＲ３とこれらの４つの独自なＦＲ４の対合により、重鎖のＦＷデータベースが作成された。カッパおよびラムダ軽鎖に関するこのＦＷデータベースも同様に作成された。

生じたＦＷデータベースには全部で６６６の記録があり、そのうちの２６０が生殖細胞系の重鎖から作成され、そして１９０および２１６がそれぞれカッパおよびラムダ軽鎖から作成される。ＦＷデータベースには重複する登録は無く、そして各ＦＷ記録が独自である。

２．抗体配列のＦＲおよびＣＤＲへの線引き
抗体配列の可変性に基づくＫａｂａｔのＣＤＲの定義が、配列の線引きによく使用される。他の既知の法則またはパターン（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）も、抗体配列中にＣＤＲを見いだすためによく応用されるが、多くの抗体のＣＤＲがパターンに適合しないことはまれではない。ＣＤＲに比べてＦＲは長さおよび相同性の点で一層保存されている。ＣＤＲを直接見いだすことに代えて、本発明の方法はＦＲを同定するために、以下に記載するようなアルゴリズムを使用し、そして対応するＣＤＲをしかるべく演繹する（抗体ＦＲ／ＣＤＲ分解については図４を参照にされたい）。

上記のように構築されたＦＷのデータベースは、各ＦＷについてＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４配列を含む。所定の抗体配列およびその適合する生殖細胞系ＦＷについて、アルゴリズムが以下のようにフレイム領域を同定する（すなわち、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４配列）。ＦＲ２を例にとると、ヒト生殖細胞系配列から導かれるＦＲ２ウィンドウは、第１残基から始まる抗体配列に沿って動かされ、そしてウィンドウ中の配列に関する類似性が各残基の位置で計算される。ＦＲ２ウィンドウ配列はその抗体の対の配列と合った時、高い類似性ピークが観察され、これによりＦＲ２を同定する。同様に、ＦＲ１、ＦＲ３およびＦＲ４を類似様式で見いだすことができる。このアルゴリズムはフレイム領域を同定するのに大変効果的であり、そして任意の抗体配列に普遍的に応用することができる。

３．新規フラグメントに基づく相同性およびフレイムワークデータベースのフィルタリング
ＣＤＲグラフティングでは、齧歯類供与体の抗体のＦＷがヒトのものに置き換えられ、そしてＣＤＲは同じままである。しかし齧歯類抗体中の各ＦＲの長さがヒトＦＲ中の長さと適合しなければならない。供与体の抗体配列がＦＲおよびＣＤＲ領域に線引きされた後、そのＦＲは上で作成したデータベース中の各ＦＷと比較される。これにより供与体の抗体に対するそれらの類似性により順位付けされたＦＷのリストが作成される。本発明の相同性比較アルゴリズムを以下に詳述する。

最初に、非ヒト抗体のＦＲとヒトＦＲとの間のＦＲ長の適合性がチェックされ、そして非ヒトＦＲと同一長を有するヒト配列のサブセットが選択される。例えばＦＲ１では、重鎖に関するこの領域には常に３０の残基があり、一方、カッパおよびラムダ鎖に関して、この数は常にそれぞれ２２および２３である。所定の抗体がカッパ軽鎖である場合、データベース中これらカッパＦＷのみを選択することができ；供与体と受容体との間のＦＲ１の長さは同一ではないので、ラムダＦＷを選択することはできないが、供与体のカッパ配列は全体としてラムダ生殖細胞系に大変類似する見込みが高い。この新規な相同性の比較アルゴリズムは、ＦＷの選択で疑陽性を有意に減らすことが期待される。

次いで受容体ＦＷはＦＲ長の適合性のチェックを通った場合、供与体と受容体ＦＷとの間の残基の差異の数を数えられ、次いで供与体と受容体ＦＷ配列との間の全体的な配列類似性が計算される。類似性が同一性閾値（ｉｄｅｎｔｉｔｙｔｈｒｅｓｈｏｌｄｖａｌｕｅ）と呼ぶ閾値未満の場合、対応するＦＷは飛ばされる／除かれる。同一性閾値は使用者に特定のパラメーターであり、そしてデフォルト値は重および軽鎖の両方について少なくとも６０％である。このパラメーターの目的は、供与体と合理的な類似性を持つＦＷのみがＣＤＲグラフティングに選択できるように、候補ＦＷの数を減らすことである。

次いで選択したヒトのペプチド配列と非ヒトフレイムワーク領域のペプチド配列との間のＣＤＲ１およびＣＤＲ２長の適合性が比較される。具体的にはＣＤＲ１長が比較され、そして異なる残基の数を反映する値が作成される。同様にＣＤＲ２長が比較され、そして同様の値が作成される。ＣＤＲ１およびＣＤＲ２長の差異の値が一緒に加えられてＣＤＲ１２長の適合値（ＣＤＲ１２ｌｅｎｇｔｈｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙｖａｌｕｅ）が作成される。ＣＤＲ１２長の適合閾値（ＣＤＲ１２ｌｅｎｇｔｈｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙｔｈｒｅｓｈｏｌｄｖａｌｕｅ）より高いＣＤＲ１２長の適合値を有するフレイムワークは排除される。推薦されるＣＤＲ１２長の適合閾値は、０または１である。

最後に仮想ＦＷデータベースの長さの比較、配列相同性およびＣＤＲ１２長の比較から同定されたすべての候補ＦＷは、最も相同的なＦＷが１位に順位付けられるようにＦＷ配列の同一性に基づき分類される。

４．スクリーニングのための代表的ＦＷの選択
特定の状況下では、全候補組よりも小さい代表的な候補ＦＷのライブラリーをスクリーニングすることが望ましいかもしれない。最初にＦＷの中には、幾つかの生殖細胞系配列間で生来、近い類似性によりわずか１つの残基の差異で互いに似過ぎているものもある。この状況では、スクリーニングにそのようなすべてのＦＷを含まないことが合理的かつ有利であり、そしてその代わりに代表的な１つのＦＷを選択する。第２にウェットラボでは、生じたライブラリーが大きすぎる場合、すべての組み合わせＦＷをスクリーニングする能力が無いかもしれない。例えばＦＷ類似性閾値が６０％（重鎖について）、および７０％（軽鎖について）のデフォルトに設定される場合、７５および８０の候補ＦＷがマウス抗−ＴＬＲ３ｍＡｂの重鎖および軽鎖についてそれぞれ得られた（図５および６、およ
び以下の実施例１を参照にされたい）。ＨＣ／ＬＣＦＷの組み合わせの総数は６０００であり、そしてこれはウェットラボでのスクリーニングとしては大きな挑戦となる。

本発明では、代表的ＦＷの選択を自動化し、そしてスクリーニング用に一層小さく、かつ重複が少ないＦＷライブラリーを作成するためのアルゴリズムが開発された。使用者はＦＷライブラリーサイズ（メンバー数）、そしてＦＷ重複基準（重複閾値：Ｒｅｄｕｎｄａｎｔ＿Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）を入力することができ、そしてアルゴリズムが自動的にすべての候補ＦＷを比較し、そしてしかるべくＦＷライブラリーを作成する。ＦＷ重複基準の選択は、相同性比較後の候補ＦＷの総数およびスクリーニングに望ましいサイズのＦＷライブラリーに依存する。実際には１〜３の残基の差異が薦められる。ＦＷライブラリーのサイズは任意の整数、例えば４〜２０であることができる。アルゴリズムのステップおよびパラメーターを以下に詳細に記載する。

アルゴリズムのパラメーター：
候補＿ＦＷ＿リスト：相同性比較後のすべての候補ＦＷ；
出力＿ＦＷ＿リスト：ＦＷライブラリー配列のリスト；
ライブラリー＿サイズ：ＦＷライブラリーのサイズ；
重複＿閾値：２つのＦＷが重複するかを考慮する基準；
アクティブ＿ＦＷ：候補ＦＷ＿リストから現在選択されているＦＷ；
流れ図：
ａ．候補＿ＦＷ＿リストのサイズをチェックし、このリストが空ならばステップｆ）へ
行く；
ｂ．候補＿ＦＷ＿リストから第１のＦＷを選択する；
ｉ．このＦＷをアクティブ＿ＦＷに設定する；
ｉｉ．これを候補＿ＦＷ＿リストからはずす；
ｉｉｉ．これを出力＿ＦＷ＿リストに入れる；
ｃ．出力＿ＦＷ＿リストをチェックし、ライブラリー＿サイズに達したらステップｆ）
へ行く；
ｄ．候補＿ＦＷ＿リスト中の各ＦＷとアクティブ＿ＦＷとの間の残基の差異をカウント
し、差異が重複＿閾値未満ならばこのＦＷを候補＿ＦＷ＿リストからはずし；
ｅ．ステップａ）へ行き；
ｆ．齧歯類抗体のＣＤＲを、出力＿ＦＷ＿リスト中の各ＦＷに移植し；そして終了する
。
出力：
代表的なヒト化抗体のライブラリー

上記に定めたアルゴリズムを変更して、ウェットラボのスクリーニング能力に合うようにＦＷライブラリーのサイズを変えることができる。齧歯類の抗体重鎖および軽鎖について、対応するＦＷライブラリーがそれぞれ作成され、そしてヒトに適合したすべての重鎖および軽鎖がスクリーニングのために組み合わされる。このように本発明の全ＦＷライブラリー法のアルゴリズムは、親和性の保持に重要となる見込みがある最適な鎖間相互作用を持つヒト重鎖および軽鎖の好ましい対を見いだす確率を上げる。

当業者はオブジェクト指向のＪａｖａ言語におけるようなコンピュータープログラミングを介して、アルゴリズムの重要なステップを自動化することができた。有用なインポート／エクスポート機能には、齧歯類抗体配列を種々の形式で読み取り、そしてＦＷライブラリーの組をフラットなＦａｓｔａファイルに書き込み、またはそれらをスプレッドシートもしくはＨＴＭＬファイルにエクスポートする能力を含む。

本発明の方法によりヒト重鎖および軽鎖フレイムワークの好ましい対を選択した後、非
ヒト可変領域からのＣＤＲ領域、および選択したヒト重鎖および軽鎖の代表的フレイムワークの少なくとも１つのメンバーからのフレイムワーク領域をそれぞれ含むキメラ分子を構築することができ、ここでキメラ分子は非ヒト抗体が結合する抗原と同じ抗原に結合するヒトに適合した抗体または抗体フラグメントである。当業者には周知である組換えＤＮＡ技法を使用してキメラ分子を構築することができる。次いでキメラ分子は各分子について、抗原に対する結合親和性をスクリーニングし、そして最適なヒトに適合した抗体もしくは抗体フラグメントを選択することにより選択することができる。

本発明の方法は、現行のヒト適合化技術よりも多くの利点を提供する。例えばＳＤＲ移植のような構造に基づくすべての他の方法とは対照的に、本発明の方法は詳細な抗体または抗原−抗体複合体構造の情報が必要ではない。本発明の方法の別の利点は、同じＣＤＲ供与体に関して幾つかの同等な、しかし明らかに異なるヒト化抗体を提供できる点である。これは治療用の抗体の開発に特に有用であり、研究者はリード候補を選択し、そして１もしくは複数の第２世代もしくはバックアップ候補を有することができるようになる。

本発明の方法に関連する別の利点は、これらの同等な候補はそれらの異なる配列により、異なる化学的、生理学的および製薬学的特性を有することができる点である。これは治療用抗体の改善における他の観点で利用することができる。例えば低い溶解性の抗体のＣＤＲをヒトのフレイムワークライブラリーに合わせ、そして改善された溶解性を持つ良い結合体を生じた抗体から選択することができる。

本発明はこれから以下の具体的な非限定的実施例を参照にして記載する。

マウスモノクローナル抗体のヒトへの適合化
マウス抗−ＴＬＲ３ｍＡｂＣ１０６８重鎖（ＨＣ）および軽鎖（ＬＣ）のアミノ酸配列は、それぞれ図５および６に列挙する。検討した本発明のフレイムワークライブラリーのヒト化法アルゴリズムをｍＡｂＣ１０６８に対して応用して、８種のＨＣおよび１２種のＬＣのＦＷライブラリー組を作成した。４種のＨＣおよび４種のＬＣを初期のスクリーニングに取り出した。

各ＦＷとｍＡｂＣ１０６８との間の類似性を表１に報告する。結果は４種のＨＣおよび４種のＬＣのすべてが全体的な配列類似性という意味で同等であることを示す。４種のＨＣの多くの配列アライメントは、これら４種のＦＷが互いに大変類似していることを示し（図７）、そしてこれは４種のＬＣＦＷにもあてはまる（多くのＦＷ配列アライメントについては図８を参照にされたい）。

４種の重鎖および４種の軽鎖可変領域構築物のすべての可能な組み合わせを表す１６の
ｍＡｂが発現された。すべての重鎖可変領域のフレイムワークは、残基１０８でＳｅｒからＰｒｏへの置換、およびＰｈｅ１１４およびＬｅｕ１１５からのＡｌａ置換；完全長の重鎖でのＳ２２８Ｐ、Ｆ２３４ＡおよびＬ２３５Ａを有するヒトＩｇＧ４重鎖定常領域で発現された。すべての軽鎖可変領域のフレイムワークはヒトＫ定常領域を使用して発現された。抗体は、適切な重鎖および軽鎖を含有するプラスミドの同時トランスフェクションにより哺乳動物細胞で一時的に発現された。抗体は標準的なプロテインＡ精製を使用して精製され、そして特性決定のためにＰＢＳに透析された。

１６すべてのｍＡｂが、親のマウスｍＡｂＣ１０６８に対して比較されるようにＥＬＩＳＡ形式を使用してヒトＴＬＲ３の細胞外ドメインへの結合を評価された。簡単に説明すると、可溶性ヒトＴＬＲ３の細胞外ドメインを９６ウェルプレートのウェルに塗布し、そして候補ｍＡｂを種々の濃度（１０〜３から１０３ｎｇ／ｍｌ）でインキュベーションし、そして結合した抗体はマウスＩｇＧ１アイソタイプにはウサギ抗−マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（ザイメッド：Ｚｙｍｅｄ、サウスサンフランシスコ、カリフォルニア州）で、またはヒトＩｇＧ４アイソタイプにはＨＲＰ−標識抗−ヒトＩｇＧ（ジャクソン：Ｊａｃｋｓｏｎ１０９−０３６−０８８）で検出した。ＥＣ_５０値を決定し、そしてスクリーニングの結果を図９および以下の表２に示す。

Ｃ１０６８について算出されたＥＣ_５０は８ｎｇ／ｍｌであった；結果はヒトに適合したｍＡｂの１２種が、親マウスのｍＡｂ１０６８に対して算出されたＥＣ_５０よりも４０倍未満の低下を有することを示した。対ＬＶ５／ＨＶ５、ＬＶ５／ＬＶ４およびＬＶ１／ＨＶ５は、最も相同的な対ＬＶ１／ＨＶ１よりも親和性という意味で良い。

表２および図９の親和性のデータは、明らかに少なくとも抗−ＴＬＲ３抗体の場合にはベストフィット選択が最高の受容体ではないことを表し、そして鎖間相互作用が抗体の親和性に貢献することを示す。したがって我々の新規なヒトフレイムワークライブラリー法およびアルゴリズムは、従来のベストフィットの取り組みに基本的に挑戦し、そして同時に抗体のヒト化の受容体の選択に大変有望な実験的取り組みを提供する。

本発明を完全に記載しているが、当業者には多くの変更および修飾が添付する請求の範囲の精神および範囲から逸脱することなくなされ得ることは明白である。

Claims

ヒトに適合した抗体の作成に使用するためのヒト抗体フレイムワークの選択法であって：
ａ．非ヒト抗体の可変領域のペプチド配列を得；
ｂ．非ヒト可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）およびフレイムワーク領域のペプチド配列を線引きし；
ｃ．ヒト生殖細胞系遺伝子によりコードされるヒト抗体フレイムワーク１、２、３および４領域のペプチド配列のライブラリーを構築し；
ｄ．非ヒト成熟抗体のフレイムワーク領域と同一の長さを有するライブラリーからヒトペプチド配列のメンバーのサブセットを選択し；
ｅ．選択したヒトペプチド配列と非ヒトフレイムワーク領域のペプチド配列のフレイムワーク領域の配列類似性を比較し；
ｆ．選択したヒトペプチド配列と非ヒトフレイムワーク領域のペプチド配列との間のＣＤＲ１およびＣＤＲ２の長さの適合性を比較し；
ｇ．選択したヒトペプチド配列の第２のサブセットを選択し、ここで選択した第２のサブセットは同一性閾値よりも大きなフレイムワーク領域のアミノ酸配列類似性を有し、そしてＣＤＲ１およびＣＤＲ２の長さの差異の和がＣＤＲ１２の長さの適合性閾値より小さいか、またはそれに等しく；そして
ｈ．ライブラリーのサイズ値およびフレイムワーク領域の重複値に基づき、工程ｇ）の第２のサブセットから代表的なフレイムワークを選択する、
工程を含んでなる上記方法。
ヒトに適合した抗体また抗体フラグメントの作成法であって：
ａ．非ヒト抗体の可変領域のペプチド配列を得；
ｂ．非ヒト可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）およびフレイムワーク領域のペプチド配列を線引きし；
ｃ．ヒト生殖細胞系遺伝子によりコードされるヒト抗体フレイムワーク１、２、３および４領域のペプチド配列のライブラリーを構築し；
ｄ．非ヒト成熟抗体のフレイムワーク領域と同一の長さを有するライブラリーからヒトペプチド配列のメンバーのサブセットを選択し；
ｅ．選択したヒトペプチド配列と非ヒトフレイムワーク領域のペプチド配列とのフレイムワーク領域の配列類似性を比較し；
ｆ．選択したヒトペプチド配列と非ヒトフレイムワーク領域のペプチド配列との間のＣＤＲ１およびＣＤＲ２の長さの適合性を比較し；
ｇ．選択したヒトペプチド配列の第２のサブセットを選択し、ここで選択した第のサブセットは同一性閾値よりも大きなフレイムワーク領域のアミノ酸配列類似性を有し、そしてＣＤＲ１およびＣＤＲ２の長さの差異の和がＣＤＲ１２の長さの適合性閾値より小さいか、またはそれに等しく；
ｈ．ライブラリーのサイズ値およびフレイムワーク領域の重複値に基づき、工程ｇ）の第２のサブセットから代表的なフレイムワークを選択し；そして
ｉ．非ヒト可変領域からの各ＣＤＲ領域および工程ｈ）で選択されたヒト重鎖および軽鎖の代表的フレイムワークの少なくとも１つのメンバーからのフレイムワーク領域を含むキメラ分子を構築し、ここでキメラ分子は非ヒト抗体が結合する抗原と同じ抗原に結合するヒトに適合した抗体または抗体フラグメントである、
工程を含んでなる上記方法。
さらに：
ｊ．抗原に対する結合親和性に関する各組み合わせをスクリーニングし、そして最適なヒトに適合した抗体もしくは抗体フラグメントを選択する工程を含んでなる、請求項２に記載の方法。
同一性閾値が重鎖および軽鎖フレイムワークについて少なくとも６０％である、請求項１または２に記載の方法。
ＣＤＲ１２の長さの適合性値が０または１である、請求項１または２に記載の方法。
ライブラリーサイズ値が４〜２０である、請求項１または２に記載の方法。
フレイムワーク領域の重複値が１〜３である請求項１または２に記載の方法。