JP5137551B2 - 生化学反応カセット - Google Patents

Description

本発明は、血液等の検体中の病原菌等に由来する遺伝子の有無に関する検査を行って、検査対象者の健康状態の判定材料とする場合に好適に利用できるＤＮＡマイクロアレイなどのプローブ担体を備える生化学反応カセットに関する。さらに詳しくは、反応チャンバー内に存在する液体または気体の流れを改善するための生化学反応カセットの構造に関するものである。

核酸の塩基配列の解析、核酸試料中の標的核酸の検出を迅速、正確に行なう方法として、ＤＮＡマイクロアレイに代表されるプローブ担体を用いたハイブリダイゼーション反応を利用した方法が多く提案されている。

ＤＮＡマイクロアレイとは、標的核酸と相補的な塩基配列を有するプローブを、ビーズ、ガラス板等の固相上に高密度で固定したものであり、これを用いた標的核酸の検出は一般に以下のような工程を有する。

第１の工程として、ＰＣＲ法に代表される増幅方法によって、標的核酸を増幅する。具体的には、まず、核酸試料溶液に第１および第２のプライマーを加え、温度サイクルをかける。第１のプライマーは標的核酸の一部と特異的に結合し、第２のプライマーは標的核酸と相補的な核酸の一部と特異的に結合する。標的核酸を含む二本鎖核酸と第１および第２のプライマーが結合すると伸長反応によって標的核酸を含む二本鎖核酸が増幅される。十分に標的核酸を含む二本鎖核酸が増幅された後に、核酸試料溶液に第３のプライマーを加えて温度サイクルをかける。第３のプライマーは、酵素、蛍光物質、発光物質等で標識されており、標的核酸と相補的な核酸の一部と特異的に結合する。標的核酸に相補的な核酸と、第３のプライマーが結合すると伸長反応によって酵素、蛍光物質、発光物質等で標識された標的核酸が増幅されるのである。結果として、核酸試料溶液に標的核酸が含まれている場合は標識された標的核酸が生成され、核酸試料溶液に標的核酸が含まれない場合は標識された標的核酸は生成されない。

第２の工程として、この核酸試料溶液をＤＮＡマイクロアレイに接触させ、ＤＮＡマイクロアレイのプローブとハイブリダイゼーション反応させる。プローブと相補的な標的核酸がある場合は、プローブと標的核酸がハイブリッド体を形成する。

第３の工程として、標的核酸の検出を行なう。プローブと標的核酸がハイブリッド体を形成しているかどうかは、標的核酸の標識物質によって検出が可能であり、これにより特定の塩基配列の有無を確認できる。

このハイブリダイゼーション反応を利用したＤＮＡマイクロアレイは、病原菌を特定する医療診断や患者の体質等を検査する遺伝子診断への応用が期待されている。しかしながら、核酸の増幅、ハイブリダイゼーション、検出の各工程は、それぞれ個別の装置で行なわれている事が多く、作業が煩雑であり、診断にかなりの時間を要してしまう。特に、スライドグラス上でハイブリダイゼーション反応を行なう構成では、プローブ固定面が露出しているため、スライドグラス上に指などが触れることでプローブが欠落したり汚染されたりする可能性があり、その取り扱いは慎重に行なう必要がある。これらの問題を解決するために、反応チャンバー内にＤＮＡマイクロアレイを備え、反応チャンバー内でハイブリダイゼーション反応を行ない、その後に検出もできる生化学反応カセットの構造がいくつか提案されている。

特開2003-302399号公報では、液体の初期充填時に気泡が残ってしまうことを防止するためのチャンバー構造が開示されている。さらに、特開2002-243748号公報では液体の均一な広がり、流れを形成するための構造が開示されている。

このような生化学反応カセットの反応チャンバーは、一般的に高さが低く、平面状に広がった空間を有しており、容積が小さい。反応チャンバーの容積が小さいことで使用する核酸試料溶液等の液量が少なくてすみ、反応チャンバーの高さが低いことで内部に層流流れが生じるようになる。さらに、固相上のプローブと標的核酸のハイブリダイゼーション反応を効率化させるためには、反応チャンバー内で核酸試料溶液を攪拌させると良い。最も簡単な方法としては、注入口で液体を押し引きし、反応チャンバー内の核酸試料溶液を揺動させる方法がある。
特開2003-302399号公報 特開2002-243748号公報

プローブと標的核酸との反応は、ＤＮＡマイクロアレイ上で均一に実行させることが好ましい。そのためには、反応チャンバー内に流体を均一に流し、ハイブリダイゼーション反応のばらつきを低減させる必要がある。

特開2003-302399号公報の構成では、液体の初期充填時は反応チャンバー内に液体が均一に広がるものの、反応チャンバーに液体が充填された状態で液体を送液した場合、反応チャンバー中央付近の流速が早くなってしまう場合がある。同様に、特開2002-243748号公報の構成でも、反応チャンバーに液体が充填された状態で液体を送液した場合、反応チャンバー内に流速分布が生じてしまう場合がある。

本発明の目的は、反応チャンバー内での液体の流れを簡易な構成の付加によって均一化できる構成を有する生化学反応カセットを提供することにある。

本発明にかかる生化学反応カセットは、標的物質検出用のプローブ固定領域に試料を反応させるための反応チャンバーと、該反応チャンバーに試料を注入するための注入口と、該反応チャンバーから試料を排出するための排出口と、を有し、前記注入口、前記反応チャンバー及び前記排出口を有して構成される流路中に流路断面積を減少させる流体抵抗部を備え、前記流体抵抗部が、該流体抵抗部が配置された部分において前記流路の幅方向における少なくとも一方の端部よりも他の部分の流体抵抗が高い流体抵抗差を生じさせる構造を有する生化学反応カセットであって、
前記反応チャンバーは天井部と底面とを有して構成され、前記プローブ固定領域が該天井部または該底面の前記反応チャンバーの幅方向における中央部を含んで配置されており、該プローブ固定領域の配置された部分における天井部と底面の間隔が、前記反応チャンバーの幅方向における少なくとも一方の端部の天井部と底面との間隔よりも小さく形成されている間隔差を有することを特徴とする生化学反応カセットである。

本発明の第３の態様にかかる生化学反応カセットは、上記の第１及び第２の態様にかかる構成を合わせ持つものである。

本発明によれば、注入口、反応チャンバーおよび排出口を有して構成される流路中に流路断面積を減少させる流体抵抗部を配置することで流体の流れを均一に制御することができる。ただし、流体抵抗部の幅方向の端部や、注入口、排出口から離れた位置では、流速が遅くなる傾向にあるため、これらの位置での流体抵抗を小さくすることで流速の低下を防ぐことが好ましい。一つの好ましい態様として、注入口および排出口を流路幅方向の中央に配置し、流路幅方向における両端部の流体抵抗を中央部よりも同程度小さくすることで、容易に流速を均一化できる構成となる。他の好ましい態様として、流速が遅くなる反応チャンバーの幅方向での両端付近の流体抵抗を中央部の流体抵抗より小さくするように反応チャンバーの構造を調整することで、反応チャンバー両端部の流速の低下を抑え、反応チャンバー内での流速の均一化を図ることができる。これらの流体抵抗部の配置と反応チャンバーの構成を併用することで流速の更なる均一化が達成可能となる。

以下、図面に基づいて本発明にかかる実施形態について説明する。
（実施形態１）
図１は本発明の第１の実施形態に係る生化学反応カセットの構造を示す斜視図である。図２は本発明の第１の実施形態に係る生化学反応カセットの構造を示す平面図および断面図である。図２（ａ）におけるｂ−ｂ断面の断面図が図２（ｂ）、ｃ‐ｃ断面の断面図が図２（ｃ）である。

まず、カセットの構造について説明する。カセット１０は、ガラス基板１１と材質がポリカーボネードである筐体１２が接合された構成からなる。なお、ガラス基板に対する筺体部分の接合形態は図示した例に限定されず、種々の形態を採り得る。また、筐体１２の材質はポリカーボネードに限定されるものではなく、ポリカーボネード以外のプラスチック、ガラス、ゴム、シリコーンおよびこれらの少なくとも２種からなる複合材料等でも良い。ガラス基板１１と筐体１２の接合面において、筐体１２に所定の断面形状の窪みが設けられており、ガラス基板１１と筐体１２との間に反応チャンバー３が形成される。これにより、反応チャンバー３の底面はガラス基板１１の表面の一部から構成されるようになる。反応チャンバー３に充填された核酸試料溶液に標的核酸が含まれている場合、ガラス基板１１の表面の一部に設けられたプローブ固定領域１３のプローブと標的核酸とが反応するようになっている。標的核酸とプローブの組み合わせは、これらの両方がＤＮＡである場合など検出目的に応じて選択できる。また、プローブ固定領域は、多数のプローブを担体に配列固定したＤＮＡチップなどのプローブ担体を用いて形成することができる。標的物質としては、上述した核酸に限定されず、担体に固定されたプローブによりその検出が可能となるものが対象となり、標的物質に応じて選択されたプローブを担体に固定して標的物質検出用のプローブ固定領域を形成することができる。

筐体１２には注入口４及び排出口５が設けられており、反応チャンバー３とカセット１０外部の空間とを、バッファー領域３ａ及び３ｂを介して連結する。すなわち、１つの流路内に、注入口４、バッファー領域３ａ、反応チャンバー３、バッファー領域３ｂ及び排出口５を配列した構造が形成されている。本実施形態では、反応チャンバー３及びバッファー領域３ａ及び３ｂでは、天井部と底部は平行面で形成されており、天井部の底部からの高さは一定である。

また、反応チャンバー３に隣接して、天井部から鉛直方向に伸びる突起部材１、２を有する流体抵抗部が設けられている。なお、突起部材１、２は、底部から天井部への鉛直方向に伸びるようにもうけてもよい。この点は、後述する各実施形態でも同様である。

さらに、突起部材１、２は両端にそれぞれ突起量が小さい小突起部１ａ、１ｂ、２ａ、２ｂを備えている。これらに構成によって、突起部材１、２が存在する領域において、天井部の高さは中央部で低く、両端部で高くなる幅方向における間隔差が付与される。液体は、注入口４からバッファー領域３ａを介して反応チャンバー３へ注入される。途中、突起部材１、２が形成する狭隙部を液体は通過し、反応チャンバー３に接続された排出口５からバッファー領域３ｂを介してカセット１０外に排出される。すなわち、これらの部分から液体の流路が形成されている。なお、突起部は、天井部または底部に設けても良いし、これらの両方に設けても良い。

ここでは筐体１２に反応チャンバー３、バッファー領域３ａ及び３ｂおよび突起部材１、２を設けているため、反応チャンバー３の底面は同一平面をなしている。しかしながら、これに限定されるのではなく、反応チャンバー３、バッファー領域３ａ及び３ｂおよび突起部材１、２の一部または全部をガラス基板１１に設け、反応チャンバー３、バッファー領域３ａ及び３ｂ及び突起部の２以上の底面が同一平面をなしていない構成でも良い。

図１及び２では反応チャンバーの流路方向に対する幅（図１におけるX軸方向の長さ）は同一に形成されているが、これらの幅も各部間で同一ではなくとも良い。しかしながら、製造工程を複雑化しないという点や、均一な流速をより効果的に反応チャンバー内で得るという点からはこれらの部分の幅を一致させることが好ましい。

図１及び２では、小突起部１ａ、１ｂ、２ａ、２ｂは突起量が零となる部分を有しいている例を示したが、小突起部１ａ、１ｂ、２ａ、２ｂは突起部材１、２の中央部よりも突起量が小さければ良く、有限の突起量であっても良い。また、図１に示したＸＺ平面内の突起部材１、２の断面形状は、広範囲に渡って中央部の突起量が一定となっている例を示した。しかしながら、これに限定されるのではなく、中央付近が最大となるように突起量が変化していても良い。さらに、図１に示したＸＺ平面内の突起部材１、２の断面形状は、両端部で突起量が徐々に小さくなるような徐変領域の構成を示しているが、これに限定されるのではなく、中央部から両端部に向けて段階的に突起量が変化していても良い。しかしながら、反応チャンバー３内の流速を、特に中央部における流速を均一にする効果を発揮する構成としては、図１及び２に示すような形状はより好ましい様態の一つである。また、突起部材の目的とする機能が得られる範囲内で、突起部材１と突起部材２の突起量は一致している必要はない。さらに、突起部材が２つある構成を示したが、突起部材が１つであっても、３つ以上あっても良い。

なお、本実施態様における幅方向とは、流体の流れ方向に垂直な面と反応チャンバー底面とが交差する線の方向である。流体の流れ方向は図２におけるｂ−ｂ線（中心軸）である。本実施態様では、この中心軸に流路の幅方向での中心が位置し、この中心軸から幅方向の両端部へ所定の距離の広がりを持ったプローブ配置領域が中央部を構成している。なお、プローブ固定領域１３は、図示したように中心軸を中心に幅方向に対称に設けられることが好ましい。これらの点については以下に説明する各実施形態においても同様である。

流体抵抗部は、反応チャンバー内に目的とする流体の流れが得られる位置に設けられる。好ましくは、流体抵抗部は反応チャンバーに隣接して設ける、すなわち、流体抵抗部により反応チャンバーの一部を構成することにより、反応チャンバー内の流体に効果的な影響を直接与えることができる。例えば、図１に示す構成のように、反応チャンバーの上流側の幅いっぱいに流体抵抗部を設けることが好ましい。

また、流体抵抗部を設ける位置は、液体の流れ方向におけるプローブ固定領域の前方または後方に設けることができる。流体の流れ方向におけるプローブ固定領域の少なくとも前方に設けることが好ましい。なお、この流体の流れ方向には、液体試料の流れ方向のみならず、洗浄液の流れ方向も含まれる。したがって、図１に示す構成を例にとると、１ｂ及び２ｂの一方のみを用いる構成、これらの両方を用いる構成をカセットの目的用途に応じて選択できる。

次に、カセットを用いた標的核酸の検出までの工程について説明する。まず、核酸試料溶液を準備し、必要に応じて先に述べた方法により標的核酸の増幅を行なう。核酸試料溶液に標的核酸が存在する場合、増幅工程において蛍光物質で標識された標的核酸が生成される。ここで、標識物質は蛍光物質としたが、発光物質や酵素等でも良い。この核酸試料溶液を、液体注入手段（不図示）を用いてカセット１０の反応チャンバー３に注入口４から注入する。核酸試料溶液が反応チャンバー３に充填されたら、核酸試料溶液を加熱して高温に保持し、核酸試料溶液中の標的核酸とプローブ固定領域１３上のプローブとのハイブリダイゼーション反応を進行させる。この時、核酸試料溶液中の標的核酸がプローブ固定領域１３上のプローブと接触する頻度を増加させるため、核酸試料溶液を反応チャンバー３内で往復運動させて攪拌する。この時、常に反応チャンバー３は核酸試料溶液で満たされるようにする。

攪拌のために注入口４側から核酸試料溶液が送液された場合、流路に抵抗がなければ核酸試料溶液は注入口４から排出口５に向かってほぼ一直線に流れ、反応チャンバー３中央部での流速が速くなる。しかし、突起部材１が抵抗となるので、バッファー領域３ａ全体に広がるような核酸試料溶液の流れが生じる。これにより、バッファー領域３ａの圧力が上昇し、突起部材１が形成する狭隙部に均等な圧力が加わるようになる。よって、突起部材１が形成する狭隙部から押し出された核酸試料溶液は反応チャンバー３内で流速が均一になろうとする。しかしながら、流れの両端部では側壁の影響が大きくなり、流速が低下してしまう。そこで、小突起部１ａ、１ｂによって、幅方向の両端部での狭隙部の高さを中央よりも高くし、積極的に液体を流すことで、反応チャンバー３全体の流速を均一にすることができる。攪拌に必要な量の核酸試料溶液を注入口４から送液したら、今度は排出口５側から核酸試料溶液を送液する。注入口４側から核酸試料溶液を送液した場合と同様の原理で、突起部材２および小突起部２ａ、２ｂの効果により、反応チャンバー３内に均一な流速が生じる。攪拌に必要な量の核酸試料溶液を排出口５から送液した後に、再び注入口４から核酸試料溶液を送液する。この後も、排出口５からの送液、注入口４からの送液を繰り返し、反応チャンバー３内の核酸試料溶液を攪拌する。反応チャンバー３内には均一な流速が生じるので、プローブ固定領域１３の位置に依存せず、プローブと核酸試料溶液中の標的核酸とが接触する頻度が同じになる。つまり、プローブ固定領域１３の位置によるハイブリダイゼーション反応のばらつきを低減できるのである。

さらに、次のような効果もある。反応チャンバー３の両端での流速が遅い場合、気泡が反応チャンバー３の隅部に溜まってしまう。核酸試料溶液が高温になると溶存していた空気が気泡化すること等が気泡発生の原因として挙げられる。隅部に溜まった気泡は凝集または膨張して成長し、反応チャンバー３内の核酸試料溶液の流れを乱すことがある。しかし、小突起部１ａ、１ｂ、２ａ、２ｂの効果で反応チャンバー３の両端での流速が低下しないので、気泡を積極的に移動させ隅部に溜まることを防止することができる。

核酸試料溶液が反応チャンバー３内に充填されたままであったり、蛍光物質を含む核酸試料が反応チャンバー３の壁面に付着したままであったりすると、検出時のバックグラウンドのノイズが多くなるため、これらを洗い流す必要がある。洗浄時は洗浄液を注入口４から一定時間流し続けるが、この時も先程と同様に、突起部材１および小突起部１ａ、１ｂの効果により、反応チャンバー３内に均一な流速が生じる。洗浄液の流速が均一になることで、反応チャンバー３の壁面に付着した核酸試料を洗い流す度合が反応チャンバー３の位置によらず一定になる。さらに、プローブと結合した標的核酸も洗浄液の流れによって引き剥がされる可能性がある。しかし、標的核酸の一部がプローブ固定領域から引き剥がされた場合でも、洗浄液の流速が均一になるので、標的核酸が引き剥がされる確率もプローブ固定領域１３の位置によらず一定になる。よって、洗浄後、蛍光物質で標識された標的核酸の有無を図示しない光学系で検出する際の蛍光輝度のばらつきを低減させることができる。

さらに、洗浄後に洗浄液を反応チャンバー３から排出し、プローブ固定領域１３を乾燥させる乾燥工程を入れてもよい。この場合、空気を注入口４から導入し、排出口５から排出する。プローブ固定領域１３上に液体、水滴が排除されずに残された部分は、乾燥した部分と比べて蛍光物質が発する光の強度が低下してしまう。よって、液体を流した時と同様に、突起部材１および小突起部１ａ、１ｂの効果により、反応チャンバー３内に空気を均一な速度で流し、反応チャンバー３内の液体を均一な力でカセット１０外部に排出する。この時、反応チャンバー３の両端での流速も低下しないので、反応チャンバー３の隅部に留まりやすい液体を積極的に排除することができる。

以上で説明したように、反応チャンバー３内を流れる核酸試料溶液、洗浄液の流速が均一になることで、プローブと標的核酸との結合の割合が位置によらず一定になり、検出の精度を向上させることができる。さらに、乾燥工程を入れた場合でも、プローブ固定領域１３上に液体、水滴が残ることを低減させる効果がある。

なお、バッファー領域３ａ及び３ｂを設けたことで、核酸試料溶液の注入口５からの注入時に、注入圧力に変動があっても、バッファー領域３ａによりこれを緩和することができる。

また、本実施形態にかかる生化学反応カセットの各部分の大きさは、使用目的に応じて、例えば少量試料の分析に適用できるように選択すればよく、この点は以下の各実施形態においても同様である。

また、プローブ固定領域をカセットに対して着脱自在な構成としてもよい。この点は以下の実施形態においても同様である。

以上の構成を有する生化学反応カセットによれば、突起部材１、２をそれぞれ有する流体抵抗部により、反応チャンバーの幅方向におけるプローブ固定領域と概略一致する位置に一定の流体抵抗を付与することができる。この効果は、以下に説明する各実施形態においても同様に得ることができる。

（実施形態２）
図３は本発明の第２の実施形態に係る生化学反応カセットの構造を示す斜視図である。図４は本発明の第２の実施形態に係る生化学反応カセットの構造を示す平面図および断面図である。図４（ａ）におけるｂ‐ｂ断面の断面図が図４（ｂ）、ｃ−ｃ断面の断面図が図４（ｃ）である。

カセット１０の構造は、実施形態１における突起部材１、２を、柱状部材２１、２２にしたものである。柱状部材２１が形成する間隔、および、柱状部材２２が形成する間隔を液体が通過する。柱状部材２１が形成する間隔はその両端部２１ａ、２１ｂで広くなっている。同様に、柱状部材２２が形成する間隔はその両端部２２ａ、２２ｂで広くなっている。ここでは柱状部材２１、２２の間隔を変化させたが、柱状部材２１、２２の直径（幅）を変化させてもよい。また、図３及び４では、柱状部材２１と柱状部材２２は同じ直径の柱を図３のＸ方向の同じ位置に配置しているが、柱状部材２１と柱状部材２２は直径、配置が一致していなくても良い。更に、柱状部材の形状を調節することで幅方向における目的とする流体抵抗差を得るようにしてもよい。更に、実施形態１と同様の幅方向における徐変領域や段階的流体抵抗の減少部分を設けても良い。その他の構造は、実施形態１と同じである。

本実施形態のカセットは、筐体１２を一体で成型することで製造される。ただし、製造方法はこれに限定されるのではなく、柱状部材２１、２２を接着して固定する等の方法でも良い。

以上のような構成で、柱状部材２１、２２が流路断面積を減少させ、実施形態１における突起部材１、２と同様の効果を発揮する。さらに、両端部２１ａ、２１ｂ、２２ａ、２２ｂで柱状部材の間隔を広くすることで、実施形態１における小突起部１ａ、１ｂ、２ａ、２ｂと同様の効果を発揮する。つまり、反応チャンバー３内を流れる核酸試料溶液、洗浄液の流速が均一になることで、プローブと標的核酸との結合の割合が位置によらず一定になり、検出の精度を向上させることができる。さらに、乾燥工程を入れた場合でも、プローブ固定領域１３上に液体、水滴が残ることを低減させる効果がある。

（実施形態３）
図５は本発明の第３の実施形態に係る生化学反応カセットの構造を示す斜視図である。図６は本発明の第３の実施形態に係る生化学反応カセットの構造を示す平面図および断面図である。図６（ａ）におけるｂ‐ｂ断面の断面図が図６（ｂ）、ｃ‐ｃ断面の断面図が図６（ｃ）である。

カセット１０の構造は、実施形態１における突起部材１を隔壁部材３１に、突起部材２を隔壁部材３２にしたものである。隔壁部材３１、３２には図５に示すＹ方向に、液体を通過させる多数の連通孔（微細孔）があいている。隔壁部材３１の両端部３１ａ、３１ｂ、および、隔壁部材３２の両端部３２ａ、３２ｂには、流路幅を規定する側壁との間に若干の隙間を設け、流体が受ける抵抗を小さくしている。ここでは両端部３１ａ、３１ｂ、３２ａ、３２ｂに隙間を設けた構成を示したが、隔壁部材を反応チャンバー３の幅（図５のＸ方向）全体に配置し、両端部で連通孔の穴径を大きくしたり、連通孔の密度を大きくして、連通孔の開口面積の占める割合を大きくしたりしてもよい。また、隔壁部材３１と隔壁部材３２では連通孔の密度が同じ例を示しているが、隔壁部材３１と隔壁部材３２の連通孔の密度は一致していなくても良い。すなわち、連通孔の大きさ及び／または密度を部分的に調節して幅方向の流体抵抗差を得ることができる。更に、連通孔の大きさ及び／または密度を部分的に調節して、実施形態１と同様の幅方向における徐変領域や段階的流体抵抗の減少部分を設けても良い。その他の構造は、実施形態１と同じである。

本実施形態のカセット製造方法の一例について説明する。筐体１２に溝部（不図示）を設けておき、溝部に隔壁部材３１、３２を嵌め、筐体１２とガラス基板１１で挟み込む。ただし、製造方法はこれに限定されるのではなく、筐体１２に隔壁部材３１、３２を接着して固定する等の方法でも良い。

以上のような構成で、隔壁部材３１、３２が流路断面積を減少させ、実施形態１における突起部材１、２と同様の効果を発揮する。さらに、両端部３１ａ、３１ｂ、３２ａ、３２ｂに隙間を設けることで、実施形態１における小突起部１ａ、１ｂ、２ａ、２ｂと同様の効果を発揮する。つまり、反応チャンバー３内を流れる核酸試料溶液、洗浄液の流速が均一になることで、プローブと標的核酸との結合の割合が位置によらず一定になり、検出の精度を向上させることができる。さらに、乾燥工程を入れた場合でも、プローブ固定領域１３上に液体、水滴が残ることを低減させる効果がある。

（実施形態４）
図７は本発明の第４の実施形態に係る生化学反応カセットの構造を示す斜視図である。図８は本発明の第４の実施形態に係る生化学反応カセットの構造を示す平面図および断面図である。図８（ａ）におけるｂ‐ｂ断面の断面図が図６（ｂ）、ｃ‐ｃ断面の断面図が図６（ｃ）、ｄ‐ｄ断面の断面図が図６（ｄ）、ｅ‐ｅ断面の断面図が図６（ｅ）である。

まず、カセットの構造について説明する。カセット６０は、ガラス基板６１と材質がポリカーボネードである筐体６２が接合された構成からなる。なお、ガラス基板に対する筺体部分の接合形態は図示した例に限定されず、種々の形態を採り得る。また、筐体６２の材質はポリカーボネードに限定されるものではなく、ポリカーボネード以外のプラスチック、ガラス、ゴム、シリコーンおよびこれらの少なくとも２種からなる複合材料等でも良い。ガラス基板６１と筐体６２の接合面において、筐体６２に所定の断面形状の窪みが設けられており、ガラス基板６１と筐体６２との間に反応チャンバー５３が形成される。これにより、反応チャンバー５３の底面はガラス基板６１の表面の一部から構成されるようになる。反応チャンバー５３に充填された核酸試料溶液に標的核酸が含まれている場合、ガラス基板６１の表面の一部に設けられたプローブ固定領域６３のプローブと標的核酸とが反応するようになっている。標的核酸とプローブの組み合わせは、これらの両方がＤＮＡである場合など検出目的に応じて選択できる。

筐体６２には注入口５４、排出口５５が設けられており、反応チャンバー５３とカセット６０外部の空間とを連結する。また、反応チャンバー５３はその天井部の周囲に溝部５１ａ、５１ｂ、５１ｃを有している。すなわち、天井部の注入口５４側の部分を除く３辺に連続して溝が設けられている。溝部５１ａ、５１ｂの部分では反応チャンバー５３の高さが高くなるため、反応チャンバー５３中央部と両端部とでは流体抵抗が異なる。

反応チャンバー５３に液体を充填させる時は、注入口５４から液体を注入する。液体は反応チャンバー５３を満たしつつ、初期状態で反応チャンバー５３内部にあった空気を溝部５１ａ、５１ｂ、５１ｃに追いやる。溝部５１ａ、５１ｂ、５１ｃは排出口５５に向かって若干の傾斜をつけている。よって、液体を反応チャンバー５３に充填していくと、空気は次第に排出口５５の方向に向かい、最終的には反応チャンバー５３から空気は排除されて液体で充填されるようになる。

次に、注入口５４から核酸試料溶液が送液された場合の反応チャンバー５３内の流速分布について説明する。まず、反応チャンバー５３の中央部の高さを低くすることで流体抵抗を大きくし、反応チャンバー５３中央部の流速が速くなることを防止する。反応チャンバー５３の両端部の流体抵抗には、反応チャンバー５３の上面および底面の影響の他に、側面の影響も加わる。そこで、溝部５１ａ、５１ｂによって反応チャンバー５３の上面、底面の影響を小さくし、図７のＸ方向における流体抵抗を均一にする。よって、反応チャンバー５３全体に均一な流速が分布するようになる。以上のような効果で、核酸試料溶液の攪拌、洗浄液による洗浄がプローブ固定領域６３上で均一に行われるため、蛍光物質で標識された標的核酸の有無を図示しない光学系で検出する際の蛍光輝度のばらつきを低減させることができる。

さらに、乾燥工程を入れた場合も、実施形態１〜３と同様の効果を得る。つまり、液体を流した時と同様に、溝部５１ａ、５１ｂの効果により、注入口５４から流入した空気が反応チャンバー５３内を均一な速度で流れ、反応チャンバー５３内の液体を均一な力で排出口５５からカセット６０外部に排出する。この時、反応チャンバー５３の両端での流速が低下しないので、反応チャンバー５３の隅部に留まりやすい液体を積極的に排除する。ここでは、反応チャンバー５３の流体抵抗を反応チャンバー５３の高さのみで制御する例を示したが、反応チャンバー５３の高さの変化と実施形態１〜３に示したような流体抵抗部材とを組み合せても良い。

以上で説明したように、反応チャンバー５３内を流れる核酸試料溶液、洗浄液の流速が均一になることで、プローブと標的核酸との結合の割合が位置によらず一定になり、検出の精度を向上させることができる。さらに、乾燥工程を入れた場合でも、プローブ固定領域６３上に液体、水滴が残ることを低減させる効果がある。

（実施形態５）
図９は本発明の第５の実施形態に係る生化学反応カセットの構造を示す斜視図である。図１０は本発明の第５の実施形態に係る生化学反応カセットの構造を示す平面図および断面図である。図１０（ａ）におけるｂ‐ｂ断面の断面図が図１０（ｂ）、ｃ‐ｃ断面の断面図が図１０（ｃ）である。

カセット１０の構成は実施形態１とほぼ同一である。異なるのは突起部材７１、７２であるので、この突起部材７１、７２の効果についてのみ説明する。

突起部材７１、７２は両端にそれぞれ突起量が小さい小突起部７１ａ、７１ｂ、７２ａ、７２ｂを備えている。よって、突起部材７１、７２が存在する領域において、天井部の高さは中央部で低く、両端部で高くなる。さらに、図１０（ｃ）で最も良く描かれているように、突起部材７１、７２はテーパー形状の部分（テーパー部）７１ｃ、７１ｄ、７２ｃ、７２ｄを備えている。このテーパー部は、突起部材７１、７２の流体の流れ方向にその突起量が徐々に小さくなる領域を少なくとも有している。

ここではテーパー部を突起部材７１、７２の上流側、下流側にそれぞれ備えた例を示したが、突起部材７１、７２のプローブ固定領域側（テーパー部７１ｄ、７２ｃ）に少なくとも設けられていることがより好ましい。これは、突起部材７１、７２のプローブ固定領域側に発生する渦、乱流が、突起部材７１、７２より外側で発生する渦、乱流よりプローブ固定領域での反応に悪影響を与えるからである。さらに、突起部材が２つある構成を示したが、突起部材が１つであっても、３つ以上あっても良い。

以上のように、突起部材７１、７２にテーパー部７１ｃ、７１ｄ、７２ｃ、７２ｄを設けた構成により、流体がバッファー領域３ａ、反応チャンバー３、バッファー領域３ｂと流れる際の突起部材７１、７２近傍に発生する渦、乱流を低減することができる。突起部材７１、７２近傍に発生する渦、乱流は流れを乱す要素である。つまり、テーパー部７１ｃ、７１ｄ、７２ｃ、７２ｄの効果により、突起部材７１、７２および小突起部７１ａ、７１ｂ、７２ａ、７２ｂで均一化された流れを乱すことなく反応チャンバー３に送り込むことができる。

（実施形態６）
図１１は本発明の第６の実施形態に係る生化学反応カセットの構造を示す斜視図である。図１２は本発明の第６の実施形態に係る生化学反応カセットの構造を示す平面図および断面図である。図１１（ａ）におけるｂ‐ｂ断面の断面図が図１１（ｂ）、ｃ‐ｃ断面の断面図が図１１（ｃ）である。

カセット１０の構成は実施形態１とほぼ同一である。異なるのは注入口４、排出口５の位置と突起部材８１、８２の形状である。注入口４、排出口５の位置に応じた最適な突起部材８１、８２の形状についてのみ説明する。

注入口４、排出口５が反応チャンバー３の壁面付近に備えられ、突起部材８１、８２が流体抵抗として注入口４と排出口５の間に配置されている。突起部材８１、８２の両端のうち注入口４および排出口５近傍である突起部材端部８１ａ、８２ａの高さは、突起部材８１、８２の中央部の高さと同一である。そして、突起部材８１、８２の両端のうち注入口４および排出口５より遠方の突起部材端部８１ｂ、８２ｂの高さは、突起部材８１、８２の中央部の高さより低くなっている。

実施形態１では注入口４および排出口５が反応チャンバー３における幅方向の中央付近に配置されており、反応チャンバー３の幅方向の流れは両側に広がるため、圧力が緩和されやすい構成であった。しかし、注入口４および排出口５が反応チャンバー３の壁面付近に偏って配置されている場合、反応チャンバー３の幅方向の流れは片側にしか発生せず、圧力が緩和されにくい構成となる。つまり、注入口４および排出口５付近の流速は低下しにくい。よって、突起部材端部８１ａ、８２ａの流体抵抗を小さくしてしまうと、突起部材端部８１ａ、８２ａ部分の流速が大きくなり、反応チャンバー３内の流速を均一にすることができなくなる。そこで、突起部材端部８１ａ、８２ａの高さを突起部材８１、８２中央部の高さと同じにし、突起部材端部８１ａ、８２ａ部分の流速が大きくなることを防いでいる。

ここで、突起部材端部８１ａ、８２ａの高さは、突起部材８１、８２中央部の高さと同一としたが、これに限定されるのではなく、注入口４および排出口５の配置や流体の物性、流速によって突起部材端部８１ａ、８２ａの高さは任意に設定できる。また、注入口４および排出口５の位置を一方向へ片寄せした例を示したが、これに限定されるのではなく、注入口４と排出口５の位置をそれぞれ反対方向へ片寄せしても良いし、注入口４または排出口５の一方が反応チャンバー３の幅方向中央にあっても良い。

以上のように、注入口４または／および排出口５を反応チャンバー３の壁面付近に配置した場合でも、突起部材８１、８２の高さによって注入口４または／および排出口５近傍の流体抵抗を調整することで、流速の均一化を図ることができる。また、ここでは実施形態１に対して、注入口４および排出口５を反応チャンバー３の壁面付近に配置した例を示した。しかし、これに限定されるのではなく、実施形態２〜５に対して注入口４または／および排出口５を反応チャンバー３の壁面付近に配置した場合でも、注入口４または／および排出口５付近の流体抵抗を大きくすることで同様の効果を得ることができる。

本発明の第１の実施形態に係わる生化学反応カセットの構造を説明する斜視図である。 本発明の第１の実施形態に係わる生化学反応カセットの構造を説明する平面図および断面図である。 図３は本発明の第２の実施形態に係る生化学反応カセットの構造を説明する斜視図である。 図４は本発明の第２の実施形態に係る生化学反応カセットの構造を説明する平面図および断面図である。 図５は本発明の第３の実施形態に係る生化学反応カセットの構造を説明する斜視図である。 図６は本発明の第３の実施形態に係る生化学反応カセットの構造を説明する平面図および断面図である。 図７は本発明の第４の実施形態に係る生化学反応カセットの構造を説明する斜視図である。 図８は本発明の第４の実施形態に係る生化学反応カセットの構造を説明する平面図および断面図である。 図９は本発明の第５の実施形態に係る生化学反応カセットの構造を説明する斜視図である。 図１０は本発明の第５の実施形態に係る生化学反応カセットの構造を説明する平面図および断面図である。 図１１は本発明の第６の実施形態に係る生化学反応カセットの構造を説明する斜視図である。 図１２は本発明の第６の実施形態に係る生化学反応カセットの構造を説明する平面図および断面図である。

符号の説明

１、２ 突起部材
３、５３ 反応チャンバー
３ａ、３ｂ バッファー領域
４、５４ 注入口
５、５５ 排出口
１０、６０ カセット
１１、６１ ガラス基板
１２、６２ 筐体
１３、６３ プローブ固定領域
２１、２２ 柱状部材
３１、３２ 隔壁部材
５１ａ、５１ｂ、５１ｃ 溝部

Claims (22)

1. 標的物質検出用のプローブ固定領域に試料を反応させるための反応チャンバーと、該反応チャンバーに試料を注入するための注入口と、該反応チャンバーから試料を排出するための排出口と、を有し、前記注入口、前記反応チャンバー及び前記排出口を有して構成される流路中に流路断面積を減少させる流体抵抗部を備え、前記流体抵抗部が、該流体抵抗部が配置された部分において前記流路の幅方向における少なくとも一方の端部よりも他の部分の流体抵抗が高い流体抵抗差を生じさせる構造を有する生化学反応カセットであって、
   前記反応チャンバーは天井部と底面とを有して構成され、前記プローブ固定領域が該天井部または該底面の前記反応チャンバーの幅方向における中央部を含んで配置されており、該プローブ固定領域の配置された部分における天井部と底面の間隔が、前記反応チャンバーの幅方向における少なくとも一方の端部の天井部と底面との間隔よりも小さく形成されている間隔差を有することを特徴とする生化学反応カセット。
2. 前記プローブ固定領域の配置された部分における天井部または底部に突起を設けることで、前記間隔差を付与する請求項１に記載の生化学反応カセット。
3. 前記反応チャンバーの幅方向における端部の天井部と底面との間隔が、前記排出口に向かって大きくなる傾斜が、前記反応チャンバーに設けられている請求項１または２に記載の生化学反応カセット。
4. 前記反応チャンバーの幅方向における端部の天井部と底面との間隔が、前記プローブ固定領域の配置された部分の天井部と底面との間隔から徐変しながら大きくなる徐変領域を、前記反応チャンバーが備える請求項１乃至３のいずれか１項に記載の生化学反応カセット。
5. 前記流体抵抗部により、前記反応チャンバーの幅方向におけるプローブ固定領域と概略一致する位置に一定の流体抵抗が付与される請求項１乃至４のいずれか１項に記載の生化学反応カセット。
6. 前記流体抵抗部は、前記流路の幅方向の中央部から端部への流体抵抗が徐変しながら小さくなる徐変領域を備えている請求項１乃至５のいずれか１項に記載の生化学反応カセット。
7. 前記流路が、天井部及び底部を有して構成されており、前記流体抵抗部は、前記天井部または／および前記底面から鉛直方向に伸びる突起部材を有する請求項１乃至６のいずれか１項に記載の生化学反応カセット。
8. 前記突起部材は、前記反応チャンバーの幅方向の中央部の突起量より端部の突起量が小さいことにより前記流体抵抗差を付与する請求項７に記載の生化学反応カセット。
9. 前記流体抵抗部は、多数の柱状部材の前記流路の幅方向への配列により構成されている請求項１乃至６のいずれか１項に記載の生化学反応カセット。
10. 前記柱状部材の前記流路の幅方向における配列の間隔により前記流体抵抗差を付与する請求項９に記載の生化学反応カセット。
11. 各柱状部材の前記流路の幅方向における幅により前記流体抵抗差を付与する請求項９に記載の生化学反応カセット。
12. 各柱状部材の形状により前記流体抵抗差を付与する請求項９に記載の生化学反応カセット。
13. 前記流体抵抗部は、微細孔のあいた隔壁部材を有して構成されている請求項１乃至６のいずれか１項に記載の生化学反応カセット。
14. 前記流路がその幅を規定する側壁を有し、該側壁と前記隔壁部材との間に隙間が設けられている請求項１３に記載の生化学反応カセット。
15. 前記隔壁部材の微細孔の開口面積の割合を部分的に調整することにより前記流体抵抗差を付与する請求項１３または１４に記載の生化学反応カセット。
16. 前記隔壁部材の微細孔の開口の大きさを部分的に調整することにより、前記流体抵抗差を付与する請求項１３または１４に記載の生化学反応カセット。
17. 標的物質検出用のプローブの固定領域を有し、該プローブ固定領域に試料を反応させるための反応チャンバーと、該反応チャンバーに試料を注入するための注入口と、該反応チャンバーから試料を排出するための排出口と、を有する標的物質検出用の生化学反応カセットにおいて、
    前記プローブ固定領域が前記反応チャンバーの幅方向における中央部に配置されており、かつ、前記反応チャンバーは、天井部と底面とを有して構成され、
    前記プローブ固定領域が、該天井部または該底面の前記反応チャンバーの幅方向における中央部を含んで配置されており、該プローブ固定領域の配置された部分における天井部と底面の間隔が、前記反応チャンバーの幅方向における少なくとも一方の端部の天井部と底面との間隔よりも小さい間隔を有する生化学反応カセット。
18. 前記プローブ固定領域の配置された部分における天井部または底面に突起を設けることで、前記間隔差を付与する請求項１７に記載の生化学反応カセット。
19. 前記反応チャンバーの幅方向における端部の天井部と底面との間隔は、前記排出口に向かって大きくなる傾斜が設けられている請求項１７または１８に記載の生化学反応カセット。
20. 前記反応チャンバーの幅方向における端部の天井部と底面との間隔は、前記プローブ固定領域の配置された部分の天井部と底面との間隔から徐変しながら大きくなる徐変領域を備える請求項１７乃至１９のいずれか１項に記載の生化学反応カセット。
21. 前記突起部材は、前記流路内の流体の流れと概略一致する方向にテーパー形状を有することを特徴とする請求項７または８に記載の生化学反応カセット。
22. 前記テーパー形状は、前記突起部材の前記プローブ固定領域側の突起量が徐々に小さくなる領域を有することを特徴とする請求項２１に記載の生化学反応カセット。

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