JP5255456B2 - ピラジン誘導体を含有する医薬組成物およびピラジン誘導体を組み合わせて使用する方法 - Google Patents

Description

本発明は、ウイルス性疾患の治療または予防などの処置に有用なピラジン誘導体またはその塩および一種以上のノイラミニダーゼ阻害剤を含有する医薬組成物に関する。また、インフルエンザの治療または予防などの処置のためにピラジン誘導体またはその塩およびノイラミニダーゼ阻害剤を組み合わせて使用する方法に関する。

インフルエンザウイルスによって引き起こされるインフルエンザウイルス感染症（以下、インフルエンザと称する。）は、しばしば致死的疾患となる。近年、鳥型インフルエンザなどヒトに対して強い病原性を示すウイルスが発生している。鳥型インフルエンザは、世界的な流行の恐れがある。
しかしながら、インフルエンザを適用とした薬剤は、抗菌剤などと比較してはるかに少ない。現在使用されているアマンタジンおよびオセルタミビルなどは、耐性化などの問題を有している。
抗インフルエンザウイルス剤を組み合せて使用する方法は、インフルエンザウイルスの耐性化の低減、治療効果の増強および／または副作用の低減等を目的として検討されている。しかしながら、組合せに用いられる薬剤の数が限られており、必ずしも満足できる効果が得られていない。

インフルエンザウイルスに効果を示す薬剤として、たとえば、ノイラミニダーゼ阻害剤が知られている。ノイラミニダーゼは、インフルエンザウイルス表面のスパイク状の糖タンパクであり、インフルエンザウイルスが、のどや気管支の細胞に感染し増殖した後、周囲の細胞に広がる時に必要となる。ノイラミニダーゼを阻害することによって、インフルエンザウイルスが周囲の細胞に広がることを抑制できる。たとえば、ノイラミニダーゼ阻害剤であるオセルタミビルは、生体内で活性物質であるＧＳ−４０７１となり、インフルエンザウイルスのノイラミニダーゼを阻害し、抗ウイルス作用を示す（非特許文献１）。ノイラミニダーゼ阻害剤として、オセルタミビルおよびザナミビルが市販されており、現在も薬剤開発研究が行われている。
一方、抗ウイルス活性を有するピラジン誘導体が、知られている（特許文献１）。このピラジン誘導体は、細胞内でリボシルリン酸化を受け、ウイルスのＲＮＡポリメラーゼを阻害することによって抗ウイルス作用を示すことが知られている（特許文献２）。
しかしながら、ノイラミニダーゼ阻害剤およびピラジン誘導体を含有する医薬組成物ならびにノイラミニダーゼ阻害剤およびピラジン誘導体を組み合せて使用する方法は、全く知られていない。

国際公開第００／１０５６９号パンフレット 国際公開第０３／０１５７９８号パンフレット 日本臨床、2003年、第61巻、p.1975〜1979

強い抗インフルエンザウイルス活性を有し、副作用が少ないインフルエンザの治療または予防などの処置に有用な医薬組成物およびインフルエンザを処置する方法が望まれている。

このような状況下において、本発明者は、鋭意検討を行った結果、一般式［１］

「式中、Ｒ^１およびＲ^２は、同一または異なって水素原子またはハロゲン原子を；Ｒ^３は、水素原子またはアミノ保護基を示す。」で表されるピラジン誘導体またはその塩および一種以上のノイラミニダーゼ阻害剤を含有する医薬組成物が、強い抗インフルエンザウイルス活性を有し、インフルエンザの処置に有用であること、これらの化合物を組み合せて使用する方法が、インフルエンザの処置の方法として有用であることを見出し、本発明を完成した。

ピラジン誘導体またはその塩ならびに一種以上のノイラミニダーゼ阻害剤を含有する医薬組成物は、相乗的な強い抗インフルエンザウイルス活性を有し、インフルエンザの治療または予防などの処置に有用であり、これらを組み合せて使用する方法は、インフルエンザの治療または予防などの処置の方法として有用である。

以下、本発明について詳述する。
本明細書において、特にことわらない限り、ハロゲン原子とは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子およびヨウ素原子を；アシル基とは、たとえば、ホルミル基、アセチル、プロピオニル、ブチリル、イソバレリルおよびピバロイルなどの直鎖状または分枝鎖状のＣ_２−１２アルカノイル基、ベンジルカルボニルなどのアルＣ_１−６アルキルカルボニル基、ベンゾイルおよびナフトイルなどの環式炭化水素カルボニル基、ニコチノイル、テノイル、ピロリジノカルボニルおよびフロイルなどの複素環式カルボニル基、スクシニル基、グルタリル基、マレオイル基、フタロイル基ならびにアミノ酸（アミノ酸としては、たとえば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、アルギニン、リジン、ヒスチジン、ヒドロキシリジン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、プロリンおよびヒドロキシプロリンなどが挙げられる。）から誘導されるＮ末端が保護されていてもよい直鎖状または分枝鎖状のα−アミノアルカノイル基を；アルキルオキシカルボニル基とは、たとえば、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、１，１−ジメチルプロポキシカルボニル、イソプロポキシカルボニル、２−エチルヘキシルオキシカルボニル、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルおよびｔｅｒｔ−ペンチルオキシカルボニルなどの直鎖状または分枝鎖状のＣ_１−１２アルキルオキシカルボニル基を；アルアルキルオキシカルボニル基とは、たとえば、ベンジルオキシカルボニルおよびフェネチルオキシカルボニル基などのアルＣ_１−６アルキルオキシカルボニル基を；アリールオキシカルボニル基とは、たとえば、フェニルオキシカルボニルなどの基を；アルアルキル基とは、たとえば、ベンジル、ジフェニルメチル、トリチル、フェネチルおよびナフチルメチルなどのアルＣ_１−６アルキル基を；アルコキシアルキル基とは、たとえば、メトキシメチルおよび１−エトキシエチルなどのＣ_１−６アルキルオキシＣ_１−６アルキル基を；アルアルキルオキシアルキル基とは、たとえば、ベンジルオキシメチルおよびフェネチルオキシメチルなどのアルＣ_１−６アルキルオキシＣ_１−６アルキル基を；

アリールチオ基とは、たとえば、フェニルチオなどの基を；アルキルスルホニル基とは、たとえば、メチルスルホニル、エチルスルホニルおよびプロピルスルホニルなどのＣ_１−６アルキルスルホニル基を；アリールスルホニル基とは、たとえば、ベンゼンスルホニル、トルエンスルホニルおよびナフタレンスルホニルなどの基を；ジアルキルアミノアルキリデン基とは、たとえば、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノメチレンおよびＮ，Ｎ−ジエチルアミノメチレンなどの基を；アルアルキリデン基とは、たとえば、ベンジリデンおよびナフチルメチレンなどの基を；含窒素複素環式アルキリデン基とは、たとえば、３−ヒドロキシ−４−ピリジルメチレンなどの基を；シクロアルキリデン基とは、たとえば、シクロペンチリデンおよびシクロヘキシリデンなどの基を；ジアリールホスホリル基とは、たとえば、ジフェニルホスホリルなどの基を；ジアルアルキルホスホリル基とは、たとえば、ジベンジルホスホリルなどの基を；含酸素複素環式アルキル基とは、たとえば、５−メチル−２−オキソ−２Ｈ−１，３−ジオキソール−４−イルメチルなどの基を；置換シリル基とは、たとえば、トリメチルシリル、トリエチルシリルおよびトリブチルシリルなどの基を意味する。

アミノ保護基としては、通常のアミノ保護基として使用し得るすべての基を含み、たとえば、Ｗ．グリーン（W.Greene）ら、プロテクティブ・グループス・イン・オーガニック・シンセシス（Protective Groups in Organic Synthesis）第3版、第494〜653頁、1999年、ジョン・ウィリイ・アンド・サンズ社（John Wiley & Sons,INC.）に記載されている基が挙げられる。具体的には、たとえば、アシル基、アルキルオキシカルボニル基、アルアルキルオキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、アルアルキル基、アルコキシアルキル基、アルアルキルオキシアルキル基、アリールチオ基、アルキルスルホニル基、アリールスルホニル基、ジアルキルアミノアルキリデン基、アルアルキリデン基、含窒素複素環式アルキリデン基、シクロアルキリデン基、ジアリールホスホリル基、ジアルアルキルホスホリル基、含酸素複素環式アルキル基および置換シリル基などが挙げられる。

本発明に用いられる一般式［１］の化合物の塩としては、通常知られているヒドロキシル基における塩を挙げることができる。たとえば、ナトリウムおよびカリウムなどのアルカリ金属との塩；カルシウムおよびマグネシウムなどのアルカリ土類金属との塩；アンモニウム塩；ならびにトリメチルアミン、トリエチルアミン、トリブチルアミン、Ｎ−メチルピペリジン、Ｎ−メチルモルホリン、ジエチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、プロカイン、ジベンジルアミン、Ｎ−ベンジル−β−フェネチルアミン、１−エフェナミンおよびＮ,Ｎ'−ジベンジルエチレンジアミンなどの含窒素有機塩基との塩などを挙げることができる。
好ましい塩としては、薬理学的に許容される塩が挙げられ、ナトリウムとの塩が、より好ましい。

本発明に用いられる一般式［１］の化合物において、好ましい化合物としては、以下の化合物が挙げられる。
Ｒ^１が、水素原子；Ｒ^２が、フッ素原子；Ｒ^３が水素原子である化合物が好ましい。

本発明に用いられる一般式［１］の化合物は、自体公知の方法を組み合わせることにより製造されるが、たとえば、特許文献１に記載の製造法により製造することができる。

本発明に用いられるノイラミニダーゼ阻害剤としては、たとえば、オセルタミビル、ザナミビル、ペラミビル（peramivir）、ＣＳ−８９５８およびＦＲＵＮＥＴなどのそれ自体またはその生体内での代謝物質がノイラミニダーゼ阻害作用を有する化合物が挙げられ、オセルタミビルおよびザナミビルが、より好ましく、オセルタミビルがさらに好ましい。

本発明の医薬組成物の投与経路は、特に限定されず、静脈内、経口、筋肉内、皮下、吸入、噴霧または他の投与経路により投与することができる。また、一般式［１］で表されるピラジン誘導体またはその塩は、ノイラミニダーゼ阻害剤と同時にまたは特定の順序で投与してもよい。

本発明の医薬組成物は、インフルエンザの治療または予防などの処置に有用である。
本発明の医薬組成物によって、より重篤なインフルエンザの治療または予防などの処置が可能となる。また、使用する個々の薬剤量を減じて投与しても強い抗インフルエンザウイルス作用を示すことより、各々の薬剤の副作用を減じることが可能となる。

本発明の医薬組成物を用いる場合、通常、製剤化に使用される賦形剤、担体および希釈剤などの製剤補助剤を適宜混合してもよく、これらは常法にしたがって、錠剤、カプセル剤、散剤、シロップ剤、顆粒剤、丸剤、懸濁剤、乳剤、液剤、粉体製剤、坐剤、点眼剤、点鼻剤、点耳剤、貼付剤、軟膏剤または注射剤などの形態で経口または非経口で投与することができる。また投与方法、投与量および投与回数は、患者の年齢、体重および症状に応じて適宜選択することができる。通常、成人に対しては、経口または非経口（たとえば、注射、点滴および直腸部位への投与など）投与により、１日、0.01〜1000mg／kgを１回から数回に分割して投与すればよい。

次に、本発明を試験例を挙げて説明するが、本発明は、これらに限定されるものではない。

試験化合物として、６−フルオロ−３−ヒドロキシ−２−ピラジンカルボキサミド（以下、Ｔ−７０５とする）を選択した。ノイラミニダーゼ阻害剤として、オセルタミビルの生体内での活性体であるＧＳ−４０７１およびザナミビルを選択した。なお、本試験に用いたＧＳ−４０７１は、タミフル（市販薬）より抽出した後、常法の加水分解によって得た。

試験例１
試験化合物として、Ｔ−７０５を選択した。ノイラミニダーゼ阻害剤として、ＧＳ−４０７１を選択した。
（１）ＭＤＣＫ細胞の培養
培養液10％ウシ胎児血清添加イーグルMEM培地中、5％二酸化炭素条件下、37℃で継代培養されているマージン−ダービー イヌ腎（Madin-Darby Caine Kidney）（以下、ＭＤＣＫとする）細胞をエチレンジアミン四酢酸トリプシン法によって剥離し、同培地で100μLに2×10⁴個の細胞を含むように調製した懸濁液を96ウェルプレートに播種した。5％二酸化炭素条件下、37℃で一夜培養し、単層となったＭＤＣＫ細胞を得た。

（２）インフルエンザウイルス感染および薬剤添加
試験培地として、1％ウシ血清アルブミンを含み、カナマイシン60μg/mLおよびビタミン類を通常の４倍濃度加えたイーグルMEM培地に3μg/mLとなるようＬ−１−トシルアミド−２−フェニルエチルクロロメチルケトン（TPCK）処理トリプシンを加えた培地を用いた。
（１）で得られたＭＤＣＫ細胞の培養上清を取り除き、イーグルMEM培地ですすいだ後、各ウェルにウシ血清アルブミンおよびビタミン類を試験培地の2倍濃度含むイーグルMEM培地を100μL、試験培地の4倍濃度のTPCK処理トリプシンを含むイーグルMEM培地で4.0×10³PFU/mLに調整したインフルエンザウイルス（ＰＲ／８（Ｈ１Ｎ１））液を50μLおよび設定濃度の4倍濃度のＴ−７０５またはＧＳ−４０７１を含むイーグルMEM培地（Ｔ−７０５設定濃度（μg/mL）:0.0156、0.0313、0.0625、0.125、0.25、0.5、1、2、4／ＧＳ−４０７１設定濃度（μg/mL）:0.00313、0.00625、0.0125、0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8）または5：1の重量濃度比になるよう混合したＴ−７０５およびＧＳ−４０７１を設定濃度の4倍含む同培地を50μL加えた。
薬剤添加後、5％二酸化炭素条件下、35℃で2日間培養した。

（３）ニュートラルレッド取り込み試験法
インフルエンザウイルスの増殖に伴って認められる細胞変性効果（CPE）は、ジャーナル・オブ・ビロロジカル・メソッズ（J. Virol. Methods）、2002年、第106巻、p.71〜79およびプロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc. Natl. Acad. Sci.）1998年、第95巻、p.8874〜8849に記載の方法により判定した。
培養終了後、カルシウム・マグネシウム不含ダルベッコリン酸緩衝液で希釈した0.033％ニュートラルレッド溶液を各ウェルに100μL加え、5％二酸化炭素条件下、35℃で静置した。2時間後、ウェル内の液を吸引除去し、100μLのカルシウム・マグネシウム不含ダルベッコリン酸緩衝液で2回すすいだ後、各ウェルに0.1mol/Lクエン酸ナトリウムおよび0.1mol/L塩酸を含む緩衝液（pH4.2）とエタノールを容量比１：１で混合した液を100μL加え、遮光下、室温に静置した。30分後にマイクロプレートリーダー（バイオ−ラッド（BIO-RAD）Model 550）にて吸光度（540nm）を測定した。非感染コントロールは、インフルエンザウイルス液の代わりに試験培地の4倍濃度のTPCK処理トリプシンを含むイーグルMEM培地50μLを加え、試験群と同様の操作を行い、吸光度を測定した。ブランクには、ＭＤＣＫ細胞を播種しないウェルに非感染対照と同様の操作を加え、吸光度を測定した。例数は、８で実施し、平均値を用い、ブランクの値を差引いた数値を吸光度とした。非感染コントロールの吸光度から感染コントロールの吸光度を差引いた値をウイルス増殖の完全抑制値とし、以下に示す式から各試験のウイルス増殖抑制率を算出した。
ウイルス増殖抑制率＝［（単剤および併用作用時の吸光度）−（感染コントロールの吸光度）］／［（非感染コントロールの吸光度）−（感染コントロールの吸光度）］

（４）併用効果の解析
単剤および二剤併用時の濃度、併用比率およびウイルス増殖抑制率から、SAS release 8.2（SASインスティチュートジャパン）を用いて、チョウ（Chou）らのメディアンエフェクト（Median effect）法を用いて解析した。アドバンスド・エンザイム・レギュレーション（Advanced Enzyme Regulation）1984年、第22号、p.27〜55に示された方法のうち、作用機序が完全に独立している薬剤同士（mutually nonexclusive drug）の場合の方程式を用いCI値を算出した。併用効果の判定は、タイラ（Taira）らの論文［アクタメディカ岡山（Acta Medica Okayama.）2006年、第60号、p.25〜34］の記載に準じ、CI≦0.8のとき相乗、0.8＜CI＜1.2のとき相加、1.2≦CIのとき拮抗とし、50％ウイルス増殖抑制時のCI値で判定した。

Ｔ−７０５単剤作用時、ＧＳ−４０７１単剤作用時および両者の併用作用時のウイルス増殖抑制率を表１に示す。その値を用いて解析した結果を表２に示す。

Ｔ−７０５およびオセルタミビルの生体内活性物質であるＧＳ−４０７１の組合せ投与は、単剤の投与に比べ、優れた相乗的なウイルス増殖抑制効果を示した。

試験例２
試験化合物として、Ｔ−７０５を選択した。ノイラミニダーゼ阻害剤として、ザナミビルを選択した。試験例１に記載の方法により同様の試験を行った。

Ｔ−７０５単剤作用時、ザナミビル単剤作用時および両者の併用作用時のウイルス増殖抑制率を表３に示す。その値を用いて解析した結果を表４に示す。

Ｔ−７０５およびザナミビルの組合せ投与は、単剤の投与に比べ、優れた相乗的なウイルス増殖抑制効果を示した。

試験例３
試験化合物として、Ｔ−７０５を選択した。ノイラミニダーゼ阻害剤として、ＧＳ−４０７１を選択した。インフルエンザウイルスとしてＶｉｃｔｏｒｉａ／３／７５（Ｈ３Ｎ２）を用いて、試験例１に記載の方法により同様の試験を行った。

Ｔ−７０５単剤作用時、オセルタミビル単剤作用時および両者の併用作用時のウイルス増殖抑制率を表５に示す。その値を用いて解析した結果を表６に示す。

Ｔ−７０５およびオセルタミビルの生体内活性物質であるＧＳ−４０７１の組合せ投与は、単剤の投与に比べ、優れた相乗的なウイルス増殖抑制効果を示した。

試験例４
試験化合物として、Ｔ−７０５を選択した。ノイラミニダーゼ阻害剤として、ザナミビルを選択した。試験例３に記載の方法により同様の試験を行った。

Ｔ−７０５単剤作用時、ザナミビル単剤作用時および両者の併用作用時のウイルス増殖抑制率を表７に示す。その値を用いて解析した結果を表８に示す。

Ｔ−７０５およびザナミビルの組合せ投与は、単剤の投与に比べ、優れた相乗的なウイルス増殖抑制効果を示した。

上記の結果から明らかなように、一般式［１］で表されるピラジン誘導体またはその塩および種々のノイラミニダーゼ阻害剤の組合せ投与は、相乗的な抗インフルエンザウイルス活性を示し、インフルエンザの治療または予防などの処置に有効である。

ピラジン誘導体またはその塩ならびに一種以上のノイラミニダーゼ阻害剤を含有する医薬組成物は、相乗的な強い抗インフルエンザウイルス活性を有し、インフルエンザの治療または予防などの処置に有用であり、これらを組み合せて使用する方法は、インフルエンザの治療または予防などの処置の方法として有用である。

Claims (8)

1. 一般式
   

   

   
   「式中、Ｒ ^１ は、水素原子を；Ｒ ^２ は、フッ素原子を；Ｒ^３は、水素原子を示す。」で表されるピラジン誘導体またはその塩ならびにオセルタミビル、ザナミビル、ペラミビルおよびＣＳ−８９５８から選ばれる一種以上のノイラミニダーゼ阻害剤を含有する、インフルエンザウイルス感染症を治療または予防するための医薬組成物。
2. ノイラミニダーゼ阻害剤がオセルタミビルまたはザナミビルである、請求項１に記載の医薬組成物。
3. ノイラミニダーゼ阻害剤がオセルタミビルである、請求項１に記載の医薬組成物。
4. ノイラミニダーゼ阻害剤がザナミビルである、請求項１に記載の医薬組成物。
5. 一般式
   

   

   
   「式中、Ｒ ^１ は、水素原子を；Ｒ ^２ は、フッ素原子を；Ｒ^３は、水素原子を示す。」で表されるピラジン誘導体またはその塩ならびにオセルタミビル、ザナミビル、ペラミビルおよびＣＳ−８９５８から選ばれる一種以上のノイラミニダーゼ阻害剤を含む、インフルエンザウイルス感染症の治療または予防のためのキット。
6. ノイラミニダーゼ阻害剤がオセルタミビルまたはザナミビルである、請求項５に記載のキット。
7. ノイラミニダーゼ阻害剤がオセルタミビルである、請求項５に記載のキット。
8. ノイラミニダーゼ阻害剤がザナミビルである、請求項５に記載のキット。