JP5014137B2 - ナノ粒子化ホエイタンパク質 - Google Patents

Description

発明の詳細な説明

本発明は、ナノ粒子化形態のホエイタンパク質を生産する方法、及びそのようにして得られるナノ粒子化ホエイタンパク質に関する。特に、本発明は、これらのナノ粒子化ホエイタンパク質の、乳化剤、脂肪代替物、ミセルカゼイン代替物、漂白剤、起泡剤、生地改良剤及び／又は充填剤としての使用に関する。

脂肪含有食品材料は、多くの人々の食事の相当な割合を構成している。かかる製品の生産が直面する問題の１つは、相分離が起こらないように、製品の貯蔵寿命全体を通じて脂肪が安定していなければならないという点に存する。

この目的のために、乳化剤が利用される。乳化剤は、非水相に可溶な親油性若しくは疎水性部分、及び水に可溶な極性若しくは親水性部分の固有の特性に基づいて、一旦形成されたエマルションを安定化させ、その結果、乳化剤分子は、一方の相を他方の相に乳化するのを促進する。乳化剤はまた、一旦形成された液滴を凝集及び合体から保護する。乳化剤としては、親水コロイド、リン脂質（レシチン）、糖脂質等の天然物質も、ステアリル−２−ラクチレート、モノ若しくはジアシルグリセリド等の合成物質も用いられる。

これらの物質の主な欠点の１つは、最終製品のコストは実質的に増加させるが、製品の栄養価は増加させない点に存する。かかる種類の物質はまた、タンパク質と界面で競合するために、十分な安定化特性を示さないことがある。

従って、本発明の１つの目的は、固有の欠点を示さず、容易に入手可能な、既存の乳化剤の代替物を提供することにある。

本発明の他の目的は、高いタンパク効率（ＰＥＲ）を有する、脂肪代替物、漂白剤、起泡剤、生地改良剤及び／又は充填剤を提供することにある。

この目的を達成するために、ホエイタンパク質を含有する溶液を特定の時間、狭いｐＨ範囲で特定の温度下に置いて、１μｍ未満、好ましくは１００〜９９０ｎｍの直径を有するホエイタンパク質凝集体を生成させるステップを含む、ナノ粒子化ホエイタンパク質の生産方法が提示される。

特に、本発明は、
ｉ）ホエイタンパク質の水溶液のｐＨを狭い範囲に調節するか、或いは、ｐＨを一定に保ったまま、ホエイタンパク質調製物のイオン強度を調節するステップと、
ｉｉ）水溶液を、１０秒〜３０分の時間、８０°〜９５℃の温度下に置いて、１μｍ未満の粒子径を有する球形ナノ粒子化ホエイタンパク質の分散液を得るステップと、
を含む、ナノ粒子化ホエイタンパク質の生産方法に関する。

ナノ粒子化ホエイタンパク質の分散液は、特に凍結乾燥又は噴霧乾燥によって、更に乾燥させてもよい。噴霧乾燥粉末を戻した溶液中でホエイタンパク質ナノ粒子が観察されることが判明した。形態及び構造に差異は検出されず、ホエイタンパク質ナノ粒子が噴霧乾燥に対して物理的に安定であることが確認された。

前記ナノ粒子は、少なくとも１００のタンパク効率を有する。

本発明に至る長い実験の過程で、本発明者らは、驚くべきことに、ホエイタンパク質、又はその１つ若しくは複数の主要成分の水溶液を、約８０〜９５℃の所望の温度で、約１０秒〜３０分間熱処理する前に、ｐＨを非常に正確な狭い範囲（±０．２ｐＨ単位）に調節すると、得られるホエイタンパク質が、球形の形状と直径１μｍ未満の粒子サイズとを有する微粒子の形態を示すことを見出した。利点は、従来の方法とは異なり、そのように調製されるホエイタンパク質粒子は、粒子径の減少をもたらすいかなる機械的ストレスも受けないということである。この方法は、せん断なしで、熱処理の間にホエイタンパク質の自発的ナノ粒子化を誘導するものである。

ナノ粒子化ホエイタンパク質は、長期に渡って溶液系中の脂肪及び／又は空気を安定化することができるので、乳化剤、脂肪代替物、ミセルカゼイン代替物又は起泡剤としての使用に最適であることが明らかにされている。更に、本発明のナノ粒子化ホエイタンパク質はなお、漂白剤として機能しうる状態にあり、その結果、１つの化合物によっていくつかの課題が達成されることになる。ホエイは豊富に入手可能な物質なので、ホエイを使用すれば、乳化剤、充填剤、漂白剤又は起泡剤を必要とする製品のコストは減少し、同時に、製品の栄養価は増加することになる。

本発明の方法で用いられるホエイタンパク質としては、任意の市販のホエイタンパク質単離物又は濃縮物、すなわち当該分野で公知の任意のホエイタンパク質の調製方法によって得られるホエイタンパク質、並びにそこから調製されたホエイタンパク質画分、又はβ−ラクトグロブリン（ＢＬＧ）、α−ラクトアルブミン、血清アルブミン等のタンパク質を用いることができる。特に、チーズ製造の副産物として得られるスイートホエイ、酸カゼイン製造の副産物としての酸ホエイ、牛乳精密ろ過によって得られる未処理のホエイ、又はレンネットカゼイン製造の副産物としてのレンネットホエイを、ホエイタンパク質として用いることができる。特にコスト面からは、製造後更なる分画プロセスに供されてないホエイタンパク質調製物が出発物質として好ましい。本発明は、ウシ由来のホエイ単離物に限定されないが、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ラクダ等の哺乳動物種由来のホエイ単離物に関する。本発明の方法はまた、卵タンパク質、ダイズ、穀物、油糧種子由来の、又は他の植物若しくは動物由来の、脱ミネラル化され、又は僅かにミネラル化された他の球状タンパク質にも適用される。「僅かにミネラル化された」とは、特別なミネラル強化を行うことなくホエイタンパク質濃縮物又は単離物を調製した後に、透析可能又はダイアフィルトレーション可能な遊離ミネラルが除去されて、タンパク質関連のミネラルが維持され、又は自然にミネラル化が起こることを意味するものと理解されたい。

ホエイタンパク質は、水溶液中に、溶液の総重量に対して、０．１重量％〜１２重量％、好ましくは０．１重量％〜８重量％、より好ましくは０．２重量％〜７重量％、更に好ましくは０．５重量％〜６重量％、特に１重量％〜４重量％存在することができる。

ナノ粒子化ステップの前に存在するホエイタンパク質調製物の水溶液は、各ホエイ生産過程の副産物、他のタンパク質、ガム、炭水化物等の化合物を更に含有してもよい。この溶液はまた、他の食品成分（脂肪、炭水化物、植物エキス等）を含有してもよい。このような追加的な化合物の量は、好ましくは、溶液の総重量に対して５０重量％以下、好ましくは２０重量％以下、より好ましくは１０重量％以下である。

ホエイタンパク質は、例えばカゼインと比較して１１８／１００の、より高いタンパク効率（ＰＥＲ）を有する。
ＰＥＲ＝体重増加（ｇ）／タンパク質摂取量（ｇ）

例：

ホエイタンパク質は、必須アミノ酸（ＡＡ）の優れた供給源である（４５％）。ストレス下や高齢者において必要性が増すＡＡに富み、カゼイン（０．３ｇシステイン／１００ｇタンパク質）と比較して、スイートホエイタンパク質はシステインを７倍多く、また、酸ホエイはシステインを１０倍多く含有する。システインは、グルタチオン（ＧＳＨ）合成の律速アミノ酸であり、グルタチオンは、グルタミン酸、システイン及びグリシンから成るトリペプチドである。グルタチオンは、ストレス下の生体防御において最も重要な機能を果たす。ホエイタンパク質を含む経口サプリメントは、ＨＩＶ感染患者の血漿中ＧＳＨレベルを増大させる（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．２００１年、３１、１７１〜１７８頁）。

本発明のナノ粒子は、少なくとも１００、好ましくは少なくとも１１８のＰＥＲを有する。

ホエイタンパク質、並びにその画分及び／又は主要なタンパク質は、精製された形態又は粗生成物の形態で用いることができる。好ましい実施形態では、ナノ粒子化ホエイタンパク質の調製の出発物質の塩含有量は、二価陽イオンで２．５％未満、より好ましくは２％未満である。

或いは、ｐＨ調節ステップが望ましくない場合は、ｐＨを一定に保ったままホエイタンパク質調製物のイオン強度を調節することが可能である。その場合、イオン強度は、一定のｐＨ下のナノ粒子化が可能なように、有機イオン又は無機イオンによって調節することができる。

次いで、出発物質を熱処理に供する。これに関して、ナノ粒子化ホエイタンパク質を得るには、約８０〜約９５℃、好ましくは約８２〜約８９℃、より好ましくは約８４〜８７℃の範囲、最も好ましくは約８５℃の温度を有することが重要であることが判明している。

所望の温度に達した後、最短で１０秒間、最長で３０分間、そこに（所望の温度に）維持する。ホエイタンパク質水溶液を所望の温度に維持する時間は、好ましくは１２〜２５分、より好ましくは１２〜２０分、更に好ましくは約１５分である。

本明細書において、ナノ粒子とは、１μｍ未満、好ましくは１００〜７００ｎｍの直径を有する粒子を意味するものとする。ナノ粒子の平均直径は、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）を用いて測定することができる。ここで、液体のナノ粒子化試料は、寒天ゲルチューブ中に封入した。固定は、０．１Ｍ、ｐＨ７．４のカコジル酸バッファー中２．５％グルタルアルデヒドの溶液中に浸漬して行い、また、後固定は、同バッファー中２％四酸化オスミウムの溶液を用いて行ったが、いずれの溶液も０．０４％ルテニウムレッドを含有していた。段階的なエタノール系（７０、８０、９０、９６、１００％エタノール）で脱水した後、試料をスパー樹脂（スパー／エタノール １：１、２：１、１００％）に包埋した。樹脂の重合（７０℃、４８時間）後、ライカウルトラカットＵＣＴウルトラミクロトームで準超薄切片及び超薄切片を切り出した。酢酸ウラニル及びクエン酸鉛で染色した超薄切片を、透過型電子顕微鏡（フィリップスＣＭ１２、８０ｋＶ）で検査した。

この知見によれば、ｐＨ及びイオン強度は本発明の方法における重要な因子である。Ｃａ、Ｋ、Ｎａ、Ｍｇのような遊離陽イオンが実質的に欠如しているか枯渇している、十分に透析した試料に関しては、所定の時間、５．４未満のｐＨで熱処理を行うとカードが得られ、他方、６．８を超えるｐＨでは可溶性ホエイタンパク質が生じることが判明している。従って、このかなり狭いｐＨ領域においてのみ、直径１μｍ未満のサイズの微粒子形態のホエイタンパク質が得られる。同様の微粒子形態は、等電ｐＨ未満で対称的に、すなわちｐＨ３．５〜５．０で得られる。

好ましい実施形態では、二価陽イオンの含有量が少ない場合（最初のホエイタンパク質粉末１００ｇに対して０．２ｇ未満）は、負荷電ナノ粒子を得るために、ｐＨを５．６〜６．４、より好ましくは５．８〜６．０の範囲に調節する。ホエイタンパク質源（濃縮物又は単離物）のミネラル含有量に応じて、ｐＨは８．４まで上げることができる。特に、大量の遊離ミネラル存在下で負荷電ナノ粒子を得るためには、ｐＨは７．５〜８．４、好ましくは７．６〜８．０とすることができ、また、中程度の量の遊離ミネラル存在下で負荷電ナノ粒子を得るためには、ｐＨは６．４〜７．４、好ましくは６．６〜７．２とすることができる。ｐＨは一般に、好ましくは食品グレードの酸、例えば、塩酸、リン酸、酢酸、クエン酸、グルコン酸又は乳酸の添加によって調節する。ミネラル含有量が高い場合は、ｐＨは一般に、好ましくは食品グレードのアルカリ溶液、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム又は水酸化アンモニウムの添加によって調節する。

他の好ましい実施形態では、正荷電ナノ粒子を得るために、タンパク質源のミネラル含有量に応じてｐＨが３．５〜５．０に調節された、塩を含有しない溶液中でホエイタンパク質のナノ粒子化を行う。

好ましい実施形態では、二価陽イオンの含有量がホエイタンパク質粉末中０．２％〜２．５％の場合は、ｐＨを６．３〜９．０の範囲に調節する。

他の実施形態では、ホエイタンパク質の熱処理の間のｐＨ値の実質的な変化を避けるために、ホエイタンパク質の水溶液にバッファーを添加する。原則として、バッファーは、任意の食品グレードのバッファー系、すなわち、例えば、酢酸及びその塩（酢酸ナトリウム、酢酸カリウム等）、リン酸及びその塩（ＮａＨ_２ＰＯ_４、Ｎａ_２ＨＰＯ_４、ＫＨ_２ＰＯ_４、Ｋ_２ＨＰＯ_４等）、並びにクエン酸及びその塩、から選択される。

本発明の方法によって得られるナノ粒子化ホエイタンパク質は、１μｍ未満、好ましくは１００〜９９０ｎｍ、より好ましくは直径１００〜７００ｎｍのサイズを有するが、所望の用途に応じて、ナノ粒子の割合は少なくとも８０％であり、残りの可溶性凝集体又は可溶性タンパク質の割合は２０％未満である。平均ナノ粒子径は、０．２００未満の多分散指数を特徴とする。結果的に、本発明によって得られる白色懸濁液は安定であり、ｐＨ３〜８の広い範囲で乳状の外観を呈する。

５００ｎｍでの吸光度によって測定される濁度は、１％タンパク質溶液について少なくとも３吸光度単位であるが、ナノ粒子の収率が８０％より高い場合は、１６吸光度単位に達することがある。

本発明の方法によって生産されるナノ粒子化ホエイタンパク質の純度は、残りの可溶性タンパク質の量を測定することによって得ることができる。２０℃及び２６９００ｇで１５分間の遠心分離を行うと、ナノ粒子が除去される。上清を用いて、石英キュベット中、２８０ｎｍでタンパク質量を測定する。値は、熱処理前の初期値のパーセンテージで表す。

ナノ粒子の割合＝（最初のタンパク質の量−可溶性タンパク質の量）／最初のタンパク質の量

いかなる理論にも拘束されることを望まないが、本明細書に記載の方法は、結果的に、ホエイタンパク質の、非常に小さい凝集体の形成をもたらすと考えられている。この凝集体は、所定のサイズを有するものであり、タンパク質表面に存在する排斥力及び引力の間の静電的バランスから生じる特別な変性状態にあって、観察される特性を生み出す。特に、ナノ粒子化ホエイタンパク質は完全な乳化特性及び起泡特性を有するので、タンパク質の変性状態は、疎水性相、例えば脂肪滴又は空気と、親水性相である水溶液との相互作用を可能にすると思われる。

従って、他の実施形態では、本発明はまた、乳化剤としてのナノ粒子化ホエイタンパク質の使用に関する。ナノ粒子化ホエイタンパク質は、癖のない味を有する、すなわちかかる物質の使用によって異臭が生じないことから、乳化剤としての使用に最適である。これらはまた、ミセルカゼイン代替物として使用することもできる。

本発明の方法によって得られるナノ粒子化ホエイタンパク質は、例えばムース又はアイスクリーム中、コーヒークリーマー中、又は低脂肪若しくは本質的に無脂肪の乳製品中にも存在するようなエマルション又は泡の安定化を必要とするあらゆる種類の食品の調製のために使用することができる。或いは、用途があれば、ミセルカゼイン代替物として使用することもできる。本発明のナノ粒子化ホエイタンパク質の用途が見出される製品の例としては、パスチャライズド牛乳、ＵＨＴ牛乳、加糖練乳、ヨーグルト、発酵乳、ミルクベースの発酵製品、ミルクチョコレート、ムース、泡、エマルション、アイスクリーム、発酵穀物ベースの製品、ミルクベースの粉末、乳児用フォーミュラ、栄養強化食、ペットフード、錠剤、液体細菌懸濁液、乾燥経口サプリメント、液状経口サプリメント等が挙げられる。

特に、本発明のナノ粒子化ホエイタンパク質を単独で、又は多糖（例えば、アラビアガム又はカラギーナン）等の他の活性物質と組み合わせて使用して、マトリックス（例えば、乳状の泡のマトリックス）を安定化することができる。癖のない味、漂白力、及び熱処理後の安定性を有することから、本発明のナノ粒子化ホエイタンパク質は、脱脂乳の白さ及び口当たりを改善するために使用することができる。

同じ総タンパク質含有量で乳製品の漂白力を増大することに加えて、同時に、食品マトリックス中の脂肪分を減少させることができる。この特徴は、例えば牛乳自体に由来する更なる脂肪を添加することなくミルククリーマーを添加することを可能にするものであり、本発明のナノ粒子化ホエイタンパク質の特別な有利性を表すものである。

このため、他の実施形態において、本発明はまた、本明細書に記載のナノ粒子化ホエイタンパク質を含有する、食品、栄養補助食品、栄養及び／又は医薬組成物を包含する。

以下の実施例は、本発明を例示するものであり、本発明を限定するものではない。

［実施例］
本発明のナノ粒子の調製を詳細に記載する以下の実施例を参照することによって、本発明を更に明確にする。本明細書に開示される特定の実施形態は、本発明のいくつかの態様を例示するものとして意図されているので、本明細書及び特許請求の範囲に記載の発明の範囲がこれらの実施形態によって限定されることはない。あらゆる均等な実施形態は、本発明の範囲内にあるものとして意図されている。実際、本明細書に示され、記載されたもの以外の、本発明の種々の変更は、以上の説明から当業者に明らかになるであろう。かかる変更もまた、添付の特許請求の範囲に包含されるものとして意図されている。

（実施例１：β−ラクトグロブリンのナノ粒子化）
β−ラクトグロブリン（ロットＪＥ００２−８−９２２、１３−１２−２０００）は、ダビスコ（アメリカ合衆国ミネソタ州ルシュール）から得た。限外ろ過及びイオン交換クロマトグラフィーによって、スイートホエイからタンパク質を精製した。粉末の組成は、８９．７％タンパク質、８．８５％水分、１．３６％灰分（０．０７９％Ｃａ^２＋、０．０１３％Ｍｇ^２＋、０．０９７％Ｋ^＋、０．５７６％Ｎａ^＋、０．０５０％Ｃｌ⁻）である。使用した他の全ての試薬は分析グレードであった（メルクダルムシュタット、ドイツ）。ミリＱ（登録商標）水（ミリポア）中のβ−ラクトグロブリンの溶媒和及び２０℃、２時間の攪拌によって、０．２％濃度のタンパク質溶液を調製した。次いで、ＨＣｌの添加によって、アリコートのｐＨを５．０、５．２、５．４、５．６、５．８、６．０、６．２、６．４、６．６、６．８及び７．０に調節した。溶液を２０ｍｌのガラスバイアル（アジレントテクノロジー）に充填し、シリコン／ＰＴＦＥシールを含むアルミニウムカプセルで密閉した。溶液を８５℃で１５分間加熱した（当該温度に達するまでの時間は２．３０〜３．００分）。熱処理後、試料を氷水中で２０℃まで冷却した。
生成物の目視外観（図１）は、ナノ粒子化の最適ｐＨが５．８であることを示す。

（実施例２：ホエイタンパク質単離物のナノ粒子化）
ホエイタンパク質単離物（ＷＰＩ）（バイプロ（Ｂｉｐｒｏ）（登録商標）、バッチＪＥ０３２−１−４２０）をダビスコ（アメリカ合衆国ミネソタ州ルシュール）から得た。粉末の組成を表１に示す。
ミリＱ（登録商標）水（ミリポア）中のホエイタンパク質粉末の溶媒和及び２０℃、２時間の攪拌によって、３．４％タンパク質のタンパク質溶液を調製した。最初のｐＨは７．２であった。次いで、ＨＣｌ ０．１Ｎの添加によって、アリコートのｐＨを５．６、５．８、６．０、６．２、６．４及び６．６に調節した。溶液を２０ｍｌガラスバイアル（アジレントテクノロジー）に充填し、シリコン／ＰＴＦＥシールを含むアルミニウムカプセルで密閉した。溶液を８５℃で１５分間加熱した（当該温度に達するまでの時間は２．３０〜２．５０分）。熱処理後、試料を氷水中で２０℃まで冷却した。
加熱したホエイタンパク質の濁度を５００ｎｍ及び２５℃で測定し、試料を希釈して、０．１〜３吸光度単位の範囲での測定を可能にした（分光光度計ユビコン（Ｕｖｉｋｏｎ）８１０、コントロンインストゥルメント）。最初のタンパク質濃度３．４％に対して、値を計算した。

図２に示されるように、同じ試料について１０分の間隔の範囲内で、５００ｎｍで測定した吸光度が安定した（初期値の５％未満の変動）ときに、ナノ粒子化のｐＨに達したとみなした。この生成物に関して、ナノ粒子化の最適ｐＨは６．０〜６．２であった。熱処理前に調節したこのｐＨに関して、安定した濁度は２１であり、遠心分離後に２８０ｎｍでの吸光度によって評価した残りの可溶性タンパク質は１．９％であった。最初のタンパク質の４５％はｐＨ６．０でナノ粒子に変わったと結論付けることができる。

（実施例３：ナノ粒子の顕微鏡観察）
（ナノ粒子の生成）
ミリＱ（登録商標）水（ミリポア）中のホエイタンパク質粉末（ＷＰＩ９０バッチ９８９／２、ラクタリス、フランス、レチエー）の溶媒和によって、２％タンパク質のタンパク質溶液を調製し、２０℃で２時間攪拌した。次いで、ＨＣｌ ０．１Ｎ又はＮａＯＨ ０．１Ｎを用いて、アリコートのｐＨを調節した。溶液を２０ｍｌガラスバイアル（アジレントテクノロジー）に充填し、シリコン／ＰＴＦＥシールを含むアルミニウムカプセルで密閉した。溶液を８５℃で１５分間加熱した（当該温度に達するまでの時間は２．３０〜２．５０分）。熱処理後、試料を氷水中で２０℃まで冷却した。この生成物に関して、ナノ粒子化の最適ｐＨは７．４であった。

（顕微鏡観察）
寒天ゲルチューブ中に液体ナノ粒子化試料を封入した。固定は、０．１Ｍ、ｐＨ７．４カコジル酸バッファー中２．５％グルタルアルデヒドの溶液中に浸漬して行い、また、後固定は、同バッファー中２％四酸化オスミウムの溶液を用いて行ったが、いずれの溶液も０．０４％ルテニウムレッドを含有していた。段階的なエタノール系（７０、８０、９０、９６、１００％エタノール）で脱水した後、試料をスパー樹脂（スパー／エタノール １：１、２：１、１００％）に包埋した。樹脂の重合（７０℃、４８時間）後、ライカウルトラカットＵＣＴウルトラミクロトームで準超薄切片又は超薄切片を切り出した。酢酸ウラニル及びクエン酸鉛で染色した超薄切片を、透過型電子顕微鏡（フィリップスＣＭ１２、８０ｋＶ）で検査した。
ＴＥＭ顕微鏡写真を図３に示す。得られたナノ粒子は、直径２００ｎｍの球形の形状を呈している。

（粒度分布）
ｐＨ４．２５（約＋２５ｍＶのゼータ電位で正に帯電）及びｐＨ６．０（約−３０ｍＶのゼータ電位で負に帯電）、８５℃、１５分間の１重量％β−ラクトグロブリン分散液の熱処理によって得られたナノ粒子について、ナノ粒子の強度ベースの粒度分布を測定した。ナノ粒子のｚ平均流体力学的直径はｐＨ４．２５で２２９．３ｍｍ、ｐＨ６．０で２２７．２であった。動的光散乱を用いて、β−ＬＧ及びホエイタンパク質凝集体を追跡した。６３３ｎｍのレーザー放射源及び４．０ｍＶの動力を備えたナノサイザーＺＳ装置（マルバーンインスツルメンツ、イギリス）を用いた。装置は後方散乱配置で使用し、検出は１７３°の散乱角で行った。これにより、濁った試料に見られる複数の散乱シグナルのかなりの減少が可能となる。方眼のある石英セル（ヘルマ、光路１ｃｍ）中に試料を配置した。光線の光路を、試料濁度（減衰）に応じて、装置で自動的に設定した。散乱強度の揺らぎから、自己相関関数を計算した。結果を図６に示す。これは、平均的粒子が、非常に狭い多分散指数（＜０．２００）を特徴としていることを示す。結果的に、本発明によって得られる白色懸濁液は、ｐＨ３〜８の広い範囲で、安定であり、乳状の外観を呈する。

（実施例４：一定のｐＨでのβ−ラクトグロブリンのナノ粒子化）
２％β−ラクトグロブリンの水溶液を用いる条件で、実施例１に記載される方法を繰り返した。この溶液のｐＨは、アルギニンＨＣｌ溶液を添加して、５〜２００ｍＭの最終塩濃度、及び１％の最終β−ラクトグロブリン濃度を得た後、７．０に調節されていた。続いて、熱処理（８０℃、１０分、昇温に約２分）を行ってナノ粒子を生成させた。

結果を図４に示す。この結果は、約５０〜７０ｍＭのイオン強度範囲でのみ、ナノ粒子化ホエイタンパク質の存在を示す実質的な濁度が観察されることを示している。

（実施例５：漂白剤の調製）
未処理のホエイタンパク質（ＷＰＩ９５バッチ８４８、ラクタリス、８重量％水溶液）を、実施例２に従って処理した。２ｍｍ測定セルを備えたマクベスＣＥ−ＸＴＨ Ｄ６５ １０°ＳＣＥ装置を用いて、透過−反射モードで、得られた生成物の明度（Ｌ）を測定した。得られた明度はＬ＝７４．８であり、高脂肪乳のＬ＝７４．５の値に匹敵するものだった。

（実施例６：コーヒークリーマーの調製）
未処理のホエイタンパク質（Ｂｉｐｒｏ（登録商標）、ロットＪＥ０３２−１−４２０、０．５重量％水溶液）を、Ｂｉｐｒｏ（登録商標）についてのナノ粒子化ｐＨ６．０に調節された５０ｍＭリン酸クエン酸バッファー存在下、５０℃で、１０重量％部分水添パーム油、１４重量％マルトデキストリン（ＤＥ２１）と混合した。ラニーホモジナイザーを用いて４００／５０バールで混合物を均質化し、続いて１５分間、８５℃で熱処理した。

得られたエマルションは、４℃の保存条件下で、少なくとも１カ月の期間に渡って高い安定性を示した。そして、１５％の脂肪分及びＬ＝７５．９の明度を有する参照液体クリーマー（クレームアキャフェ（Ｃｒｅｍｅ ａ Ｃａｆｅ）、スイス、エミ）と比較して、Ｌ＝７８の白さを生じた。

（実施例７：水性泡の調製）
最終β−ラクトグロブリン濃度が１重量％、及びアルギニンＨＣｌが６０ｍＭとなるように、未処理のβ−ラクトグロブリン（Ｂｉｏｐｕｒｅ、ダビスコ、ロットＪＥ００２−８−９２２、２重量％水溶液）を１２０ｍＭアルギニンＨＣｌ溶液と混合した。次いで、１Ｎ ＨＣｌの添加によって、ｐＨを７．０に調節した。次いで、最初のβ−ラクトグロブリンの９０％が、１３０ｎｍのｚ平均粒径を有するナノ粒子に変換されるように、８０℃で１０分間、混合物を熱処理した。ここで、ナノ粒子の直径は、ナノサイザーＺＳ装置（マルバーンインスツルメンツ、イギリス）を用いて測定した。試料を石英キュベットに注ぎ、散乱光の変動を自動的に記録した。得られた自己相関関数から、キュムラント法を用いて粒子の拡散係数を求め、次いで、ストークス−アインシュタインの法則を用いてｚ平均流体力学的直径を求めた。この測定において、溶媒の屈折率は１．３３、ナノ粒子の屈折率は１．４５とした。次いで、得られたβ−ラクトグロブリンナノ粒子分散液の５０ｍＬを、ガラスフリット（１２〜１６μｍの泡を発生する。）を通じて窒素散布を行って起泡し、標準化されたＦｏａｍｓｃａｎ（商標）（ＩＴコンセプト（ＩＴＣｏｎｃｅｐｔ））装置を用いて１８０ｃｍ^３の泡容積を生じさせた。次いで、泡の容積安定性を、画像解析を用いて２６℃で経時的に追跡し、アルギニンＨＣｌなしで同様の条件で処理したβ−ラクトグロブリン（ナノ粒子は形成されなかった。）で得られた泡の安定性と比較した。図５は、β−ラクトグロブリンナノ粒子の存在によって泡容積安定性が大いに向上したことを示している。

（実施例８：ホエイベースの発酵乳製品−発酵試験）
（材料）
ホエイタンパク質単離物（ＷＰＩ）（Ｂｉｐｒｏ（登録商標））をダビスコ（アメリカ合衆国ミネソタ州ルシュール）から得た（タンパク質濃度９２．７％）。
噴霧乾燥ホエイ透過物（Ｖａｒｉｏｌａｃ８３６）：ラクトース濃度：８３％−ミネラル：８％
乳酸５０％
食用ラクトース（ラクタリス）
脱イオン水

（方法）
タンパク質濃度が４．６％、すなわち３リットルの溶液に対してＷＰＩ粉末が１５４．５ｇ、水が２８４５．５ｇとなるように、バイプロ（Ｂｉｐｒｏ）（登録商標）粉末を脱イオン水中に溶解した。水和時間は３時間であった。水和後、別々の試験に用いるために、この溶液を２００ｍｌの試料に分けた。

各溶液について、５０％の乳酸を添加し、加熱前にｐＨを調節した。二重釜で８５℃まで試料を加熱し、この温度で１５分間維持した。加熱後、溶液を４０℃で冷却し、ラクトバチルスブルガリクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）及びストレプトコッカスサーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）を接種した。６℃の低温室に置く前に、試料を５時間３０分、４１℃のスチームルームに置いた。

結果を表３に示す。

（実施例９：脂肪分の減少したホエイタンパク質増強アイスクリーム）
（材料）
タンパク質含有量が９０％のホエイタンパク質単離物（ＷＰＩ、ラクタリスのプロラクタ（Ｐｒｏｌａｃｔａ）９０（登録商標）、フランス、レチエー）
タンパク質含有量が３５％の脱脂粉乳
スクロース
マルトデキストリンＤＥ３９
無水乳脂
乳化剤
脱イオン水
食用塩酸 １Ｍ

（方法）
二重ジャケット８０Ｌタンクを用いて、泡の形成を避けるために穏やかに攪拌しながら、脱イオン水に５０℃でプロラクタ９０（登録商標）粉末を分散させて、タンパク質濃度を９．６７重量％とした。すなわち、３．３ｋｇのプロラクタ９０（登録商標）を、３１．０５ｋｇの脱イオン水に分散させた。１時間の分散後、ＨＣｌの添加によって、分散液のｐＨをナノ粒子化ｐＨに調節した。ホエイタンパク質ナノ粒子を生成させるために、分散液の温度を８５℃まで上昇させ、１５分間維持した。１５分後、温度を５０℃まで下げ、ナノ粒子分散液に更なる成分（すなわち、脱脂粉乳、マルトデキストリンＤＥ３９、スクロース、乳化剤及び無水乳脂）を連続的に添加した。ミックスの最終的な量は５０ｋｇであり、全固形分が３９．５％、脂肪分が５重量％であった。３０分の水和後、ミックスを二段階均質化し（８０／２０バール）、一晩のエージングの前に低温殺菌（ｐａｓｔｅｕｒｉｓｅ）した（８６℃／３０秒）。
翌日、ホイヤーＭＦ５０装置を用いてアイスクリームミックスを１００％のオーバーランで冷凍し、−４０℃で硬化させてから、−２０℃で保存した。最終的なアイスクリームは、アイスクリームミックスベースでタンパク質８重量％（カゼイン２０％、ホエイタンパク質８０％）及び脂肪５重量％を含有していた。

（実施例１０：噴霧乾燥によって得られる粉末ホエイタンパク質ナノ粒子）
（材料）
タンパク質含有量が９０％のホエイタンパク質単離物（ＷＰＩ、ラクタリスのプロラクタ（Ｐｒｏｌａｃｔａ）９０（登録商標）、フランス、レチエー）
食用ラクトース
マルトデキストリンＤＥ３９
脱イオン水
食用塩酸 １Ｍ

（方法）
二重ジャケット１００Ｌタンクを用いて、泡の形成を避けるために穏やかに攪拌しながら、脱イオン水に５０℃でプロラクタ９０（登録商標）粉末を分散させて、タンパク質濃度を１０重量％とした。すなわち、１１ｋｇのプロラクタ９０（登録商標）を、８９ｋｇの脱イオン水に分散させた。１時間の分散後、ＨＣｌの添加によって、分散液のｐＨをナノ粒子化ｐＨ（ここでは約６．３）に調節した。ホエイタンパク質ナノ粒子を生成させるために、分散液の温度を８５℃まで上昇させ、１５分間維持した。１５分後、温度を５０℃まで下げ、１０重量％ホエイタンパク質ナノ粒子分散液を５０ｋｇの２つのバッチに分けた。最初の試験において、２０ｋｇのラクトースを、５０ｋｇのナノ粒子分散液に５０℃で分散させ、３０分間攪拌した。同様に、２０ｋｇのマルトデキストリンＤＥ３９を、残りの５０ｋｇのホエイタンパク質ナノ粒子分散液に添加した。
次いで、ニロＳＤ６．３Ｎ塔に１５Ｌ／時間の流速で２つの混合物を噴霧して乾燥した。空気入力温度は１４０℃であり、空気出力温度は８０℃であった。得られた粉末の水分含有量は５％未満であった。
噴霧乾燥の前後に、動的光散乱を用いて、ホエイタンパク質ナノ粒子のサイズを水中のラクトース及びマルトデキストリン（ＤＥ３９）存在下で測定した。ホエイタンパク質ナノ粒子の粘度の希釈形態に合うように、噴霧乾燥前の分散液の希釈、又は粉末の還元によって総タンパク質濃度を０．４重量％に設定した。ナノサイザーＺＳ装置（マルバーンインスツルメンツ）を用いて、２０の測定値からナノ粒子直径の平均値を求めた。

ラクトース及びマルトデキストリン（ＤＥ３９）存在下でホエイタンパク質ナノ粒子について測定した粒子径は、それぞれ３１０．４ｎｍ及び３０６．６であった。粉末の還元後、それぞれの直径は、２６５．３ｎｍ及び２６８．５であった。これらの測定値から、ホエイタンパク質ナノ粒子が、噴霧乾燥に関して物理的に安定であることが確認された。その結果は、１％リンタングステン酸の存在下、ｐＨ７のネガティブ染色を用いて行った、０．１重量％ホエイタンパク質ナノ粒子の水中分散液のＴＥＭ顕微鏡観察によって裏付けられた。８０ｋＶで作動するフィリップスＣＭ１２透過型電子顕微鏡を用いた。噴霧乾燥前の溶液中、及び噴霧乾燥粉末の還元後の溶液中で、ホエイタンパク質ナノ粒子を観察した。形態及び構造の差異は検出できなかった。

β−ラクトグロブリンのナノ粒子化に対するｐＨ及び熱処理の効果を示す実験の結果を示す図である。 ５００ｎｍでの濁度測定値を用いて、商業的調製物（バイプロ（Ｂｉｐｒｏ）（登録商標）、バッチＪＥ０３２−１−４２０）に関するナノ粒子化のｐＨを決定する方法を示す図である。 ｐＨ７．４でのナノ粒子化ホエイタンパク質（２重量％、ＷＰＩ９５、ラクタリス）の透過型電子顕微鏡写真である。スケールバーは２００ｎｍである。 ７．０の一定のｐＨでのタンパク質ナノ粒子の形成に対するイオン強度（アルギニンＨＣｌ）の影響を評価する実験の結果を示す図である。 ６０ｍＭアルギニンＨＣｌの存在下、ｐＨ７．０で１重量％β−ラクトグロブリンナノ粒子（ダビスコ）によって安定化された泡の容積安定性（ＦＶＳ）を、非ナノ粒子化β−ラクトグロブリンと比較して示す図である。 ｐＨ４．２５（約＋２５ｍＶのゼータ電位で正に帯電）及びｐＨ６．０（約−３０ｍＶのゼータ電位で負に帯電）、８５℃、１５分間の１重量％β−ラクトグロブリン分散液の熱処理によって得られたナノ粒子の、強度ベースの粒度分布を示す図である。ナノ粒子のｚ平均流体力学的直径はｐＨ４．２５で２２９．３ｍｍ、ｐＨ６．０で２２７．２であった。ネガティブ染色の後にＴＥＭによって得られたナノ粒子の対応する顕微鏡写真を示す。スケールバーは１μｍである。

Claims (15)

1. 二価陽イオンを含有するホエイタンパク質の水溶液のｐＨを５．８〜６．０に調節するステップと、当該二価陽イオンを含有するホエイタンパク質の水溶液を、１２〜２５分の時間、８２℃〜８９℃の温度下に置いて、球形負荷電ナノ粒子化ホエイタンパク質の分散液を得るステップと、を含み、前記ホエイタンパク質源が、β−ラクトグロブリン（ＢＬＧ）である、負荷電ナノ粒子化ホエイタンパク質の生産方法。
2. ミネラルを含有するホエイタンパク質の水溶液のｐＨを７．５〜８．４又は６．４〜７．４に調節するステップと、当該ミネラルを含有するホエイタンパク質の水溶液を、１０秒〜３０分の時間、８０℃〜９５℃の温度下に置いて、球形負荷電ナノ粒子化ホエイタンパク質の分散液を得るステップと、を含み、前記ホエイタンパク質源が、β−ラクトグロブリン（ＢＬＧ）である、負荷電ナノ粒子化ホエイタンパク質の生産方法。
3. ホエイタンパク質の水溶液中のホエイタンパク質の量が、溶液の総重量に対して、０．１重量％〜１２重量％、好ましくは０．１重量％〜８重量％、より好ましくは０．２重量％〜７重量％、更に好ましくは１重量％〜４重量％である、請求項１又は２に記載の方法。
4. ｐＨを、食品グレードの酸及び／又は食品グレードのアルカリ溶液の添加によって調節する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
5. ホエイタンパク質の水溶液にバッファーを添加するステップを更に含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
6. ホエイタンパク質の水溶液が、ガム、脂肪、炭水化物及び植物エキスから選ばれる追加の化合物を含有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
7. 追加の化合物が、ホエイタンパク質の水溶液の総重量に対して５０重量％以下である、請求項６に記載の方法。
8. 乾燥するステップを更に含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
9. 請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法によって得られ、１μｍ未満の直径の粒子サイズを有する、負荷電ナノ粒子化ホエイタンパク質。
10. 平均ナノ粒子径が、０．２００未満の多分散指数を有する、請求項９に記載の負荷電ナノ粒子化ホエイタンパク質。
11. 少なくとも１１８のタンパク効率を有する、請求項９又は１０に記載の負荷電ナノ粒子化ホエイタンパク質。
12. 食品、栄養補助食品又は栄養組成物の調製のための、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の負荷電ナノ粒子化ホエイタンパク質の使用。
13. コーヒークリーマー、ヨーグルト、パスチャライズド牛乳、ＵＨＴ牛乳、加糖練乳、発酵乳、ミルクベースの発酵製品、ミルクチョコレート、ムース、泡、エマルション、アイスクリーム、ミルクベースの粉末、乳児用フォーミュラ、栄養強化食、ペットフード、又は錠剤、乾燥経口サプリメント、液状経口サプリメントのための、請求項１２に記載の使用。
14. 請求項９〜１１のいずれか一項に記載の負荷電ナノ粒子化ホエイタンパク質を含有し、食品、栄養補助食品及び栄養組成物から選ばれる組成物。
15. コーヒークリーマー、ヨーグルト、発酵乳、ミルクベースの発酵製品、ムース、アイスクリーム、ミルクベースの粉末、乳児用フォーミュラ、栄養強化食、ペットフード、又は錠剤、乾燥経口サプリメント、液状経口サプリメントである、請求項１４に記載の組成物。

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