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JP5279425B2 - オステオプロテゲリン結合タンパク質のアンタゴニスト性選択的結合因子 - Google Patents

オステオプロテゲリン結合タンパク質のアンタゴニスト性選択的結合因子 Download PDF

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Description

（発明の分野）
本発明は、オステオプロテゲリン結合タンパク質（ＯＰＧｂｐ）に対する選択的結合因子に関する。より詳細には、本発明は、ＯＰＧｂｐに選択的に結合し、かつ骨量の喪失に関連する状態を防止または処置するために使用することができる抗体および抗原結合ドメインに関する。本発明の選択的結合因子を製造するための核酸分子、ベクターおよび宿主細胞もまた提供される。
（発明の背景）
生きている骨組織は、骨の沈着と再吸収との動的な平衡を示している。これらのプロセスは、骨の有機マトリックスを含む様々な分子を分泌する骨芽細胞と、骨マトリックスの溶解および骨塩の可溶化を促進する破骨細胞との２つの細胞タイプによって主に媒介されている。骨が成長中である若年者では、骨沈着速度が骨溶解速度を上回っているが、中高年者では、再吸収速度が沈着を上回ることがある。後者の状況では、骨分解の増大は、骨量および骨強度の低下、骨折の危険性の増大、および折れた骨の遅い修復または不完全な修復をもたらす。
破骨細胞は、骨髄内の造血系前駆体細胞から形成される大きな食作用多核細胞である。成熟した機能的な骨芽細胞の増殖および形成は十分に理解されていないが、破骨細胞は、様々な増殖促進因子にさらされることに応答して単球／マクロファージ細胞系統に沿って成熟すると考えられている。骨髄の前駆体細胞が前破骨細胞に発達する初期段階は、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、腫瘍壊死因子−β（ＴＮＦ−β）、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）および白血病阻害因子（ＬＩＦ）などの可溶性因子によって媒介されると考えられている。培養では、前破骨細胞は、添加されたマクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）の存在下で形成される。これらの因子は、主に破骨細胞発達の初期段階で作用している。
破骨細胞の形成および骨の再吸収を刺激し、そして発達の後期段階で作用すると考えられるポリペプチド因子のオステオプロテゲリン結合タンパク質（ＯＰＧｂｐ）が記載されている。ＰＣＴ国際特許出願公開ＷＯ９８／４６７５１を参照のこと。ＯＰＧｂｐは、間質細胞株の存在下で同時培養することを必要とすることなく、骨髄前駆体細胞からの破骨細胞の形成を刺激する。ＯＰＧｂｐによる骨再吸収の刺激は、その同族受容体である、オステオプロテゲリンの分化および活性化受容体（ＯＤＡＲ）との相互作用を必要とし、そしてオステオプロテゲリン（ＯＰＧ）によるＯＤＡＲ／ＯＰＧｂｐの相互作用の阻害は骨の再吸収をも阻害した。従って、ＯＤＡＲに対するＯＰＧｂｐの結合を調節することにより、破骨細胞の形成および骨の喪失は影響を受ける。
ＯＰＧｂｐとＯＤＡＲとの相互作用を調節する選択的結合因子、特に、ＯＰＧｂｐとＯＤＡＲとの相互作用を阻止し、かつ／または骨の再吸収などのＯＰＧｂｐの少なくとも１つの活性を阻害するそのような因子を同定することは本発明の目的の１つである。骨量の喪失を防止および処置するために使用することができるそのような選択的結合因子を同定することは本発明のさらなる目的である。ＯＰＧｂｐとＯＤＡＲとの相互作用を調節し、かつＯＰＧｂｐの少なくとも１つの活性を中和する抗体または抗原結合ドメインまたはそのフラグメントもしくは変化体を同定することは本発明のさらなる目的である。本発明の抗体は、骨量の喪失を防止および処置するために使用することができる。
（発明の概要）
本発明は、オステオプロテゲリン結合タンパク質（ＯＰＧｂｐ）の選択的結合因子を提供する。１つの実施形態において、本発明の選択的結合因子は、ＯＰＧｂｐの少なくとも１つの活性を部分的または完全に阻害する。すなわち、選択的結合因子はＯＰＧｂｐのアンタゴニストである。別の実施形態において、選択的結合因子は、ＯＰＧと、その同族受容体である、オステオプロテゲリンの分化および活性化受容体（すなわち、ＯＤＡＲ）との相互作用を部分的または完全に阻害し、かつそれによりＯＰＧｂｐの活性を部分的または完全に阻害する様式でＯＰＧｂｐに結合する。本発明の選択的結合因子は、現実にはタンパク質であり得るし、本明細書中ではタンパク質性選択的結合因子として示される。
本発明はまた、ＯＰＧｂｐにおけるエピトープに結合し、かつＯＰＧｂｐの少なくとも１つの活性を部分的または完全に阻害する抗体またはその抗原結合ドメインあるいはそのフラグメント、変化体または誘導体を提供する。すなわち、本発明の抗体はアンタゴニスト抗体である。好ましくは、ＯＰＧｂｐは哺乳動物のＯＰＧｂｐである。より好ましくは、ＯＰＧｂｐは、可溶型または細胞表面結合型であり得るヒトＯＰＧｂｐ、またはそのフラグメント、誘導体および変化体である。
選択的結合因子が抗体である場合、そのような抗体は、ネズミＯＰＧｂｐまたはヒトＯＰＧｂｐなどのＯＰＧｂｐ（好ましくは、ヒトＯＰＧｂｐ）で、あるいはその免疫原性のフラグメント、誘導体または変化体で動物を免疫化することによって調製することができる。さらに、動物は、ＯＰＧｂｐを発現して、ＯＰＧｂｐがトランスフェクション細胞の表面に結合するように、ＯＰＧｂｐをコードする核酸分子を含有するベクターでトランスフェクションされた細胞で免疫化することができる。あるいは、抗体である選択的結合因子は、ＯＰＧｂｐに結合するための抗体または抗原結合ドメイン配列を含むライブラリーをスクリーニングすることによって得ることができる。そのようなライブラリーは、組み立てられたファージ粒子の表面に発現するバクテリオファージのコートタンパク質に対するタンパク質融合体またはペプチド融合体としてバクテリオファージにおいて都合よく調製される。この場合、コードするＤＮＡ配列はファージ粒子内に含有される（いわゆる「ファージディスプレイライブラリー」）。一例において、ファージディスプレイライブラリーは、可変軽鎖および可変重鎖などのヒト抗体をコードするＤＮＡ配列を含有する。
抗体または抗原結合ドメインである選択的結合因子は、天然の抗体に類似する四量体の糖タンパク質であり得るか、あるいはＯＰＧｂｐに結合することができ、かつＯＰＧｂｐの活性を部分的または完全に中和する単鎖抗体（Ｆｖフラグメント、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメントまたはＦ（ａｂ）’フラグメント）、二重特異性抗体、ヘテロ抗体、またはそれらの他のフラグメント、変化体もしくは誘導体であり得る。抗体または抗原結合ドメインは、ハイブリドーマ細胞株（例えば、マウスのミエローマ細胞に融合させた脾臓細胞などの抗体産生細胞）において産生させることができ、あるいは前記の抗体または抗原結合ドメインをコードする核酸分子でトランスフェクションされた異種の細胞株において産生させることができる。
本発明の抗体または抗原結合ドメインは、
（ａ）図９（配列番号５１）または図１０（配列番号５３）に示されるＦａｂ重鎖アミノ酸配列、
（ｂ）（ａ）における配列の保存的アミノ酸置換を含む重鎖アミノ酸配列、
（ｃ）（ａ）における配列に対する同一性が少なくとも約８０％である重鎖アミノ酸配列、あるいは
（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のフラグメントまたは誘導体
を含み、
そしてこの抗体または抗原結合ドメインはＯＰＧｂｐに選択的に結合する。
別の実施形態において、本発明の抗体または抗原結合ドメインは、図９（配列番号５１）または図１０（配列番号５３）に示されるＦａｂ重鎖アミノ酸配列と、図５（配列番号４３）または図６（配列番号４５）に示されるＦａｂ軽鎖アミノ酸配列とを含む抗体または抗原結合ドメインによって認識されるヒトＯＰＧｂｐにおけるエピトープを認識する。また、ＯＰＧｂｐにおけるＤＥエピトープを認識する抗ＯＰＧｂｐ抗体または抗原結合ドメインも提供される。
別の実施形態において、本発明の抗体または抗原結合ドメインは、可変軽鎖（Ｖｌ）および可変重鎖（Ｖｈ）を含み、そして、
それぞれのＶｌ鎖が、フレームワークアミノ酸配列により隔てられている、ＣＤＲ１（Ｖｌ）、ＣＤＲ２（Ｖｌ）およびＣＤＲ３（Ｖｌ）と呼ばれるＣＤＲアミノ酸配列を含み、
ＣＤＲ１（Ｖｌ）が、
Figure 0005279425
からなる群から選択され、
ＣＤＲ２（Ｖｌ）が、
Figure 0005279425
からなる群から選択され、そして
ＣＤＲ３（Ｖｌ）が、
Figure 0005279425
からなる群から選択され、
ＣＤＲ１（Ｖｌ）、ＣＤＲ２（Ｖｌ）およびＣＤＲ３（Ｖｌ）が互いに独立的に選択され、かつ
それぞれのＶｈ鎖が、フレームワークアミノ酸配列により隔てられている、ＣＤＲ１（Ｖｈ）、ＣＤＲ２（Ｖｈ）およびＣＤＲ３（Ｖｈ）と呼ばれるＣＤＲアミノ酸配列を含み、
ＣＤＲ１（Ｖｈ）が、
Figure 0005279425
からなる群から選択され、
ＣＤＲ２（Ｖｈ）が、
Figure 0005279425
からなる群から選択され、そして
ＣＤＲ３（Ｖｈ）が、
Figure 0005279425
からなる群から選択され、
ＣＤＲ１（Ｖｈ）、ＣＤＲ２（Ｖｈ）およびＣＤＲ３（Ｖｈ）が互いに独立的に選択される。
別の実施形態において、本発明の抗体または抗原結合ドメインは、可変軽鎖（Ｖｌ）および可変重鎖（Ｖｈ）を含み、そして、
Ｖｌ鎖が、配列ＲＡＳＱＳＩＳＲＹＬＮ（配列番号０１）を有するＣＤＲ１と、配列ＧＡＳＳＬＱＳ（配列番号０５）を有するＣＤＲ２と、配列ＱＨＴＲＡ（配列番号０９）を有するＣＤＲ３とを含み、かつ
Ｖｈ鎖が、配列ＮＹＡＩＨ（配列番号１３）を有するＣＤＲ１と、配列ＷＩＮＡＧＮＧＮＴＫＦＳＱＫＦＱＧ（配列番号１６）を有するＣＤＲ２と、配列ＤＳＳＮＭＶＲＧＩＩＩＡＹＹＦＤＹ（配列番号１９）を有するＣＤＲ３とを含み、
それぞれのＶｌ鎖およびＶｈ鎖におけるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３がフレームワークアミノ酸配列により隔てられている。
本発明の抗体および抗原結合ドメインは、軽鎖アミノ酸配列および重鎖アミノ酸配列をコードする、ゲノムＤＮＡに存在する生殖系列の核酸配列に由来する。抗体は、生殖系列配列の再配置および体細胞変異の生成物である核酸配列によってコードされる。
１つの実施形態において、本発明の抗体および抗原結合ドメインは、Ｖｌ鎖およびＶｈ鎖を含み、Ｖｌ鎖が、図１９などにおけるＶｈ１生殖系列遺伝子（配列番号６６）の再配置変化体または体細胞変化体を含み、そしてＶｈ鎖が、図１６などにおけるＶｈ１生殖系列遺伝子（配列番号５９）の再配置変化体または体細胞変化体を含み、そして抗体はＯＰＧｂｐポリペプチドに選択的に結合する。
別の実施形態において、Ｖｌ鎖は、図２０などにおけるＶｋ３生殖系列遺伝子（配列番号６８）の再配置変化体または体細胞変化体を含み、そしてＶｈ鎖は、図１６などにおけるＶｈ１生殖系列遺伝子（配列番号５９）の再配置変化体または体細胞変化体を含む。
別の実施形態において、Ｖｌ鎖は、図２１などにおけるＶｋ３生殖系列遺伝子（配列番号７０）の再配置変化体または体細胞変化体を含み、そしてＶｈ鎖は、図１７などにおけるＶｈ３生殖系列遺伝子（配列番号６２）の再配置変化体または体細胞変化体を含む。
別の実施形態において、Ｖｌ鎖は、図２２などにおけるＶｌ３生殖系列遺伝子（配列番号７２）の再配置変化体または体細胞変化体を含み、そしてＶｈ鎖は、図１８などにおけるＶｈ３生殖系列遺伝子（配列番号６４）の再配置変化体または体細胞変化体を含む。
本発明の選択的結合因子（抗体または抗原結合ドメイン）は、ＯＤＡＲに対するＯＰＧｂｐの結合、破骨細胞の形成または活性化、あるいはＯＰＧｂｐにより媒介される骨再吸収などの、ＯＰＧｂｐの少なくとも１つの活性を部分的または完全に阻害し、そして骨疾患を防止し、かつ／または処置するために使用される。１つの実施形態において、抗体または抗原結合ドメインなどのＯＰＧｂｐアンタゴニストは、骨量の喪失を防止し、かつ／または処置するために、骨量の喪失を受けている動物、または骨量の喪失に対する危険性を有する動物に投与される。ＯＰＧｂｐアンタゴニストは、骨粗鬆症、骨へのガンの転移による骨量の喪失；慢性関節リウマチ、悪性の高カルシウム血症、およびステロイド誘導型骨粗鬆症による骨量の喪失を防止し、かつ／または処置するために使用することができる。
また、本発明の抗体または抗原結合ドメインと、薬学的に受容可能なキャリアとを含む組成物も提供される。
（図面の簡単な説明）
図１は、ヒトＯＰＧｂｐ［１４３−３１７］に対する反応性についての優勢なＦａｂパターンのＥＬＩＳＡを示す。力価測定を、ＥＬＩＳＡにおいて１０９個〜１０１１個のファージ／ウエルの典型的な範囲を得るためにウエルあたり最大で５０μｌのファージ溶液を使用して行った。ＥＬＩＳＡ用のファージストックは実施例１に記載されるように調製された。値を１点の測定から得た。「ＡＢ」および「Ｘ」のパターンは同じ線に重なった。
図２は、「ＡＴ」および「Ｙ」の各ＦａｂによるＯＤＡＲに対するＯＰＧｂｐ結合の阻害を示す。Ｆａｂは、実施例４に記載されるように精製され、そして図に示される最終ウエル濃度に添加された。ＯＰＧｂｐ／ＯＤＡＲ結合アッセイの詳細は実施例１に示される。値は二連の測定の平均値であった。
図３は、「ＡＴ」、「Ｙ」および「Ｐ」の各Ｆａｂの骨髄アッセイを示す。「ＡＴ」、「Ｙ」および「Ｐ」の各Ｆａｂのそれぞれの、１つのエンドトキシン非含有調製物（０．５ＥＵ／ｍｌ以下）の結果を示した。Ｆａｂは、実施例４に記載されるように精製され、そして図に示される最終ウエル希釈に添加された（Ｆａｂストック溶液は７５０μｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌであった）。アッセイ形式は、抗ｈｕ−ＯＰＧｂｐ Ｆａｂを１０ｎｇ／ｍｌの最終細胞ウエル濃度のヒトＯＰＧｂｐ［１４３−３１７］で１時間プレインキュベーションすることを含む。値は三連の測定の平均値であった。
図４は、「ＡＴ」、「Ｙ」および「Ｐ」の各ＦａｂのＲａｗ細胞アッセイを示す。「ＡＴ」、「Ｙ」および「Ｐ」の各Ｆａｂのそれぞれの、１つのエンドトキシン非含有調製物（０．５ＥＵ／ｍｌ以下）の結果を示した。Ｆａｂは、実施例４に記載されるように精製された。Ｆａｂは、グラフに示される最終細胞ウエル濃度に１／２０希釈される前に、ヒトＯＰＧｂｐ［１４３−３１７］と室温で１時間プレインキュベーションされた。ＯＰＧｂｐの最終細胞ウエル濃度は２０ｎｇ／ｍｌであった。細胞濃度は１×１０５／ｍｌであった。値は三連の測定から得られ、誤差バーは２標準偏差（２ＳＴＤ）を示している。
図５は、Ｆａｂ「ＡＴ」軽鎖のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。
図６は、Ｆａｂ「Ｙ」軽鎖のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。
図７は、Ｆａｂ「Ｐ」軽鎖のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。
図８は、Ｆａｂ「Ｓ」軽鎖のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。
図９は、Ｆａｂ「ＡＴ」重鎖のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。
図１０は、Ｆａｂ「Ｙ」重鎖のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。
図１１は、Ｆａｂ「Ｐ」重鎖のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。
図１２は、Ｆａｂ「Ｓ」重鎖のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。
図１３は、図５〜図１２に示されるＦａｂアミノ酸配列の比較を示す。「ＡＴ」、「Ｙ」、「Ｐ」および「Ｓ」の各Ｆａｂの重鎖および軽鎖の予測されるアミノ酸配列を同一性および類似性について比較した。「ＡＴ」および「Ｙ」の重鎖は１つのアミノ酸位置のみで異なる。ライブラリーが示しているように、４つのＦａｂはすべて同一の重鎖ＣＨ１領域を有し、この領域は、同一性および類似性の計算において含められた重鎖のカルボキシ側半分を含んでいる。「ＡＴ」、「Ｙ」および「Ｐ」の軽鎖は、同じであるか、または類似するＶκファミリーをともに有し、従って、計算において含められた鎖のカルボキシル側半分において１個〜２個のアミノ酸のみが異なる。
図１４は、「ＡＴ」、「Ｙ」、「Ｐ」および「Ｓ」の各Ｆａｂの予測される重鎖および軽鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）の比較を示す。重鎖を比較する場合、ＣＤＲ１は、すべてのＦａｂについてアミノ酸残基３２〜３６（３６を含む）を含み、ＣＤＲ２は、すべてのＦａｂについてアミノ酸残基５１〜６７（６７を含む）を含み、ＣＤＲ３は、「ＡＴ」および「Ｙ」のＦａｂについてはアミノ酸残基１００〜１１６（１１６を含む）を含み、「Ｐ」のＦａｂについてはアミノ酸残基１００〜１０６（１０６を含む）を含み、「Ｓ」のＦａｂについてはアミノ酸残基１００〜１１３（１１３を含む）を含む。軽鎖を比較する場合、ＣＤＲ１は、「ＡＴ」および「Ｙ」のＦａｂについてはアミノ酸残基２９〜３９（３９を含む）を含み、「Ｐ」のＦａｂについてはアミノ酸残基２８〜３９（３９を含む）を含み、「Ｓ」のＦａｂについてはアミノ酸残基２７〜３５（３５を含む）を含み、ＣＤＲ２は、「ＡＴ」、「Ｙ」および「Ｐ」のＦａｂについてはアミノ酸残基５５〜６１（６１を含む）を含み、「Ｓ」のＦａｂについてはアミノ酸残基５３〜５９（５９を含む）を含み、ＣＤＲ３は、「ＡＴ」、「Ｙ」および「Ｐ」のＦａｂについてはアミノ酸残基９４〜９８（９８を含む）を含み、「Ｓ」のＦａｂについてはアミノ酸残基９２〜１０２（１０２を含む）を含む。
図１５は、Ｆａｂクラスの比較を示す。Ｆａｂクラスの比較をＶ−Ｂａｓｅ ＤＮＡ ＰＬＯＴ分析から得た。記号（＊）は、最も近い一致した多様性（Ｄ）領域が、既知の生殖系列配列に関連しているにもかかわらず、決定できなかったことを示す。記号（＊＊）は、最も近く一致した生殖系列可変（Ｖ）領域配列が同定されたが、現在まで正式に名付けられておらず、より希なλファミリーであることを示す。
図１６は、「ＡＴ」および「Ｙ」の各Ｆａｂの予測される重鎖アミノ酸配列（それぞれ、図９および図１０における残基２〜１２７（１２７を含む））と、ＶＨ１ファミリーに由来する生殖系列配列との比較を示す。生殖系列配列は、Ｖ領域配列１〜０３、Ｄ領域配列３〜１０およびＪ領域配列ＪＨ４（配列番号４４）を含む。ＦＲ１、ＦＲ２およびＦＲ３は３つのフレームワーク領域を示し、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は３つの相補的決定領域を示し、Ｈ１、Ｈ２およびＨ３はフレームワーク領域とＣＤＲとの間における対応する接合配列を示す。「ＡＴ」、「Ｙ」と生殖系列のＶ配列、Ｄ配列またはＪ配列との違いが太字で示される。図１６〜図２２における生殖系列アミノ酸残基の番号付けは、Ｋａｂａｔ他、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（米国厚生省、第４版、１９９１年）に記載される通りである。
図１７は、Ｆａｂ「Ｐ」の予測される重鎖アミノ酸配列（図１１における残基２〜１１７（１１７を含む））と、ＶＨ３ファミリーに由来する生殖系列配列との比較を示す。配列はＶ領域配列３〜３０およびＪ領域配列ＪＨ４を含む。Ｄ領域配列は不明である。
図１８は、Ｆａｂ「Ｓ」の予測される重鎖アミノ酸配列（図１２における残基２〜１２４（１２４を含む））と、ＶＨ３ファミリーに由来する生殖系列配列との比較を示す。生殖系列配列は、Ｖ領域配列３〜０９、Ｄ領域配列６〜１９およびＪ領域配列ＪＨ４を含む。
図１９は、Ｆａｂ「ＡＴ」の予測される軽鎖アミノ酸配列（図５における残基６〜１０８（１０８を含む））と、Ｖκ１ファミリーに由来する生殖系列配列との比較を示す。生殖系列配列はＶ領域配列０１２およびＪ領域配列ＪＫ１を含む。
図２０は、Ｆａｂ「Ｙ」の予測される軽鎖アミノ酸配列（図６における残基６〜１０８（１０８を含む））と、Ｖκ３ファミリーに由来する生殖系列配列との比較を示す。生殖系列配列はＶ領域配列Ｌ６およびＪ領域配列ＪＫ２を含む。
図２１は、Ｆａｂ「Ｐ」の予測される軽鎖アミノ酸配列（図７における残基５〜１０８（１０８を含む））と、Ｖκ３ファミリーに由来する生殖系列配列との比較を示す。生殖系列配列はＶ領域配列Ａ２７およびＪ領域配列ＪＫ４を含む。
図２２は、Ｆａｂ「Ｓ」の予測される軽鎖アミノ酸配列（図８における残基５〜１１２（１１２を含む））と、ＶＬ３ファミリーに由来する生殖系列配列との比較を示す。生殖系列配列はＶ領域配列３ｍおよびＪ領域配列ＪＬ２を含む。
図２３は、「ＡＴ」４０５、「ＡＴ」４０６および「ＡＴ」４０７の各単離物のＲＡＷ細胞アッセイを示す。Ｆａｎ「ＡＴ」をコードするｃＤＮＡを、実施例７に記載されるように、ヒトＩｇＧ１のＣＨ１領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域をコードするｃＤＮＡに融合した。異なるリーダー配列を使用して、「ＡＴ」４０５、「ＡＴ」４０６および「ＡＴ」４０７と呼ばれる、得られる単離物を作製した。「ＡＴ」４０５〜４０７を、グラブに示される最終細胞ウエル濃度に希釈する前に、ＯＰＧｂｐと室温で１時間プレインキュベーションした。ＯＰＧｂｐの最終細胞ウエル濃度は４０ｎｇ／ｍｌであった。値は三連の測定から得られ、誤差バーは２標準偏差（２ＳＴＤ）を示している。
図２４は、「ＡＴ」４０５および「ＡＴ」４０７の骨髄アッセイを示す。「ＡＴ」４０５および「ＡＴ」４０７の、１つのエンドトキシン非含有調製物（０．５ＥＵ／ｍｌ以下）の結果を示した。サンプルをヒトＯＰＧｂｐ［１４３−３１７］と室温で１時間プレインキュベーションし、その後、細胞に加えた。サンプルストックからの「ＡＴ」４０５および「ＡＴ」４０７に対する最終細胞ウエル希釈度がｘ軸に示される。ＯＰＧｂｐの最終細胞ウエル濃度は２０ｎｇ／ｍｌであった。
図２５は、「ＡＴ」４０６の骨髄アッセイを示す。「ＡＴ」４０６の、１つのエンドトキシン非含有調製物（０．５ＥＵ／ｍｌ以下）の結果を示す。サンプルをヒトＯＰＧｂｐ［１４３−３１７］と室温で１時間プレインキュベーションし、その後、細胞に加えた。サンプルの最終細胞ウエル濃度がｘ軸に示される。ＯＰＧｂｐの最終細胞ウエル濃度は２０ｎｇ／ｍｌであった。
図２６は、「Ｓ」４３５および「Ｙ」４２９の骨髄アッセイを示す。「Ｓ」４３５および「Ｙ」４２９の構築は実施例７に記載される。「Ｓ」４３５および「Ｙ」４２９のそれぞれの、１つのエンドトキシン非含有調製物（０．５ＥＵ／ｍｌ以下）の結果を示す。サンプルをヒトＯＰＧｂｐ［１４３−３１７］と室温で１時間プレインキュベーションし、その後、細胞に加えた。サンプルの最終細胞ウエル濃度がｘ軸に示される。ＯＰＧｂｐの最終細胞ウエル濃度は２０ｎｇ／ｍｌであった。
図２７は、「Ｙ」４４２および「Ｐ」４４４の骨髄アッセイを示す。「Ｙ」４４２および「Ｐ」４４４の構築および発現は実施例７に記載される。「Ｙ」４４２および「Ｐ」４４４のそれぞれの、１つのエンドトキシン非含有調製物（０．５ＥＵ／ｍｌ以下）の結果を示す。サンプルをヒトＯＰＧｂｐ［１４３−３１７］と室温で１時間プレインキュベーションし、その後、細胞に加えた。サンプルの最終細胞ウエル濃度がｘ軸に示される。ＯＰＧｂｐの最終細胞ウエル濃度は２０ｎｇ／ｍｌであった。
図２８は、ＦＬＡＧ−ネズミ［１５３−３１６］ＯＰＧｂｐ／ＤＥの核酸配列およびアミノ酸配列を示す。
図２９は、ＤＥループの領域における、ヒトＯＰＧｂｐ［１４３−３１７］、ネズミＯＰＧｂｐ［１５８−３１６］およびＦＬＡＧ−ネズミ［１５８−３１６］ＯＰＧｂｐ／ＤＥのアミノ酸配列のアラインメントである。下線部は、ＦＬＡＧ−マウスＯＰＧｂｐ／ＤＥ分子を作製するためにマウスＯＰＧｂｐに導入されたヒトＯＰＧｂｐのアミノ酸残基である。
図３０は、ヒトＯＰＧｂｐ［１４３−３１７］、ネズミＯＰＧｂｐ［１５８−３１６］またはＦＬＡＧ−ネズミ［１５８−３１６］ＯＰＧｂｐ／ＤＥのいずれかがコーティングされたプレートに対するＡＴ抗体の結合および反応性を調べる酵素免疫アッセイである。
（発明の詳細な説明）
本発明は、ＯＰＧ結合タンパク質（ＯＰＧｂｐ）に選択的に結合する因子を提供する。好ましくは、この因子は、ＯＰＧｂｐのその同族受容体ＯＤＡＲに対する結合、破骨細胞の形成および／または活性化、あるいは骨の再吸収などの、ＯＰＧｂｐの少なくとも１つの活性を部分的または完全に阻害するＯＰＧｂｐアンタゴニストまたは阻害剤である。１つの実施形態において、選択的結合因子は、ＯＰＧｂｐのその同族受容体に対する結合を部分的または完全に阻止し、かつ破骨細胞の形成および／または骨の再吸収を部分的または完全に阻害するようにＯＰＧｂｐに選択的に結合する抗体である。
用語「選択的結合因子」は、ＯＰＧｂｐに優先的に結合する分子をいう。選択的結合因子には、タンパク質、ペプチド、核酸、炭水化物、脂質または低分子量化合物が含まれる。好ましい実施形態において、選択的結合因子は抗体であり、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、キメラ抗体、ＣＤＲグラフト抗体、可溶型形態または結合型形態で標識され得る抗体に対する抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、ならびにそのフラグメント、領域または誘導体などであり、これらは、酵素的切断、ペプチド合成または組換え技術（これらに限定されない）を含む既知の様々な技術によって提供される。本発明の抗ＯＰＧｂｐ選択的結合因子は、ＯＤＡＲ受容体に対するＯＰＧｂｐの結合を阻害するＯＰＧｂｐの様々な部分に結合することができる。
本発明の抗体および抗原結合ドメインはＯＰＧｂｐに選択的に結合する。すなわち、本発明の抗体および抗原結合ドメインは、他の抗原に対するよりも大きな結合親和性でＯＰＧｂｐに対して優先的に結合する。本発明の抗体は、ヒトＯＰＧｂｐに選択的に結合し得るが、ネズミＯＰＧｂｐなどのヒト以外のＯＰＧｂｐにも検出可能であるように結合し得る。あるいは、本発明の抗体は、ヒト以外のＯＰＧに選択的に結合し得るが、ヒトＯＰＧにも検出可能であるように結合し得る。あるいは、本発明の抗体は、ヒトＯＰＧｂｐにだけ結合することができ、ヒト以外のＯＰＧｂｐには検出可能であるように結合しない。
用語「モノクローナル抗体」は、それぞれのモノクローナル抗体が典型的には抗原上の１つのエピトープを認識する実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体をいう。用語「モノクローナル」は、抗体を作製するいずれかの特定の方法に限定されない。例えば、本発明のモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ他、Ｎａｔｕｒｅ、２５６、４９５（１９７５）に記載されるようなハイブリドーマ法によって作製することができ、あるいは例えば、本明細書中に記載されるような技術を使用してファージライブラリーから単離することができる。
用語「抗原結合ドメイン」または用語「抗原結合領域」は、抗原と相互作用し、かつ結合因子に抗原に対するその特異性および親和性を与えるアミノ酸残基を含有する選択的結合因子（抗体分子など）のそのような部分をいう。好ましくは、抗原結合領域はヒト起源である。他の実施形態において、抗原結合領域は、他の哺乳動物種、特に、ウサギ、ラットまたはハムスターなどの齧歯類に由来し得る。
用語「エピトープ」は、結合因子の抗原結合領域の１つまたは複数において、選択的結合因子（抗体など）が認識して結合することができる任意の分子のそのような部分をいう。エピトープは、通常、アミノ酸または糖側鎖などの分子の化学的に活性な様々な表面配置から構成され、特異的な三次元構造特性ならびに特異的な電荷特性を有する。「阻害性および／または中和性のエピトープ」により、選択的結合因子が結合したときに、エピトープを含有する分子または生物の生物学的活性（ＯＰＧｂｐのその受容体に対する結合を含む）の喪失を、インビボ、インビトロまたはインシトゥーで、より好ましくはインビボで生じさせるエピトープが意味される。
用語「軽鎖」は、抗体に関連して使用されるとき、定常ドメインのアミノ酸配列に基づいてカッパ（κ）またはラムダ（λ）と呼ばれる２つの異なるタイプをいう。
用語「重鎖」は、抗体に関連して使用されるとき、重鎖定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、α、δ、ε、γおよびμと呼ばれる５つの異なるタイプをいう。重鎖のこれらの異なるタイプは、５クラスの抗体、それぞれ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭをもたらす。これには、ＩｇＧの４つのサブクラス、すなわち、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４が含まれる。
用語「可変領域」または用語「可変ドメイン」は、軽鎖および重鎖の一部分で、配列が抗体間で大きく異なり、かつそれぞれの特定の抗体のその特定の抗原に対する結合および特異性において使用される、典型的には、重鎖におけるアミノ末端の約１２０アミノ酸〜１３０アミノ酸の部分、および軽鎖におけるアミノ末端の約１００アミノ酸〜１１０アミノ酸の部分をいう。配列における変動性は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれるそのような領域に集中しているが、可変ドメインにおけるより高度に保存された領域はフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれている。軽鎖および重鎖のＣＤＲは抗体と抗原との相互作用を担っている。
用語「定常領域」または用語「定常ドメイン」は、抗体が抗原に結合することに直接的には関与していないが、様々なエフェクター機能（Ｆｃ受容体との相互作用など）を示す、軽鎖および重鎖のカルボキシ末端部分をいう。
用語「ＯＰＧｂｐ」または用語「ＯＰＧｂｐポリペプチド」は、ＰＣＴ国際特許出願公開ＷＯ／４６７５７（その開示は参考として組み込まれる）の図４に示されるようなアミノ酸配列を含むポリペプチド、および関連ポリペプチドをいう。関連ポリペプチドには、対立遺伝子変化体；スプライシング変化体；フラグメント；誘導体；置換変化体、欠失変化体および挿入変化体；融合ポリペプチド；ならびに種間ホモログが含まれる。また、ヒトＯＰＧｂｐの残基６９〜３１７（３１７を含む）（ＷＯ９８／４６７５７における番号付けに従う）などのＯＰＧｂｐの可溶型形態、または免疫学的応答を生じさせるのに十分なそのサブセットも包含される。１つの実施形態において、可溶型のヒトＯＰＧｂｐには、残基１４０〜３１７（３１７を含む）、残基１４３〜３１７（３１７を含む）、またはそれらの免疫原性フラグメントが含まれる。ＯＰＧｂｐは、本明細書中に定義されるように成熟ポリペプチドであってもよく、そして調製方法に依存してアミノ末端のメチオニン残基を有してもよく、または有しなくてもよい。
用語「フラグメント」は、ＯＰＧｂｐまたはＯＰＧｂｐのタンパク質性選択的結合因子に関連して使用されるとき、全長未満の長さのアミノ酸配列を含むペプチドまたはポリペプチドをいう。そのようなフラグメントは、例えば、アミノ端における短縮化、カルボキシ端における短縮化、および／またはアミノ酸配列からの残基（１つまたは複数）の内部欠失から生じ得る。フラグメントは、選択的ＲＮＡスプライシングから、またはインビボでのプロテアーゼ活性から生じ得る。
用語「変化体」は、ＯＰＧｂｐまたはＯＰＧｂｐのタンパク質性選択的結合因子に関連して使用されるとき、天然または非修飾の配列と比較して、１つ以上のアミノ酸配列の置換、欠失および／または付加を含むペプチドまたはポリペプチドをいう。例えば、ＯＰＧｂｐ変化体は、天然ＯＰＧｂｐのアミノ酸配列に対する１つ以上の変化から生じ得る。また、例として、ＯＰＧｂｐの選択的結合因子の変化体は、天然または以前の非修飾の選択的結合因子のアミノ酸配列に対する１つ以上の変化からも生じ得る。変化体は、対立遺伝子変化体またはスプライシング変化体などのように天然に存在し得るし、あるいは人工的に構築することができる。ポリペプチド変化体は、前記変化体をコードする対応する核酸分子から調製することができる。
用語「誘導体」は、ＯＰＧｂｐまたはＯＰＧｂｐのタンパク質性選択的結合因子に関連して使用されるとき、化学的に修飾されているポリペプチドまたはペプチド、あるいはその変化体、フラグメントまたは誘導体をいう。例には、１つ以上のポリマー（水溶性ポリマーなど）、Ｎ結合型もしくはＯ結合型の炭水化物、糖、リン酸塩、および／または他のそのような分子を共有結合的に結合することが含まれる。誘導体は、結合した分子のタイプまたは位置のいずれかにおいて、天然に存在するペプチドまたはポリペプチドあるいは出発のペプチドまたはポリペプチドとは異なる様式で修飾される。誘導体は、ペプチドまたはポリペプチドに天然で存在する１つ以上の化学基の欠失をさらに含む。
用語「融合」は、ＯＰＧｂｐまたはＯＰＧｂｐのタンパク質性選択的結合因子に関連して使用されるとき、ペプチドまたはポリペプチド、あるいはそのフラグメント、変化体および／または誘導体を異種のペプチドまたはポリペプチドと連結することをいう。
用語「生物学的に活性な」は、ＯＰＧｂｐまたはタンパク質性選択的結合因子に関連して使用されるとき、ＯＰＧｂｐまたは選択的結合因子に特徴的な少なくとも１つの活性を有するペプチドまたはポリペプチドをいう。ＯＰＧｂｐの選択的結合因子は、ＯＰＧｂｐの少なくとも１つの生物学的活性に関して、アゴニスト活性、アンタゴニスト活性または中和活性を有し得る。
用語「天然に存在する」は、核酸分子、ポリペプチド、宿主細胞などの生物学的材料とともに使用されるとき、自然界に見出されるもので、ヒトによって操作されていないものをいう。
用語「単離された」は、ＯＰＧｂｐまたはＯＰＧｂｐのタンパク質性選択的結合因子に関連して使用されるとき、その天然の環境で見出される少なくとも１つの混在ポリペプチドを含まないペプチドまたはポリペプチド、好ましくは、その治療的または診断的な使用を妨げる何らかの他の混在哺乳動物ポリペプチドを実質的に含まないペプチドまたはポリペプチドをいう。
用語「成熟」は、ＯＰＧｂｐまたはＯＰＧｂｐのタンパク質性選択的結合因子に関連して使用されるとき、リーダー配列を失っているペプチドまたはポリペプチドをいう。この用語はまた、アミノ端（リーダー配列を伴うか、またはリーダー配列を伴わない）および／またはカルボキシ端のタンパク質分解的プロセシング、より大きな前駆体からのより小さいポリペプチドの切断、Ｎ結合型および／またはＯ結合型のグリコシル化などの、ペプチドまたはポリペプチドの他の修飾を含む場合がある。
用語「効果的な量」および用語「治療的に効果的な量」は、ＯＰＧｂｐの選択的結合因子に関連して使用されるとき、ＯＰＧｂｐの１つ以上の生物学的活性のレベルの観測可能な変化を維持するために有用であるか、または必要である選択的結合因子の量をいう。前記の変化は、ＯＰＧｂｐ活性のレベルの増大または低下のいずれかであり得る。
用語「保存的アミノ酸置換」は、その位置におけるアミノ酸残基の極性または電荷に対する影響をほとんど有しないような、非天然残基による天然アミノ酸残基の置換をいう。例えば、保存的置換は、ポリペプチド内の非極性残基が任意の他の非極性残基により置換されることから生じる。さらに、ポリペプチド内の任意の天然の残基はまた、アラニン走査変異誘発（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４、１０８１〜１０８５、１９８９）について以前に記載されているようにアラニンで置換することができる。保存的アミノ酸置換に関する例示的な規則を表Ｉに示す。
Figure 0005279425
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保存的アミノ酸置換はまた、生物学的システムにおける合成によってではなく、化学的なペプチド合成によって典型的に取り込まれる、天然に存在しないアミノ酸残基を含む。このような残基には、ペプチドミメティクス、およびアミノ酸成分の他の逆形態または反転形態が含まれる。
アミノ酸配列に対する様々な保存的修飾（およびコードするヌクレオチドに対する対応する様々な修飾）により、天然に存在するＯＰＧｂｐまたは選択的結合因子の機能的および化学的な特性に類似する機能的および化学的な特性を有するＯＰＧｂｐポリペプチド（およびそのタンパク質性選択的結合因子）を製造することができる。それに反して、ＯＰＧｂｐ（およびそのタンパク質性選択的結合因子）の機能的および／または化学的な特性における実質的な様々な改変を、（ａ）例えば、シートまたはらせんの立体配座としての置換領域における分子骨格の構造、（ｂ）標的部位における分子の電荷または疎水性、あるいは（ｃ）側鎖の嵩張りを維持したときにその作用が著しく変化する置換を選択することによって達成することができる。天然に存在する残基は、側鎖の共通した性質に基づいて様々なグループに分けることができる：
１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
２）中性で親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；
３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
４）塩基性：Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
５）鎖の配向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；および
６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
非保存的置換には、これらのクラスの１つのメンバーを別のクラスに由来するメンバーに交換することが含まれることがある。
２つ以上の核酸分子および／またはポリペプチドの「同一性または類似性」により、２つ以上の異なる配列の関連性の大きさが提供される。用語「同一性」は、２つの異なるアミノ酸配列における対応する位置において同一であるアミノ酸をいう。用語「類似性」は、２つの異なるアミノ酸配列における対応する位置において同一であるか、または上記に定義されるような保存的置換であるかのいずれかであるアミノ酸をいう。
同一性または類似性の程度は、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８８）；Ｂｉｏｃｏｍｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９３）；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ １（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．およびＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ、１９９４）；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９８７）；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編、Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９１）；Ｃａｒｉｌｌｏ他、ＳＩＡＭ Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．、４８、１０７３（１９８８）に記載される様々な方法（これらに限定されない）を含む知られている方法によって容易に計算することができる。
同一性および／または類似性を決定する好ましい方法は、調べている配列の間における最長の一致をもたらすように設計されている。同一性および類似性を決定する様々な方法が、公開されているコンピュタープログラムでコード化されている。２つの配列の間における同一性および類似性を決定するための例示的なコンピュータープログラム法には、ＧＡＰ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ他、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１２、３８７（１９８４）；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、ウィスコンシン大学、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮおよびＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ他、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１５、４０３〜４１０（１９９０））を含むＧＣＧプログラムパッケージが含まれるが、これに限定されない。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）および他の供給源から公開されている（ＢＬＡＳＴマニュアル、Ａｌｔｓｃｈｕｌ他、ＮＣＢ ＮＬＭ ＮＩＨ Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）。よく知られているＳｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムもまた、同一性を決定するために使用することができる。
ＯＰＧｂｐポリペプチド
ＯＰＧｂｐポリペプチドならびにそのフラグメント、変化体および誘導体は、本発明の選択的結合因子をスクリーニングして同定するための標的分子として使用される。抗体を選択的結合因子として調製することが所望される場合、ＯＰＧｂｐポリペプチドは好ましくは免疫原性である。すなわち、ＯＰＧｂｐポリペプチドは、動物に投与されたときに免疫応答を誘発する。あるいは、抗体がインビトロ技術によって調製される場合、標的分子として使用されるＯＰＧｂｐポリペプチドは、抗体または抗原結合ドメインに検出可能なほどに結合することができる。
ＯＰＧｂｐポリペプチドは生物学的方法または化学的方法で調製される。組換えＯＰＧｂｐをコードするＤＮＡ配列の発現などの生物学的方法はこの分野では知られている（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他（上記）を参照のこと）。Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ他、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、８５：２１４９（１９６３）；Ｈｏｕｇｈｔｏｎ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８２：５１３２（１９８５）；ＳｔｅｗａｒｔおよびＹｏｕｎｇ、Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ（１９８４））によって示される方法などの化学的合成方法もまた、本発明のＯＰＧｂｐポリペプチドを調製するために使用することができる。そのようなポリペプチドは、アミノ末端にメチオニンを伴って、またはアミノ末端にメチオニンを伴うことなく合成することができる。化学合成されたＯＰＧｂｐポリペプチド、あるいはそのフラグメントまたは変化体は、ジスルフィド架橋を形成させるために、これらの参考文献に示されるような方法を使用して酸化することができる。化学合成により調製された本発明のＯＰＧｂｐポリペプチドは、組換え製造されたか、または天然供給源から精製された対応するＯＰＧｂｐポリペプチドに匹敵し得る少なくとも１つの生物学的活性を有する。
ＯＰＧｂｐポリペプチドは、ＯＰＧｂｐポリペプチドが天然に見出される供給源の組織および／または体液などの生物学的サンプルから単離することによって得ることができる。ＯＰＧｂｐポリペプチドの供給源は起源がヒトまたは非ヒトであり得る。天然に存在するＯＰＧｂｐポリペプチドの単離は、電気泳動、その後の電気溶出、様々なタイプのクロマトグラフィー（アフィニティー、免疫アフィニティー、分子ふるいおよび／またはイオン交換）および／または高圧液体クロマトグラフィーによる分離などのこの分野で知られている様々な方法を使用して達成することができる。精製途中のＯＰＧｂｐポリペプチドの存在は、例えば、組換え製造されたＯＰＧｂｐポリペプチドまたはそのペプチドフラグメントに対して調製された抗体を使用してモニターすることができる。
本発明のポリペプチドには、単離されたＯＰＧｂｐポリペプチドおよびそれに関連するポリペプチド（これには、本明細書中上記に規定されるようなフラグメント、変化体、融合ポリペプチドおよび誘導体が含まれる）が含まれる。本発明のＯＰＧｂｐフラグメントは、アミノ端における短縮化（リーダー配列を有するものまたはリーダー配列を有しないもの）、カルボキシル端における短縮化、および／またはポリペプチドに対する内部の欠失から生じ得る。そのようなＯＰＧｂｐポリペプチドフラグメントは必要に応じてアミノ末端メチオニン残基を含むことができる。本発明のポリペプチドは、抗体応答を誘発することができる点で免疫原性である。
本発明のＯＰＧｂｐポリペプチド変化体は、天然のＯＰＧｂｐアミノ酸配列と比較して、１つ以上のアミノ酸の置換、付加および／または欠失を含む。アミノ酸の置換は、上記に規定されるように保存的、または非保存的、またはそれらの任意の組合せであり得る。変化体は、アミノ酸残基の付加をカルボキシ末端またはアミノ末端のいずれかに有し得る（この場合、アミノ末端はリーダー配列を有してもよく、または有しなくてもよい）。
本発明の実施形態には、ＯＰＧｂｐのグリコシル化変化体およびシステイン変化体が含まれる。ＯＰＧｂｐグリコシル化変化体には、グリコシル化部位の数および／またはタイプが、天然のＯＰＧｂｐポリペプチドと比較して変化している変化体が含まれる。１つの実施形態において、ＯＰＧｂｐグリコシル化変化体は、天然のＯＰＧｂｐと比較して、それよりも多い数またはそれよりも少ない数のＮ結合型グリコシル化部位を含む。Ｎ結合型炭水化物鎖の転位を含むＯＰＧｂｐグリコシル化変化体もまた提供される。この場合、１つ以上のＮ結合型グルコシル化部位（典型的には、天然に存在するＮ結合型グルコシル化部位）が除去され、そして１つ以上の新しいＮ結合型部位が作出されている。ＯＰＧｂｐシステイン変化体は、天然ＯＰＧｂｐと比較して、それよりも多い数のシステイン残基、あるいはそれよりも少ない数のシステイン残基を含む。１つの実施形態において、１つ以上のシステイン残基が欠失されるか、または別のアミノ酸（例えば、セリン）で置換される。ＯＰＧｂｐのシステイン変化体は、変性した状態から単離した後、生物学的に活性な立体配座へのＯＰＧｂｐのリフォールディングを助けることによって生物学的に活性なＯＰＧｂｐの回収を改善させることができる。
ＯＰＧｂｐポリペプチド変化体を調製することは当業者のレベルの範囲内である。１つの方法において、１つ以上のアミノ酸の置換、欠失および／または付加を天然のＯＰＧｂｐにおいて導入することができる。この場合、ＯＰＧｂｐ変化体はＯＰＧｂｐの天然の構造および少なくとも１つの生物学的活性を保持している。１つの方法は、同一性および／または類似性が比較的低い領域および比較的高い領域を同定するために、様々な異なる種に由来するＯＰＧポリペプチドの配列を比較することである。比較的低い同一性および／または類似性を有するＯＰＧｂｐポリペプチドのそのような領域は、構造および活性に必須である可能性は低く、従って、アミノ酸の変化に対して、特に、非保存的である変化に対してより大きな許容性を有し得ることが理解される。比較的保存された領域においてさえ、活性を保持しながら、保存的なアミノ酸置換を導入できることもまた理解される。
別の方法では、構造−機能の様々な関係を使用して、活性または構造にとって重要な残基を類似するポリペプチドにおいて同定することができる。例えば、ＯＰＧｂｐと、構造−機能分析が可能である腫瘍壊死因子ファミリーの他のメンバーとの間で保存されたアミノ酸残基を比較することができ、そのような比較に基づいて、ＯＰＧｂｐ内のどのアミノ酸残基が活性または構造にとって重要であるかを予測することができる。当業者は、ＯＰＧｂｐのそのような予測された重要なアミノ酸残基のために、化学的に類似するアミノ酸置換を選ぶことができる。
さらに別の方法では、ＯＰＧｂｐの二次構造または三次構造（これはＯＰＧｂｐ結晶のｘ線回折または構造予測方法のいずれかにより決定される）の分析を行い、実際の構造または予測された構造に関連して特異的なアミノ酸残基の位置をＯＰＧｂｐポリペプチド内において決定することができる。この情報を使用して、アミノ酸の変化を、ＯＰＧｂｐポリペプチドの二次構造および／または三次構造をできる限り保持しようとする様式で導入することができる。
さらに別の方法では、アミノ酸を特定の位置で変化させることの影響を、アミノ酸置換を導入し、そして本明細書中に記載されるアッセイを使用して、変化したＯＰＧｂｐポリペプチドを生物学的活性について調べることによって実験的に調べることができる。アラニン走査変異誘発（Ｃｕｎｎｉｇｈａｍ他、上記）などの技術がこの方法には特に適している。多くの変化した配列を、多くの置換をＯＰＧｂｐ内の様々なアミノ酸位置において導入し、そしてファージディスプレイライブラリーの一部として変化したポリペプチドの集団をスクリーニングすることによって都合よく調べることができる。この方法を使用して、活性にとって必須であるＯＰＧｂｐポリペプチドのそのような領域を容易に決定することができる。
上記の方法は、天然の構造を保持するＯＰＧｂｐ変化体を作製するために有用である。従って、それぞれの変化体に対して惹起される抗体は、ＯＰＧｂｐの天然の構造的な決定基、すなわちエピトープを認識する可能性があり、そしてまた天然のＯＰＧｂｐに結合する可能性もある。しかし、場合により、天然のＯＰＧｂｐ構造を保持しないＯＰＧｂｐ変化体、または部分的もしくは完全に満たされていないＯＰＧｂｐ変化体を製造することが望ましい場合がある。そのようなタンパク質に対して惹起される抗体により、ＯＰＧｂｐ上の隠れたエピトープが認識される。
本発明はまた、異種のペプチドまたはタンパク質に融合したＯＰＧｂｐポリペプチドならびにそのフラグメント、変化体および誘導体を含むＯＰＧｂｐ融合ポリペプチドを提供する。異種のペプチドおよびタンパク質には、ＯＰＧｂｐ融合ポリペプチドの検出および／または単離を可能にするエピトープ；膜貫通受容体タンパク質またはその一部（細胞外ドメインまたは膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインなど）；膜貫通受容体タンパク質に結合するリガンドまたはその一部；触媒作用的に活性である酵素またはその一部；オリゴマー化を促進するタンパク質またはその一部（ロイシンジッパードメインなど）；ならびに安定性を増大させるタンパク質またはペプチド（免疫グロブリンの定常領域など）が含まれるが、これらに限定されない。ＯＰＧｂｐポリペプチドは、自身に、またはそのフラグメント、変化体もしくは誘導体に融合させることができる。融合は、ＯＰＧｂｐポリペプチドのアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかにおいて行うことができ、そしてリンカー分子またはアダプター分子を用いることなく直接的であり得るか、あるいはリンカー分子またはアダプター分子を介して行うことができる。リンカー分子またはアダプター分子はまた、融合成分の分離を可能にするＤＮＡ制限エンドヌクレアーゼまたはプロテアーゼに対する切断部位を伴って設計することができる。
本発明のさらなる実施形態において、ＯＰＧｂｐポリペプチド、フラグメント、変化体および／または誘導体は、ヒトＩｇＧのＦｃ領域に融合させられる。一例において、ヒトＩｇＧのヒンジ領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域を、当業者に知られている方法を使用してＯＰＧｂｐポリペプチドのＮ末端またはＣ末端のいずれかにおいて融合することができる。別の例では、ヒンジ領域およびＣＨ２領域およびＣＨ３領域の一部を融合することができる。そのようにして製造されたＯＰＧｂｐ−Ｆｃ融合ポリペプチドは、プロテインＡアフィニティーカラムの使用によって精製することができる。さらに、Ｆｃ領域に融合させたペプチドおよびタンパク質は、非融合の対応物よりも実質的に大きいインビボでの半減期を示すことが見出されている。また、Ｆｃ領域への融合により、融合ポリペプチドの二量体化／マルチマー化が可能になる。Ｆｃ領域は、天然に存在するＦｃ領域であり得るか、あるいは治療の質、循環時間、低下した凝集などのいくつかの性質を改善するために変化させることができる。
ＯＰＧｂｐポリペプチドの誘導体は本発明の範囲に含まれる。そのような誘導体は、ＯＰＧｂｐポリペプチドがポリマーに結合している化学的に修飾されたＯＰＧｂｐポリペプチド組成物である。選択されるポリマーは、結合しているタンパク質が生理学的な環境などの水性の環境で沈殿しないように典型的には水溶性である。ポリマーは、任意の分子量であってもよく、そして分枝状または非分枝状であってもよい。ＯＰＧｂｐポリペプチドポリマーの範囲には、ポリマーの混合物が含まれる。好ましくは、最終生成物の調製物が治療的に使用される場合、ポリマーは薬学的に受容可能である。
水溶性ポリマーまたはその混合物としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、モノメトキシポリエチレングリコール、デキストラン（例えば、約６ｋＤの低分子量デキストランなど）、セルロース、または他の炭水化物系ポリマー、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシド共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）およびポリビニルアルコールを挙げることができる。
好ましい水溶性ポリマーはポリエチレングリコールである。本明細書中で使用されるポリエチレングルコールは、モノ（Ｃ１〜Ｃ１０）アルコキシポリエチレングリコールまたはアリールオキシポリエチレングリコールなどの、他のタンパク質を誘導体化するために使用されている様々な形態のＰＥＧのいずれをも包含することが意味される。共有結合的に結合したＯＰＧｂｐマルチマーを調製するために使用され得る二官能性のＰＥＧ架橋分子もまた本発明により包含される。
化学的に誘導体化されたＯＰＧｂｐポリペプチドを調製する様々な方法がこの分野では十分に知られている。例として、ＰＥＧを用いたＯＰＧｂｐポリペプチドの誘導体化を、Ｆｒａｎｃｉｓ他、Ｆｏｃｕｓ ｏｎ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ、３、４〜１０（１９９２）；欧州特許ＥＰ０１５４３１６；同ＥＰ０４０１３８４；および米国特許第４，１７９，３３７号に記載される手順を使用して行うことができる。好ましい実施形態において、ＯＰＧｂｐポリペプチド誘導体は１つのＰＥＧ成分をアミノ末端に有する。米国特許第５，２３４，７８４号を参照のこと（これは参考として組み込まれる）。
本明細書中に開示されるＯＰＧｂｐポリペプチド誘導体は、非修飾のポリペプチドと比較して、ＯＰＧｂｐの少なくとも１つの生物学的活性の増強または低下を示し得るか、あるいは半減期または安定性の増大または低下を示し得る。
ＯＰＧｂｐ選択的結合因子
ＯＰＧｂｐポリペプチドならびにそのフラグメント、変化体および誘導体は、ＯＰＧｂｐの選択的結合剤を同定するために使用することができる。上記に定義されているように、ＯＰＧｂｐの選択的結合因子はタンパク質性および非タンパク質性の両方の結合因子を包含し、本発明の１つの好ましい実施形態において、選択的結合因子はタンパク質性である。さらに別の好ましい実施形態において、選択的結合因子は、ＯＰＧｂｐ（好ましくは、ヒトＯＰＧｂｐ）に結合する抗体またはそのフラグメントである。本発明の抗体は、ＯＰＧｂｐの少なくとも１つの生物学的活性のレベルを増強するアゴニスト抗体であり得るか、あるいはＯＰＧｂｐの少なくとも１つの生物学的活性のレベルを低下させるアンタゴニスト抗体であり得る。ＯＰＧｂｐのアンタゴニスト抗体はまた、ＯＰＧｂｐの阻害抗体または中和抗体と呼ばれることがある。そのような抗体は本発明の好ましい実施形態であるが、ＯＰＧｂｐ活性のアゴニストまたはアンタゴニストである他のタンパク質性選択的結合因子もまた本発明により包含されることが理解される。
下記の例に記載されるように、ＯＰＧｂｐの少なくとも１つの活性を阻害する抗ＯＰＧｂｐ抗体および抗原結合ドメインが同定されている。本発明の実施形態には、図９、図１０、図１１または図１２のいずれかに示されるような重鎖Ｆａｂ配列を含み、かつκ軽鎖配列またはλ軽鎖配列をさらに含む抗体が含まれる。軽鎖Ｆａｂ配列は、図５、図６、図７または図８に示されている通りである。例えば、「ＡＴ」抗体は、軽鎖配列および重鎖配列がそれぞれ図５および図９であり、「Ｙ」抗体は、軽鎖配列および重鎖配列がそれぞれ図６および図１０であり、「Ｓ」抗体は、軽鎖配列および重鎖配列がそれぞれ図７および図１１であり、「Ｐ」抗体は、軽鎖配列および重鎖配列がそれぞれ図８および図１２である。本発明の抗体は、任意のイソタイプ、すなわち、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥまたはＩｇＤのいずれかに由来するヒトＦｃ領域をさらに含む。好ましくは、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４などのヒトＩｇＧに由来する。
本発明はまた、本明細書中に開示されるＦａｂ配列のフラグメント、変化体または誘導体を含む抗体または抗原結合ドメインを提供する。フラグメントは、典型的には軽鎖定常ドメインまたは重鎖定常ドメインに連結されている軽鎖Ｆａｂ配列または重鎖Ｆａｂ配列のいずれかの可変ドメインを含む。変化体には、図５〜８のいずれか１つにおけるＦａｂ配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の同一性または類似性を有する軽鎖Ｆａｂ配列、または対応する可変ドメインを含む抗体が含まれるか、あるいは図９〜１２のいずれか１つにおけるＦａｂ配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の同一性または類似性を有する重鎖Ｆａｂ配列、または対応する可変ドメインを含む抗体が含まれる。これらの抗体は、典型的には、全長型の抗体を形成させるために、重鎖および軽鎖の定常領域と結合させることができる。
本発明の抗体および抗原結合ドメイン、ならびにそのフラグメント、変化体および誘導体は、ＯＰＧｂｐポリペプチドに対して、好ましくはヒトＯＰＧｂｐポリペプチドに対して選択的に結合する能力を保持している。１つの実施形態において、抗体は、約１ｎＭ以下あるいは０．１ｎＭ以下あるいは１０ｐＭ以下あるいは１０ｐＭ未満の解離定数（ＫＤ）でＯＰＧｂｐポリペプチドに結合する。実施例８では、「ＡＴ」抗体が約０．３３ｎＭ〜０．４３ｎＭのＫＤでＯＰＧｂｐに結合することが認められた。
本発明の抗体には、ポリクローナルの単一特異性ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、組換え抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全にヒトの抗体、単鎖抗体および／または二重特異性抗体が含まれる。抗体フラグメントには、ＯＰＧｂｐポリペプチド上のエピトープに結合する、抗ＯＰＧｂｐ抗体の様々なそのような一部分が含まれる。そのようなフラグメントの例として、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、Ｆ（ａｂ）’フラグメント、ＦｖフラグメントおよびｓＦｖフラグメントが含まれる。抗体は、全長型抗体の酵素的切断によって、または抗体の可変領域をコードする核酸配列を含有する組換えプラスミドの発現などの組換えＤＮＡ技術によって作製することができる。
ポリクローナル抗体は、抗原で免疫化された動物の血清に由来する抗体分子の不均一な集団である。抗原は、抗体が結合し得る分子または分子の一部分で、その抗原のエピトープに結合し得る抗体を産生するように動物を誘導することがさらに可能な分子または分子の一部分である。抗原は１つ以上のエピトープを有し得る。上記に示される特異的な反応は、抗原が、非常に選択的な様式で、その対応する抗体と反応するが、他の抗原によって惹起され得る多数の他の抗体とは反応しないことを示すことが意味される。
ＯＰＧｂｐポリペプチドに対するポリクローナル抗体は、一般には、ＯＰＧｂｐおよびアジュバントの皮下注射または腹腔内注射を多数回行うことによって動物（例えば、ウサギまたはマウス）において惹起される。本発明に従って、ＯＰＧｂｐポリペプチドあるいはその変化体、フラグメントまたは誘導体を、免疫化される動物種において免疫原性であるキャリアタンパク質（キーホルリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシチログロブリンまたはダイズトリプシン阻害剤など）にコンジュゲート化することは有用であり得る。また、ミョウバンなどの凝集化剤が、免疫反応を増強するために使用される。免疫化後、動物は採血され、血清が抗ＯＰＧｂｐ抗体の力価についてアッセイされる。
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、実質的に類似するエピトープ結合部位を含有する、抗原に対して特異的である抗体の実質的に均一な集団を含有する。そのような抗体は免疫グロブリンの任意のクラスであり得るし、これには、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびその任意のサブクラスが含まれる。本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、インビトロ、インシトゥーまたはインビボで培養することができる。インビボまたはインビトロで高力価体を製造することが好ましい製造方法である。
ＯＰＧｂｐに対するモノクローナル抗体は、培養における連続的な細胞株による抗体分子の製造を提供する任意の方法を使用して製造される。モノクローナル抗体を調製する好ましい方法の例として、Ｋｏｈｌｅｒ他、Ｎａｔｕｒｅ、２５６、４９５〜４９７（１９７５）のハイブリドーマ法、およびヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Ｋｏｚｂｏｒ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３３、３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒ他、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、５１頁〜６３頁（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８７）；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８））が挙げられる：これらの内容は全体が参考として本明細書中に組み込まれる。
好ましい抗ＯＰＧｂｐ選択的結合因子には、ヒトＯＰＧｂｐがその同族受容体のＯＤＡＲに結合することを部分的または完全に阻害するモノクローナル抗体、または同じ特異的な結合特性を実質的に有する抗体、ならびにそれらのフラグメントおよび領域が含まれる。モノクローナル抗体の特異性および親和性を競合的阻害によって決定するための好ましい様々な方法を、Ｈａｒｌｏｗ他、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、１９８８）；Ｃｏｌｌｉｇａｎ他編、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎ．Ｙ．（１９９２、１９９３）；Ｍｕｌｌｅｒ、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．９２：５８９〜６０１（１９８３）に見出すことができる。これらの参考文献は参考として本明細書中に組み込まれる。
本発明により、ＯＰＧｂｐポリペプチドとの反応性を有するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株もまた提供される。
キメラ抗体は、ネズミのモノクローナル抗体に由来する可変領域とヒト免疫グロブリン定常領域とを有する抗体などの、種々の部分が異なる動物種に由来する分子である。キメラ抗体は、例えば、ネズミのモノクローナル抗体がハイブリドーマからのより大きな収量を有するが、ヒトにおいてより大きな免疫原性を有する場合、ヒト／ネズミのキメラなモノクローナル抗体が使用されるように、適用における免疫原性を低下させ、かつ製造における収量を増大させるために主に使用される。
キメラ抗体およびその製造方法はこの分野では知られている。Ｃａｂｉｌｌｙ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１：３２７３〜３２７７（１９８４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１：６８５１〜６８５５（１９８４）；Ｂｏｕｌｉａｎｎｅ他、Ｎａｔｕｒｅ、３１２：６４３〜６４６（１９８４）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ他、Ｎａｔｕｒｅ、３１４：２６８〜２７０（１９８５）；Ｌｉｕ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８４：３４３９〜３４４３（１９８７）；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）。これらの参考文献は参考として本明細書中に組み込まれる。
例えば、本発明のキメラなモノクローナル抗体は治療剤として使用することができる。そのようなキメラ抗体において、重鎖および／または軽鎖の一部分は、所望する生物学的活性を示す限り、特定の種に由来する抗体または１つの特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一であるか、または相同的であり、その一方で、鎖（１つまたは複数）の残り部分は、別の種に由来する抗体または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体、ならびにそのような抗体のフラグメントにおける対応する配列と同一であるか、または相同的である（米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、８１：６８５１〜６８５５（１９８５）を参照のこと）。
本明細書中で使用される用語「キメラ抗体」には、一価、二価または多価の免疫グロブリンが含まれる。一価のキメラ抗体は、ジスルフィド架橋によりキメラなＬ鎖と結合したキメラなＨ鎖によって形成される二量体（ＨＬ）である。二価のキメラ抗体は、少なくとも１つのジスルフィド架橋により結合した２つのＨＬ二量体によって形成される四量体（Ｈ２Ｌ２）である。多価のキメラ抗体もまた、例えば、（例えば、ＩｇＭのＨ鎖またはμ鎖に由来する）凝集するＣＨ領域を用いることによって製造することができる。
本発明のネズミ抗体およびキメラ抗体、フラグメントおよび領域は、免疫グロブリンの個々の重鎖（Ｈ）および／または軽鎖（Ｌ）を含むことができる。キメラなＨ鎖は、ＯＰＧｂｐに対して特異的な非ヒト抗体のＨ鎖に由来する抗原結合領域で、ＣＨ１またはＣＨ２などのヒトＨ鎖Ｃ領域（ＣＨ）の少なくとも一部分に結合している抗原結合領域を含む。
本発明によるキメラなＬ鎖は、ＯＰＧｂｐに対して特異的な非ヒト抗体のＬ鎖に由来する抗原結合領域で、ヒトＬ鎖Ｃ領域（ＣＬ）の少なくとも一部分に結合している抗原結合領域を含む。
選択結合因子、例えば、可変領域の結合特異性が同じであるか、または異なるキメラなＨ鎖およびＬ鎖を有する抗体、フラグメントまたは誘導体などもまた、知られている方法工程に従って、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ他編、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎ．Ｙ．、１９９３）およびＨａｒｌｏｗ他、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、１９８８）に従って、個々のポリペプチド鎖を適切に結合することによって調製することができる。これらの参考文献の内容は全体が参考として本明細書中に組み込まれる。この方法を用いて、キメラなＨ鎖（またはその誘導体）を発現する宿主が、キメラなＬ鎖（またはその誘導体）を発現する宿主とは別に培養され、そしてこれらの免疫グロブリン鎖が別々に回収され、その後、結合させられる。あるいは、このような宿主は同時に培養することができ、そして鎖を培養培地中で自発的に結合させ、その後、組み立てられた免疫グロブリン、フラグメントまたは誘導体を回収することができる。
一例として、本発明の選択的結合因子（キメラ抗体など）の抗原結合領域は、好ましくは、ヒトＯＰＧｂｐに対して特異的な非ヒト抗体に由来する。そのような非ヒト抗体をコードするＤＮＡの好ましい供給源には、ハイブリドーマとして広く知られているハイブリッド細胞株などの、抗体を産生する細胞株が含まれる。
本発明はまた、抗ＯＰＧｂｐ抗体のフラグメント、変化体および誘導体ならびに融合体を提供する。この場合、「フラグメント」、「変化体」、「誘導体」および「融合体」の各用語は本明細書中に定義されている。本発明は、修飾されていない抗ＯＰＧｂｐ抗体に機能的に類似している抗ＯＰＧｂｐ抗体のフラグメント、変化体、誘導体および融合体を包含する。すなわち、それらは、修飾されていない抗体の活性の少なくとも１つを保持している。上記に示された修飾に加えて、植物毒素および細菌毒素などの細胞傷害性タンパク質をコードする遺伝子配列の付加もまた含まれる。ＯＰＧｂｐ抗体のフラグメント、変化体、誘導体および融合体は、本発明の宿主のいずれかから製造することができる。
好適なフラグメントには、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ＦｖおよびｓｃＦｖが含まれる。これらのフラグメントは、完全な抗体のＦｃフラグメントを有しておらず、循環からより迅速に除去され、そして完全な抗体よりも小さい非特異的な組織結合性を有し得る。Ｗａｈｌ他、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２４：３１６〜３２５（１９８３）を参照のこと。これらのフラグメントは、この分野で十分に知られている方法を使用して、例えば、パパイン（Ｆａｂフラグメントを製造するために）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを製造するために）などの酵素を用いたタンパク質分解的切断によって完全な抗体から製造される。本発明のモノクローナル抗体によって認識されるこれらの抗原結合領域および／またはエピトープを同定することにより、本出願の様々な実施形態に匹敵する、類似した結合特性および治療的または診断的な有用性を有するさらなるモノクローナル抗体を作製するために必要な情報が得られる。
本発明は、ＯＰＧｂｐ上の阻害エピトープおよび／または中和エピトープを認識して、これに結合する抗ＯＰＧｂｐ抗体または抗原結合ドメインを提供する。この結合の結果、抗ＯＰＧｂｐ抗体は、ＯＰＧｂｐがその受容体に結合することを部分的または完全に阻害することができ、あるいは破骨細胞の形成、骨の再吸収および／または骨の喪失を部分的または完全に阻害することができる。より詳細には、本発明は、ＯＰＧｂｐのＤＥ領域のアミノ酸配列の一部を含むエピトープ（「ＤＥエピトープ」）を認識して、これに結合する抗ＯＰＧｂｐ抗体を提供する。ＯＰＧｂｐのＤＥ領域は、ＤおよびＥのβシート領域にほぼまたがっており、ループ配列（「ＤＥループ」）が介在している。ヒトＯＰＧｂｐにおけるＤＥ領域は、アミノ酸残基２１２付近からアミノ酸残基２５０付近（これを含む）までを含む（図２９を参照のこと）。しかし、ヒトＯＰＧｂｐのＤＥ領域のアミノ酸配列および終点は単なる例示にすぎず、従って、ＤＥ領域は、ヒトＯＰＧｂｐにおける配列および終点とは異なる配列および終点を有し得ることが理解される。本発明は、そのような可変ＤＥ領域に結合する抗体を包含する。
抗ＯＰＧｂｐ抗体または抗原結合ドメインはＤＥ領域内の任意の位置において結合し得ることが考えられるが、好ましい実施形態は、ＤＥループの少なくとも一部に結合する抗ＯＰＧｂｐ抗体である。ヒトＯＰＧｂｐにおけるＤＥループは約５個のアミノ酸にまたがり、残基２３０〜２３４（２３４を含む）付近に存在する。ヒトＯＰＧｂｐにおけるＤＥループは配列ＤＬＡＴＥを有する。しかし、ヒトＯＰＧｂｐのＤＥループのアミノ酸配列および終点は単なる例示にすぎず、従って、ＤＥループは、ヒトＯＰＧｂｐにおける配列および終点とは異なる配列および終点を有し得ることが理解される。本発明は、そのような可変ＤＥループに結合する抗体を包含する。
実施例１０に示されているように、配列ＤＬＡＴＥをネズミＯＰＧｂｐの対応するＤＥループに導入することにより、「ＡＴ」抗体の結合がもたらされるが、この抗体は、約２μｇ／ｍｌの抗体濃度まで、天然のＤＥループ配列を有するネズミＯＰＧｂｐに対して検出可能な親和性を有していない。別の実施形態において、抗ＯＰＧｂｐ抗体は、ヒトＯＰＧｂｐ内のアミノ酸配列ＤＬＡＴＥに対して、または前記配列の一部分に対して結合する。別の実施形態において、抗ＯＰＧｂｐ抗体または抗原結合ドメインは、Ｓ２２９Ｄ、Ｖ２３０Ｌ、Ｐ２３１ＡおよびＤ２２３Ｅのアミノ酸置換を含むネズミＯＰＧｂｐには結合するが、類似する条件のもとで、前記置換を有しないネズミＯＰＧｂｐには結合しない。
本発明の抗体は、部分的には、抗体が結合するＯＰＧｂｐ上のアミノ酸配列によって特徴づけられるが、抗体により認識されるＯＰＧｂｐ上のＤＥエピトープが、典型的には、ＤＥ領域に含まれないアミノ酸を含み得る三次元構造を含むことが当業者によって理解および認識される。ＯＰＧｂｐ配列の線状表示では、ＤＥエピトープを含むアミノ酸はＤＥ領域から離れている場合があるが、ＯＰＧｂｐの三次元構造では、ＤＥエピトープのアミノ酸はＤＥ領域の近くに存在する可能性がある。従って、ＤＥエピトープに対する抗ＯＰＧｂｐ抗体の結合には、ＤＥ領域におけるアミノ酸以外のアミノ酸が関与し得ることが理解される。それにもかかわらず、ＤＥループ内のアミノ酸残基、特に、配列ＤＬＡＴＥ内の残基の一部または全体がＯＰＧｂｐに対する抗体結合およびＯＰＧｂｐ活性の阻害に関与していることが示されている。
選択的結合因子の変化体もまた提供される。１つの実施形態において、抗体または抗原結合ドメインの変化体は天然に存在するか、または組換えＤＮＡ技術を使用して天然の配列をインビトロ操作することによって導入される、軽鎖および／または重鎖のアミノ酸配列における変化を含む。天然に存在する変化体には、外来抗原に対する抗体応答が生じているときに、対応する生殖系列ヌクレオチド配列内にインビボで生じる「体細胞」変化体が含まれる。配列において本発明の例示的なＦａｂを生じさせる生殖系列の可変軽鎖配列および可変重鎖配列における体細胞変異によってコードされる変化体が、Ｆａｂ「ＡＴ」については図１６および図１９に示され、Ｆａｂ「Ｙ」については図１６および図２０に示され、Ｆａｂ「Ｐ」については図１７および図２１に示され、Ｆａｂ「Ｓ」については図１８および図２２に示される。
抗ＯＰＧｂｐ抗体および抗原結合ドメインの変化体はまた、この分野で知られている変異誘発技術に調製される。一例において、アミノ酸の変化を抗体コード領域の全体にランダムに導入することができ、そして得られる変化体を、ＯＰＧｂｐに対する結合親和性などの所望する活性についてスクリーニングすることができる。あるいは、アミノ酸の変化を、ＯＰＧｂｐ抗体の選択された領域に、例えば、軽鎖および／または重鎖のＣＤＲならびにフレームワーク領域などに導入することができ、そして得られる抗体を、ＯＰＧｂｐに対する結合または何らかの他の活性についてスクリーニングすることができる。アミノ酸の変化には、ＣＤＲにおける１つまたは複数のアミノ酸置換が含まれ、これは、１つのアミノ酸の違いから、所与ＣＤＲ（ＣＤＲ３など）内のアミノ酸のすべての可能な置換の導入にまで及ぶ。別の方法では、ＯＰＧｂｐ結合に対するＣＤＲ内の各残基の寄与を、ＣＤＲ内の少なくとも１つの残基をアラニンで置換することによって評価することができる（Ｌｅｗｉｓ他、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２、１０６５〜１０７２（１９９５））。その後、より最適な配列を決定するために、ＯＰＧｂｐに対する結合に関して最適でない残基を変化させることができる。ＣＤＲ３などのＣＤＲのサイズを大きくするためにアミノ酸を挿入することによって作製される変化体もまた包含される。例えば、ほとんどの軽鎖ＣＤＲ３配列は長さが９アミノ酸である。９残基よりも短い抗体内の軽鎖ＣＤＲ３配列を、ＣＤＲの長さを大きくするために適切なアミノ酸を挿入することによってＯＰＧｂｐに対する結合について最適化することができる。
１つの実施形態において、抗体または抗原結合ドメインの変化体は、１つまたは複数のアミノ酸変化を、重鎖または軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３の１つ以上に含み、そして必要な場合には、重鎖または軽鎖のフレームワーク領域のＦＲ１、ＦＲ２またはＦＲ３の１つ以上に含む。アミノ酸の変化は、アミノ酸残基の置換、欠失および／または挿入を含む。例示的な変化体には、配列ＮＹＡＩＨ（配列番号１３）または配列ＷＩＮＡＧＮＧＮＴＩＫＦＳＱＫＦＱＧ（配列番号１６）または配列ＤＳＳＮＭＶＲＧＩＩＩＡＹＹＦＤＹ（配列番号１９）における１つ以上のアミノ酸変化を有する「ＡＴ」の重鎖可変領域変化体、あるいは配列ＲＡＳＱＳＩＳＲＹＬＮ（配列番号０１）または配列ＧＡＳＳＬＱＳ（配列番号０５）または配列ＱＨＴＲＡ（配列番号０９）における１つ以上のアミノ酸変化を有する「ＡＴ」の軽鎖可変領域変化体が含まれる。上記の「ＡＴ」の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の変化体は、フレームワーク領域における１つ以上のアミノ酸変化をさらに含むことができる。一例において、１つ以上のアミノ酸変化を、体細胞的に変異したフレームワーク残基をその位置において生殖系列残基で置換するために導入することができる。上記のアミノ酸変化が置換である場合、そのような変化は保存的な置換または非保存的な置換であり得る。
実施例１１および１２により、ＡＴ抗体の軽鎖ＣＤＲ３領域および重鎖ＣＤＲ３領域における変化体が提供される。１つの実施形態において、本発明は、得られる抗体または抗原結合ドメインがＯＰＧｂｐ結合タンパク質に選択的に結合するように、配列番号１９（重鎖ＣＤＲ３）または配列番号９（軽鎖ＣＤＲ３）のいずれかにおける変化体を提供する。１つの実施形態において、ＯＰＧｂｐはヒトＯＰＧｂｐである。
本発明は、可変軽鎖および可変重鎖を含み、かつ下記の配列からなる群から選択される配列を有する重鎖ＣＤＲ３領域をさらに含む抗ＯＰＧｂｐ抗体を提供する：
Figure 0005279425
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配列中、Ｘは、その位置において通常存在するアミノ酸残基とは異なる任意のアミノ酸であり、そして得られる抗体はＯＰＧｂｐに選択的に結合する。
本発明はまた、可変軽鎖および可変重鎖を含み、かつ５アミノ酸から９アミノ酸まで大きくなっている軽鎖ＣＤＲ３配列をさらに含む抗ＯＰＧｂｐ抗体を提供する。より詳細には、軽鎖ＣＤＲ３配列は、下記の配列からなる群から選択される選択される：
ＱＨＴＸＸＸＸＲＡ（配列番号９７）
配列中、左から右へのＸの最初の存在は、アルギニン以外の任意のアミノ酸残基を表し、Ｘの２番目、３番目および４番目の存在は任意のアミノ酸残基を表すが、好ましくはアラニンを表し、そして得られる抗体はＯＰＧｂｐに選択的に結合する。本発明の別の実施形態において、軽鎖ＣＤＲ３配列は、下記の配列からなる群から選択される選択される：
ＱＨＴＸＡＡＡＲＡ（配列番号９８）
（配列中、Ｘは、アラニン以外の任意のアミノ酸残基である）。
別の実施形態において、本発明の抗体変化体は、配列番号１におけるようなＣＤＲ１配列と、配列番号５におけるようなＣＤＲ２配列とを有するＶｌ鎖を含み、そして、配列番号１３におけるようなＣＤＲ１配列と、配列番号１６におけるようなＣＤＲ２配列とを有するＶｈ鎖を含む。別の実施形態において、本発明の抗体変化体は、上記の軽鎖ＣＤＲ３変化体を有する「ＡＴ」抗体に由来するＶｌ鎖と、上記の重鎖ＣＤＲ３変化体を有する「ＡＴ」抗体に由来するＶｈ鎖とを含む。変化体はまた、軽鎖または重鎖の「鎖シャフリング」（Ｍａｒｋｓ他、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０、７７９〜７８３（１９９２））によって調製することができる。典型的には、１つの軽鎖（または重鎖）が、重鎖（または軽鎖）のレパートリーを有するライブラリーと組合せられ、そして得られる集団が、ＯＰＧｂｐに対する結合などの所望する活性についてスクリーニングされる。この技術により、１つの軽鎖（または重鎖）との組合せで、重鎖および軽鎖の両方のレパートリーを含むライブラリーに関して可能になるよりも大きな、種々の重鎖（または軽鎖）のサンプルをスクリーニングすることが可能になる。
本発明の選択的結合因子は二重特異性であり得る。本発明の二重特異的な選択的結合因子はいくつかの形態であり得る。例えば、二重特異性抗体は、単一抗体（または抗体フラグメント）に類似しているが、２つの異なる抗原結合部位（可変領域）を有する。二重特異性抗体は、化学的技術（例えば、Ｋｒａｎｚ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７８：５８０７（１９８１）を参照のこと）によって、「ポリドーマ」技術（米国特許第４，４７８，８９３号（Ｒｅａｄｉｎｇ）を参照のこと）によって、または組換えＤＮＡ技術によって製造することができる。
本発明の選択的結合因子はまたヘテロ抗体であり得る。ヘテロ抗体は、それぞれの抗体またはフラグメントが異なる特異性を有する２つ以上の抗体または抗体結合フラグメント（Ｆａｂ）が一緒に連結されているものである。
本発明はまた「ヒト化」抗体に関する。非ヒト抗体をヒト化するための様々な方法がこの分野では十分に知られている。一般に、ヒト化抗体は、１つ以上のアミノ酸残基が、非ヒトである供給源に由来するヒト抗体に導入されている。一般に、非ヒトの残基はＣＤＲに存在する。ヒト化は、この分野で知られている様々な方法（Ｊｏｎｅｓ他、Ｎａｔｕｒｅ、３２１、５２２〜５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ他、Ｎａｔｕｒｅ、３３２、３２３〜３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９、１５３４〜１５３６（１９８８）に従い、齧歯類の相補性決定領域（ＣＤＲ）をヒト抗体の対応する領域の代わりに使用することによって行うことができる。
本発明の選択的結合因子（キメラ抗体、ＣＤＲグラフト化抗体およびヒト化抗体を含む）はこの分野で知られている様々な組換え方法によって製造することができる。抗体をコードする核酸が、本明細書中に記載される材料および手順ならびにこの分野で知られている材料および手順を使用して、宿主細胞に導入され、そして発現させられる。好ましい実施形態において、抗体は、ＣＨＯ細胞などの哺乳動物宿主細胞において製造される。完全なヒト抗体は、宿主細胞にトランスフェクションされた組換えＤＮＡを発現させることによって、または上記に記載されるようにハイブリドーマ細胞において発現させることによって製造することができる。
モノクローナル抗体の生成を回避する、抗体分子の抗原結合領域の組換えＤＮＡ型を作製するための技術は本発明の実施の範囲に包含される。そうするために、抗体に特異的なメッセンジャーＲＮＡ分子が、免疫化動物から取り出された免疫系細胞から抽出され、相補的なＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に転写される。その後、このｃＤＮＡは細菌発現システムにクローン化される。本発明の実施に好適なそのような技術の一例では、発現したＦａｂタンパク質を細胞周辺腔空間（細菌の細胞膜と細胞壁との間）に移動または分泌させるリーダー配列を有する、バクテリオファージλのベクターシステムが使用される。非常に多くの機能的なＦａｂフラグメントを迅速に作製し、そして抗原に結合するフラグメントについてそれらをスクリーニングすることができる。そのようなＯＰＧｂｐ選択的結合因子（ＯＰＧｂｐポリペプチドに対する特異性を有するＦａｂフラグメント）は、本明細書中おいて定義、議論および特許請求されているように、用語「抗体」に特に包含される。
本発明の範囲にはまた、適切な抗原特異性のマウス抗体分子に由来する遺伝子を、ヒト補体を活性化してＡＤＣＣを媒介する能力などの適切な生物学的活性のヒト抗体分子に由来する遺伝子と一緒にスプライシングすることによってキメラ抗体を製造するために開発された様々な技術も含まれる。（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、８１：６８５１（１９８４）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ他、Ｎａｔｕｒｅ、３１２：６０４（１９８４））。一例は、Ｆｃ領域を異なるイソタイプのＦｃ領域で置換することである。この技術によって製造される抗体などの選択的結合因子は本発明の範囲内である。
本発明の好ましい実施形態において、抗ＯＰＧｂｐ抗体は完全なヒト抗体である。従って、本発明により、ＯＰＧｂｐポリペプチドに結合する抗体であって、ヒト生殖系列の免疫グロブリン核酸配列の天然に存在する体細胞変化体、ならびにそのフラグメント、合成的変化体、誘導体および融合体である核酸配列によってコードされる抗体が包含される。そのような抗体は、この分野で知られている任意の方法によって製造することができる。例示的な方法には、内因性の免疫グロブリン産生が存在しないもとでヒト抗体のレパートリーを産生し得るトランスジェニック動物（例えば、マウス）のＯＰＧｂｐ抗原（必要な場合にはキャリアにコンジュゲート化された、免疫応答を誘発し得る任意のＯＰＧｂｐポリペプチド）による免疫化が含まれる。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、９０、２５５１〜２５５５（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ他、Ｎａｔｕｒｅ、３６２、２５５〜２５８（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎ他、Ｙｅａｒ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、７、３３（１９９３）を参照のこと。
あるいは、ヒト抗体は、ファージディスプレイ抗体ライブラリーをインビトロでスクリーニングすることによって得ることができる。Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ他、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２７、３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓ他、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２、５８１（１９９１）を参照のこと（これらは参考として本明細書中に組み込まれる）。様々な抗体含有ファージディスプレイライブラリーが、当業者によって記載されており、そして容易に調製され得る。ライブラリーは、適切な標的に対して分泌され得る多様なヒト抗体配列（ヒトのＦａｂフラグメント、ＦｖフラグメントおよびｓｃＦｖフラグメントなど）を含有することができる。実施例１には、ＯＰＧｂｐに選択的に結合するそのような分子を同定するために、ＯＰＧｂｐに対するＦａｂファージライブラリーのスクリーニングが記載される。ファージディスプレイライブラリーは、ＯＰＧｂｐの選択的結合因子を同定するためにスクリーニングされ得る抗体以外のペプチドまたはタンパク質を含む得ることが理解される。
抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体は、抗体の抗原結合部位に一般に関連する特徴的な決定基を認識する抗体である。Ｉｄ抗体は、抗Ｉｄが調製されるモノクローナル抗体を用いて、そのモノクローナル抗体の供給源と同じ種および遺伝子タイプの動物（例えば、マウス株）を免疫化することによって調製することができる。免疫化された動物は、これらのイディオタイプ決定基に対する抗体（抗Ｉｄ抗体）を産生することによって、免疫化抗体のイディオタイプ決定基を認識し、これに応答する。例えば、米国特許第４，６９９，８８０号（これは全体が参考として本明細書中に組み込まれる）を参照のこと。抗Ｉｄ抗体はまた、さらに別の動物における免疫応答を誘導するための「免疫原」としても使用することができ、いわゆる抗−抗Ｉｄ抗体を製造することができる。抗−抗Ｉｄは、抗Ｉｄ抗体が誘導された元のモノクローナル抗体とエピトープ的に同一であり得る。従って、ｍＡｂのイディオタイプ決定基に対する抗体を使用することによって、同一の特異性の抗体を発現する他のクローンを同定することが可能である。
ＯＰＧｂｐの選択的結合物質の製造
調製すべきＯＰＧｂｐの選択的結合物質がタンパク質様選択的結合物質、例えば抗体または抗原結合ドメインである場合、該物質を製造するために種々の生物学的または化学的方法を利用できる。
治療用途のための選択的結合物質を十分量製造するためには生物学的方法が好ましい。本発明の抗体および抗原結合ドメインの製造には標準的な組換えＤＮＡ技術がとりわけ有用である。発現ベクター、宿主細胞および発現した生成物の回収方法の例を以下に記載する。
標準的なライゲーション技術を用いてＯＰＧｂｐ抗体または抗原結合ドメインをコードする核酸分子を適当な発現ベクターに挿入する。ベクターは典型的には用いる特定の宿主細胞において機能的であるように選択する（すなわちベクターは宿主細胞機構に適合し、遺伝子の増幅および／または遺伝子の発現を生じることができる）。抗ＯＰＧｂｐ抗体をコードする核酸分子を原核細胞、酵母、昆虫（バキュロウイルス系）および／または真核宿主細胞において増幅／発現できる。宿主細胞の選択は抗ＯＰＧｂｐ抗体を翻訳後修飾（例えばグリコシル化および／またはリン酸化）するかどうかに一部依存する。その場合、酵母、昆虫または哺乳動物宿主が好ましい。発現ベクターの概説に関してはＭｅｔｈ．Ｅｎｚ．ｖ．１８５、Ｄ．Ｖ．Ｇｏｅｄｄｅｌ編、アカデミックプレス・インコーポレーティッド、サンディエゴ、カルフォルニア州（１９９０）を参照されたい。
典型的には、いずれかの宿主細胞で使用される発現ベクターは１つまたはそれ以上の以下の構成成分：プロモーター、１つまたはそれ以上のエンハンサー配列、複製起点、転写終止配列、ドナーおよびアクセプタースプライシング部位を含有する完全イントロン配列、分泌のためのリーダー配列、リボソーム結合部位、ポリアデニル化配列、発現すべきポリペプチドをコードする核酸配列を挿入するためのポリリンカー領域、および選別マーカーエレメントを含有する。これらの配列の各々について以下でより詳細に記載する。
ベクター成分は同種性（すなわち宿主細胞と同一の種および／または株に由来する）、異種性（すなわち宿主細胞種または株以外の種に由来する）、ハイブリッド（すなわち１つ以上の供給源に由来する異なる配列の組み合わせ）、合成、または通常免疫グロブリン発現を制御するように機能する元来の配列でよい。このように、ベクター成分の供給源は、成分が宿主細胞機構の中で機能的であり、それにより活性化されるならば、原核もしくは真核生物、いずれかの脊椎もしくは無脊椎生物、またはいずれかの植物でよい。
複製起点は発現に用いられる宿主細胞の型に基づいて選択される。例えば、プラスミドｐＢＲ３２２（製品番号３０３−３ｓ、ニュー・イングランド・バイオラブズ、ベバリー、マサチューセッツ州）からの複製起点がたいていのグラム陰性細菌に適しているが、ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、水胞性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）またはパピローマウイルス（例えばＨＰＶまたはＢＰＶ）に由来する起点が哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。一般に、複製起点成分は哺乳動物発現ベクターには必要ではない（例えばＳＶ４０起点はしばしば初期プロモーターを含有するという理由だけで使用される）。
転写終止配列は典型的にはポリペプチドコーディング領域の３’末端に位置し、転写を終止させる働きをする。通常原核細胞の転写終止配列はＧ−Ｃに富むフラグメントであり、後にポリＴ配列が続く。配列は容易にライブラリーからクローン化されるか、またはベクターの一部として市販により購入されるが、前記したもののように核酸合成の方法を用いて容易に合成することもできる。
選択マーカー遺伝子エレメントは選択培養培地中で成長する宿主細胞の生存および成長に必要なタンパク質をコードする。典型的な選択マーカー遺伝子は（ａ）原核宿主細胞に関して、抗生物質またはその他の毒素、例えばアンピシリン、テトラシリンまたはカナマイシンに対する抵抗性を賦与する、（ｂ）細胞の栄養要求欠損を補足する；または（ｃ）複合培地から利用できない必要な栄養を供給するタンパク質をコードする。好ましい選択マーカーはカナマイシン抵抗性遺伝子、アンピシリン抵抗性遺伝子、およびテトラサイクリン抵抗性遺伝子である。ネオマイシン抵抗性遺伝子もまた原核および真核宿主細胞における選択に使用することができる。
その他の選択マーカーを用いて発現される遺伝子を増幅することができる。増幅は成長に重要なタンパク質の産生により必要とされる遺伝子が、組換え細胞の連続した世代の染色体内でタンデムに反復される過程である。哺乳動物細胞に適した選択マーカーの例としてはジヒドロ葉酸リダクターゼ（ＤＨＦＲ）およびチミジンキナーゼなどがある。ベクターに存在するマーカーのために形質転換体のみが生存に唯一適合するという淘汰圧下に哺乳動物細胞形質転換体を置く。培地中の選択物質の濃度が連続的に変化する条件下で形質転換した細胞を培養することにより淘汰圧を賦課し、それにより選択遺伝子および抗ＯＰＧｂｐ抗体をコードするＤＮＡの双方を増幅させる。結果的に増幅されたＤＮＡから合成される抗体の量が増加する。
リボゾーム結合部位は通常ｍＲＮＡの翻訳開始に必要であり、Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列（原核細胞）またはＫｏｚａｋ配列（真核細胞）により特徴づけられる。典型的にはエレメントはプロモーターの３’および発現すべきポリペプチドのコーディング配列の５’に位置する。Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列は変化するが、典型的にはポリプリンである（すなわちＡ−Ｇ含量が高い）。多くのＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列が同定されており、前記の方法を用い、原核細胞ベクターを用いてその各々を容易に合成することができる。
リーダーまたはシグナル配列を用いてポリペプチドを直接分泌させる。シグナル配列はポリペプチドコーディング領域の５’末端内または直ぐ末端に位置し得る。多くのシグナル配列が同定されており、発現に使用する宿主細胞に基づいて選択できる。本発明では、シグナル配列は抗ＯＰＧｂｐ抗体または抗原結合ドメインをコードする核酸配列に対して同種（天然発生）または異種でよい。選択された異種シグナル配列は宿主細胞により認識されプロセッシングされる、すなわちシグナルペプチダーゼにより切断される配列でなければならない。元来の免疫グロブリンシグナル配列を認識およびプロセシングしない原核宿主細胞では、例えばアルカリ性ホスファターゼ、ペニシリナーゼ、または熱安定性エンテロトキシンＩＩリーダーの群から選択される原核細胞シグナル配列によりシグナル配列が置換される。酵母分泌では、元来の免疫グロブリンシグナル配列が酵母インベルターゼ、アルファ因子、または酸ホスファターゼリーダーにより置換され得る。哺乳動物細胞発現では元来のシグナル配列で十分であるが、別の哺乳動物シグナル配列が適当である。
たいていの場合、宿主細胞からの抗ＯＰＧｂｐ抗体または抗原結合ドメインの分泌により、抗体からシグナルペプチドが除去される。従って、成熟抗体はいずれのリーダーまたはシグナル配列をも欠如する。
例えば真核宿主細胞発現系においてグリコシル化が望ましい場合、種々のプレ配列を操作してグリコシル化または収量を改善できる場合もある。例えば、特定のシグナルペプチドのペプチダーゼ切断部位を変化させるか、またはこれもまたグリコシル化に影響するプロ配列を付け加えることができる。最終的なタンパク質生成物は１位置（成熟タンパク質の最初のアミノ酸に相対する）で発現のための１つまたはそれ以上のさらなるアミノ酸事象を有することができ、これは全体的には除去されていない。例えば最終的なタンパク質生成物はＮ末端に結合した、ペプチダーゼ切断部位に見出される１つまたは２つのアミノ酸を有してよい。また別に、酵素が成熟ポリペプチド内のかかる部分で切断する場合、いくつかの酵素切断部位を使用することにより、望ましいＯＰＧｂｐポリペプチドのわずかにトランケートされた形態になり得る。
本発明の発現ベクターは典型的には宿主生物により認識され、および抗ＯＰＧｂｐ抗体または抗原結合ドメインをコードする核酸分子に機能的に連結されたプロモーターを含有する。発現に用いる宿主細胞および望ましいタンパク質の収量に依存して、元来のまたは異種性のいずれかのプロモーターを用いることができる。
原核宿主細胞で使用するのに適したプロモーターにはベータ・ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系；アルカリ性ホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系；およびハイブリッドプロモーター、例えばｔａｃプロモーターなどがある。その他の公知の細菌性プロモーターもまた適している。その配列が確立され、それにより当業者は、いずれかの必要な制限部位を供給するのに必要とされるリンカーまたはアダプターを用いて、それらを望ましいＤＮＡ配列にライゲートすることができるようになった。
酵母宿主で使用するのに適したプロモーターもまた当業界で公知である。酵母エンハンサーを酵母プロモーターと共に使用するのが有利である。哺乳動物宿主細胞で使用するのに適したプロモーターは公知であり、ウイルス、例えばポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（例えばアデノウイルス２）、ウシ乳頭腫ウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよび最も好ましくはシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）のゲノムに由来するものなどがある。その他の適当な哺乳動物プロモーターには異種性哺乳動物プロモーター、例えば熱ショックプロモーターおよびアクチンプロモーターなどがある。
本発明の選択的結合物質を発現するために用いることができる別のプロモーターには、非限定例としては：ＳＶ４０初期プロモーター領域（ＢｅｒｎｏｉｓｔおよびＣｈａｍｂｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ ２９０：３０４−３１０（１９８１））；ＣＭＶプロモーター；ラウス肉腫ウイルスの３’長末端反復に含まれるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏら、Ｃｅｌｌ ２２：７８７−７９７（１９８０））；ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ． ７８：１４４−１４４５（１９８１））；メタロチオネイン遺伝子の制御配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ２９６：３９−４２（１９８２））；原核細胞発現ベクター例えばベーターラクタマーゼプロモーター（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７５：３７２７−３７３１（１９７８））；またはｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８０：２１−２５（１９８３））などがある。以下の動物転写調節領域もまた興味深く、これは組織特異性を呈し、トランスジェニック動物において利用されている：膵腺房細胞において活性であるエラスターゼＩ遺伝子調節領域（Ｓｗｉｆｔら、Ｃｅｌｌ ３８：６３９−６４６（１９８４）；Ｏｒｎｉｔｚら、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ． Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５０：３９９−４０９（１９８６）；ＭａｃＤｏｎａｌｄ、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ７：４２５−５１５（１９８７））；膵臓ベータ細胞において活性であるインスリン遺伝子調節領域（Ｈａｎａｈａｎ、Ｎａｔｕｒｅ ３１５：１１５−１２２（１９８５））；リンパ細胞において活性である免疫グロブリン遺伝子調節領域（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｌら、Ｃｅｌｌ ３８：６４７−６５８（１９８４）；Ａｄａｍｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ ３１８：５３３−５３８（１９８５）；Ａｌｅｘａｎｄｅｒら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：１４３６−１４４４（１９８７））；精巣、乳房、リンパおよびマスト細胞において活性であるマウス乳腺癌ウイルス調節領域（Ｌｅｄｅｒら、Ｃｅｌｌ ４５：４８５−４９５（１９８６））、肝臓において活性であるアルブミン遺伝子調節領域（Ｐｉｎｋｅｒｔら、Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ １：２６８−２７６（１９８７））；肝臓において活性であるアルファフェトタンパク質遺伝子調節領域（Ｋｒｕｍｌａｕｆら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：１６３９−１６４８（１９８５）；Ｈａｍｍｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３５：５３−５８（１９８７））；肝臓において活性であるアルファ１−アンチトリプシン遺伝子調節領域（Ｋｅｌｓｅｙら、Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ １：１６１−１７１（１９８７））；脊髄細胞において活性であるベータ・グロブリン遺伝子調節領域（Ｍｏｇｒａｍら、Ｎａｔｕｒｅ ３１５：３３８−３４０（１９８５）；Ｋｏｌｌｉａｓら、Ｃｅｌｌ ４６：８９−９４（１９８６））；脳の乏突起神経膠細胞において活性であるミエリン塩基性タンパク質遺伝子調節領域（Ｒｅａｄｈｅａｄら、Ｃｅｌｌ ４８：７０３−７１２（１９８７））；骨格筋において活性であるミオシンＬ鎖−２遺伝子調節領域（Ｓａｎｉ、Ｎａｔｕｒｅ ３１４：２８３−２８６（１９８５））；および視床下部において活性であるゴナドトロピン放出ホルモン遺伝子調節領域（Ｍａｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３４：１３７２−１３７８（１９８６））。
エンハンサー配列をベクターに挿入して真核宿主細胞における転写を増加させることができる。哺乳動物遺伝子から利用できるいくつかのエンハンサー配列が公知である（例えば、グロブリン、エラスターゼ、アルブミン、アルファ・フェト・タンパク質およびインスリン）。しかしながら、典型的にはウイルスからのエンハンサーが用いられる。ＳＶ４０エンハンサー。サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、ポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが真核細胞プロモーターの活性化の増強エレメントの例である。エンハンサーはポリペプチドコーディング領域の５’または３’位置でベクターにスプライシングされ得るが、典型的にはプロモーターから５’の部位に位置する。
本発明を実施するのに好ましいベクターは細菌、昆虫、および哺乳動物宿主に適合するベクターである。かかるベクターにはとりわけ、ｐＣＲＩＩ、ｐＣＲ３、およびｐｃＤＮＡ３．１（インビトローゲン・カンパニー、サンディエゴ、カリフォルニア州）、ｐＢＳＩＩ（ストラッタジーン・カンパニー、ラジョーラ、カリフォルニア州）、ｐＥＴ１５（ノバゲン、マディソン、ウィスコンシン州）、ｐＧＥＸ（ファルマシア・バイオテック、ピスカッタウェイ、ニュージャージー州）、ｐＥＧＦＰ−Ｎ２（クロンテック、パロアルト、カリフォルニア州）、ｐＥＴＬ（ＢｌｕｅＢａｃＩＩ、インビトローゲン）、ｐＤＳＲ−アルファ（ＰＣＴ公開番号ＷＯ９０／１４３６３）およびｐＦａｓｔＢａｃＤｕａｌ（ギブコ／ＢＲＬ、グランドアイランド、ニューヨーク州）などがある。
さらに可能なベクターには、非限定例としては、コスミド、プラスミド、または修飾ウイルスなどがあるが、ベクター系は選択された宿主細胞と適合していなければならない。かかるベクターには、非限定例としては、プラスミド例えばブルースクリプト・プラスミド誘導体（高コピー数ＣｏｌＥ１基盤ファゲミド、ストラッタジーン・クローニング・システム・インコーポレーティッド、ラジョーラ、カリフォルニア州）、クローニングＴａｑ増幅ＰＣＲ生成物のために設計されたＰＣＲクローニングプラスミド（例えばＴＯＰＯ（商標）ＴＡクローニング・キット、ＰＣＲ２．１・プラスミド誘導体、インビトローゲン、カールスバッド、カリフォルニア州）、および哺乳動物、酵母またはウイルスベクター、例えばバキュロウイルス発現系（ｐＢａｃＰＡＫプラスミド誘導体、クロンテック、パロアルト、カリフォルニア州）などがある。形質転換、トランスフェクション、感染、エレクトロポレーション、またはその他の公知の技術により宿主細胞に組換え分子を挿入することができる。
本発明の宿主細胞は原核宿主細胞（例えば大腸菌）または真核宿主細胞（例えば酵母細胞、昆虫細胞、または脊椎動物細胞）でよい。宿主細胞を適当な条件下で培養する場合、続いて培養培地から（宿主細胞がそれを培地に分泌する場合）、または直接それを生成する宿主細胞から（それが分泌されない場合）収集できる本発明の抗体または抗原結合ドメインを発現する。適当な宿主の選択は種々の因子、例えば望ましい発現レベル、活性に望ましいかまたは必要とされるポリペプチド修飾、例えばグリコシル化またはリン酸化、および生物学的に活性な分子へのフォールディングの平易さなどに依存する。
多くの適した宿主細胞が当業界で公知であり、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）、マナサス、バージニア州から入手可能である。例としては哺乳動物細胞、例えばチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ６１）ＣＨＯ ＤＨＦＲ−細胞（Ｕｒｌａｕｂら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９７：４２１６−４２２０（１９８０））、ヒト胎児腎（ＨＥＫ）２９３もしくは２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ１５７３）、または３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ９２）などがある。適当な宿主細胞の選択および形質転換、培養、増幅、スクリーニングおよび製品製造並びに精製の方法は当業界で公知である。その他の適当な哺乳動物細胞系はサルＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ１６５０）およびＣＯＳ−７細胞系（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ１６５１）、並びにＣＶ−１細胞系（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ７０）である。哺乳動物宿主細胞の別の例には霊長類細胞系および齧歯類細胞系などがあり、形質転換された細胞系を含む。通常の二倍体細胞、１次組織のインビトロ培養に由来する細胞株、および１次外植体もまた適している。候補細胞は遺伝子型的に選択遺伝子を欠失しているか、または優性に作用する選択遺伝子を含有していてよい。その他の適当な哺乳動物セルラインには、非限定例としてはマウス神経芽細胞腫Ｎ２Ａ細胞、ＨｅＬａ、マウスＬ９２９細胞、スイス由来の３Ｔ３ライン、Ｂａｌｂ−ｃまたはＮＩＨマウス、ＢＨＫまたはＨａＫハムスター細胞系などがあり、これらはアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）、マナサス、バージニア州から入手可能である。これらの細胞系の各々はタンパク質発現の分野の業者に公知であり、利用可能である。
本発明に適した宿主細胞として同様に有用であるのは細菌細胞である。例えば、大腸菌の種々の株（例えばＨＢ１０１（ＡＴＣＣ番号：３３６９４）、ＤＨ５α、ＤＨ１０、およびＭＣ１０６１（ＡＴＣＣ番号：５３３３８））がバイオテクノロジーの分野で宿主細胞として公知である。Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種、その他のバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種等もまたこの方法で用いることができる。
当業者に公知の酵母細胞の多くの株もまた本発明のポリペプチドを発現するための宿主細胞として利用できる。好ましい酵母細胞には例えばサッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｖｉｓａｅ）などがある。
さらに、望む場合、昆虫細胞系を本発明の方法において利用することができる。かかる系については例えばＫｉｔｔｓら（Ｂｉｏｔｅｈｎｉｑｕｅｓ １４：８１０−８１７（１９９３））、Ｌｕｃｋｌｏｗ（Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｖｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４：８１０−８１７（１９９３））およびＬｕｃｋｌｏｗら（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：４５６６−４５７９（１９９３））に記載されている。好ましい昆虫細胞はＳｆ−９およびＨｉ５（インビトローゲン、カールスバッド、カリフォルニア州）である。
抗ＯＰＧｂｐ抗体または抗原結合ドメインをコードする核酸分子の選択された宿主への形質転換またはトランスフェクションは、例えば塩化カルシウム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクションまたはＤＥＡＥデキストラン法などの公知の方法により達成できる。選択される方法は用いられる宿主細胞型に一部関係する。これらの方法およびその他の適当な方法は当業者に公知であり、例えば前出のＳａｍｂｒｏｏｋらに示されている。
またトランスジェニック動物を用いてグリコシル化選択的結合物質、例えば抗体および抗原結合ドメインを発現することもできる。例えば、トランスジェニック乳生成動物（例えば雌ウシまたはヤギ）を用いて動物の乳中にグリコシル化結合物質を得ることができる。また別に、植物を用いてグリコシル化選択的結合物質を生成することができる。
ＯＰＧｂｐの選択的結合物質をコードする発現ベクターを含む宿主細胞（すなわち形質転換またはトランスフェクションされている）を当業者に公知の標準的な培地を用いて培養できる。培地は通常細胞の成長および生存に必要な全ての栄養を含有する。大腸菌を培養するのに適した培地は例えばルリアブロス（ＬＢ）および／またはテリフィックブロス（ＴＢ）である。真核細胞を培養するのに適した培地はＲＰＭＩ１６４０、ＭＥＭ、ＤＭＥＭであり、これらは全て培養される特定の細胞系に必要とされる血清および／または成長因子を補充されていてよい。昆虫培養に適した培地は、イーストレート、ラクトアルブミン加水分解産物、および／または必要な場合ウシ胎仔血清を補充したグレース培地である。
典型的には、トランスフェクトされたまたは形質転換された細胞の選択的成長に有用な抗生物質またはその他の化合物を培地への補充物質として添加する。使用される化合物は宿主細胞が形質転換されたプラスミドに存在する選択マーカーエレメントにより指示される。例えば選択マーカーエレメントがカナマイシン抵抗性である場合、培養培地に添加される化合物がカナマイシンである。選択的成長のためのその他の化合物にはアンピシリン、テトラシリンおよびネオマイシンなどがある。
宿主細胞により生成された抗ＯＰＧｂｐ抗体または抗原結合ドメインの量を当業界で公知の標準的な方法を用いて評価することができる。かかる方法には、非限定例としてはウェスターンブロット分析、ＳＤＳポリアクルアミドゲル電気泳動、非変性ゲル電気泳動、ＨＰＬＣ分離免疫沈澱および／または活性アッセイなどがある。
細胞培地に分泌された抗ＯＰＧ抗体または抗原結合ドメインの精製はアフィニティ、イムノアフィニティーまたはイオン交換クロマトグラフィー、分子ふるいクロマトグラフィー、調製用ゲル電気泳動または等電点電気泳動、クロマトフォーカシングおよび高圧液体クロマトグラフィーなどの種々の技術を用いて達成することができる。例えば、Ｆｃ領域を含む抗体はＦｃ領域に選択的に結合するプロテインＡを用いるアフィニティクロマトグラフィーにより都合よく精製することができる。抗体または抗原結合ドメインの修飾形態をアフィニティータグ、例えばヘキサヒスチジンまたはその他の小型ペプチド例えばＦＬＡＧ（イーストマン・コダック・カンパニー、ニューヘブン、コネティカット州）またはｎｙｃ（インビトローゲン）で、そのカルボキシルまたはアミノ末端のいずれかで調製し、ワンステップアフィニティーカラムにより精製することができる。例えばポリヒスチジンは大きな親和性および特異性でニッケルと結合し、従ってニッケルのアフィニティカラム（例えばキアゲン（登録商標）ニッケルカラム）をポリヒスチジンタグ化選択的結合物質の精製に使用できる。（例えばＡｕｓｕｂｅｌら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、セクション１０．１１．８、ジョーン・ウィレイ・アンド・サンズ、ニューヨーク（１９９３）を参照）。１つ以上の精製工程が要求される場合もある。
原核宿主細胞に発現させる本発明の選択的結合物質はペリプラスム間隙もしくは細胞質のいずれかで可溶性形態で、または細胞内封入体の一部として不溶性形態で存在し得る。当業者に公知のいずれかの標準的な技術を用いて宿主細胞から選択的結合物質を抽出することができる。例えば、宿主細胞を溶解してフレンチプレス、ホモジナイゼーション、および／またはソニケーション、続いて遠心することによりペリプラスム／細胞質の内容物を放出させることができる。
細胞質に存在するか、またはペリプラスム間隙から放出される抗ＯＰＧｂｐ抗体または抗原結合ドメインの可溶性形態を当業界で公知の方法を用いてさらに精製でき、例えばＦａｂフラグメントは浸透圧ショック技術により細菌ペリプラスム間隙から放出される。
抗体または抗原結合ドメインが封入体を形成する場合、これらはしばしば細胞膜内および／または外に結合でき、従って遠心後のペレット物質に主に見出される。次いでペレット物質を極端なｐＨでまたは還元剤例えばジチオスレイトールの存在下、アルカリ性ｐＨで、またはトリスカルボキシルホスフィンの存在下酸ｐＨでカオトロピック剤、例えばデタージェント、グアニジン、グアニジン誘導体、尿素、または尿素誘導体と反応させ、封入体を放出、粉砕、および可溶化することができる。次いで可溶性選択的結合物質をゲル電気泳動、免疫沈澱等を用いて分析することができる。可溶化抗体または抗原結合ドメインを単離するのが望ましい場合、標準的な方法、例えば以下およびＭａｒｓｔｏｎら（Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．１８２：２６４−２７５（１９９０））に示される方法を用いて単離を行うことができる。
抗体または抗原結合ドメインが単離時に生物学的に活性でない場合もある。「リフォールディング」またはポリペプチドのその３次構造への変換およびジスルフィド結合の作製のための種々の方法を用いて生物学的活性を復活させることができる。かかる方法には可溶化ポリペプチドを通常７以上のｐＨ、および特定の濃度のカオトロープの存在に暴露することなどがある。カオトロープの選択は封入体可溶化に用いられる選択に非常に類似するが、通常カオトロープは低濃度で用いられ、可溶化に用いられるカオトロープと同一である必要はない。たいていの場合、リフォールディング／酸化溶液はまた還元剤または還元剤プラスその酸化形態を特別な比率で含有し、特定のレドックス電位を生じ、ジスルフィドがシャッフルされてタンパク質のシステインブリッジの形成を生じることが可能になる。いくつかの一般に用いられるレドックスカップルにはシステイン／シスタミン、グルタチオン（ＧＳＨ）／ジチオビスＧＳＨ、塩化第２銅、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）／チジアンＤＴＴ、および２−メルカプトエタノール（ｂＭＥ）／ビチオ−ｂ（ＭＥ）などがある。多くの例ではリフォールディングの効率を高めるためにコソルベントを用いることができるかまたは必要とされ、この目的で用いられるより一般的な試薬しはグリセロール、種々の分子量のポリエチレングリコール、アルギニン等がある。
本発明の抗体および抗原結合ドメインを化学的方法（例えば固相ペプチド合成）により、当業界で公知の技術、例えばＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄら（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９（１９６３））、Ｈｏｕｇｈｔｅｎら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：５１３２（１９８５））およびＳｔｅｗａｒｔおよびＹｏｕｎｇ（Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、ピアース・ケミカル・カンパニー、ロックフォード、イリノイ州（１９８４））に示される技術を用いて調製することもできる。かかるペプチドをアミノ末端でメチオニンを用いてまたは用いずに合成することができる。これらの参考文献に示す方法を用いて化学的に合成された抗体および抗原結合ドメインを酸化し、ジスルフィドブリッジを形成することができる。このようにして調製された抗体は、元来のまたは組換え的に製造された抗ＯＰＧｂｐ抗体または抗原結合ドメインに随伴される少なくとも１つの生物学的活性を保持する。
ＯＰＧｂｐの選択的結合物質に関するアッセイ
ＯＰＧｂｐの少なくとも１つの生物学的活性を部分的または完全に阻止する選択的結合物質を同定するスクリーニング方法が本発明により提供される。ＯＰＧｂｐの生物学的活性の阻止には、非限定例としてはＯＰＧｂｐのその同族レセプターへの結合の阻止、ＯＤＡＲ、ＯＰＧｂｐによるインビトロもしくはインビボ破骨細胞形成刺激の阻止、および／またはＯＰＧｂｐにより媒介される骨ターンオーバーもしくは骨再吸収の阻止などがある。本発明の選択的結合物質には抗ＯＰＧｂｐ抗体並びにそのフラグメント、変種、誘導体および融合体、ペプチド、ペプチド擬似化合物または有機擬似化合物などがある。
ＯＰＧｂｐの生物学的活性を部分的または完全に阻止し得る選択的結合物質を同定するためのスクリーニング方法にはインビトロまたはインビボアッセイなどがある。インビトロアッセイにはＯＤＡＲに対するＯＰＧｂｐの結合を検出するアッセイなどがあり、これを用いて、ＯＤＡＲに対するＯＰＧｂｐの結合の速度または程度を増加または減少させる能力に関してＯＰＧｂｐの選択的結合物質をスクリーニングできる。アッセイの１つの型ではＯＰＧｂｐポリペプチド、好ましくはＯＰＧｂｐの可溶性形態、例えば細胞該ドメインを固体支持体（例えばアガロースまたはアクリルビーズ）に固定し、ＯＰＧｂｐの存在下または不在下のいずれかでＯＤＡＲポリペプチドを添加する。選択的結合物質の存在下または不在下でＯＰＧｂｐおよびＯＤＡＲの結合の程度を測定する。例えば放射性標識、蛍光標識または酵素反応により結合を検出できる。また別に、表面プラスモン共鳴検出器系、例えばＢＩＡコアアッセイ系（ファルマシア、ピスカッタウェイ、ニュージャージー州）を用いて結合反応を実施できる。
インビトロアッセイ例えば前記したアッセイを都合よく用いてＯＤＡＲに対するＯＰＧｂｐの結合に及ぼす影響に関して多くの選択的結合物質を迅速にスクリーニングできる。アッセイを自動化してファージディスプレイ、合成ペプチドおよび化学合成ライブラリーで生じた化合物をスクリーニングできる。
ＯＤＡＲに対するＯＰＧｂｐの結合の結合を増加させるかまたは減少させる選択的結合物質を、いずれかのポリペプチドを発現する細胞および細胞系を用いる細胞培養においてスクリーニングすることもできる。細胞および細胞系をいずれかの哺乳動物から得ることができるが、好ましくはヒトもしくはその他の霊長類、イヌ、または齧歯類供給源から得られる。実例を挙げると、表面にＯＤＡＲを発現する細胞に対するＯＰＧｂｐの結合を選択的結合物質の存在下または不在下で評価し、結合の程度を、例えばＯＰＧｂｐに対するビオチン化抗体を用いるフローサイトメトリーにより決定できる。
インビトロ活性を用いてＯＰＧｂｐ活性を阻止する選択的結合物質を同定することもできる。アッセイの例としてはＯＰＧｂｐに依存する細胞成長および増殖の刺激並びにＯＰＧｂｐに媒介される骨髄細胞からの破骨細胞形成などがあるが、後者は本発明出願の実施例１に記載している。
インビボアッセイもまた選択的結合物質が骨ターンオーバーおよび／または骨再吸収を低下または阻止することができるかどうかを決定するために利用することができる。卵巣切除およびプロ再吸収物質、例えばＯＰＧｂｐまたはＩＬ−１の投与などの種々の方法により動物における骨再吸収を増強させることができる。ＷＯ９７／２３６１４およびＷＯ９８／４６７５１を参照。ＯＰＧインヒビターのヒト患者の骨再吸収に及ぼす影響を種々の公知の方法、例えば単一光子吸光光度法（ＳＰＡ）、二重光子吸光光度法（ＤＰＡ）、二重エネルギーＸ線吸光光度法（ＤＥＸＡ）、定量用コンピューター断層撮影法（ＱＣＴ）および超音波診断法により測定することができる（Ｊｏｈｎｓｔｏｎら、Ｐｒｉｍｅｒ ｏｎ ｔｈｅ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｂｏｎｅ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ ｏｆ Ｍｉｎｅｒａｌ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ、第２版、Ｍ．Ｊ．Ｆａｖｕｓ編、ラーベン・プレス、１３７〜１４６頁参照）。特定の生化学的マーカー、例えば血清オステオカルシン、血清アルカリ性ホスファターゼ、血清プロコラーゲンＩ伸長ペプチド、コラーゲンの尿または血清Ｃ末端またはＮ末端テロペプチド、尿カルシウム、ヒドロキシプロリン並びに尿ピリジノリンおよびデオキシピリジノリンの変化を測定することにより骨ターンオーバーおよび再吸収を決定することもできる。前記の生化学的マーカーのレベルの低下により、骨再吸収が低下し、骨量の損失が減少していることが示されることは一般に認識されている。また別に、骨再吸収に及ぼす影響を骨の機械的強度、とりわけ骨のねじれ（捻転）強度の変化を測定することにより決定することもできる。
診断適用に関しては、特定の実施形態では、ＯＰＧｂｐの選択的結合物質、例えばその抗体および抗原結合ドメインを典型的には検出可能部分で標識する。検出可能部分は検出可能なシグナルを直接的かまたは間接的に生成できるいずれかの部分でよい。例えば、検出可能部分は放射性同位元素、例えば３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、または１２５Ｉ、蛍光または化学ルミネセンス化合物、例えばフルオレセイン・イソチオシアネート、ローダミン、またはルシフェリン；または酵素、例えばアルカリ性ホスファターゼ、βガラクトシダーゼまたは西洋ワサビペルオキシダーゼでよい。Ｂａｙｅｒら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．１８４：１３８−１６３（１９９０）。
ＯＰＧｂｐポリペプチドの検出および定量のために、本発明の選択的結合物質をいずれかの公知のアッセイ方法、例えばラジオイムノアッセイ、競合結合アッセイ、直接および間接サンドウィッチアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、および免疫沈澱アッセイ（Ｓｏｌａ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、シー・アール・シー・プレス、１４７〜１５８頁（１９８７））に用いることができる。抗体は用いるアッセイ方法に適当な親和性でＯＲＧｂｐポリペプチドに結合する。
本発明の選択的結合物質はまた、検出可能部分で標識された選択的結合物質が動物に、好ましくは血流中に投与され、宿主中の標識抗体の存在および位置が検定されるインビボ撮像にも有用である。核磁気共鳴、放射線、または当業界で公知のその他の検出手段のいずれかにより動物中で検出できるいずれかの部分で物質を標識できる。
本発明はまたＯＰＧｂｐの選択的結合物質、例えば抗体または抗原結合ドメイン、および生物学的サンプル中のＩＯＧｂｐレベルを検出するのに有用なその他の試薬を含むキットにも関する。かかる試薬は２次作用、検出可能な標識、遮断血清、陽性および陰性対照サンプル、ならびに検出試薬などでよい。
ＯＰＧｂｐ選択的結合物質の治療用途
本発明の選択的結合物質を治療用として使用できる。治療用選択的結合物質はＯＰＧｂｐアゴニストまたはアンタゴニスト、および１つの実施形態では、インビトロまたはインビボでＯＰＧｂｐポリペプチドの少なくとも１つの生物学的活性を阻止する抗ＯＰＧｂｐアンタゴニスト抗体でよい。例えばＯＰＧｂｐのアンタゴニストはＯＤＡＲに対するＯＰＧｂｐの結合を少なくとも約１００倍、もしくは約１０００倍；または１０００倍以上阻止する。また別に、ＯＰＧｂｐアンタゴニストは、例えば実施例１に記載する骨髄アッセイにおいて測定可能なＩＣ５０（５０％阻止を提供する濃度）により示されるように、インビトロで破骨細胞形成を阻止する。また別に、ＯＰＧｂｐアンタゴニストは基底値と比較して少なくとも２０％、または少なくとも５０％まで骨ターンオーバーマーカーを低下させる。アンタゴニストＯＰＧｂｐ選択的結合物質（例えば抗体）は本明細書に記載するスクリーニングアッセイにより同定される。
ＯＰＧｂｐアンタゴニスト、例えば抗ＯＰＧｂｐアンタゴニスト抗体および抗原結合ドメインを用いて骨量の損失、または構造的に正常な骨が構造的に異常な骨と置き換えられることにより特徴づけられる骨疾患を予防または処置することができる。ＯＰＧｂｐアンタゴニストを、以下の障害：骨粗鬆症、例えば１次骨粗鬆症、内分泌性骨粗鬆症（甲状腺機能亢進症、副甲状腺機能亢進症、クッシング症候群、および先端巨大症）、骨粗鬆症の遺伝的および先天的形態（骨形成不全症、ホモシスチン尿症、メンケス症候群およびライリー・デイ症候群）および四肢の固定による骨粗鬆症；骨髄炎、または骨量損失に至る骨の感染性損傷；充実性腫瘍（乳房、肺および腎臓）に起因する高カルシウム血症および血液学的悪性病変（多発性骨髄腫、リンパ腫および白血病）、突発性高カルシウム血症、および甲状腺機能亢進症および腎機能障害に随伴される高カルシウム血症；ステロイド投与により誘起され、小腸および大腸の障害に随伴され、慢性肝炎および腎臓疾患に随伴される手術後オステオペニア；骨壊死、または外傷性損傷もしくはゴーシェ病、鎌状赤血球貧血、全身性エリテマトーデスおよびその他の症状に随伴される非外傷性壊死に随伴される骨細胞死；リウマチ性関節炎による骨量損失；骨量の歯周損失；骨関節炎；人工装具のゆるみ；並びに溶骨性転移；のいずれかに起因する骨量の損失を有するかまたは骨量の損失を有する可能性がＯＰＧｂｐアンタゴニストある動物に投与することができる。ＯＰＧｂｐアンタゴニストを用いて、構造的に健常な骨が破壊され構造的に不全な骨と置き換わることにより特徴づけられた特定の骨障害、例えば成人および若年の骨ページェット病（奇形性骨炎）；先天性骨障害、例えば繊維性骨異形成における、および骨硬化性骨転移における副甲状腺機能亢進症を予防または処置することもできる。
本発明の実施形態では、ＯＰＧｂｐアンタゴニストを用いて悪性または転移性腫瘍により引き起こされる溶骨性破壊に起因する骨量損失を処置するのに都合よい。本発明のＯＰＧポリペプチドを用いて乳房、前立腺、甲状腺、腎臓、肺、食道、直腸、膀胱、頚管、卵巣および肝臓癌、ならびに消化管の癌に随伴される骨量の喪失を処置することができる。特定の血液学的悪性病変、例えば多発性骨髄腫およびリンパ腫、例えばホジキン病に随伴される骨量の喪失なども含まれる。
本発明のＯＰＧｂｐのアンタゴニスト抗体および抗原結合ドメインを含むアンタゴニストを単独でまたは別の治療薬と組み合わせて、とりわけ別の癌治療薬と組み合わせて投与する。かかる薬物には一般に放射線治療または化学療法が含まれる。化学療法には以下の１つまたはそれ以上を用いる処置などがある：アントラシクリン、タクソール、タモキシフェン、ドクソルビシン、５−フルオロウラシル、およびその他の当業者に公知の薬物。１つの実施形態では、癌治療薬は黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）アンタゴニスト、好ましくはペプチドアンタゴニストである。最も好ましくは、ＬＨＲＨアンタゴニストは以下の構造からなるデカペプチド：
Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｆ−Ｇ−Ｈ−Ｉ−Ｊ、
ここで
Ａはピロ−ｇｌｕ、Ａｃ−Ｄ−Ｎａｌ、Ａｃ−Ｄ−Ｑａｌ；Ａｃ−Ｓａｒ、またはＡｃ−Ｄ−Ｐａｌであり；
ＢはＨｉｓまたは４−Ｃｌ−Ｄ−Ｐｈｅであり；
ＣはＴｒｐ、Ｄ−Ｐａｌ、Ｄ−Ｎａｌ、Ｌ−Ｎａｌ−Ｄ−Ｐａｌ（Ｎ−Ｏ）、またはＤ−Ｔｒｐであり；
ＤはＳｅｒであり；
ＥはＮ−Ｍｅ−Ａｌａ、Ｔｙｒ、Ｎ−Ｍｅ−Ｔｙｒ、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ（ｉＰｒ）、４−Ｃｌ−Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、Ａｓｎ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、ＡｒｇまたはＩｌｅであり；
Ｆは
Figure 0005279425
 （式中、ＲおよびＸは別個にＨおよびアルキルであり；Ｙは小型極性基を含む）
であり；
ＧはＬｅｕまたはＴｒｐであり；
ＨはＬｙｓ（ｉＰｒ）、Ｇｌｎ、Ｍｅｔ、またはＡｒｇであり；
ＩはＰｒｏであり；および
ＪはＧｌｙ−ＮＨ２またはＤ−Ａｌａ−ＮＨ２である；
またはその医薬的に許容される塩である。
別の実施形態ではＬＨＲＨアンタゴニストはペプチド：
Ｎ−Ａｃ−Ｄ−Ｎａｌ−４−Ｃ；−Ｐｈｅ−Ｄ−Ｐａｌ−Ｓｅｒ−Ｎ−Ｍｅ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（ｉＰｒ）−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ２を含む。
本明細書では標準的な略語および慣例を使用し、以下の標準的でない残基および部分は以下のように略する：
Ｎａｌ ３−（２−ナフチル）アラニニル
４−Ｃｌ−Ｐｈｅ （４’−クロロフェニル）アラニニル
Ｐａｌ ３−（３’−ピリジル）アラニニル
Ｐａｌ（Ｎ−Ｏ） ３−（３’−ピリジン−Ｎ−オキシド）アラニニル
ｉＰｒ−Ｌｙｓ Ｎ−エプシロン−２−プロピル−リジニル
Ｑａｌ ３−（２’−キノリニル）アラニニル
ＬＨＲＨアンタゴニストデカペプチドの別の形態もまた本発明に包含される。かかるデカペプチドは米国特許第５８４３９０１号に記載されており、出展明示により本明細書の一部とする。
ＯＰＧｂｐアンタゴニストと腫瘍細胞に結合する抗体との組み合わせもまた包含され、腫瘍成長に細胞毒性および／または細胞増殖抑制効果を誘導する。かかる抗体の例としては細胞表面タンパク質Ｈｅｒ２、ＣＤＣ２０、ＣＤＣ３３、ムチン様糖タンパク質および腫瘍細胞に存在する表皮成長因子レセプター（ＥＧＦＲ）などがあり、これらのタンパク質を展示する腫瘍細胞において細胞毒性および／または細胞増殖抑制効果を誘導する。かかる抗体の例としては乳癌治療のためのヘルセプチン、非ホジキンリンパ腫の処置のためのリタクサンなどがある。腫瘍細胞において選択的にアポプトシスを誘導するポリペプチド、例えばＴＮＦ関連ポリペプチドトレイルもまた癌治療薬に含まれる。ＯＲＧｂｐアンタゴニストを癌治療薬での処置の前、同時または後に投与することができる。転移性癌による骨量損失の発病を予防するかまたは緩和するためにＯＲＧｂｐを予防的に投与するか、または転移による骨量損失の既存の症状の処置のために投与することができる。
本発明のＯＰＧｂｐアンタゴニストを用いて骨の腫瘍細胞の成長を予防および／または処置することができる。腫瘍細胞は破骨細胞が内部骨マトリックスを再吸収するのを刺激するので、骨に転移する癌は迅速に拡散し得る。ＯＰＧｂｐアンタゴニストでの処置は再吸収を阻止することにより骨密度を維持し、腫瘍細胞が骨格じゅうに拡散する可能性を低減する。骨に転移するいずれの癌もＯＰＧｂｐアンタゴニストで予防および／または処置できる。
１つの実施形態では、ＯＰＧｂｐアンタゴニスト、例えば抗体で多発性骨髄腫を予防および／または処置できる。多発性骨髄腫は骨に局在し、患う患者は局在領域において破骨細胞活性化の増強による典型的な骨量の喪失を呈する。骨髄腫細胞は直接的または間接的にＯＰＧｂｐを生成し、今度は破骨細胞を活性化して、骨髄間隙に埋め込まれた骨髄腫細胞を取り囲んで局所的な骨溶解に至る。骨髄腫細胞に隣接する正常な破骨細胞は、今度はＩＬ−６を生成し、骨髄腫細胞の成長および増殖に至る。骨髄腫細胞はクローン化様式で広がり、不適切な骨再吸収により作られている骨間隙を占拠する。動物をＯＰＧｂｐアンタゴニストで処置することにより破骨細胞の活性化が遮断され、今度は破骨細胞によるＩＬ−６生成が低下し、骨髄腫細胞成長および／または増殖が抑制される。
ＯＰＧｂｐアンタゴニストを単独で、骨量喪失に至る前記で参考にした症状の処置に、または治療上有効量の骨成長促進（タンパク質同化）薬または抗再吸収薬、例えばＢＭＰ−１からＢＭＰ−１２と称する骨形態形成因子、形質転換成長因子βおよびＴＧＦ−βファミリーメンバー、繊維芽成長因子ＦＧＦ−１からＦＧＦ−１０、インターロイキン−１インヒビター、ＴＮＦαインヒビター、副甲状腺ホルモン、プロスタグランジンＥシリーズ、ビスフォスフォネートおよび骨増強ミネラル例えばフッ素およびカルシウムと組み合わせて用いることができる。タンパク質同化作用薬には副甲状腺ホルモンおよびインスリン様成長因子（ＩＧＦ）などがあり、ここで後者の薬物はＩＧＦ結合タンパク質と複合体形成しているのが好ましい。好ましい実施形態はＯＰＧｂｐアンタゴニストとインターロイキン−１（ＩＬ−１）レセプターアンタゴニストとの、またはＯＰＧｂｐアンタゴニストと可溶性ＴＮＦレセプター、例えば可溶性ＴＮＦレセプター−１または可溶性ＴＮＦレセプター−２との組み合わせなども含まれる。ＩＬ−１レセプターアンタゴニストの例はＷＯ８９／１１５４０に記載されており、可溶性ＴＮＦレセプター−１の例はＷＯ９８／０１５５５に記載されている。
骨再吸収の速度の低下により、過剰な骨密度が特徴的な症状である大理石骨病に至り得る。ＯＰＧｂｐのアゴニストは破骨細胞形成および骨再吸収を増加させることができ、骨再吸収低下および異常な骨量増加を有するまたはその可能性のある動物に投与することができる。
医薬用組成物
ＯＰＧｂｐ選択的結合物質の医薬用組成物は本発明の範囲内である。かかる組成物は治療的または予防的に有効量のＯＰＧｂｐ選択的結合物質、例えば抗体、またはそのフラグメント、変種、誘導体もしくは融合体を医薬的に許容される物質と混合して含む。好ましい実施形態では、医薬用組成物は、ＯＰＧｂｐの少なくとも１つの生物学的活性を部分的または完全に阻止する抗ＯＰＧｂｐアンタゴニスト抗体を医薬的に許容される物質と混合して含む。典型的には抗体は動物投与用に十分精製されている。
本発明の組成物で使用するための医薬的に許容される物質には当業界で公知の担体、賦形剤、希釈剤、抗酸化剤、保存剤、着色剤、着香希釈剤、乳化剤、懸濁剤、溶媒、増量剤、充填剤、バッファー、分配ベヒクル、等張化剤、コソルベント、湿潤剤、錯化剤、緩衝剤、抗菌剤および界面活性剤などがある。
中性緩衝生理食塩水または血清アルブミンと混合した生理食塩水が適当な担体の実例である。抗酸化剤、例えばアスコルビン酸；低分子量ポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン；親水性重合体、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジン；単糖類、二糖類、およびその他の炭化水素、例えばグルコース、マンノース、またはデキストリン；キレート試薬、例えばＥＤＴＡ；糖アルコール、例えばマンニトールまたはソルビトール；塩形成対イオン、ナトリウム；および／または非イオン性界面活性剤、例えばトゥイーン、プルロニックまたはポリエチレングリコールもまた組成物に含まれる。また実例を挙げると、張力増強剤にはアルカリ金属ハロゲン化物（好ましくは塩化ナトリウムまたはカリウム）、マンニトール、ソルビトール等がある。適当な保存剤には、非限定例としては塩化ベンザルコニウム、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロロヘキシジン、ソルビン酸等がある。過酸化水素を保存剤として使用することもできる。適当なコソルベントは、例えばグリセリン、プロピレングリコール、およびポリエチレングリコールである。適当な錯化剤は、例えばカフェイン、ポリビニルピロリドン、ベータ・シクロデキストリンまたはヒドロキシプロピル・ベータ・シクロデキストリンである。適当な界面活性剤または湿潤剤にはソルビタンエステル、ポリソルベート、例えばポリソルベート８０、トロメタミン、レシチン、コレステロール、チロキサパール等がある。バッファーは慣用されるバッファー、例えば酢酸塩、ホウ酸塩、クエン酸塩、リン酸塩、炭酸水素塩、またはトリスＨＣｌでよい。酢酸塩バッファーのｐＨはおよそ４．０から５．５でよく、トリスバッファーのｐＨはおよそ７．０から８．５でよい。さらなる医薬用物質はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版、Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編、マック・パブリッシング・カンパニー（１９９０）に示されており、その対応する箇所は出展明示により本明細書の一部とする。
組成物は液体形態または凍結・乾燥されたすなわち凍結乾燥形態でよい。凍結乾燥形態は賦形剤、例えばスクロースを含んでよい。
本発明の組成物は非経口投与に適している。好ましい実施形態では、組成物は当業者に利用できるいずれかの経路、例えば皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、脳内（実質組織内）、脳室内、筋肉内、眼内、動脈内、または病巣内経路による動物への注射または注入に適している。非経口用処方は典型的には無菌でパイロジェン不含の等張水溶液であり、任意に医薬的に許容される保存剤を含有する。
最適な医薬用処方は意図する投与経路、分配様式および望ましい投与量に依存して当業者により容易に決定できる。
その他の処方もまた本発明により企図される。また医薬用組成物は重合体化合物、例えばポリ乳酸、ポリグリコール酸等の特定の調製、またはＯＰＧｂｐ選択的結合物質（例えば抗体）のリポソームへの導入をも含んでよい。ヒアルロン酸をも使用でき、これは循環における保持時間を延長する効果を有する。医薬用組成物はまたＯＰＧｂｐ選択的結合物質（例えば抗体）と、デポー注射として分配される選択的結合物質の放出を調節または持続させるために提供される物質、例えば注射用マイクロスフェア、インビボ侵食性粒子もしくはビーズ、またはリポソームとの処方をも含む。分配に適したその他の手段には埋め込み可能な分配装置などがある。
ＯＰＧｂｐ選択的結合物質（例えば抗体）を含む医薬用組成物を吸入用の乾燥粉末として処方することができる。かかる吸入溶液をエアロゾル分配用の液化プロペラント中に処方することもできる。さらに別の処方では溶液を霧状にできる。
ＯＰＧｂｐ選択的結合物質を含有する特定の処方が経口投与できることも企図される。この様式で投与される処方は固体投与形態、例えば錠剤およびカプセルの調剤に通例使用される担体を用いてまたは用いずに処方できる。例えば、カプセルを、消化管の一点で処方の活性部分を放出し、そのとき生物学的利用性が最大化され、体内前分解が最小化されるように設計できる。別の物質を含有して選択的結合物質の吸収を促進させることができる。希釈剤、着香剤、低融点ワックス、植物油、滑沢剤、懸濁剤、錠剤崩壊剤、および結合剤を用いることもできる。
別の製剤は有効量のＯＰＧｂｐ選択的結合物質を、錠剤の製造に適した無毒の賦形剤と混合して含むことができる。錠剤を滅菌水または別の適当なベヒクルに溶解することにより、溶液を単位投与形態に調製することができる。適当な賦形剤には、非限定例としては不活性希釈剤、例えば炭酸カルシウム、リン酸カルシウム；または結合剤、例えばデンプン、ゼラチン、もしくはアカシア；または滑沢剤、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、もしくはタルクなどがある。
別の処方は当業者に明らかであり、１つまたはそれ以上の別の治療薬と組み合わせたＯＰＧｂｐ選択的結合物質を含む処方などがある。種々のその他の徐放または分配調節手段、例えばリポソームキャリヤ、体内侵食性微粒子または多孔性ビーズおよびデポー注射を処方する技術もまた当業者に公知である。例えば、Ｓｕｐｅｒｓａｘｏら、医薬用組成物の分配のための有孔性重合体微粒子の放出調節に関する記載（ＷＯ９３／１５７２２（ＰＣＴ／ＵＳ９３／００８２９）参照）を参照（その開示は出展明示により本明細書の一部とする）。
投与様式にかかわらず、体重、体表面積または器官の大きさに従って具体的な用量を算出することができる。前記した処方の各々に関与する処置のための適当な用量を決定するために必要な計算のさらなる改良は当業者により日常的に行われ、当業者により日常的に行われる仕事の範囲内である。適当な用量−応答性データを用いて適当な用量を確認することができる。
肺投与により本発明の医薬用組成物を投与することができ、例えば化学的に修飾されたタンパク質の肺分配について開示するＰＣＴ ＷＯ９４／２００６９（出展明示により本明細書の一部とする）を参照されたい。肺分配に関しては、粒子の大きさが遠位の肺への分配に適していなければならない。例えば粒子の大きさは１μｍから５μｍでよいが、例えば各々の粒子が適切に有孔性である場合、より大きな粒子を使用することができる。
また別に、またはさらに、ＯＰＧｂｐ選択的結合物質が吸収されるかまたはカプセル化されている膜、スポンジ、またはその他の適当な物質を患部へ埋め込むことにより組成物を局所的に投与することができる。埋め込み装置を使用する場合、いずれかの適当な組織、または器官に装置を埋め込むことができ、ＯＰＧｂｐ選択的結合物質の分配はボーラスにより、または連続投与により、または連続注入を用いるカテーテルにより装置から直接行われる。
本発明の医薬用組成物を徐放性処方または製剤で投与することもできる。徐放性製剤の適当な例には成形された製品の形態の半透過性重合体マトリックス、例えばフィルム、またはマイクロカプセルなどがある。徐放性マトリックスにはポリエステル、ポリラクチド（例えば米国特許第３７７３９１９号、欧州特許第５８４８１号参照）、Ｌグルタミン酸およびガンマ・Ｌ−グルタミン酸エチルの共重合体（Ｓｉｄｍａｎら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ２２：５４７−５５６（１９８３））、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）（Ｌａｎｇｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７−２７７（１９８１）およびＬａｎｇｅｒ、Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８−１０５（１９８２））、エチレン・ビニル・アセテート、またはポリ−Ｄ（−）−３−ヒドロキシ酪酸などがある。徐放性組成物はまたリポソームをも含み、これは当業界で公知のいくつかの方法のいずれかにより調製できる。例えばＥｐｐｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：３６８８−３６９２（１９８５）；欧州特許第３６６７６号；欧州特許第８８０４６号；欧州特許第１４３９４９号を参照。
ＯＰＧｂｐ選択的結合物質、例えば抗体並びにそのフラグメント、変種、誘導体および融合体を単独でまたは別の医薬用組成物と組み合わせて用いることができる。例えば、ＯＰＧｂｐアンタゴニストおよびインターロイキン−１レセプターアンタゴニスト、またはＯＰＧｂｐアンタゴニストおよび可溶性ＴＮＦレセプター−１、またはＯＰＧｂｐアンタゴニストおよび可溶性ＴＮＦレセプター−２を別個にまたは一緒に含む医薬用組成物をリウマチ性関節炎の処置に用いることができる。さらにＯＰＧｂｐアンタゴニストおよび癌治療薬を別個にまたは一緒に含む医薬用組成物を癌および随伴する骨量の損失の処置に用いることができる。処置すべき症状に依存してＯＰＧｂｐアンタゴニストまたはアゴニストとの別の組み合わせが可能である。
エクソビボの様式でＯＰＧｂｐ選択的結合物質組成物を含む医薬用組成物を使用するのが望ましい例もある。その場合、患者から取り出した細胞、組織、または器官を、ＯＰＧｂｐ選択的結合物質を含む医薬用組成物に暴露し、その後、細胞、組織および／または器官を続いて患者に再移植する。
ＯＰＧｂｐ選択的結合物質を含む組成物を、本明細書に記載されるような方法を用いて遺伝子操作し、ポリペプチド、選択的結合物質、フラグメント、変種、または誘導体を発現および分泌する特定の細胞を患者に移植することにより分配できる場合もある。かかる細胞は動物またはヒト細胞でよく、患者自身の組織に由来するか、またはヒトもしくはヒト以外の別の供給源に由来してよい。任意に細胞を不死化してもよい。しかしながら、免疫学的応答の機会を低減するために、細胞をカプセル化し、周辺組織の浸潤を避けるのが好ましい。カプセル化物質は典型的にはタンパク質生成物の放出が可能であるが患者の免疫系による、または周辺組織からのその他の有害な因子による細胞の破壊を防御する、生体適合性の半透過性重合体封入物または膜である。
細胞の膜カプセル化に用いる方法は当業者に公知であり、カプセル化された細胞の調製および患者におけるその移植は過度に説明することなく達成できる。例えば、米国特許第４８９２５３８号；第５０１１４７２号；および第５１０６６２７号を参照。生存細胞をカプセル化するための系はＰＣＴ ＷＯ９１／１０４２５（Ａｅｂｉｓｃｈｅｒら）に記載されている。その他の種々の徐放性または分配調節手段、例えばリポソームキャリヤ、インビボ侵食性粒子またはビーズを処方する技術、もまた当業者に公知であり、記載されている。カプセル化されたまたはされていない細胞を患者の適当な体組織または器官に移植できる。
ＯＰＧｂｐ選択的結合物質（例えば抗ＯＰＧｂｐ抗体、またはそのフラグメント、変種、誘導体、および融合体）を含む医薬用組成物の治療的および予防的有効量は、例えば治療目的、例えば組成物が用いられている適用、投与経路、および対象の症状に依存する。本発明のＯＰＧｂｐアンタゴニスト抗体または抗原結合ドメインを治療的または予防的有効量で投与して転移性骨疾患に随伴される骨の損失を予防および／または処置する。ＯＰＧｂｐアンタゴニスト抗体の「治療的または予防的有効量」とは骨量の損失の速度および／または程度を低減するか、または正常の骨量を有する対象の骨量喪失を防御する量である。種々の公知の方法、例えば単一光子吸光光度法（ＳＰＡ）、二重光子吸光光度法（ＤＰＡ）、二重エネルギーＸ線吸光光度法（ＤＥＸＡ）、定量用コンピューター断層撮影法（ＱＣＴ）および超音波診断法により骨量の変化を測定することができる（Ｊｏｈｎｓｔｏｎら、Ｐｒｉｍｅｒ ｏｎ ｔｈｅ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｂｏｎｅ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ ｏｆ Ｍｉｎｅｒａｌ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ、第２版、Ｍ．Ｊ．Ｆａｖｕｓ編、ラーベン・プレス、１３７〜１４６頁参照）。当業者はこれらの方法を用いてＯＰＧ融合ポリペプチドの治療的に有効な量を決定することができる。治療的に有効な量を骨ターンオーバーに関する生化学的マーカー、例えば血清オステオカルシン、血清アルカリ性ホスファターゼ、血清プロコラーゲンＩ伸長ペプチド、コラーゲンの尿または血清Ｃ末端またはＮ末端テロペプチド、尿カルシウム、ヒドロキシプロリン並びに尿ピリジノリンおよびデオキシピリジノリンの変化を測定することにより決定することもできる。前記の生化学的マーカーのレベルの低下により、骨再吸収が低下し、骨量の損失が減少していることが示されることは一般に認識されている。また別に、ＯＰＧｂｐ融合ポリペプチドの治療的に有効な量を骨の機械的強度の変化、とりわけ骨のねじれ（捻転）強度の増大を測定することにより決定することもできる。
従って、最適な治療効果を得るために要求されるように、管理者が投与量を測定し、投与経路を変更することが必要であろう。典型的な用量は約０．１μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇまでかまたはそれ以上の範囲であり、これは前記した因子に依存する。別の実施形態では、用量は約１μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇまで；約５μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇまで；または０．１μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇまで；または１μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇまでの範囲でよい。典型的には、臨床医は望ましい効果を達成できる用量に至るまで組成物を投与する。従って組成物を１回投与で、または時間をかけて２回もしくはそれ以上の回数投与（ＯＰＧｂｐ選択的結合物質を同一量含有してもしなくてもよい）で、または埋め込んだ装置またはカテーテルを解して連続注入で投与することができる。
以下の実施例は本発明をより十分に説明するために提供するものであって、その範囲を限定することを意図するものではない。
実施例１
試薬およびアッセイ
ＣＨＯ宿主細胞中ＰＣＴ ＷＯ９８／４６７５１の図４に示されるようにアミノ酸１４０から３１７（両端を含めて）のヒトＯＰＧｂｐをコードするｃＤＮＡの発現物からこれらの研究で用いるスクリーニング標的を調製し、以下のように精製した。Ｑセファロースカラム（ファルマシア）を２０ｍＭ トリス（ｐＨ８．５）で平衡化した。ｐＨ８．５に滴定をも行った条件培地を適用し、カラムをトリスバッファーで洗浄し、２０カラム容量以上の１００から６００ｍＭ ＮａＣｌグラジエントでタンパク質を溶出した。ＯＰＧＬを含有する分画をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスターンブロット分析により同定した。次いでＯＰＧｂｐ含有分画をｐＨ４．８に滴定し、２０ｍＭ 酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）で平衡化したＳｐカラム（ファルマシア）に適用した。洗浄後、０から０．３Ｍ ＮａＣｌグラジエント、続いて０．５Ｍおよび１Ｍ ＮａＣｌステップによりタンパク質を溶出した。ＯＰＧｂｐを全てのバッファーで溶出したが、０から０．３Ｍ ＮａＣｌグラジエント分画のみがインビトロ破骨細胞刺激バイオアッセイにおいて活性であることが見出された。収量は４０ｍｇ／ｌであった。アミノ末端シークエンシングにより精製されたタンパク質の約８０％がヒトＯＰＧｂｐのアミノ酸１４３で出発したが、残りの約２０％はアミノ酸１４７で出発した。ファージライブラリーのスクリーニングに用いられる最終生成物をＯＰＧｂｐ［１４３−３１７］と称し、主に精製された形態である。
抗ＯＰＧｂｐポリクローナル抗体を以下のように調製した。３匹のニュージーランドウサギ（ウェスターン・オレゴン・ラビット・カンパニー、フィロマス、オレゴン州）に最初、等量のハンター・タイター・マックス（シット・アール・エックス・コーポレーション、アトランタ、ジョージア州）およびＯＰＧｂｐ［１４３−３１７］を注射した。ウサギあたり０．２ｍｇ注射した。これを４および６週後に繰り返した。５０ｍｌ出血を７週目に行い、その後週１回、全部で６回出血を行った。以下のようにＯＰＧｂｐ樹脂に固定した免疫ウサギの血清から抗体をアフィニティー精製した。アクチゲル・アルド樹脂（ステロゲン）３ｍｌを１０ｍｌカラム（コンテス・フレックス・カラム）に加え、ＰＢＳ ５０ｍｌで洗浄した。ＯＰＧｂｐ［１４３−３１７］３ｍｇをＰＢＳ ３ｍｌに希釈し、これをアクチゲル・カラムに加え、穏やかに振盪して混合物した。次いで１Ｍ シアノボロハイドライドＮａ ０．６ｍｌを加え、混合物を４℃で一晩振盪した。ピアース・ゲントル・エルーション・バッファー（ピアース）５０ｍｌで洗浄し、続いてＰＢＳ １５０ｍｌで洗浄した。免疫ウサギの血清５０ｍｌを、０．４５μｍフィルターを通して滅菌濾過し、カラムに加え、混合物を４℃で一晩振盪した。翌日カラムの内容物を沈殿させて液相を排出した。次いでカラムをＯＤ２８０が０．００２になるまでＰＢＳ １５０ｍｌで洗浄した。次いで１％氷酢酸含有ピアース・ゲントル・エルーション・バッファーをカラムに加え、１ｍｌ分画を１０分間隔で収集し、ＯＤ２８０により分析した。ＯＤ２８０吸収物質を最も多量に含有する分画をプールし、ＰＢＳ ２ｌに対して４８時間透析した。この時バッファー交換を１回行った。
溶出したファージプールに関して、ＰＢＳ（ｐＨ８．０）中１．５μｇ／ｍｌのＯＰＧｂｐをロッカー上のヌンク・マクシソープ・イムノプレートに室温で２時間プレートし、ＥＬＩＳＡアッセイを実施した。２％ＭＰＢＳのリンス溶液（ブロック・バッファー）をイムノプレートに加え、室温で３分間インキュベートし、捨てた。２％ＭＰＢＳで室温で１時間遮断を行った。ＴＢＳ−トゥイーン２０（０．１％）（ＴＢＳ；トリス緩衝生理食塩水；１０ｍＭ トリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ。１５０ｍＭ ＮａＣｌ）を用いて５回洗浄を行った。コンジュゲート希釈バッファー（ＴＢＳ中０．４％脱脂粉乳または０．４％Ｍ−ＴＢＳ）中最低の１０１０ファージ／ウェルを用いて室温で１時間、ファージの力価測定を加えた。ＴＢＳ−トゥイーン２０（０．１％）を用いて洗浄を行った。抗Ｍ１３西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）モノクローナル抗体コンジュゲート（ファルマシア・ピスカッタウェイ、ニュージャージー州）を０．４％ＭＴＢＳ中１／２０００希釈で、室温で１．５時間使用した。ＴＢＳ−トゥイーン２０（０．１％）で洗浄を５回行った。ＯＤ４０５で検出するための比色基質である２，２’−アジノビス（３−エチルベンズチアゾリンスルホン酸）（ＡＢＴＳ）（ピアース、ロックフォード、イリノイ州）を加えた。プレートしたｈｕＯＰＧｂｐ［１４３−３１７］の検出用の陽性対照を、ＯＰＧ［２２−１９４］−Ｆｃ、続いて検出用の抗Ｆｃアルカリ性ホスファターゼおよびパラ・ニトロフェニルフェノール（ｐＮＰＰ）基質を加えて実施した。
ＰＣＲ条件および２ｘＴＹ−ＡＧ培養
９６ウェルサーモウェルプレートで典型的なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実施した。各ウェルはＰＣＲ反応混合物［１０ｘＰＣＲバッファー（ギブコＢＲＬプロダクツ、グランドアイランド、ニュウーヨーク州）２μｌ、水１７．３μｌ、ｄＮＴＰ ０．２μｌ（２５ｍＭ）、プライマー８７０−０２ ０．２μｌ、プライマー２１８２−８３ ０．２μｌ（挿入増幅用プライマーストック １０ピコモル／μｌ）、Ｔａｑポリメラーゼ０．１μｌ］２０μｌを含む。個々のコロニーを採取し、ウェルに再懸濁し、鉱物油２０μｌで積層し、密封し、次いでＰＣＲ器機内に置いた。
Figure 0005279425
同一の採取したコロニーを第２の９６ディープウェルブロックの対応するウェル位置に移して培養物を調製するためのプレートを２検体ずつ作った。培養物を２ｘＴＹ−ＡＧ（２ｘＴＹブロス：（水１ｌあたりバクトトリプトン１６ｇ、水１ｌあたり酵母抽出物１０ｇ、水１ｌあたりＮａＣｌ ５ｇ）１００μｇ／ｍｌアンピシリンおよび２％グルコース含有）０．３から１．０ｍｌ中で成長させた。ブロックを通気性のテープで密封し、１０００ｒｐｍで２分間遠心して液体を沈め、３７℃のインキュベーター中３００から３５０ｒｐｍで一晩培養した。一晩培養したものに５０％グリセロール １５０μｌ／ウェルを加え、混合し、−８０℃で凍結した。
ＰＣＲ反応条件は９０℃で４５秒、５５℃で４５秒、７２℃で１．５分を４０サイクル、続いて７２℃で１０分間の伸長であった。ＰＣＲ反応が完了した後、２．５から４．０μｌを２５ウェル １％アガロースゲル上を０．５μｌ／ｍｌ臭化エチジウムでＤＮＡ分子量標準（ギブコＢＲＬプロダクツ、グランドアイランド、ニューヨーク州、またはストラッタジーン、ラジョーラ、カリフォルニア州）用いて９０ボルトで９０分間走らせた。１．６ｋｂ以上の全長インサートのみを考慮した。
ＰＣＲ反応物の１６μｌアリコートを水１０μｌ、１０ｘＲＥアクトバッファー２（ギブコＢＲＬプロダクツ）、ＢＳＡ（１０ｍｇ／ｍｌ）０．３μｌ，ＢｓｔＮＩ（ギブコ；１００００単位／ｍｌ）０．７μｌを含有する全消化混合物３０μｌで、６０℃で３時間ＢｓｔＮＩ消化した。消化したサンプルを２５ウェル ３％アガロースゲル上を８０ボルトで３．５時間走らせた。
ＲＡＷ細胞アッセイ
種々濃度のＦａｂ被験サンプルを一定量のヒトＯＰＧｂｐ［１４３−３１７］と混合し、ＤＭＥＭ、１０％ウシ胎仔血清および１ｘグルタミン−ペニシリン−ストレプトマイシン混合物中、室温で少なくとも１時間インキュベートした。ＦａｂサンプルおよびＯＰＧｂｐの濃度は各実験で示す。インキュベーションの後、混合物を９６ウェル平底組織培養プレート中２ｘ１０４ ＲＡＷ２６４．７セル／ウェル（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、マナサス、バージニア州、受け入れ番号ＴＩＢ−７１）に加えた。１０％ウシ胎仔血清および１ｘグルタミン−ペニシリン−ストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ中ＲＡＷ細胞を培養した。５％ＣＯ２、３７℃で３日間の後、培地をウェルから吸引し、０．１％トリトンＸ−１００含有０．１Ｍ クエン酸をウェルあたり１００μｌ加え、室温で５分間インキュベートし、トリトンＸ−１００含有クエン酸塩バッファー中パラ・ニトロフェニルホスフェート（ｐＮＰＰ）基質および酒石酸塩（基質濃度は２０ｍＭ ｐＮＰＰおよび３３５ｍＭ 酒石酸塩であった）を加え、さらに室温で５分間インキュベートすることにより、細胞を破骨細胞分化マーカーである酒石酸塩抵抗性酸ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）に関して染色した。ＮａＯＨを０．０５Ｍの濃度まで加えて反応を停止させた。酸ホスファターゼはｐＮＰＰ基質を４０５ｎｍでの吸収により検出されるパラ・ニトロフェノールに変換する。４０５ｎｍでの吸収の変化を対照および被験サンプルの双方に関して用量ログ関数としてプロットした。分散分析（ＡＮＯＶＡ）および９５％の信頼限界を有する相対強度を算出した。陽性対照には前記したようにＯＰＧｂｐ［１４３−３１７］で予備インキュベートし、ＲＡＷ２６４．７細胞と共にインキュベートした種々濃度のＯＰＧ［２２−１９４］−Ｆｃ融合タンパク質または抗ＯＰＧｂｐポリクローナル抗体調製物が含まれる。
骨髄アッセイ
本質的にはＬａｃｅｙら（Ｃｅｌｌ ９３：１６５−１７６（１９９８））およびＫｏｎｇら（Ｎａｔｕｒｅ ３９７：３１５−３２３（１９９９））に記載されるように破骨細胞形成に関するネズミ骨髄アッセイを実施した。簡単には、アッセイは、非付着ネズミ骨髄細胞をヒトＯＰＧｂｐ（１４３−３１７）の存在下であるが、間質細胞系ＳＴ２、１，２５（ＯＨ）２ビタミンＤ３およびデキサメサゾンは添加せずに培地中約７日間培養したＰＣＴ ＷＯ９７／２３６１４に記載されるネズミ骨髄培養アッセイを修飾したものである。破骨細胞表現型を有する細胞をＴＲＡＰ陽性細胞の発現により検出した。ＴＲＡＰ活性は溶液中または組織化学的染色により測定した。
溶液中のＴＲＡＰ活性を検出するために、成熟骨髄細胞を１００ｍＭ クエン酸塩バッファー（シグマ、Ｃａｔ＃９１−５）＋０．１％トリトンＸ−１００、ｐＨ５．０中３から５分間溶解した。１０ｍＭ −ＮＰＰ、８０ｍＭ 酒石酸塩、および１００ｍＭ クエン酸塩＋０．１％トリトンＸ−１００、ｐＨ５．０を加え、室温で３から５分間インキュベートし、５００ｍＭ ＮａＯＨ／ウェル５０μｌで反応を停止させた後、４０５ｎｍｆで測定した。陽性応答は〜２．０ＯＤから〜６ＯＤまでで４０５ｎｍにおける吸収が濃度依存的に減少した。
組織化学的染色に関しては、細胞をホルムアルデヒド基盤の固定溶液中で固定し、次いでファスト・ガーネットＧＢＣ（２−メチル−４−［（２−メチルフェニル）−アゾ］ベンゼンジアゾニウム）溶液＋ナフトールＡＳ−ＢＩ（Ｃ１８Ｈ１５ＢｒＮＯ６Ｐ）リン酸塩溶液＋酢酸塩溶液＋酒石酸塩溶液で染色し、３７℃で１時間インキュベートし、次いですすぎ、乾燥し、顕微鏡的に評価した。ＴＲＡＰ陽性で３個またはそれ以上の核（ＴＲＡＰ陽性ＭＮＣ）を含有する細胞を破骨細胞と考えた。
実施例２
ヒトＦａｂライブラリーのスクリーニング
バクテリオファージＭ１３で調製した独特なヒトＦａｂフラグメント４ｘ１０１０のライブラリーをターゲット・クエスト、ＮＶ（アムステルダム、オランダ）から入手した。ヒトＦａｂライブラリーを構築およびスクリーニングするための一般的な方法についてはＨａｒｒｄら（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ３１：５−３１（１９９８）；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：１８２１８−１８２３０（１９９９））で報告された。以下の方法によりＯＰＧｂｐ［１４３−３１７］に結合するＦａｂフラグメントに関してライブラリーをスクリーニングした。
固相直接プレーティング
前記のように調製したＯＰＧｂｐ［１４３−３１７］を、ヌンク・マキシソルブ・イムノチューブ（１２ｘ７５ｍｍ、容量５ｍｌ）を用いてＴＢＳ（ｐＨ８．０）（ＴＢＳはトリス緩衝生理食塩水：１０ｍＭ トリス（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌであった）中１．５μｇ／ｍｌのタンパク質濃度で固相に直接室温で２時間プレートすることにより、固相に固定した。これらの条件により２時間で固相の最大プレートの８０％が可能であるが（２時間で最大であるがまだ飽和されていなかった）、ＯＰＧｂｐ［２２−１９４］−Ｆｃへの結合能力は保持されている。２時間のインキュベーションの後、チューブをＰＢＳで３回洗浄した。イムノチューブをＰＢＳ（ＭＰＢＳ）中２％脱脂粉乳（マーべルまたはカーネーション）で室温で１から４時間満たし、ＰＢＳ−トゥイーン２０（０．１％）およびＰＢＳで各々２回洗浄することによりプレート化された標的を遮断した。ＰＥＧ濃縮ファージ（およそ１０１３）を２％ＭＰＢＳで予備遮断し、ファージを固相標的に暴露する前に乳結合ファージを吸収させた。予備遮断ファージを４ｍｌでプレート化標識とともに室温で２時間インキュベートした（３０分間はさかさまに回転させ、９０分は静置した）。チューブに結合した内容物をＰＢＳ−トゥイーン２０（０．１％）で２０回、ＰＢＳで２０回洗浄して結合していないファージを除去し、非特異的結合を低減させた。１００ｍＭ トリエチルアミン（ＴＥＡ）（ｐＨ１２）１ｍｌで１０分間全ファージ溶出し、チューブをさかさまに回転させ、続いて１Ｍ トリスＨＣｌ（ｐＨ７．４）０．５ｍｌで中和して固相からファージを溶出した。また別に、０．４％ＭＰＢＳ中１μＭ ＯＰＧｂｐ［１４３−３１７］または１μＭ ＯＰＧ［２２−１９４］−Ｆｃ（各々ｐＨ８．０またはｐＨ７．４）いずれか１ｍｌで溶出することにより特異的ファージ結合物質を収集した。
大腸菌ＴＧ１株（ファルマシア、ピスカッタウェイ、ニュージャージー州）で溶出したファージ（結合物質）を力価測定した。「トラック希釈」法（Ｈｕｙｃｋｅら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２３：６４８−６５０（１９９７））に変更を加えた方法により、２ｘＴＹブロス中ファージ希釈物１０μｌをロングフェース（Ａ６００ ０．２から１．０ＯＤ）ＴＧ１細胞９０μｌに混合し、室温で２０から３０分インキュベーションして力価測定を２検体ずつで実施した。１０μｌを水平にすじをつけてレーンにし、２ｘＴＹ−ＡＧ角型ペトリ皿（２ｘＴＹブロス、２％グルコース、１００μｌ／ｍｌアンピシリンおよび１５ｇ／ｌ寒天含有）あたり６レーン作り、３７℃で一晩インキュベーションした。
溶出したファージ（結合物質）をＴＧ１細胞で細菌感染させることにより増幅した。２ｘＴＹブロス２５ｍｌを大腸菌ＴＧ１細胞に接種し、３０℃、２７０ｒｐｍで１２時間以上成長させた。一晩培養物を２ｘＴＹブロス５０ｍｌ中１：１００で接種し、２７０ｒｐｍで〜１．５時間、ＯＤ６００が０．５になるまで成長させた。選択したファージを増幅するために、指数関数大腸菌ＴＧ１細胞５容量を加え、２ｘＴＹブロス４容量および溶出（中和された）ファージ１容量と一緒に３７℃の水浴中３０分間インキュベートした。プレートする容量を減じるために、細胞を４０００ｒｐｍで遠心し、ペレットを２ｘＴＹ−ＡＧブロス（１００μｇ／ｍｌアンピシリン、２％グルコース）に再懸濁した。選択の第１ラウンドではサンプルを２から４個の１６ｃｍ２２ｘＴＹ−ＡＧプレート（２ｘＴＹブロス、２％グルコース、１００μｇ／ｍｌアンピシリンおよび１５ｇ寒天含有）にプレートし、多様性を維持した。選択のその後のラウンドでは１個のプレートで十分であった。プレートを３０℃で一晩インキュベートした。一晩成長させた後、２ｘＴＹ−ＡＧ ５ｍｌを各々の大きいプレートに加え、細菌を滅菌スプレッダーで掻き取った。４０００ｒｐｍで１０分間スピンダウンして再懸濁および濃縮を完了した後、濃縮サンプルをヌンク・クリオチューブに移した。滅菌グリセロールを加えて最終濃度１５％にし、直ぐに−７０℃で保存した。
増幅した細胞を２ｘＴＹ−ＡＧブロスに再懸濁して〜０．１ＯＤにし、３７℃、２７０℃で１．５から２．５時間、ＯＤ６００が０．５になるまで成長させ、適量のＭ１３Ｋ０７ヘルパーファージ（ギブコＢＲＬプロダクツ、グランドアイランド、ニューヨーク州）が入った５０ｍｌファルコンチューブに移し（５ｍｌ）、細菌に対するファージの比率を１対２０にした。ファージと細菌の混合物を攪拌せずに３７℃で３０分間インキュベートし、続いて３７００ｒｐｍで１５分間遠心した。上澄を除去し、細菌ペレットを２ｘＴＹ−ＡＫ（１００μｇ／ｍｌＡアンピシリン、２５μｇ／ｍｌカナマイシン）２５ｍｌに再懸濁し、２５０ｍｌフラスコに移し、２７０ｒｐｍで振盪しながら３０℃で一晩インキュベートした。翌日培養物を５０ｍｌファルコンチューブ中３７００ｒｐｍで２０分間遠心して細菌をペレット化した。上澄に１／５の容量のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）溶液（２０％ＰＥＧ ８０００、２．５Ｍ ＮａＣｌ）を加え、氷上で少なくとも１時間維持した。ファージを３７００ｒｐｍ、４℃で２０分間ペレット化した。上澄を捨て、ペレットを〜０．１ｍｌ滅菌ＰＢＳに再懸濁し、１．５ｍｌエッペンドルフチューブに移した。サンプルを〜１４０００ｒｐｍで２分間マイクロ遠心して残りの細菌を除去し、上澄を新しいチューブに移した。ＰＥＧ沈殿を繰り返した。濃縮ＰＥＧ沈殿ファージを選択またはスクリーニングアッセイに用いた。標準物質は培養物２５ｍｌから約１から５ｘ１０２３ファージを生じた。長期保存用にはファージにグリセロールを加え（最終濃度１５％）、ファージを−７０℃で保存した。
この方法は結合、溶出および増幅の工程からなる１ラウンドスクリーニングについて記載している。典型的には、バックグラウンドよりも少なくとも４倍大きいレベルでＥＬＩＳＡアッセイにおいてＯＰＧｂｐ［１４３−３１７］に結合するファージプールを得るために３から５ラウンドのスクリーニングを実施した。スクリーニングを完了した後、最終溶出ファージを個々のコロニーに関してプレートし、以下に記載するようにコロニーＰＣＲおよびＢｓｔＮＩ消化により挿入されたＤＮＡを分析した。
液相
回転装置で２％ＭＰＢＳ中室温で６０分間ファージを予備遮断した。ビオチン化ＯＰＧｂｐｂ−ｂ’ループペプチド（５００ｎＭ）を平衡ファージ混合物に直接加え、回転装置で（さかさまにする）室温で３０分から１時間インキュベートした。ループペプチドは配列［ビオチン（ＬＣ）−ＴＤＩＰＳＧＳＨＫＶＳＬＳＳＷＹＨＤＲＧ］（配列番号２４）を有し、ここでＬＣ（直鎖、すなわち（ＣＨ２）５−ＮＨ２）を用いてＯＰＧｂｐｂ−ｂ’ループ配列をビオチンに連結させる。ビオチン化抗原−ファージ複合体の液相捕捉のためにストレプトアビジン・コーティング・ダイナビーズ（選択あたり１．５ｍｌエッペンドルフチューブ中１００μｌ）を用いた（陰性用に３ｘ、標的抗原選択用に１ｘ）。ダイナルスマグネットを用いてトレプトアビジンビーズをチューブの側面に引き寄せることにより予備平衡化し、バッファーを除去し、ビーズを２％ＭＰＢＳ１ｍｌに再懸濁した。さかさまにする回転装置で、室温で１から２時間平衡化した。
ラウンド２および３で３つの陰性選択を実施した。陰性選択用に予備遮断したファージを２％ＭＰＢＳで予備平衡化したストレプトアビジンコーティングダイナビーズのチューブに加え、さかさまにする回転装置で、室温で３０分間インキュベートした（２回繰り返す）。ビーズを側面に引き寄せ、結合していないファージを新たなエッペンドルフチューブに移し、抗原選択用に使用した。ビオチン化ｈｕＯＰＧｂｐｂ−ｂ’ループペプチド（５００ｎＭ）を直接平衡ファージ混合物に加え、さかさまにする回転装置で室温で３０分から１時間インキュベートした。平衡化ビーズをチューブの側面に引き寄せ、バッファーを除去し、ファージ−ビオチン化ペプチド混合物で再懸濁し、続いてさかさまにする回転装置で室温で１５分間インキュベートした。チューブをマグネチックラックに１分間置き、吸引し、ビーズを２％ＭＰＢＳ−トゥイーン２０（０．１％）１ｍｌで６回、ＰＢＳ−トゥイーン２０（０．１％）１ｍｌで６回、およびＰＢＳ１ｍｌで２回洗浄した。回転装置で１００ｍＭ ＴＥＡ（ｐＨ１２）１ｍｌ中室温でファージを５から１０分間溶出し、続いて１Ｍ トリスＨＣｌ（ｐＨ７．４）０．５ｍｌで中和した。
実施例３
ＯＰＧｂｐに結合するＦａｂクローンの同定
大腸菌ＴＧ１細胞をＥＬＩＳＡ応答性ラウンドからのファージプールで感染させ、個々のコロニーをＰＣＲ分析用に採取した。典型的には各選択用に１から４個のプレートの９６個のコロニーを採取した。特異的な一連のプライマーによるＰＣＲでＦａｂ ｃＤＮＡを増幅し、Ｆａｂインサートの長さに関してアガロースゲルを分析した。＞１．６ｋｂの長さのＦａｂインサートが全長であった。またｃＤＮＡをＢｓｔＮＩ制限酵素で消化し、縞模様をアガロースゲルでの電気泳動により分析した。同一の大きさのＰＣＲ全長インサートを呈するクローンおよび２個またはそれ以上単離体で同一のＢｓｔＮＩの縞模様をさらなる分析のための候補物質とした。前記の基準を用いて以下のＦａｂを同定した。
トリエチルアミン（ｐＨ１２）での３ラウンドの溶出を用いる液相スクリーニングの後Ｆａｂパターン「Ｐ」を同定し、続いて１μＭ ＯＰＧｂｐ［１４３−３１７］での１ラウンドの溶出を用いて前記したように固相スクリーニングを行った。
トリエチルアミン（ｐＨ１２）での３ラウンドの溶出を用いる液相スクリーニングによりＦａｂパターン「Ｓ」を同定し、続いて１μＭ ＯＰＧ［２２−１９４］−Ｆｃでの２ラウンドの溶出を用いて前記したように固相スクリーニングを行った。
前記したように１μＭ ＯＰＧ［２２−１９４］−Ｆｃでの４ラウンドの溶出を用いる固相スクリーニングによりＦａｂパターン「ＡＴ」を同定した。
前記したようにＯＰＧｂｐ［１４３−３１７］での３ラウンドの溶出を用いる固相スクリーニングによりＦａｂパターン「Ｙ」を同定した。
以下の方法によりＦａｂＡＴ、Ｙ、ＰおよびＳパターンを呈する個々のコロニーからファージを調製した。プラスミド調製物を作り、Ｔｇ１細胞に形質転換した。ＰＣＲ分析により全長インサートの形質転換を確認した。ディープウェルブロック（０．５ｍｌ用量）で、または１０ｍｌ培養物としてのいずれかで細胞を成長させた。Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーファージ／細胞感染の比率が２０：１でファージを救済し、ＰＥＧを１度に沈殿させ（固相直接プレーティングプロトコルでのように）、〜２００μｌから２ｍｌのウェルの大きさのディープウェルブロックまたはＰＢＳ中〜５００μｌから１０ｍｌの培養物に再懸濁した。
ＥＬＩＳＡへのファージ力価は１０１１から１０１４ファージ／ｍｌの範囲であった。最大５０μｌ／ウェルの添加を用いて容量に基づく力価測定を行い、ＥＬＩＳＡにおいて１０９から１０１１ファージ／ウェルが得られた。前記したようにファージＥＬＩＳＡを実施した。ＥＬＩＳＡではＡＢＴＳとの結合ファージを検出するために４０５ｎｍでの比色基質である抗Ｍ１３−ＨＲＰコンジュゲートを用いた。抗Ｍ１３ ＨＲＰコンジュゲートはファージ上の主要なコートタンパク質ＶＩＩＩに特異的であった。単一の点の決定から値が得られた。
主要パターン「ＡＴ」、「Ｙ」、「Ｐ」および「Ｓ」の各々からの代表的なクローンＥＬＩＳＡの結果を図１に示した。４個全てのＦａｂクローンはＯＰＧｂｐ［１４３−３１７］との有意な反応性を示した。パターン「ＡＴ」および「Ｙ」からの全てのクローンのメンバー（６７２クローンから２７メンバー、９６クローンから９メンバー）をシークエンシングしてそのパターン内で同一であることを見出した。従って、いずれかのパターンメンバーはパターン「ＡＴ」および「Ｙ」の全パターンの典型である。
パターン「Ｑ」（９６クローンから３メンバー）、「Ｘ」（９６クローンから３メンバー）および「ＡＢ」（９６クローンから２メンバー）もまた、典型的なクローンにより決定されるようにプレートされたＯＰＧｂｐ［１４３−３１７］に対してＥＬＩＳＡ陽性であった。ＥＬＩＳＡシグナルはパターン「ＡＴ」、「Ｙ」、「Ｐ」および「Ｓ」よりもかなり低く、９６クローン中２から３個のメンバーによってのみ示されるので、これらはμＭ範囲のＫｄｓを有し、さらには分析されなかった。パターン「Ｘ」はＥＬＩＳＡ陽性のみであり、そのとき洗浄液中のトゥイーン２０の濃度は０．１％から０．０１％に低減した。
実施例４
可溶性Ｆａｂの精製
Ｆａｂ「ＡＴ」、「Ｙ」、「Ｐ」および「Ｓ」を含有するファージを大腸菌ＨＢ２１５１（ファルマシア、ピスカッタウェイ、ニュージャージー州）に感染させ、パターンＹに関してはＩＰＴＧレベルを０．２５ｍＭに低減する以外は、ＩＰＴＧを１ｍＭまで、一般的には少なくとも５時間添加してＦａｂフラグメントの発現を誘導した。誘導後、細胞（７５０ｍｌ）を遠心により収穫し、浸透圧ショックによりＦａｂをペリプラスミック間隙から放出させた。
全ペレットを氷冷ＴＥＳ（０．２Ｍ トリス、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、１７．１％スクロース、ｐＨ８．０）８ｍｌに再懸濁し、５０ｍｌチューブに移し、氷上時々穏やかに振盪して５から１０分間インキュベートした。一方空のチューブをＴＥＳ／Ｈ２Ｏ（１：３）８．８ｍｌで洗浄し、残りの細胞ペレットを回収し、別の細胞に加え、さらに２０分間氷上でインキュベートした。細胞を１４０００ｒｐｍで３分間遠心し、上澄を少し水に浸された細胞ペレットから別の５０ｍｌチューブに移した。上澄を再度１４０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心し、残りの細胞夾雑物を除去した。上澄をＴＥＳ放出ペリプラスミック分画と称した。細菌ペレットをＴＥＳプラス１５ｍＭ ＭｇＳＯ４ １０ｍｌに再懸濁し、氷上で１５分間インキュベートし、前記のように２回遠心した。上澄をＭｇ放出ペリプラスミック分画と称した。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；ＲＩＡグレード、シグマ）をキャリヤおよび安定剤として各ペリプラスミック分画に加えて最終濃度を１ｍｇ／ｍｌとし、１回交換のタロン・カラムバッファー（２０ｍＭ トリスＨＣｌ／０．１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．５）プラスプロテアーゼインヒビター、最終濃度０．０５ｍｇ／ｍｌペファブロック、５０ｎＭ ロイペプチン、０．０６μｇ／ｍｌアグロチニンおよび０．９μｇ／ｍｌペプスタチンＡで、２ｌ中４℃で一晩透析した。
Ｆａｂ含有ペリプラスミック抽出物（ＴＥＳおよびＭｇ放出）を０．８ｍｌから１．５ｍｌ（抽出容量の１／２０）の予備平衡化タロン樹脂（クロンテック）と共に４℃で１時間の振盪と結びつけたバッチ法に別個に供し、次いでバッチ法を２０カラム容量のカラムバッファーで少なくとも２回洗浄した。タロン樹脂をカラムに詰め、１０カラム容量のカラムバッファーで洗浄し、２カラム容量のカラムバッファープラス５０ｍＭ イミイダゾールで洗浄し、非特異的結合タンパク質を放出させた。精製されたＦａｂを２から３カラム容量の２００ｍＭ イミダゾール、４％グリセロールで溶出した。次いで精製された抽出物をセントリコン１０（アミコン・インコーポレーティッド、ビバリー、マサチューセッツ州）中ＰＢＳ（ｐＨ７．４）に最終濃度０．５から５ｍｇ／ｍｌに濃縮／交換した。可溶性Ｆａｂ「ＡＴ」の純度をノベックス（サンディエゴ、カリフォルニア州）１０％ビストリスＮｕＰＡＧＥゲル上でＮｕＰＡＧＥ ＭＯＰＳ ＳＤＳ ラニングバッファー（非還元性）および４Ｘ ＬＤＳサンプルバッファー（ｐＨ８．４５）で可溶性Ｆａｂ「ＡＴ」の純度を決定した。ＬＤＳサンプルバッファーを含有する精製されたＦａｂサンプルを７０℃で１０分間加熱し、４０μｌ／レーンで負荷した。ゲルを２００ボルトで２０分間走らせ、次いで５０ボルト〜１．５時間に低減し、ノベックス・コロイダル・クーマシー・ブルー色素で〜１４時間染色し、脱染した。可溶性Ｆａｂ「ＡＴ」が９８％以上の純度を有することを決定した。
実施例５
精製抗ＯＰＧｂｐＦａｂの活性
精製された可溶性Ｆａｂ「ＡＴ」および「Ｙ」を以下のアッセイにより分析した。
ＯＰＧｂｐ／ＯＤＡＲ相互作用阻止アッセイ
ヒトＯＰＧｂｐ［１４３−３１７］およびそのレセプターＯＤＡＲを蛍光エネルギー移動（ＦＲＥＴ）アッセイにおいて測定した。ＯＰＧｂｐとの１時間の予備インキュベーションにより感受性が高められた。ヒトＯＤＡＲの可溶性細胞外ドメインをアミノ末端ＦＬＡＧタグおよびカルボキシ末端ヒトＦｃ領域との融合ポリペプチドとして構築した。Ｆｃ領域はポリクローナルヤギ抗ヒトＦｃ特異的アロフィコシアニン（ＡＰＣ）により認識および結合され、これは６６５ｎｍでの吸収により検出される。ＯＰＧｂｐ［１４３−３１７］をＥｕ２＋で標識し、これを６２０ｎｍでの吸収により検出する。このアッセイではＯＰＧｂｐのＯＤＡＲに対する結合が蛍光エネルギー移動の引き金となり、競合曲線に関して高度な感受性を有する。Ａ６６５／Ａ６２０吸収比率の減少はＯＤＡＲに対するＯＰＧｂｐ結合の阻止を示す。
可溶性Ｆａｂ「ＡＴ」および「Ｙ」の２検体ずつの調製物に関してｓＯＤＡＲ−Ｆｃに対するＯＰＧｂｐ−Ｅｕ結合の濃度依存的阻止が観察された。可溶性Ｆａｂ「ＡＴ」（調製物Ａ）は５５０ｎＭのＩＣ５０で可溶性ＯＤＡＲ−Ｆｃ融合に対するＯＰＧｂｐ結合を阻止した。可溶性Ｆａｂ「Ｙ」は６μＭのＩＣ５０で阻止した。Ｆａｂ「ＡＴ」クローン１Ｂ５は１μＭ ＯＰＧ［２２−１９４］−Ｆｃの溶液を用いる９０分間のＯＰＧｂｐ標的からの溶出により得られた７個の９６ウェルプレートからの２７メンバー（全て同一のアミノ酸配列を有する）の主要なパターンからであった。Ｆａｂ「Ｙ」クローン１Ｂ４は１μＭ ＯＰＧｂｐ溶出９０分間を用いる最適化プレートＯＰＧｂｐスクリーンからの１個の９６ウェルプレートからの主要な９メンバー（全て同一のアミノ酸配列を有する）のパターンからであった。Ｆａｂ「ＡＴ」クローン６Ｆ１１（調製物Ｂと称する）の第２の精製によりＰＢＳに関して４４０ｎＭの類似のＩＣ５０、およびＴＢＳに関して３５４ｎＭのＩＣ５０を生じた。Ｆａｂ「Ｙ」の第２の精製（調製物Ｂ）によりＴＢＳに関して４．１μＭの類似のＩＣ５０を生じた。陽性対照は各々対応するＩＣ５０、０．８９および０．９３ ｎＭを有するＴＢＳまたはＰＢＳ中のＯＰＧｂｐ［１４３−３１７］であった。２検体ずつの調製物［Ａ］および［Ｂ］で類似のＩＣ５０が得られた。ＴＢＳ中Ｆａｂ［ＡＴ］および［Ｙ］のＢ調製物の結果を図２に示す。
骨髄アッセイ
可溶性Ｆａｂ「ＡＴ」「Ｙ」および「Ｐ」を実施例４に記載したとおり精製し、続いて以下に記載する以外は製造者の指示書に従ってＰＢＳ中室温でポリミキシンアフィニティーカラム（〜１ｍｌ；バイオラッド、ヘルクレス、カルフォルニア州）を用いる２連続エンドトキシン除去工程を行った。Ｆａｂに結合したエンドトキシンを除去する可能性を高めるために、サンプルを加えた後、１００μｌから１５０μｌアリコートを５分毎に２から２．５時間、カラムの底部から上部に再循環させた。４％グリセロール含有ＰＢＳ ３カラム容量でＦａｂを溶出した。
製造者の指示書に従ってＥ−トクセート（リムルスアメーバー様ライゼート）検出系（シグマ、セントルイス、ミズーリー州）を用いてエンドトキシンに関してサンプルを試験した。次いでサンプルを滅菌濾過した（０．２μｍ）。精製後Ｆａｂ「Ｐ」は変性し、ＥＬＩＳＡではＯＰＧｂｐ［１４３−３１７］にあまり結合しなかった。これらの実験ではこれを陰性対照として用いた。
アッセイ様式には抗ＯＰＧｂｐＦａｂを１０ｎｇ／ｍｌひとＯＰＧｂｐ［１４３−３１７］（最終ウェル濃度）と共に１時間インキュベートすることが含まれる。ｐＮＰＰ発色性基質を用いて溶液中でＴＲＡＰアッセイを実施した。図３に結果を示す。Ｆａｂ「ＡＴ」は５７．８ｎＭで５０％低下（ＩＣ５０）を呈し；Ｆａｂ「Ｙ」は２１２ｎＭで５０％低下（ＩＣ５０）を呈し；Ｆａｂ「Ｐ」１．５μＭで５０％低下（ＩＣ５０）を呈した。推測されるＦａｂ分子量５００００をこれらの計算で用いて変換因子：１μｇ／ｍｌ＝２０ｎＭ が得られた。
ＴＲＡＰ組織化学的染色により決定されるＩＣ５０はｐＮＰＰアッセイで決定された前記の値に類似した。
ＲＡＷ細胞アッセイ
ＲＡＷ細胞アッセイへの可溶性Ｆａｂ「ＡＴ」「Ｙ」および「Ｐ」の添加の影響を図４に示す。グラフの５０％の値を１．６５ＯＤ４０５ｎｍとした。Ｆａｂ「ＡＴ」は１５μｇ／ｍｌ、３００ｎＭ（Ｆａｂ分子量を５００００と仮定）のＩＣ５０を有する。Ｆａｂ「Ｙ」は２．５ＯＤ４０５から２．１５ＯＤ４０５までで８０％の値でシグナルが低下する。外挿法により、Ｆａｂ「Ｙ」に関する１．６５のＯＤ４０５の５０％の値は〜４００μｇ／ｍｌｘ２０＝〜８μＭに到達する。「Ｐ」はアッセイにおいて検出可能な反応性をなんら示さない。
実施例６
Ｆａｂクローンのシークエンシングおよび分析
Ｆａｂ「ＡＴ」、「Ｙ」、「Ｐ」および「Ｓ」の軽鎖に関するＤＮＡおよび予測されるアミノ酸配列を各々図５、６、７および８に示した。Ｆａｂ「ＡＴ」、「Ｙ」、「Ｐ」および「Ｓ」の重鎖に関するＤＮＡおよび予測されるアミノ酸配列を各々図９、１０、１１および１２に示した。図１３は同一性および類似性に基づく４つの主要なＦａｂパターンクローンの各々の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列比較行列を示す。同一性および類似性はＧＣＧプログラムまたは手計算のいずれかにより得られた。Ｆａｂ「ＡＴ」および「Ｙ」重鎖配列は単一のアミノ酸により異なるような最も近い対合性を有し（保存変化）、従って同一性９９．６％、類似性１００％であった。互いの同一性および類似性の双方に関して上位４つのパターン間で軽鎖アミノ酸配列を比較した。Ｆａｂ「ＡＴ」、「Ｙ」および「Ｐ」は少なくとも８５％の同一性、および少なくとも８９％の類似性を示した。パターン「Ｓ」はさらにまれなＶラムダファミリーの最も類似性がものである。
相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列の比較を図１４に示した。Ｆａｂ「ＡＴ」および「Ｙ」はＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３において同一の重鎖アミノ酸配列を有した。Ｆａｂ「Ｐ」および「Ｓ」各々の重鎖ＣＤＲ１は「ＡＴ」および「Ｙ」ＣＤＲ１配列に同一の３つのアミノ酸残基を有した。「Ｐ」および「Ｓ」のＣＤＲ２配列は「ＡＴ」および「Ｙ」ＣＤＲ２配列に対するよりも互いに顕著な同一性を示した。Ｆａｂ「ＡＴ」および「Ｙ」の軽鎖はＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の長さが同一であることが示された。パターン「ＡＴ」および「Ｙ」軽鎖ＣＤＲ１および３では各々１１個の残基のうちの７個（６４％）および５個の残基のうちの３個（６０％）で同一性が示された。パターン「ＡＴ」および「Ｙ」軽鎖ＣＤＲ２は互いに同一性を示さないが、各々は軽鎖ＣＤＲ２に関するコンセンサス配列の一部を含有する。パターン「ＡＴ」の最初の４個の残基をバターン「Ｙ」の最後の３個の残基と組み合わせた場合、パターン「Ｐ」の軽鎖ＣＤＲ２が得られた。軽鎖ＣＤＲ３は５個から２５個の残基の長さに変化し得る。従って、パターン「ＡＴ」、「Ｙ」および「Ｐ」で得られた軽鎖ＣＤＲ３は非常に短かった。最も独特な４個の主要なパターンクローンはＦａｂ「Ｓ」であった。
４つの主要なパターンで表されるＦａｂクラスの比較を図１５に示す。これらの結果はＶ基盤ＤＮＡ プロット分析から得られた。予測されるＦａｂ「ＡＴ」および「Ｙ」は同一のＶＤＪ領域（可変性、多様性および連結性）を有する同一のＶＨ１ファミリー（可変重鎖１ファミリー）である。Ｆａｂ「ＡＴ」および「Ｙ」は異なる軽鎖ファミリーに属する。Ｆａｂ「Ｐ」および「Ｓ」は同一のＶＨ３重鎖ファミリーに属するが、異なる軽鎖ファミリーに属する。全ての重鎖はＪＨ４ｂ連結領域を有する。
Ｆａｂ配列および対応する生殖細胞系配列のアラインメントを重鎖に関しては図１６から１８に示し、軽鎖に関しては図１９から２２に示す。「ＡＴ」、「Ｙ」、「Ｐ」および「Ｓ」の重鎖および軽鎖における変化は抗体応答中に抗体生殖細胞系配列中で上昇する天然発生ソメティック・マタスティスに起因する。「ＡＴ」および「Ｙ」重鎖の可変領域（各々図９および１０のアミノ末端の１２７個のアミノ酸）は対応するＶＤＪ生殖細胞系配列と比較して、各々１７および１８個のアミノ酸変化を有した。「Ｐ」重鎖の可変領域（図１１のアミノ末端の１１７個のアミノ酸）は対応するＶＤＪ生殖細胞系配列と比較して、１６個のアミノ酸変化を有する。「Ｓ」重鎖の可変領域（図１２のアミノ末端の１２４個のアミノ酸）は生殖細胞系配列と比較して、１４個のアミノ酸変化を有した。「ＡＴ」軽鎖の可変領域（図５の６から１０８残基）は対応するＶＪ生殖細胞系配列と比較して、１６個のアミノ酸変化を有し；「Ｙ」軽鎖（図６の６から１０８残基）は１４個のアミノ酸変化を有し；「Ｐ」軽鎖（図７の５から１０８残基）は１４個のアミノ酸変化を有し；および「Ｓ」軽鎖（図８の５から１１２残基）は１２個のアミノ酸変化を有した。一般に、重鎖および軽鎖の双方のＣＤ３領域で最も頻繁にアミノ酸の差異を生じた。
実施例７
ヒトＯＰＧｂｐ抗体全長のクローニングおよび発現
以下の方法によりＦａｂクローンを抗体全長に変換した。
ｐＤＳＲα１９：ｈＣＨの構築
プラスミドｐＤＳＲα１９：ＥＰＯをＨｉｎｄＩＩＩおよびＳａｌＩで消化してエリスロポイエチンのコーディング領域を除去した。ヒトＩｇＧ１ ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含有するプラスミドｐＣＲブラントＣＨ１−３をベクターｐＣＲブラント（インビトローゲン）に挿入し、これを用いて１．４ｋｂヒトＩｇＧ定常領域を得た。ｐＣＲブラントＣＨ１−３をＨｉｎｄＩＩＩおよびＳａｌＩで消化し、定常ドメイン配列をｐＤＳＲα１９に挿入してｐＤＳＲα１９：ｈＣＨを作製した。
ｐＤＳＲα１９：ＡＴ−ＶＨ２１の構築
４つの抗ｈｕＯＰＧｂｐ Ｆａｂ重鎖ｃＤＮＡをｐＤＳＲα１９：ｈＣＨにクローン化し、ＦａｂをＩｇＧ全長に変換した。「ＡＴ」重鎖をコードするプラスミドの構築物についてここで記載する。その他のＦａｂ重鎖は類似の方法を用いてクローン化した。単一の配列を有するＦａｂを作製するために、３工程ＰＣＲを実施した。最初にプライマー２２４９−２５および２２４８−２２をＦａｂ ｃＤＮＡ鋳型と共に使用した。条件は：Ｐｆｕポリメラーゼおよび適当なバッファーおよびヌクレオチドを用いて、９４℃で１分間、（９５℃で３０秒間、５０℃で１分間、６８℃で１分間）を２０サイクル、６８℃で１０分間であった。次いでＰＣＲ生成物をプライマー２２０９−２１および２２４８−２２で増幅し、続いてプライマー２２０９−２０および２２４８−２２で増幅した。最終的なＰＣＲ生成物を清浄し、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢｓｍＢＩで切断し、ゲル精製した。このフラグメントは５’コザック（翻訳開始）部位および以下のＦａｂ「ＡＴ」重鎖の哺乳動物発現のためのシグナル配列：
ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳ（配列番号２５）
を含有する。このシグナル配列をＶＨ２１シグナル配列と称する。
プラスミドｐＤＳＲα１９：ｈＣＨをＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＢＩで消化してポリリンカーを除去した後、ＩｇＧ ＣＨ１−３ドメインおよびＦａｂ ＰＣＲ生成物を挿入してｐＤＳＲα１９：ＡＴ−ＶＨ２１を作製した。
Figure 0005279425
ｐＤＳＲα１９：ＡＴ−Ｌの構築
Ｆａｂ「ＡＴ」、「Ｙ」、「Ｐ」および「Ｓ」軽鎖ｃＤＮＡをｐＤＳＲα１９にクローン化してＦａｂを抗体全長に変換した。「ＡＴ」軽鎖をコードするプラスミドの構築についてここで記載する。その他のＦａｂ重鎖は類似の方法を用いてクローン化した。単一の配列を有するＦａｂ「ＡＴ」を作製するために、３工程ＰＣＲを実施した。最初にプライマー２２３３−５０および２２３３−５１をＦａｂ ｃＤＮＡ鋳型と共に使用した。ＰＣＲ条件は：Ｐｆｕポリメラーゼおよび適当なバッファーおよびヌクレオチドを用いて、９４℃で１分間、（９５℃で３０秒間、５０℃で１分間、６８℃で２分間）を２０サイクル、６８℃で１０分間であった。次いでＰＣＲ生成物をプライマー２１４８−９８および２２３３−５１で増幅し、続いてプライマー２１４８−９７および２２３３−５１で増幅した。最終的なＰＣＲ生成物を清浄し、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＳａｌＩで切断し、ゲル精製した。このフラグメントは５’コザック（翻訳開始）部位および以下のＦａｂ「ＡＴ」軽鎖の哺乳動物発現のためのシグナル配列：
ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＷＬＲＧＡＲＣ（配列番号３３）
を含有する。このシグナル配列を「軽」シグナル配列と称する。
プラスミドｐＤＳＲα１９：ＥＰＯをＨｉｎｄＩＩＩおよびＳａｌＩで消化してＥＰＯ遺伝子を除去した後、ＩｇＧ軽鎖ＰＣＲ生成物を挿入してｐＤＳＲα１９：ＡＴ−Ｌを作製した。
Figure 0005279425
ｐＤＳＲα１９：ＡＴ−ｔＰＡの構築
「ＡＴ」、「Ｙ」、「Ｐ」および「Ｓ」重鎖全長を生成するための発現ベクターを、プライマーを修飾して以下のシグナル配列：
Figure 0005279425
を導入した以外は前記したように構築した。このシグナル配列を「ｔＰＡ−ＲＧＲ」シグナル配列と称した。
ｐＬＤＨ−ＡＴの構築
「ＡＴ」重鎖および軽鎖の双方を含有する発現ベクターを構築した。ｐＤＳＲα１９：ＡＴ−Ｖｈ２１をＡａｔＩＩおよびＮｄｅＩで消化し、末端をＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで埋めた。「ＡＴ」重鎖発現カセットを含有するフラグメント（プロモーターおよびｐＤＳＲα１９からのポリアデニル化部位によりフランキングされた「ＡＴ」重鎖コーディング配列）をゲル精製し、ＮｈｅＩで直線化し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで埋め、アルカリ性ホスファターゼで脱リン酸化したｐＤＳＲα１９：ＡＴ−Ｌにライゲートした。重鎖発現カセットは軽鎖およびＤＨＦＲ遺伝子と同一の転写配向であった。
抗体調製
重および軽鎖「ＡＴ」、「Ｙ」、「Ｓ」および「Ｐ」全長抗体をコードするｃＤＮＡを含有する発現ベクターをＣＨＯ細胞に移し、重および軽鎖の発現を可能にする条件下で培養し、細胞培地に分泌させた。条件培地を０．４５μｍ酢酸セルロースフィルター（コーニング、アクトン、マサチューセッツ州）を通して濾過し、塩化カルシウム不含および塩化マグネシウム不含のＰＢＳ−ダルベッコリン酸塩緩衝生理食塩水（ギブコＢＲＬプロダクツ、グランド・アイランド、ニューヨーク州）で平衡化したプロテインＧセファロース（アメルシャム・ファルマシア・バイオテック、ピスカッタウェイ、ニュージャージー州）カラムに適用した。サンプルを適用した後、２８０ｎｍでの吸収が基底値に達するまでカラムをＰＢＳで洗浄した。１００ｍＭ グリシン（ｐＨ２．５）を用いてタンパク質の溶出を行った。分画を収集し、即座に１Ｍ トリスＨＣｌ（ｐＨ９．２）を加えて中和した。クーマシー染色により可視化されたＳＤＳポリアクリルアミドゲルにより抗体を検出した。
抗体を含有する分画をプールし、濃縮し、セントリコン１０（アミコン）またはより多量のセントリプレップ１０（アミコン）のいずれかを用いてＰＢＳに透析した。
単離された抗体をセファロース６（アメルシャム・ファルマシア・バイオテック、ピスカッタウェイ、ニュージャージー州）でゲル濾過して特徴づけし、単量体ＩｇＧとして流されたことが示された。
実施例８
ＦａｂのＢＩＡコア分析およびＯＰＧｂｐに対する抗体結合
Ｆａｂ「ＡＴ」、「Ｙ」および「ＡＴ」抗体に関する結合定数（Ｋｄ）、オン速度定数（ｋａ）およびオフ速度定数（ｋｄ）を表面プラスモン共鳴技術（ＢＩＡコア、ファルマシア、ピスカッタウェイ、ニュージャージー州）により決定し、その結果を表ＩＩに示す。Ｆａｂは実施例４に記載したとおりに調製し、「ＡＴ」抗体は実施例７に記載したとおりに調製した。標準的なアミンカップリングによりＯＰＧｂｐをＣＭ５チップに固定した。Ｋｄおよび速度定数をビアエバルエーション３．０ソフトウェア（ファルマシア）により決定した。
Figure 0005279425
Ｆｃ ＩｇＧ１定常領域を実施例７に記載したとおりに加えた場合、Ｆａｂ「ＡＴ」の結合親和性は約１４０ｎＭから約０．３３から０．４３ｎＭ、または約３５０から４００倍に増加した。
実施例９
抗ＯＰＧｂｐ抗体の活性
ＲＡＷ細胞アッセイ
４０５、４０６および４０７と称する「ＡＴ」抗体調製物を実施例１に記載したようにＲＡＷ細胞アッセイで試験した。「ＡＴ」４０５、「ＡＴ」４０６および「ＡＴ」４０７は発現に用いたリーダー配列のみが異なる（「ＡＴ」４０５は「軽」シグナル配列を用いて発現し、「ＡＴ」４０６はｔＰＡ−ＲＧＲシグナル配列を用い、「ＡＴ」４０７はＶＨ２１シグナル配列を用いた）。精製された成熟抗体は各調製物において同一であった。結果を図２３に示す。
「ＡＴ」４０５、「ＡＴ」４０６および「ＡＴ」４０７に関するＩＣ５０は各々２０．１ｎＭ、６０．３ｎＭおよび２１．４ｎＭであり、各々３．０μｇ／ｍｌ、９．０μｇ／ｍｌおよび３．２μｇ／ｍｌに対応する（分子量１５００００と仮定）。ＯＰＧ［２２−１９４］−Ｆｃおよび抗ＯＰＧｂｐポリクローナル抗体の陽性対照は各々３３ｎｇ／ｍｌおよび１５０ｎｇ／ｍｌであった。
「ＡＴ」ＦａｂフラグメントのＲａｗ細胞アッセイにおけるＩＣ５０の差異は「ＡＴ」全長の約２０ｎＭに比較して３００ｎＭであり、または「ＡＴ」全長抗体に関して約１５倍増加した。２つの実験におけるＯＰＧｂｐの濃度の差異を考慮して（１５０ｎｇ／ｍｌ／ ６０ｎｇ／ｍｌ＝２．５倍）、「ＡＴ」全長抗体に関する細胞機能結合活性における増加は約１５ｘ２．５＝３７．５倍であった。
骨髄アッセイ
「ＡＴ」４０５または「ＡＴ」４０７調製物をネズミ骨髄アッセイに加える影響を図２４に示した。「ＡＴ」４０５および「ＡＴ」４０７に関するＩＣ５０は各々２．１５μｇ／ｍｌ（１４．４ｎＭ）および１．８５μｇ／ｍｌ（１２．５ｎＭ）であった（ＭＷ＝１５００００）。ラット抗ＯＰＧｂｐポリクローナル抗体は〜５０ｎｇ／ｍｌのＩＣ５０でＴＲＡＰ形成を阻止した。
別の実験では、骨髄同時培養アッセイで「ＡＴ」４０６を試験し、２．３５μｇ／ｍｌ（１４．４ｎＭ）のＩＣ５０でＴＲＡＰ形成を阻止し、抗体分子量は１５００００と仮定した（図２５参照）。
「ＡＴ」Ｆａｂフラグメントに関する骨髄アッセイにおけるＩＣ５０の差異は「ＡＴ」全長抗体に関する約１３ｎＭと比較して約５０ｎＭであり約３．８５倍増加した。２つの実験におけるＯＰＧｂｐの濃度の差異を考慮して（５０ｎＭ ／ ９ｎＭ＝５．５５倍）、「ＡＴ」全長抗体からの細胞機能結合活性におけるおよその増加は約３．８５ｘ５．５５＝２１．４倍であった。Ｆａｂ「Ｙ」、「Ｐ」および「Ｓ」をコードするｃＤＮＡはまた実施例７に記載したようにヒトＩｇＧ１ ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３配列と融合し、ＣＨＯ細胞にトランスフェクトした。得られた抗体を発現させ、条件培地から精製し、前記したようにエンドトキシンを除去した。「Ｓ」および「Ｙ」軽鎖抗体（「Ｓライト」および「Ｙライト」と称する）を骨髄アッセイにおいて試験し、結果を図２６に示した。「Ｓライト」および「Ｙライト」抗体を対応する軽鎖リーダー配列を用いて発現させ、各々「Ｓ」４３５および「Ｙ」４２９と称した。「Ｙ」４２９（「Ｙライト」）は２３μｇ／ｍｌまたは１５４ｎＭのＩＣ５０を有した。「Ｓ」４３５（「Ｓライト」）はＩＣ５０の決定に関して十分な活性を呈さなかった。
「Ｙキャンパス」および「Ｐライト」はヒトＨｕ−ＩｇＧ１配列「Ｙ」および「Ｐ」であり、各々「キャンパス」および「ライト（軽）」鎖からのリーダー配列を有しており、各々「Ｙ」４２２および「Ｐ」４４４と称した。「Ｙ」４２２（「Ｙキャンパス」）は２０μｇ／ｍｌまたは１３４ｎＭのＩＣ５０を有した。「Ｐ」４４４（「Ｐライト」）は検出可能な活性を示さなかった（図２７参照）。
「Ｙ」Ｆａｂフラグメントの骨髄アッセイにおけるＩＣ５０の差異は「Ｆ」全長抗体に関する約１３４から１５４ｎＭと比較して約２１２ｎＭであり約１．３８から１．５８倍増加した。２つの実験におけるＯＰＧｂｐの濃度の差異を考慮して（５０ｎＭ ／ ９ｎＭ＝５．５５倍）、「Ｙ」Ｆａｂから「Ｙ」全長抗体への細胞機能結合活性におけるおよその増加は、従って約（１．３８から１．５８）ｘ５．５５＝７．７７から８．８倍すなわち約８倍であった。
実施例１０
ＯＰＧｂｐにおける「ＡＴ」抗体のエピトープの同定
ネズミＯＰＧｂｐ変種の生成
ヒトＯＰＧｂｐ［１４３−３１７］を実施例１に記載したように生成した。導入されたＮ末端メチオニン残基に先行される、ＰＣＴ ＷＯ９８／４６７５１の図１に示される１５８から３１６アミノ酸残基を含有するネズミＯＰＧｂｐ［１５８−３１６］を大腸菌中に生成し、前記したように（Ｌａｃｅｙら、Ｃｅｌｌ ９３：１６５−１７６（１９９８））細菌の可溶性分画から精製した。当業者に公知の方法を用いて、Ｎ末端メチオニンをコードする核酸残基、続いてＰＣＴ ＷＯ９８／４６７５１の図１に示される１５８から３１６残基のＮ末端に融合したＦＬＡＧタグ配列（ＤＹＫＤＤＤＤＫＫＬ（配列番号９９））を導入することによりＦＬＡＧ−ネズミＯＰＧｂｐ［１５８−３１６］を作製した。ＦＬＡＧ−ＯＰＧｂｐ［１５８−３１６］分子を細菌発現ベクターｐＡＭＧ２１（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託されており、受け入れ番号９８１１３である）にクローン化した。
ＦＬＡＧネズミＯＰＧＢＰ［１５８−３１６］ポリペプチド変種を構築し、これはＷＯ９８／４６７５１の図１（配列番号１）に示される２２９−２３３（両端を含む）の位置のアミノ酸残基ＳＶＰＴＤがＷＯ９８／４６７５１の図４（配列番号３）に示される２３０−２３４（両端を含む）の位置の対応するアミノ酸残基ＤＬＡＴＥで置換されている。「ＦＬＡＧネズミＯＰＧＢＰ［１５８−３１６］／ＤＥ」と称する得られた構築物は図２８に示す核酸およびタンパク質配列を有する。アミノ酸配列変化はＤおよびＥ領域間のＯＰｂｐの領域に位置する。図２９はこの領域におけるネズミ、ヒト、およびネズミＤＥ変種アミノ酸配列の比較を示す。ネズミ変種における配列変化は変化していない２３４位置のＴを有するＳ２２９Ｄ、Ｖ２３０Ｌ、Ｐ２３１ＡおよびＤ２３３Ｅである。この領域のフランキング配列は実際にはネズミおよびヒトＯＰＧｂｐ間で同一である。
２工程ＰＣＲ反応を用いてこの分子を構築し、ここで第１の工程は２つの別個のＰＣＲ反応を含み、反応Ａおよび反応Ｂと称した。反応Ａおよび反応Ｂの双方でｐＡＭＧ２１−ＦＬＡＧ−ネズミＯＰＧｂｐ［１５８−３１６］をＰＣＲの鋳型として使用した。反応ＡではＰＣＲにオリゴヌクレオチド＃２６４０−９０および＃２６４０−９１を用い、一方反応Ｂではオリゴヌクレオチド＃２６４０−９２および＃２６４０−９３を用いた。熱循環を実施し、反応Ａおよび反応ＢからのＰＣＲ生成物を当業者に利用できる方法を用いてアガロースゲルから精製した。第２工程ＰＣＲ反応を反応Ｃと称し、精製された反応Ａおよび反応Ｂ ＰＣＲ生成物を鋳型として、およびオリゴヌクレオチド＃２６４０−９０および＃２６４０−９３をプライマーとして利用した。熱循環に続いて、反応Ｃからの生成物をｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯクローニングベクター（インビトローゲン）にクローン化し、および製造者により提供された方法を用いてＤＨ１０ｂ（ギブコ）細胞にエレクトロポレーションした。クローンを選択し、確認された細胞で、導入された変異がネズミＯＰＧｂｐ［１５８−３１６］のアミノ酸配列ＳＶＰＴＤがＤＬＡＴＥに変化していることを証明した。次いで証明されたＤＮＡ配列をＮｄｅＩおよびＸｈｏＩで消化し、精製し、細菌発現ベクターｐＡＭＧ２１にサブクローニングし、プラスミドｐＡＭＧ２１−ＦＬＡＧ−ネズミＯＰＧｂｐ［１５８−３１６］／ＤＥを生じた。
Figure 0005279425
プラスミドｐＡＭＧ２１−ＦＬＡＧ−ネズミＯＰＧｂｐ［１５８−３１６］／ＤＥを含有する大腸菌宿主ＧＭ９４（受け入れ番号２０２１７３でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託されている）を２ＸＹＴ培地中で指数関数的成長相まで成長させ、Ｖ．フィスチェリ合成オートインデューサーを１００ｎｇ／ｍｌまで添加することによりＦＬＡＧ−ネズミＯＰＧｂｐ［１５８−３１６］／ＤＥタンパク質の発現を誘導した。誘導後およそ３から６時間で細胞をペレット化し組換えＦＬＡＧ−ネズミＯＰＧｂｐ［１５８−３１６］／ＤＥタンパク質をＬａｃｅｙら（前出）に記載された方法を用いて大腸菌の可溶性分画から精製した。
「ＡＴ」抗体のヒトＯＰＧｂｐ［１４３−３１７］、ネズミＯＰＧｂｐ［１５８−３１６］、およびＦＬＡＧ−ネズミＯＰＧｂｐ［１５８−３１６］／ＤＥに対する結合
コスターＥ．Ｉ．Ａ．／Ｒ．Ｉ．Ａ．プレート（平底高結合性、カタログ番号＃３５９０）をヒトＯＰＧｂｐ［１４３−３１７］タンパク質、ネズミＯＰＧｂｐ［１５８−３１６］タンパク質、またはＦＬＡＧ−ネズミＯＰＧｂｐ［１５８−３１６］／ＤＥタンパク質のいずれかで、ＰＢＳ中３μｇ／ｍｌで、４℃で一晩攪拌しながらコーティングした。一晩インキュベートした後、タンパク質溶液をプレートから除去し、ＰＢＳＴ（ＰＢＳプラス０．０５％トゥイーン２０）中５％ニワトリ血清（ギブコ／ＢＲＬ カタログ番号＃１６１１０−０８２）２００μｌをプレートの各ウェルに加え、プレートを室温（ＲＴ）で９０分間、攪拌しながらインキュベートした。インキュベーションおよび遮断の後、プレートをｄＨ２Ｏ（カタログ番号＃５０−６３−００、キルケガード・アンド・ペリー・ラボラトリーズ）中１Ｘ Ｋ−Ｐ洗浄溶液で４回洗浄し、乾燥した。精製した「ＡＴ」抗体またはヒトＯＰＧ［２２−１９４］−Ｆｃタンパク質をＰＢＳＴ中２μｇ／ｍｌから１．９５３ｎｇ／ｍｌまで下げて１：１連続希釈し、ヒトＯＰＧｂｐ［１４３−３１７］、ネズミＯＰＧｂｐ［１５８−３１６］、またはＦＬＡＧ−ネズミＯＰＧｂｐ［１５８−３１６］／ＤＥタンパク質のいずれかでコーティングしたマイクロタイタープレートの適当なウェルに１００μ／ｌを加えた。プレート室温で３時間、攪拌しながらインキュベートし、１Ｘ Ｋ−Ｐ洗浄溶液で４回洗浄し、乾燥した。ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）（ジャクソン・イムノリサーチ、カタログ番号＃１０９−０３６−０９８）をＰＢＳＴ中５％ニワトリ血清（ギブコ／ＢＲＬ カタログ番号＃１６１１０−０８２）で１：５０００に希釈し、各ウェルに１００μｌ加えた。プレートを室温で１．２５時間、攪拌しながらインキュベートし、１Ｘ Ｋ−Ｐ洗浄溶液で４回洗浄し、乾燥した。希釈していないＡＢＴＳ基質（キルケガード・アンド・ペリー；カタログ番号＃５０−６６−００）１００μｌを各ウェルに加え、十分な青緑色が発色するまで皿を室温でインキュベートした。１％ＳＤＳ１００μｌを加えて発色を停止させた。４０５ｎｍで検出するマイクロタイター・プレート・リーダーを用いて発色した色の定量を行った。
ＥＩＡの結果を図３０に示す。「ＡＴ」抗体はヒトＯＰＧｂｐ［１４３−３１７］に結合するが、ネズミＯＰＧｂｐ［１５８−３１６］に対しては試験した抗体濃度範囲では検出可能な結合は示されない。しかしながら、「ＡＴ」抗体は前記のアッセイ条件下でＦＬＡＧ−ネズミＯＰＧｂｐ［１５８−３１６］／ＤＥおよびヒトＯＰＧｂｐ［１４３−３１７］の双方に結合する。ネズミＯＰＧｂｐ［１５８−３１６］／ＤＥにおけるアミノ酸変化は、ネズミＯＰＧｂｐ［１５８−３１６］に比較して、「ＡＴ」抗体の結合に関与すると結論づけた。
実施例１に記載したＲＡＷ細胞アッセイにおける活性に関してＨＬＡＧ−ネズミＯＰＧｂｐ［１５８−３１６］／ＤＥを検定し、ヒトＯＰＧｂｐ［１４３−３１７］に類似する破骨細胞形成のＥＤ５０を有することが観察され、これはＤＥ変種がインビトロで破骨細胞活性の促進において活性であることを示している。従って、「ＡＴ」抗体のネズミＯＰＧｂｐ［１５８−３１６］／ＤＥに対する結合は破骨細胞形成を阻止する可能性がある。
「ＡＴ」抗体のエピトープはヒトＯＰＧｂｐの領域に位置し、これは少なくともアミノ酸残基ＤＬＡＴＥ（ＰＣＴ ＷＯ９８／４６７５１の図４に示されるヒトＯＰＧｂｐの２３０から２３４残基）を含む。
実施例１１
「ＡＴ」Ｆａｂおよび抗体変種の構築
３つの研究法を用いて「ＡＴ」抗体のＣＤＲ変種を作製した。：重鎖ＣＤＲ３領域のアラニン走査変異誘発、重鎖ＣＤＲ３領域の選択した部位の置換変異誘発、および軽鎖ＣＤＲ３領域の挿入変異誘発。
重鎖ＣＤＲ３領域のアラニン変種
ＡＴ重鎖のＣＤＲ３領域でアラニン走査変異誘発を行った。アラニン走査に用いたアミノ酸配列は：
ＤＳＳＮＭＶＲＧＩＩＩＡＹＹＦＤＹ（配列番号１０４）
であった。プライマー１２および１５を互いにアニーリングし、以下の条件下ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により伸長させた：各プライマー２５ピコモル、９４℃で３０秒間を６サイクル、５５℃で２分間、７４℃で２０秒間。
Figure 0005279425
この反応のＰＣＲ生成物を鋳型Ａと称する。
鋳型Ａをプライマー１１および１４を用いて以下の条件下、ＰＣＲにより伸長させた：鋳型Ａ０．５μｌ、各プライマー１０ピコモル、９４℃で３０秒間を１５サイクル、４３℃で２分間、７４℃で２０秒間。
Figure 0005279425
この反応のＰＣＲ生成物を鋳型Ｂと称する。
次いで鋳型ＡまたはＢを用いてＣＤＲ３のアラニン変種を作製した。ＰＣＲの２ラウンドを望ましいアラニンコドンを含有するプライマーを用いて実施した（９４℃で２０秒間を２０サイクルおよび７４℃で４０秒間）。アラニンコドンを含有するプライマーをＣＤＲ３残基（番号付けはカバット系に従い、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、米国保健社会福祉省、第４版（１９９１））Ｄ９５、Ｓ９６、Ｖ１００、Ｒ１００ａに関して順行配向であった。アラニンコドンを含有するプライマーは残基Ｓ９７、Ｎ９８、Ｍ９９、Ｇ１００ｂ、Ｉ１００ｃ、Ｉ１００ｄ、Ｉ１００ｅ、Ｙ１００ｇ、Ｙ１００ｈ、Ｆ１００ｉ、Ｄ１０１、Ｙ１０２に関して逆行配向であった。
次いで６個の共通するプライマーを用いる３つの伸長反応まで変異誘発反応を続けた。これらの反応により生成物を、全ＣＤＲ３領域を包含し、独特のフランキング制限部位ＢｒｌＩＩおよびＢｓｔＥＩＩを含むように伸長させた。
アラニン置換のためのプライマーを５’から３’の配向で以下に示す。アラニンコドンは太字で示す。
Figure 0005279425
伸長ＰＣＲのための６個の共通するプライマーを以下に示す。フランキングＢｇｌＩＩの配列（上部の鎖）およびＢｓｔＥＩＩ（下部の鎖）部位を太字で示した。
Figure 0005279425
Figure 0005279425
以下の表は置換されたアラニン残基を含有する合成ＤＮＡフラグメントを築くために連続して用いられた出発鋳型およびプライマー対を示す。
Figure 0005279425
Figure 0005279425
アラニン走査に用いたプライマーに関しては、ＰＣＲ条件は９４℃で２０秒間を２０サイクル、次いで７４℃で４０秒間であった。プライマー対１０＋１５を用いる伸長反応では、条件は９４℃で２０秒間を２０から２５サイクル、４２℃で１分３０秒間、７４℃で２０秒間であった。プライマー対１０＋１４を用いる伸長反応では、条件は９４℃で２０秒間を２０から２５サイクル、４８から５０℃で１分３０秒間、７４℃で２０秒間であった。プライマー対１０＋１３を用いる伸長反応では、条件は９４℃で２０秒間を２０から２５サイクル、６４℃で１分３０秒間、７４℃で２０秒間であった。ＰＣＲ生成物をＢｇｌＩＩおよびＢｓｔＥＩＩ制限酵素で消化し、ＢｇｌＩＩおよびＢｓｔＥＩＩで消化したＦａｂＡＴにクローン化し、それによりＡＴのＣＤＲ３をアラニン置換されたＣＤＲ３と置換した。アラニン置換された構築物をＤＮＡシークエンシングにより証明した。
重鎖ＣＤＲ３の置換変種
アラニン走査変異誘発に用いたのと類似の試験計画を「ＡＴ」の重鎖ＣＤＲ３のＳ９６、Ｓ９７およびＮ９８位置の無作為化に利用した。前記したように鋳型ＡおよびＢを作製した。９６、９７および９８位置を各位置に関する一連の４個のプライマーで無作為化した。括弧を付した位置には示すように変更可能なヌクレオチドがある。
Figure 0005279425
Figure 0005279425
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逆行無作為化プライマーおよびプライマー１０を用いてＰＣＲ反応を実施した。プライマー対１０＋１５、１０＋１４、１０＋１３および１０＋２２を用いて４回連続ＰＣＲ反応により得られた生成物を伸長させた。「ＡＴ」の重鎖可変領域の５’末端をプライマー１６および７２を用いて「ＡＴ」の重鎖可変領域の全長クローンから増幅した。全てのＰＣＲ生成物をゲル精製した。無作為化生成物は１６／７２生成物と重複し、フランキングプライマーは１６および２２であった。次いで可変領域全長をＨｉｎｄＩＩＩ／ＢｓｍＢＩフラグメントとしてＩｇＧ１定常領域を含有するベクターにクローニングした。全長抗体クローンをシークエンシングにより選択した。
Figure 0005279425
細菌シグナル配列を哺乳動物シグナル配列で置換したＦａｂクローンのＰＣＲ増幅によりＳ９６Ａ、Ｓ９７Ａ、およびＮ９８Ａ変種をＦａｂから全長抗体に変換した。望ましい変異を含むＦａｂからのプラスミドＤＮＡを鋳型として使用した。使用した連続プライマー対は２１＋２２、９８＋２２および１６＋２２であった。ＤＮＡ配列分析により正確なクローンを選択した。
鋳型として変換したＡＴ重鎖全長ＩｇＧ１プラスミドを用いて複数のアラニン変種（Ｓ９６Ａ、Ｓ９７Ａ；Ｓ９６Ａ、Ｎ９８Ａ；Ｓ９７Ａ、Ｎ９８ＡおよびＳ９６Ａ、Ｓ９７ＡおよびＮ９８Ａ）を作製した。以下に列挙するプライマーの１つおよびプライマー２２で最初のＰＣＲ反応を実施した。次いでプライマー対１０＋２２を用いてこれらの生成物を伸長した。そしてその生成物はフランキングプライマー１６および２２を用いる１６／７２生成物と重複し、前記したようにＩｇＧ１定常領域にクローン化した。ＤＮＡ配列分析により正確なクローンを選択した。
Figure 0005279425
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軽鎖ＣＤＲ３領域の挿入変種
ＡＴ軽鎖ＣＤＲ３は配列ＱＨＴＲＡ（配列番号０９）を有する５個のアミノ酸ループを含有する。軽鎖ＣＤＲ３配列変種を以下のように構築した。鋳型としてＦａｂ「ＡＴ」軽鎖ｃＤＮＡを含有するプラスミドを用いるＰＣＲに以下のプライマーを使用した：
Figure 0005279425
ここで、（ＡＣＧＴ）はこの位置での混合された４つの塩基を示す。
Figure 0005279425
得られたＰＣＲ生成物は５個から９個のアミノ酸に増え、ＱＨＴＲＡからＧＨＴＸＡＡＡＲＡ（Ｘはいずれのアミノ酸でもよい）に変化したＣＤＲ３ループ配列を有した。ＡＴクローンをＨｉｎｃＩＩおよびＡｓｃＩ消化し、「ＡＴ」軽鎖ＣＤＲ３領域を変種配列で置換した。ＣＤＲ３ループに挿入した３個のアラニン残基と一緒にＸ位置で２０個のアミノ酸残基全てを含有するクローンを単離し、ＤＮＡシークエンシングにより同一性を確認した。
Ｆａｂ変種の精製
重鎖ＣＤＲ３のアラニン置換変種および軽鎖ＣＤＲ３の挿入変種を生成し、以下の方法によりＦａｂフラグメントとして精製した。各々の変種を２％グルコースおよび１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含有する２ＸＹＴ５０ｍｌ中、振盪しながら３７℃でＯＤ６００が０．８から１．０になるまで成長させた。次いで各培養物をスピンダウンし、１ｍＭ ＩＰＴＧと共に１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含む２ＸＹＴ５０ｍｌに３０℃で再懸濁し、可溶性Ｆａｂの生成を誘導した。次いで可溶性Ｆａｂをペリプラスミック部分に移動させ、浸透圧ショックにより放出される前に一晩濃縮した。トリスバッファーおよびＥＤＴＡ中冷０．５Ｍ スクロース溶液で細胞を洗浄することにより浸透圧ショックを行い、細菌細胞壁を破壊し、次いで迅速に低浸透圧力の冷溶液に希釈した。放出された可溶性Ｆａｂをタロン金属アフィニティクロマトグラフィーで６Ｘ Ｈｉｓタグ化残基により精製した。イミダゾールによりタンパク質を溶出する前に不純物をＮａＣｌおよび低濃度イミダゾールで洗い流した。各変異体の発現および精製を還元、非還元および抗Ｈｉｓウェスターンブロットにより分析した。全タンパク質濃度をＡ２８０により決定した。
実施例１２
「ＡＴ」変種のＢＩＡコア分析
「ＡＴ」抗体変種に関する結合定数（Ｋｄ）、オン速度定数（Ｋａ）およびオフ速度定数（ｋｄ）、並びに「ＡＴ」Ｆａｂ変種に関するオフ速度定数（ｋｄ）を固定ＯＰＧｂｐ［１４３−３１７］を用いる表面プラスモン共鳴技術（ＢＩＡコア）により決定した。結果を表ＩＶからＶＩＩＩに示す。実施例１１に記載した軽鎖ＣＤＲ３変種は検出可能な結合を示さなかった。
Figure 0005279425
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Figure 0005279425
Figure 0005279425
本発明を好ましい実施形態に関して記載してきたが、変種および修飾が生じることは当業者に理解された。従って、添付の請求の範囲は請求される本発明の範囲内になるかかる等価物を全て包含することが意図された。
ヒトＯＰＧｂｐ［１４３−３１７］に対する反応性についての優勢なＦａｂパターンのＥＬＩＳＡを示す。力価測定を、ＥＬＩＳＡにおいて１０９個〜１０１１個のファージ／ウエルの典型的な範囲を得るためにウエルあたり最大で５０μｌのファージ溶液を使用して行った。ＥＬＩＳＡ用のファージストックは実施例１に記載されるように調製された。値を１点の測定から得た。「ＡＢ」および「Ｘ」のパターンは同じ線に重なった。 「ＡＴ」および「Ｙ」の各ＦａｂによるＯＤＡＲに対するＯＰＧｂｐ結合の阻害を示す。Ｆａｂは、実施例４に記載されるように精製され、そして図に示される最終ウエル濃度に添加された。ＯＰＧｂｐ／ＯＤＡＲ結合アッセイの詳細は実施例１に示される。値は二連の測定の平均値であった。 「ＡＴ」、「Ｙ」および「Ｐ」の各Ｆａｂの骨髄アッセイを示す。「ＡＴ」、「Ｙ」および「Ｐ」の各Ｆａｂのそれぞれの、１つのエンドトキシン非含有調製物（０．５ＥＵ／ｍｌ以下）の結果を示した。Ｆａｂは、実施例４に記載されるように精製され、そして図に示される最終ウエル希釈に添加された（Ｆａｂストック溶液は７５０μｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌであった）。アッセイ形式は、抗ｈｕ−ＯＰＧｂｐ Ｆａｂを１０ｎｇ／ｍｌの最終細胞ウエル濃度のヒトＯＰＧｂｐ［１４３−３１７］で１時間プレインキュベーションすることを含む。値は三連の測定の平均値であった。 「ＡＴ」、「Ｙ」および「Ｐ」の各ＦａｂのＲａｗ細胞アッセイを示す。「ＡＴ」、「Ｙ」および「Ｐ」の各Ｆａｂのそれぞれの、１つのエンドトキシン非含有調製物（０．５ＥＵ／ｍｌ以下）の結果を示した。Ｆａｂは、実施例４に記載されるように精製された。Ｆａｂは、グラフに示される最終細胞ウエル濃度に１／２０希釈される前に、ヒトＯＰＧｂｐ［１４３−３１７］と室温で１時間プレインキュベーションされた。ＯＰＧｂｐの最終細胞ウエル濃度は２０ｎｇ／ｍｌであった。細胞濃度は１×１０５／ｍｌであった。値は三連の測定から得られ、誤差バーは２標準偏差（２ＳＴＤ）を示している。 Ｆａｂ「ＡＴ」軽鎖のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。 Ｆａｂ「Ｙ」軽鎖のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。 Ｆａｂ「Ｐ」軽鎖のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。 Ｆａｂ「Ｓ」軽鎖のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。 Ｆａｂ「ＡＴ」重鎖のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。 Ｆａｂ「ＡＴ」重鎖のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。 Ｆａｂ「Ｙ」重鎖のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。 Ｆａｂ「Ｙ」重鎖のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。 Ｆａｂ「Ｐ」重鎖のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。 Ｆａｂ「Ｓ」重鎖のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。 Ｆａｂ「Ｓ」重鎖のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。 図５〜図１２に示されるＦａｂアミノ酸配列の比較を示す。「ＡＴ」、「Ｙ」、「Ｐ」および「Ｓ」の各Ｆａｂの重鎖および軽鎖の予測されるアミノ酸配列を同一性および類似性について比較した。「ＡＴ」および「Ｙ」の重鎖は１つのアミノ酸位置のみで異なる。ライブラリーが示しているように、４つのＦａｂはすべて同一の重鎖ＣＨ１領域を有し、この領域は、同一性および類似性の計算において含められた重鎖のカルボキシ側半分を含んでいる。「ＡＴ」、「Ｙ」および「Ｐ」の軽鎖は、同じであるか、または類似するＶκファミリーをともに有し、従って、計算において含められた鎖のカルボキシル側半分において１個〜２個のアミノ酸のみが異なる。 「ＡＴ」、「Ｙ」、「Ｐ」および「Ｓ」の各Ｆａｂの予測される重鎖および軽鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）の比較を示す。重鎖を比較する場合、ＣＤＲ１は、すべてのＦａｂについてアミノ酸残基３２〜３６（３６を含む）を含み、ＣＤＲ２は、すべてのＦａｂについてアミノ酸残基５１〜６７（６７を含む）を含み、ＣＤＲ３は、「ＡＴ」および「Ｙ」のＦａｂについてはアミノ酸残基１００〜１１６（１１６を含む）を含み、「Ｐ」のＦａｂについてはアミノ酸残基１００〜１０６（１０６を含む）を含み、「Ｓ」のＦａｂについてはアミノ酸残基１００〜１１３（１１３を含む）を含む。軽鎖を比較する場合、ＣＤＲ１は、「ＡＴ」および「Ｙ」のＦａｂについてはアミノ酸残基２９〜３９（３９を含む）を含み、「Ｐ」のＦａｂについてはアミノ酸残基２８〜３９（３９を含む）を含み、「Ｓ」のＦａｂについてはアミノ酸残基２７〜３５（３５を含む）を含み、ＣＤＲ２は、「ＡＴ」、「Ｙ」および「Ｐ」のＦａｂについてはアミノ酸残基５５〜６１（６１を含む）を含み、「Ｓ」のＦａｂについてはアミノ酸残基５３〜５９（５９を含む）を含み、ＣＤＲ３は、「ＡＴ」、「Ｙ」および「Ｐ」のＦａｂについてはアミノ酸残基９４〜９８（９８を含む）を含み、「Ｓ」のＦａｂについてはアミノ酸残基９２〜１０２（１０２を含む）を含む。 Ｆａｂクラスの比較を示す。Ｆａｂクラスの比較をＶ−Ｂａｓｅ ＤＮＡ ＰＬＯＴ分析から得た。記号（＊）は、最も近い一致した多様性（Ｄ）領域が、既知の生殖系列配列に関連しているにもかかわらず、決定できなかったことを示す。記号（＊＊）は、最も近く一致した生殖系列可変（Ｖ）領域配列が同定されたが、現在まで正式に名付けられておらず、より希なλファミリーであることを示す。 「ＡＴ」および「Ｙ」の各Ｆａｂの予測される重鎖アミノ酸配列（それぞれ、図９および図１０における残基２〜１２７（１２７を含む））と、ＶＨ１ファミリーに由来する生殖系列配列との比較を示す。生殖系列配列は、Ｖ領域配列１〜０３、Ｄ領域配列３〜１０およびＪ領域配列ＪＨ４（配列番号４４）を含む。ＦＲ１、ＦＲ２およびＦＲ３は３つのフレームワーク領域を示し、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は３つの相補的決定領域を示し、Ｈ１、Ｈ２およびＨ３はフレームワーク領域とＣＤＲとの間における対応する接合配列を示す。「ＡＴ」、「Ｙ」と生殖系列のＶ配列、Ｄ配列またはＪ配列との違いが太字で示される。図１６〜図２２における生殖系列アミノ酸残基の番号付けは、Ｋａｂａｔ他、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（米国厚生省、第４版、１９９１年）に記載される通りである。 Ｆａｂ「Ｐ」の予測される重鎖アミノ酸配列（図１１における残基２〜１１７（１１７を含む））と、ＶＨ３ファミリーに由来する生殖系列配列との比較を示す。配列はＶ領域配列３〜３０およびＪ領域配列ＪＨ４を含む。Ｄ領域配列は不明である。 Ｆａｂ「Ｓ」の予測される重鎖アミノ酸配列（図１２における残基２〜１２４（１２４を含む））と、ＶＨ３ファミリーに由来する生殖系列配列との比較を示す。生殖系列配列は、Ｖ領域配列３〜０９、Ｄ領域配列６〜１９およびＪ領域配列ＪＨ４を含む。 Ｆａｂ「ＡＴ」の予測される軽鎖アミノ酸配列（図５における残基６〜１０８（１０８を含む））と、Ｖκ１ファミリーに由来する生殖系列配列との比較を示す。生殖系列配列はＶ領域配列０１２およびＪ領域配列ＪＫ１を含む。 Ｆａｂ「Ｙ」の予測される軽鎖アミノ酸配列（図６における残基６〜１０８（１０８を含む））と、Ｖκ３ファミリーに由来する生殖系列配列との比較を示す。生殖系列配列はＶ領域配列Ｌ６およびＪ領域配列ＪＫ２を含む。 Ｆａｂ「Ｐ」の予測される軽鎖アミノ酸配列（図７における残基５〜１０８（１０８を含む））と、Ｖκ３ファミリーに由来する生殖系列配列との比較を示す。生殖系列配列はＶ領域配列Ａ２７およびＪ領域配列ＪＫ４を含む。 Ｆａｂ「Ｓ」の予測される軽鎖アミノ酸配列（図８における残基５〜１１２（１１２を含む））と、ＶＬ３ファミリーに由来する生殖系列配列との比較を示す。生殖系列配列はＶ領域配列３ｍおよびＪ領域配列ＪＬ２を含む。 「ＡＴ」４０５、「ＡＴ」４０６および「ＡＴ」４０７の各単離物のＲＡＷ細胞アッセイを示す。Ｆａｎ「ＡＴ」をコードするｃＤＮＡを、実施例７に記載されるように、ヒトＩｇＧ１のＣＨ１領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域をコードするｃＤＮＡに融合した。異なるリーダー配列を使用して、「ＡＴ」４０５、「ＡＴ」４０６および「ＡＴ」４０７と呼ばれる、得られる単離物を作製した。「ＡＴ」４０５〜４０７を、グラブに示される最終細胞ウエル濃度に希釈する前に、ＯＰＧｂｐと室温で１時間プレインキュベーションした。ＯＰＧｂｐの最終細胞ウエル濃度は４０ｎｇ／ｍｌであった。値は三連の測定から得られ、誤差バーは２標準偏差（２ＳＴＤ）を示している。 「ＡＴ」４０５および「ＡＴ」４０７の骨髄アッセイを示す。「ＡＴ」４０５および「ＡＴ」４０７の、１つのエンドトキシン非含有調製物（０．５ＥＵ／ｍｌ以下）の結果を示した。サンプルをヒトＯＰＧｂｐ［１４３−３１７］と室温で１時間プレインキュベーションし、その後、細胞に加えた。サンプルストックからの「ＡＴ」４０５および「ＡＴ」４０７に対する最終細胞ウエル希釈度がｘ軸に示される。ＯＰＧｂｐの最終細胞ウエル濃度は２０ｎｇ／ｍｌであった。 「ＡＴ」４０６の骨髄アッセイを示す。「ＡＴ」４０６の、１つのエンドトキシン非含有調製物（０．５ＥＵ／ｍｌ以下）の結果を示す。サンプルをヒトＯＰＧｂｐ［１４３−３１７］と室温で１時間プレインキュベーションし、その後、細胞に加えた。サンプルの最終細胞ウエル濃度がｘ軸に示される。ＯＰＧｂｐの最終細胞ウエル濃度は２０ｎｇ／ｍｌであった。 「Ｓ」４３５および「Ｙ」４２９の骨髄アッセイを示す。「Ｓ」４３５および「Ｙ」４２９の構築は実施例７に記載される。「Ｓ」４３５および「Ｙ」４２９のそれぞれの、１つのエンドトキシン非含有調製物（０．５ＥＵ／ｍｌ以下）の結果を示す。サンプルをヒトＯＰＧｂｐ［１４３−３１７］と室温で１時間プレインキュベーションし、その後、細胞に加えた。サンプルの最終細胞ウエル濃度がｘ軸に示される。ＯＰＧｂｐの最終細胞ウエル濃度は２０ｎｇ／ｍｌであった。 「Ｙ」４４２および「Ｐ」４４４の骨髄アッセイを示す。「Ｙ」４４２および「Ｐ」４４４の構築および発現は実施例７に記載される。「Ｙ」４４２および「Ｐ」４４４のそれぞれの、１つのエンドトキシン非含有調製物（０．５ＥＵ／ｍｌ以下）の結果を示す。サンプルをヒトＯＰＧｂｐ［１４３−３１７］と室温で１時間プレインキュベーションし、その後、細胞に加えた。サンプルの最終細胞ウエル濃度がｘ軸に示される。ＯＰＧｂｐの最終細胞ウエル濃度は２０ｎｇ／ｍｌであった。 ＦＬＡＧ−ネズミ［１５３−３１６］ＯＰＧｂｐ／ＤＥの核酸配列およびアミノ酸配列を示す。 ＤＥループの領域における、ヒトＯＰＧｂｐ［１４３−３１７］、ネズミＯＰＧｂｐ［１５８−３１６］およびＦＬＡＧ−ネズミ［１５８−３１６］ＯＰＧｂｐ／ＤＥのアミノ酸配列のアラインメントである。下線部は、ＦＬＡＧ−マウスＯＰＧｂｐ／ＤＥ分子を作製するためにマウスＯＰＧｂｐに導入されたヒトＯＰＧｂｐのアミノ酸残基である。 ヒトＯＰＧｂｐ［１４３−３１７］、ネズミＯＰＧｂｐ［１５８−３１６］またはＦＬＡＧ−ネズミ［１５８−３１６］ＯＰＧｂｐ／ＤＥのいずれかがコーティングされたプレートに対するＡＴ抗体の結合および反応性を調べる酵素免疫アッセイである。

Claims (25)

  1. 可変軽鎖（Ｖｌ鎖）および可変重鎖（Ｖｈ鎖）を含む抗体または抗原結合ドメインであって、
    ａ）Ｖｌ鎖が、配列番号０１で表されるＣＤＲ１と、配列番号０５で表されるＣＤＲ２と、配列番号０９で表されるＣＤＲ３とを含み、かつ
    Ｖｈ鎖が、配列番号１３で表されるＣＤＲ１と、配列番号１６で表されるＣＤＲ２と、配列番号１９で表されるＣＤＲ３とを含む抗体または抗原結合ドメイン；
    ｂ）Ｖｌ鎖が、配列番号０２で表されるＣＤＲ１と、配列番号０６で表されるＣＤＲ２と、配列番号１０で表されるＣＤＲ３とを含み、かつ
    Ｖｈ鎖が、配列番号１３で表されるＣＤＲ１と、配列番号１６で表されるＣＤＲ２と、配列番号１９で表されるＣＤＲ３とを含む抗体または抗原結合ドメイン；
    ｃ）Ｖｌ鎖が、配列番号０３で表されるＣＤＲ１と、配列番号０７で表されるＣＤＲ２と、配列番号１１で表されるＣＤＲ３とを含み、かつ
    Ｖｈ鎖が、配列番号１４で表されるＣＤＲ１と、配列番号１７で表されるＣＤＲ２と、配列番号２０で表されるＣＤＲ３とを含む抗体または抗原結合ドメイン；または
    ｄ）Ｖｌ鎖が、配列番号０４で表されるＣＤＲ１と、配列番号０８で表されるＣＤＲ２と、配列番号１２で表されるＣＤＲ３とを含み、かつ
    Ｖｈ鎖が、配列番号１５で表されるＣＤＲ１と、配列番号１８で表されるＣＤＲ２と、配列番号２１で表されるＣＤＲ３とを含む抗体または抗原結合ドメイン；
    であって、それぞれのＶｌ鎖およびＶｈ鎖におけるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３がフレームワークアミノ酸配列により隔てられ、かつＯＰＧｂｐに選択的に結合する、抗体または抗原結合ドメイン。
  2. 可変軽鎖（Ｖｌ鎖）および可変重鎖（Ｖｈ鎖）を含む抗体または抗原結合ドメインであって、
    Ｖｌ鎖が、配列番号０１で表されるＣＤＲ１と、配列番号０５で表されるＣＤＲ２と、配列番号０９で表されるＣＤＲ３とを含み、かつ
    Ｖｈ鎖が、配列番号１３で表されるＣＤＲ１と、配列番号１６で表されるＣＤＲ２と、下記の配列番号８１〜８３から選択されるＣＤＲ３とを含み、
    Figure 0005279425
     それぞれのＶｌ鎖およびＶｈ鎖におけるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３がフレームワークアミノ酸配列により隔てられ、Ｘが、その位置において通常存在するアミノ酸とは異なる任意のアミノ酸であり、かつＯＰＧｂｐに選択的に結合する抗体または抗原結合ドメイン。
  3. Ｖｈ鎖が、配列番号６１で表されるアミノ酸配列に少なくとも８０％同一である、請求項１ａ）または２に記載の抗体または抗原結合ドメイン。
  4. Ｖｌ鎖が、配列番号６８で表されるアミノ酸配列に少なくとも８０％同一である、請求項１ａ）または２に記載の抗体または抗原結合ドメイン。
  5. Ｖｈ鎖が、配列番号６２で表されるアミノ酸配列に少なくとも８０％同一である、請求項１ｂ）に記載の抗体または抗原結合ドメイン。
  6. Ｖｌ鎖が、配列番号７０で表されるアミノ酸配列に少なくとも８０％同一である、請求項１ｂ）に記載の抗体または抗原結合ドメイン。
  7. Ｖｈ鎖が、配列番号６４で表されるアミノ酸配列に少なくとも８０％同一である、請求項１ｃ）に記載の抗体または抗原結合ドメイン。
  8. Ｖｌ鎖が、配列番号７２で表されるアミノ酸配列に少なくとも８０％同一である、請求項１ｃ）に記載の抗体または抗原結合ドメイン。
  9. Ｖｈ鎖が、配列番号６６で表されるアミノ酸配列に少なくとも８０％同一である、請求項１ｄ）に記載の抗体または抗原結合ドメイン。
  10. Ｖｌ鎖が、配列番号７４で表されるアミノ酸配列に少なくとも８０％同一である、請求項１ｄ）に記載の抗体または抗原結合ドメイン。
  11. （ａ）配列番号５３で表される重鎖アミノ酸配列及び配列番号４５で表される軽鎖アミノ酸配列、または
    （ｂ）配列番号５５で表される重鎖アミノ酸配列及び配列番号４７で表される軽鎖アミノ酸配列、
    を含む抗体または抗原結合ドメイン。
  12. ヒトのＦｃ領域をさらに含む、請求項１〜１１のいずれかに記載の抗体または抗原結合ドメイン。
  13. 請求項１〜１１のいずれかに記載される抗体または抗原結合ドメインをコードする単離された核酸分子。
  14. 請求項１３に記載される核酸分子を含む発現ベクター。
  15. 請求項１４に記載される発現ベクターを含む宿主細胞。
  16. ＣＨＯ細胞である、請求項１５に記載の宿主細胞。
  17. 請求項１５または１６に記載される宿主細胞を、核酸分子の発現を可能にする条件のもとで培養することを含む、抗体または抗原結合ドメインを製造する方法。
  18. Ｉｇイソタイプが、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥおよびＩｇＤからなる群から選択される、請求項１〜１１のいずれかに記載の抗体または抗原結合ドメイン。
  19. イソタイプがＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４である、請求項１８に記載の抗体または抗原結合ドメイン。
  20. 請求項１〜１１のいずれかに記載される抗体または抗原結合ドメインと、薬学的に受容可能なキャリアとを含む組成物。
  21. 請求項２０に記載される組成物を含む、破骨細胞の形成または活性化を阻害するための医薬用組成物。
  22. 請求項２０に記載される組成物を含む、骨の再吸収を阻害するための医薬用組成物。
  23. 請求項２０に記載される組成物を含む、骨量の喪失を防止または治療するための医薬用組成物。
  24. 骨量の喪失が、骨粗鬆症、骨へのガンの転移、慢性関節リウマチ、悪性の高カルシウム血症、およびステロイド誘導型骨粗鬆症から生じる、請求項２３に記載の医薬用組成物。
  25. 請求項２０に記載される組成物を含む、骨における腫瘍細胞の成長を防止または治療す
    るための医薬用組成物。
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