JP4884678B2 - ヒト歯髄細胞からの象牙質再生方法 - Google Patents

Description

本発明は、ヒト歯髄細胞から象牙芽細胞への分化誘導方法、及び象牙質の再生方法に関する。より詳細には、本発明は、ヒト歯髄細胞を、担体の存在または非存在下、１，２５（ジヒドロキシ）ビタミンＤ₃を添加しながら三次元的に高密度で培養し、象牙芽細胞に分化させることによる象牙質再生方法に関する。本発明はさらに、該細胞を担体等と培養および／または移植することにより象牙質を再生する方法に関する。本発明はさらに、上記方法により再生された象牙質に関する。本発明はさらに、上記方法により分化誘導された象牙芽細胞および／または再生された象牙質を用いて歯科患者を治療する方法に関する。

現代社会は高齢化社会であり、数年後には日本国民人口の約20％が65歳以上の高齢者になることが予想されている。これら高齢者の大多数は、一部又は全部の歯牙を喪失しており、多くの人は可綴式義歯（いわゆる入れ歯）を使用している。従来の義歯は、着脱が必要で装着感もよくないなどの実際的問題のみならず、心理的にも老化の象徴といった印象があり、できれば義歯を使用したくないというのが患者の一般的認識である。さらに、全ての歯牙を喪失した場合に、総義歯を装着すると、その咀嚼能力は通常の天然歯牙の約5分の1となることが知られている。さらに、脳に対する咀嚼刺激は痴呆防止の効果があり、咀嚼力の低下は痴呆の促進になることが明らかになってきている。

歯牙喪失の理由としてう蝕や歯周疾患が挙げられる。重度のう蝕により歯髄炎や歯髄壊死を起こした歯牙を温存するための治療としては根管治療が広く行なわれている。これはう蝕により感染した歯髄組織を除去し、人工的な薬剤で充填させる治療法であるが、根管が複雑な形状をしているために根管内を完全に密閉することが出来ず、根管及び象牙細管内の細菌を完全に除去できていない場合、二次感染を起こし再度治療をしなければならなく、根管治療を行った歯牙の寿命は短いと言われている。歯牙を長期間維持するためには歯髄を可及的に温存し、根管治療の成功率を上げる必要がある。これらの問題を解決するためにも天然の象牙質を再生させれば完全に密閉することができるようになり、髄腔の穿孔やう蝕の治療による露髄部を閉鎖させることや、根管治療での充填材としても利用することが可能となる。

天然の象牙質を再生させて治療に使用する方法が提案され、検討が行なわれている。例えば、非特許文献1には、培養ヒト歯髄細胞をハイドロキシアパタイト（以下、HApと略す）とリン酸三カルシウム（以下、β−TCPと略す）の複合体の粉体に播種した試料をヌードマウス皮下へ移植して6週間後に摘出することが開示されている。そして、摘出後のヘマトキシリン／エオシン染色像から硬組織の形成が確認され、さらにこの試料から抽出したRNAを、RT-PCRを用いて評価したところ、象牙芽細胞の分化マーカーのmRNAが発現していること、すなわち、得られた硬組織が象牙質様組織であったことが開示されている。ただし、形成された硬組織の量は非常に少なく、臨床応用にはより多量の象牙質再生が求められる。

さらに非特許文献２には、ヒト歯髄細胞に１，２５−（ジヒドロキシ）ビタミンＤ₃とＴＧＦ−βを添加することで、硬組織形成の一指標であるアルカリホスファターゼ活性が上昇することが示されている。しかしながら、非特許文献２におけるアルカリホスファターゼ活性は不十分なものであり、また、ＴＧＦ−βなどのペプチド性因子は高価で供給性に問題がある上、速やかに失活するか、もしくは至適濃度を維持することが困難であり、実用上満足できる方法ではない。

また、非特許文献３及び非特許文献４では、ウシ、ブタ及びイヌ歯髄細胞にBMP2を添加しつつペレット状で培養することにより、象牙質が形成できることが示されているが、ヒト歯髄細胞については全く示されていない。また、BMP2などのペプチド性因子は高価で供給性に問題がある上、速やかに失活するか、もしくは至適濃度を維持することが困難であり、実用上満足できるものではない。更に、BMP2等の因子は、動物種により効果が異なる場合も多い。実際、非特許文献５では、ヒト歯髄細胞にBMP2を添加して培養した場合の効果が記載されているが、硬組織形成の一指標であるALPase活性を上昇させる効果は見られるものの、無添加の場合の２倍程度と不十分である上、フォンコッサ染色の結果から、細胞外基質のミネラル化（硬組織形成）が見られないことも記載されている。

S.Gronthosら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2000,5;97(25)：13625-30 P.Pavasantら、Archives of Oral Biology,2003,48,717-722 庵原ら、日歯保存誌,2003,46(5),654-665 K.Ioharaら、J.Dent.Res.,2004,83(8),590-595 T.Saitoら、J.Endodontics,2004,30(4),205-208

本発明は、上記した従来技術の問題点を解消することを解決すべき課題とした。即ち、本発明は、より効率的にヒト歯髄細胞から象牙質を形成する象牙芽細胞に分化させる方法を提供することを解決すべき課題とした。また、本発明は、う蝕などの歯科疾患への臨床応用に可能なほど多量な象牙質を再生する方法を提供することを解決すべき課題とした。さらに本発明は、分化誘導された象牙芽細胞又は再生した象牙質を用いてう蝕などの歯科疾患を治療する方法を提供することを解決すべき課題とした。

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、ヒト歯髄細胞又はヒト歯髄細胞に分化可能な細胞を、担体の存在または非存在下、１，２５（ジヒドロキシ）ビタミンＤ₃を添加しながら三次元的に高密度で培養することにより象牙質を形成する象牙芽細胞に効率良く分化させ、象牙質を再生できることを実証した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。

即ち、本発明によれば、分離したヒト歯髄細胞又はヒト歯髄細胞に分化可能な細胞のうち少なくとも１種類を、１，２５（ジヒドロキシ）ビタミンＤ₃を添加しながら三次元的に高密度で培養することを含む、分化誘導された象牙芽細胞の製造方法が提供される。

好ましくは、細胞を担体上で培養する。
好ましくは、培養時の細胞密度は２×１０⁴個／ｍｍ³〜５×１０⁶個／ｍｍ³である。
好ましくは、１，２５（ジヒドロキシ）ビタミンＤ₃の培地中の濃度が１×１０^-10〜１×１０^-5ｍｏｌ／ｌである。

本発明の別の側面によれば、上記方法により得られる分化誘導された象牙芽細胞が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、上記方法により得られる分化誘導された象牙芽細胞を培養することを含む、象牙質の再生方法が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、上記方法により再生された象牙質が提供される。

本発明のさらに別の側面によれば、上記方法により得られる分化誘導された象牙芽細胞、又は上記方法により再生された象牙質を患者に移植することを含む、歯科患者の治療方法が提供される。

本発明の方法を利用して、培地中で象牙質を形成してから、あるいは象牙質を形成するように分化誘導された象牙芽細胞を必要に応じ担体等と共に歯科患者に移植することにより、欠損部若しくは根管を充填できるよう象牙質を再生させることができる。この結果、歯牙を維持することが可能となり二次感染の確率の低い極めて有効な治療となる。また、自らの歯牙を長期間維持できることから、患者のQuality of Life（QOL）の向上に大きく貢献する。

以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本実施の形態において、象牙芽細胞への分化誘導方法及び象牙質の再生方法は、ヒト歯髄細胞またはヒト歯髄細胞に分化可能な細胞のうち少なくとも１種類を、担体の存在または非存在下、１，２５（ジヒドロキシ）ビタミンＤ₃を添加しながら三次元的に高密度で培養することを特徴とする。

本発明においてヒト歯髄細胞又はヒト歯髄細胞に分化可能な細胞は、1種類の細胞から成る単一の細胞として培養しても良いし、2種類以上の細胞からなる細胞混合物として培養しても良い。

ヒト歯髄細胞又はヒト歯髄細胞に分化可能な細胞は、ヒトの抜去歯等から採取することができる。ヒト歯髄細胞は、例えばAbout I.,他 Experimental cell research,258,33-41,2000に記載の方法に従って採取することができる。また、ヒト歯髄細胞に分化可能な細胞は、例えば以下の方法で採取することができる。埋伏歯を無菌的に取り出し、Phosphate Buffered Saline（以下PBSと略す）溶液などの適当な保存液で保存する。歯牙の中の石灰化した部分を取り除き、メスにて組織を小片にして、PBS溶液などを用いて組織を洗浄する。次いで、コラゲナーゼやディスパーゼを用いて組織を酵素処理することが好ましい。酵素処理後、ピペッティング操作と遠心操作により細胞を回収することができる。

細胞を三次元的に高密度化するには、例えば、細胞を培地等に懸濁した液を遠心分離（１５００rpm，５分間）した後、上澄みを静かに除去し、新たな培地を加えてペレット培養することにより可能である。また、得られたペレットに例えばゲル状の材料を少量添加することで、三次元的に高密度で担体中に播種された細胞を得ることもできる。この際、ペレットが大きいと内部まで栄養供給ができず、ペレット内部の細胞が死滅する可能性が高い。更に得られたペレットを少量の培地等で懸濁し、各種担体上に播種することも可能である。

細胞の密度は、２×１０⁴個／ｍｍ³〜５×１０⁶個／ｍｍ³、より好ましくは５×１０⁴個／ｍｍ³〜１×１０⁶個／ｍｍ³の範囲である。更に、細胞を低密度で担体上に播種し、予め増殖させて前記範囲内まで高密度化した後に使用することも可能である。

細胞の培養は、動物細胞の培養に用いる通常の血清入り培地や無血清培地を用いて、通常の動物細胞の培養条件（例えば、室温から37℃の温度；5％CO₂インキュベーター内など）の下で行なうことができる。また、培地には、必要に応じ、アスコルビン酸及びその塩類、デキサメタゾン、β−グリセロホスフェート及びその塩類などの添加剤を加えることも可能である。アスコルビン酸及びその塩類を使用する場合の添加量は、好ましくは培地中に10μmol/l〜500μmol/l、より好ましくは20μmol/l〜200μmol/lである。デキサメタゾンを使用する場合の添加量は、好ましくは培地中に１×１０^-9〜１×１０^-6ｍｏｌ／ｌ、より好ましくは１×１０^-8〜１×１０^-7ｍｏｌ／ｌである。また、β−グリセロホスフェート及びその塩類を使用する場合の添加量は、好ましくは培地中に１〜３０ｍｍｏｌ／ｌ、より好ましくは２〜２０ｍｍｏｌ／ｌである。培養の形態は特に限定されないが、例えば、静置培養で行なうことができる。

１，２５（ジヒドロキシ）ビタミンＤ₃の添加量は、培地中に１×１０^-10〜１×１０^-5ｍｏｌ／ｌ、より好ましくは１×１０^-8〜１×１０^-5ｍｏｌ／ｌ、さらに好ましくは１×１０^-7〜１×１０^-6ｍｏｌ／ｌである。

本発明において、細胞の培養は担体上で行ってもよいし、担体無しで培養してもよい。担体としては、象牙質の形成に必要とされる時間を耐久することができ、かつその後、速やかに吸収されるものが好ましい。さらに、細胞と高い親和性を有する材料からなる担体を使用することが好ましい。

担体の素材は、上記特性を満たすものであれば特に限定されないが、例えば、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリ（ＤＬ−ラクチド−コ−グリコシド）（ＰＬＧＡ）、ポリ乳酸（ＰＬＬＡ）、ポリカプロラクトンなどの合成高分子材料、またはコラーゲン、ゼラチン、フィブリンなどの蛋白質材料、あるいはヒアルロン酸及びその塩、アルギン酸及びその塩、象牙、サンゴなどの天然由来材料を使用することもできる。さらに、β−ＴＣＰ、HAｐ、β−ＴＣＰ／HAｐ複合体などの無機材料も使用することができる。

ＰＧＡ、ＰＬＬＡ、ＰＬＧＡまたはポリカプロラクトンなどの合成材料を使用する場合には、細胞の接着及び増殖性を高めるために、表面にコラーゲン溶液又はフィブロネクチン溶液などをコートして使用することもできる。

上記の担体の形態としては、メッシュ形態、スポンジ形態、ゲル形態、不織布形態、粒状多孔質形態などが可能であるが、三次元的に高密度で培養するためには、スポンジ形態、ゲル形態、粒状多孔質形態の担体がより好ましい。

本発明の方法では、ヒト歯髄細胞又はヒト歯髄細胞に分化可能な細胞を担体に播種して、または必要に応じて播種後培養し、該培養細胞を担体と一緒に直接患者に移植しても良い。あるいはさらに好ましくは、分離したヒト歯髄細胞又はヒト歯髄細胞に分化可能な細胞を培養して増殖させた後に担体に播種して、または必要に応じて播種後培養し、次いで該培養細胞を担体と一緒に移植し、体内で象牙質を再生させることができる。

あるいは、分離したヒト歯髄細胞又はヒト歯髄細胞に分化可能な細胞を担体に播種して増殖させた後に担体に播種して、または必要に応じて播種後培養し、次いで該培養細胞を担体と一緒に移植動物に移植し、該移植動物の体内で象牙質を再生させることもできる。移植動物の種類は特に限定されないが、好ましくは哺乳動物であり、例えば、マウス（ヌードマウスなど）、ラット（ヌードラッドなど）などのげっ歯類動物を使用することができる。移植の部位は特に限定されず、例えば、背部皮下などが挙げられる。

上記した本発明の方法により分化誘導された象牙芽細胞及び本発明の方法により再生した象牙質は、う蝕などの歯科疾患を有する患者に移植することによって、該歯科患者を治療することができる。即ち、象牙質を用いる歯科疾患の治療方法、例えば、髄腔の穿孔や露髄部の治療、根管治療などへの適用も本発明の範囲内のものである。歯科患者に移植された後も象牙質の成長を継続させることにより、象牙質を形成させることができる。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。

比較例１：低密度で播種したヒト歯髄細胞のin vivo実験
医師によるインフォームドコンセントの得られた患者（26歳女性）の智歯を使用した。治療のため抜歯した智歯をタービンで削り、歯髄を露出させ、無菌的に歯髄組織を採取し、10％抗生剤入りPBS溶液にて保存した。

メスにて歯髄組織を約2mmの小片にし、PBS溶液にて5回洗浄した。

2mg/mlコラゲナーゼをDMEM培地に溶解した酵素溶液を用いて、洗浄した組織を50分間酵素処理した。得られた組織を25ml用のピペットを用いて10分間ピペッティングした。25mlの上澄み液を遠心分離して細胞を回収した。得られた細胞をDMEM培地とNutrient Mixture F-12を１：１で混合した（以下DMEM/F12と略す）培地に15％血清を入れた培地にて5回洗浄した後、70μmセルストレイナーでろ過し、遠心分離することによって細胞を回収した。

回収した細胞を15％血清入りDMEM/F12培地に100μmol/lの濃度でL-Ascorbic acid 2-phosphate Sesquimagnesium salt （以下Ascと略す）を添加して37℃、5％CO₂条件下で培養を行ない、2回継代した細胞をトリプシン-EDTAにて細胞培養用フラスコから剥離した後、15％血清入りDMEM/F12培地にて1.0×10⁶個/100μlの細胞懸濁液に調整し、96穴プレートでHAp/β-TCP多孔体130mg（日本特殊陶業製）に播種をした後（密度；８．８５×１０³個／ｍｍ³）、37℃、5％CO₂条件下で静置培養を1時間行なった。

移植動物としては、ヌードマウスKSNを用いた。ヌードマウス背部皮膚を切開し、細胞を播種した担体を皮下に入れ、皮膚を縫合した。

移植後12週にて試料を採取した。摘出した試料は、4％Paraformaldehyde（以下PFAと略す）溶液にて固定し、常法に従ってパラフィンに包埋して連続組織切片を作成した。その後、切片にヘマトキシリン-エオジン染色（以下HE染色と略す）を施し、組織学的に観察した。

移植12週で摘出した移植体は生体に吸収されることなく原型を維持していた。また、HE染色した組織を観察した結果、細胞は生存しているが、硬組織の形成は認められなかった（図１）。

比較例２：１，２５（ジヒドロキシ）ビタミンＤ₃を添加し、低密度で播種したヒト歯髄細胞のin vivo実験
医師によるインフォームドコンセントの得られた患者（26歳女性）の智歯を使用した。治療のため抜歯した智歯をタービンで削り、歯髄を露出させ、無菌的に歯髄組織を採取し、10％抗生剤入りPBS溶液にて保存した。

メスにて歯髄組織を約2mmの小片にし、PBS溶液にて5回洗浄した。

2mg/mlコラゲナーゼをDMEM培地に溶解した酵素溶液を用いて、洗浄した組織を50分間酵素処理した。得られた組織を25ml用のピペットを用いて10分間ピペッティングした。25mlの上澄み液を遠心分離して細胞を回収した。得られた細胞をDMEM/F12培地に15％血清を入れた培地にて5回洗浄した後、70μmセルストレイナーでろ過し、遠心分離することによって細胞を回収した。

回収した細胞を15％血清入りDMEM/F12培地に100μmol/lの濃度でAscを添加して37℃、5％CO₂条件下で培養を行ない、2回継代した細胞に分化誘導因子として100μmol/l Asc、10^-6mol/l１，２５（ジヒドロキシ）ビタミンD₃、10mmol/l Glycerol 2-phosphate disodium salt hydrate（以下β-Glyと略す）、10^-8mol/ l Dexamethasoneを15％血清入りDMEM/F12培地に添加した培地で14日間培養後、トリプシン-EDTAにて細胞培養用フラスコから剥離し、15％血清入りDMEM/F12培地にて1.0×10⁶個/100μlの細胞懸濁液に調整し、96穴プレートでHAp/β-TCP多孔体130mg（日本特殊陶業製）に播種をした後（密度；８．８５×１０³個／ｍｍ³）、37℃、5％CO₂条件下で静置培養を1時間行なった。

移植動物としては、ヌードマウスKSNを用いた。ヌードマウス背部皮膚を切開し、細胞を播種した担体を皮下に入れ、皮膚を縫合した。

移植後12週にて試料を採取した。摘出した試料は、4％PFA溶液にて固定し、常法に従ってパラフィンに包埋して連続組織切片を作成した。その後、切片にHE染色を施し、組織学的に観察した。

移植12週で摘出した移植体は生体に吸収されることなく原型を維持していた。また、HE染色した組織を観察した結果、細胞は生存しているが、硬組織の形成は認められなかった（図２）。

実施例１：高密度で播種し、１，２５（ジヒドロキシ）ビタミンD₃を添加して培養したヒト歯髄細胞のin vivo実験
医師によるインフォームドコンセントの得られた患者（25歳男性）の智歯を使用した。治療のため抜歯した智歯をタービンで削り、歯髄を露出させ、無菌的に歯髄組織を採取し、10％抗生剤入りPBS溶液にて保存した。

メスにて歯髄組織を約2mmの小片にし、PBS溶液にて5回洗浄した。

2mg/mlコラゲナーゼをDMEM培地に溶解した酵素溶液を用いて、洗浄した組織を50分間酵素処理した。得られた組織を25ml用のピペットを用いて10分間ピペッティングした。25mlの上澄み液を遠心分離して細胞を回収した。得られた細胞をDMEM/F12培地に15％血清を入れた培地にて5回洗浄した後、70μmセルストレイナーでろ過し、遠心分離することによって細胞を回収した。

回収した細胞を15％血清入りDMEM/F12培地に100μmol/lの濃度でAscを添加して37℃、5％CO₂条件下で培養を行ない、2回継代した細胞をトリプシン-EDTAにて細胞培養用フラスコから剥離した後、15％血清入りDMEM/F12培地にて5.0×10⁶個/100μlの細胞懸濁液に調整し、96穴プレートでHAp/β-TCP多孔体110mg（日本特殊陶業製）に播種をした後（密度；５．２３×１０⁴個／ｍｍ³）、37℃、5％CO₂条件下で静置培養を1時間行なった。

担体に細胞が接着後、6穴プレートへ移し7日間担体上で増殖させた。

更に分化誘導因子として100μmol/l Asc、10^-6mol/l １，２５（ジヒドロキシ）ビタミンD₃、10mmol/lβ-Gly、10^-8mol/ l Dexamethasoneを15％血清入りDMEM/F12培地に添加した培地にて6日間培養した。上述した培養は、三次元的に高密度で培養していることを示している。

移植動物としては、ヌードマウスKSNを用いた。ヌードマウス背部皮膚を切開し、細胞を播種した担体を皮下に入れ、皮膚を縫合した。

移植後7週にて試料を採取した。摘出した試料は、4％PFA溶液にて固定し、常法に従ってパラフィンに包埋して連続組織切片を作成した。その後、切片にHE染色と象牙質や骨のマーカーであるDSPとOCの免疫染色を施した。

移植後７週で摘出した移植体は生体に吸収されることなく原型を維持していた。また、HE染色した組織を観察した結果、担体に沿って硬組織が形成されていた（図３）。DSPの免疫染色を行なったところ、形成された硬組織とその周辺に存在する細胞が陽性であった。OCの免疫染色では顕著な染色は認められなった（図４）。図３(a)右下の尺は200μm、図３(b)右下の尺は100μm、図４右下の尺は200μmである。

実施例２：高密度で１，２５（ジヒドロキシ）ビタミンＤ₃を添加して培養したヒト歯髄細胞のin vitro実験
医師によるインフォームドコンセントの得られた患者（24歳男性）の智歯を使用した。治療のため抜歯した智歯をタービンで削り、歯髄を露出させ、無菌的に歯髄組織を採取し、10％抗生剤入りPBS溶液にて保存した。

メスにて歯髄組織を約2mmの小片にし、PBS溶液にて5回洗浄した。

2mg/mlコラゲナーゼをDMEM培地に溶解した酵素溶液を用いて、洗浄した組織を50分間酵素処理した。得られた組織を25ml用のピペットを用いて10分間ピペッティングした。25mlの上澄み液を遠心分離して細胞を回収した。得られた細胞をDMEM/F12培地に15％血清を入れた培地にて5回洗浄した後、70μmセルストレイナーでろ過し、遠心分離することによって細胞を回収した。

回収した細胞を15％血清入りDMEM/F12培地に100μmol/lの濃度でAscを添加して37℃、5％CO₂条件下で培養を行ない、4回継代した細胞をトリプシン-EDTAにて細胞培養用フラスコから剥離した後、1×10⁵個の細胞を遠心分離機を用いてペレット化した（密度；５．５７×１０⁵個／ｍｍ³）。

得られたペレットを15mlチューブの中に入れ、100μmol/l Asc、10^-7mol/l １，２５（ジヒドロキシ）ビタミンＤ₃、10mmol/lβ-Gly、10^-8mol/ l Dexamethasoneを添加した15％血清入りDMEM/F12培地を加えて、２〜３日ごとに培地交換を行いながら、37℃、5％CO₂条件下で静置培養を行なった。上述した培養は、三次元的に高密度で培養していることを示している。

３週間培養後にペレットを取り出し、10％ホルマリン溶液で固定し、常法に従ってパラフィンに包埋して連続組織切片を作成した。その後、切片にHE染色及びフォンコッサ染色を施し、組織学的に観察した。

培養３週後の組織観察の結果、顆粒状の石灰化を確認することができた（図５(a)、(b)）。

実施例３：高密度で１，２５（ジヒドロキシ）ビタミンＤ₃を添加し、コラーゲン担体中で培養したヒト歯髄細胞のin vitro実験
医師によるインフォームドコンセントの得られた患者（24歳男性）の智歯を使用した。治療のため抜歯した智歯をタービンで削り、歯髄を露出させ、無菌的に歯髄組織を採取し、10％抗生剤入りPBS溶液にて保存した。

メスにて歯髄組織を約2mmの小片にし、PBS溶液にて5回洗浄した。

2mg/mlコラゲナーゼをDMEM培地に溶解した酵素溶液を用いて、洗浄した組織を50分間酵素処理した。得られた組織を25ml用のピペットを用いて10分間ピペッティングした。25mlの上澄み液を遠心分離して細胞を回収した。得られた細胞をDMEM/F12培地に15％血清を入れた培地にて5回洗浄した後、70μmセルストレイナーでろ過し、遠心分離することによって細胞を回収した。

回収した細胞を15％血清入りDMEM/F12培地に100μmol/lの濃度でAscを添加して37℃、5％CO₂条件下で培養を行ない、4回継代した細胞をトリプシン-EDTAにて細胞培養用フラスコから剥離した後、1×10⁵個の細胞を遠心分離機を用いてペレット化した。

得られたペレットを15mlチューブの中に入れ、5μl のコラーゲンゲル（タイプＩ）を加え緩やかに攪拌した。得られた細胞含有ゲル（密度；２．００×１０⁴個／ｍｍ³）に、100μmol/l Asc、10^-7mol/l １，２５（ジヒドロキシ）ビタミンＤ₃、10mmol/lβ-Gly、10^-8mol/ l Dexamethasoneを添加した15％血清入りDMEM/F12培地を加えて、２〜３日ごとに培地交換を行いながら、37℃、5％CO₂条件下で静置培養を行なった。上述した培養は、三次元的に高密度で培養していることを示している。

４週間培養後に細胞含有ゲルを取り出し、10％ホルマリン溶液で固定し、常法に従ってパラフィンに包埋して連続組織切片を作成した。その後、切片にHE染色及びフォンコッサ染色を施し、組織学的に観察した。

培養４週後の組織観察の結果、顕著な硬組織形成を確認することができた（図６(a)、(b)）。

実施例４：高密度で１，２５（ジヒドロキシ）ビタミンＤ₃を添加し、PGA及びコラーゲン担体中て培養したヒト歯髄細胞のin vivo実験
医師によるインフォームドコンセントの得られた患者（17歳女性）の智歯を使用した。治療のため抜歯した智歯をタービンで削り、歯髄を露出させ、無菌的に歯髄組織を採取し、10％抗生剤入りPBS溶液にて保存した。

メスにて歯髄組織を約2mmの小片にし、PBS溶液にて5回洗浄した。

2mg/mlコラゲナーゼをDMEM培地に溶解した酵素溶液を用いて、洗浄した組織を50分間酵素処理した。得られた組織を25ml用のピペットを用いて10分間ピペッティングした。25mlの上澄み液を遠心分離して細胞を回収した。得られた細胞をDMEM/F12培地に15％血清を入れた培地にて5回洗浄した後、70μmセルストレイナーでろ過し、遠心分離することによって細胞を回収した。

回収した細胞を15％血清入りDMEM/F12培地に100μmol/lの濃度でAscを添加して37℃、5％CO₂条件下で培養を行ない、4回継代した。得られた細胞に、100μmol/l Asc、10^-6mol/l１，２５（ジヒドロキシ）ビタミンＤ₃、10mmol/lβ-Gly、10^-8mol/ l Dexamethasoneを添加した15％血清入りDMEM/F12培地を加えて、２〜３日ごとに培地交換を行いながら、37℃、5％CO₂条件下で１週間静置培養を行なった。トリプシン-EDTAにて細胞培養用フラスコから剥離した後、4×10⁶個の細胞を遠心分離機をペレット化した。

得られたペレットを15mlチューブの中に入れ、綿状のPGA4mg (Albany International Research社製)及び100μl のコラーゲンゲル（タイプＩ）を加え緩やかに攪拌した。得られた細胞含有ゲル（密度；３．８１×１０⁴個／ｍｍ³）に、100μmol/l Asc、10^-6mol/l１，２５（ジヒドロキシ）ビタミンＤ₃、10mmol/lβ-Gly、10^-8mol/ l Dexamethasoneを添加した15％血清入りDMEM/F12培地を加えて１時間、37℃、5％CO₂条件下で静置培養を行なった。上述した培養は、三次元的に高密度で培養していることを示している。

得られた細胞含有ゲルを、ヌードマウス（KSN）の背部皮下に移植した。

移植後１０週にて試料を取り出し、10％ホルマリン溶液で固定し、常法に従ってパラフィンに包埋して連続組織切片を作成した。その後、切片にHE染色及びフォンコッサ染色を施し、組織学的に観察した。

移植１０週後の組織観察の結果、硬組織形成を確認することができた（図７(a)、(b)）。

比較例３：高密度で培養したヒト歯髄細胞のin vivo実験
医師によるインフォームドコンセントの得られた患者（21歳男性）の智歯を使用した。治療のため抜歯した智歯をタービンで削り、歯髄を露出させ、無菌的に歯髄組織を採取し、10％抗生剤入りPBS溶液にて保存した。

メスにて歯髄組織を約2mmの小片にし、PBS溶液にて5回洗浄した。

2mg/mlコラゲナーゼをDMEM培地に溶解した酵素溶液を用いて、洗浄した組織を50分間酵素処理した。得られた組織を25ml用のピペットを用いて10分間ピペッティングした。25mlの上澄み液を遠心分離して細胞を回収した。得られた細胞をDMEM/F12培地に15％血清を入れた培地にて5回洗浄した後、70μmセルストレイナーでろ過し、遠心分離することによって細胞を回収した。

回収した細胞を15％血清入りDMEM/F12培地に100μmol/lの濃度でAscを添加して37℃、5％CO₂条件下で培養を行ない、1回継代した細胞をトリプシン-EDTAにて細胞培養用フラスコから剥離した後、15％血清入りDMEM/F12培地にて5.0×10⁶個/100μlの細胞懸濁液に調整し、96穴プレートでHAp/β-TCP多孔体130mg（日本特殊陶業製）に播種をした後（密度；４．４２×１０⁴個／ｍｍ³）、37℃、5％CO₂条件下で静置培養を4.5時間行なった。

担体に細胞が接着後、6穴プレートへ移し15％血清入りDMEM/F12培地にて13日間担体上で増殖させた。

移植動物としては、ヌードマウスKSNを用いた。ヌードマウス背部皮膚を切開し、細胞を播種した担体を皮下に入れ、皮膚を縫合した。

移植後6週にて試料を採取した。摘出した試料は、10％ホルマリン溶液にて固定し、常法に従ってパラフィンに包埋して連続組織切片を作成した。その後、切片にHE染色を施し、組織学的に観察した。

移植後6週で摘出した移植体は生体に吸収されることなく原型を維持していた。また、HE染色した組織を観察した結果、硬組織は形成しているものの、幼弱で量も少なかった（図８）。

実施例５：高密度で播種し、１，２５（ジヒドロキシ）ビタミンD₃を添加したヒト歯髄細胞のin vivo実験
医師によるインフォームドコンセントの得られた患者（21歳男性）の智歯を使用した。治療のため抜歯した智歯をタービンで削り、歯髄を露出させ、無菌的に歯髄組織を採取し、10％抗生剤入りPBS溶液にて保存した。

メスにて歯髄組織を約2mmの小片にし、PBS溶液にて5回洗浄した。

2mg/mlコラゲナーゼをDMEM培地に溶解した酵素溶液を用いて、洗浄した組織を50分間酵素処理した。得られた組織を25ml用のピペットを用いて10分間ピペッティングした。25mlの上澄み液を遠心分離して細胞を回収した。得られた細胞をDMEM/F12培地に15％血清を入れた培地にて5回洗浄した後、70μmセルストレイナーでろ過し、遠心分離することによって細胞を回収した。

回収した細胞を15％血清入りDMEM/F12培地に100μmol/lの濃度でAscを添加して37℃、5％CO₂条件下で培養を行ない、1回継代した細胞をトリプシン-EDTAにて細胞培養用フラスコから剥離した後、15％血清入りDMEM/F12培地にて5.0×10⁶個/100μlの細胞懸濁液に調整し、96穴プレートでHAp/β-TCP多孔体130mg（日本特殊陶業製）に播種をした後（密度；４．４２×１０⁴個／ｍｍ³）、37℃、5％CO₂条件下で静置培養を4.5時間行なった。

担体に細胞が接着後、6穴プレートへ移し15％血清入りDMEM/F12培地にて7日間担体上で増殖させた。

更に分化誘導因子として100μmol/l Asc、10^-6mol/l １，２５（ジヒドロキシ）ビタミンD₃、10mmol/lβ-Gly、10^-8mol/ l Dexamethasoneを15％血清入りDMEM/F12培地に添加した培地にて6日間培養した。上述した培養は、三次元的に高密度で培養していることを示している。

移植動物としては、ヌードマウスKSNを用いた。ヌードマウス背部皮膚を切開し、細胞を播種した担体を皮下に入れ、皮膚を縫合した。

移植後6週にて試料を採取した。摘出した試料は、10％ホルマリン溶液にて固定し、常法に従ってパラフィンに包埋して連続組織切片を作成した。その後、切片にHE染色を施し、組織学的に観察した。

移植後6週で摘出した移植体は生体に吸収されることなく原型を維持していた。また、HE染色した組織を観察した結果、比較例３に比して顕著に象牙質様硬組織を形成していた（図９）。

図１は、ヒト歯髄細胞の移植により得られた組織のHE染色像（低密度）を示す。 図２は、ヒト歯髄細胞の移植により得られた組織のHE染色像（低密度、分化誘導（+））を示す。 図３は、ヒト歯髄細胞の移植により得られた組織のHE染色像（高密度、分化誘導（+））を示す。 図４は、ヒト歯髄細胞の移植により得られた組織の免疫染色像（高密度、分化誘導（+））を示す。 図５は、(a) ヒト歯髄細胞の培養により得られた組織のHE染色像（高密度、分化誘導（+））、及び(b) ヒト歯髄細胞の培養により得られた組織のフォンコッサ染色像（高密度、分化誘導（+））を示す。 図６は、(a)ヒト歯髄細胞の培養により得られた組織のHE染色像（高密度、分化誘導（+））、及び(b)ヒト歯髄細胞の培養により得られた組織のフォンコッサ染色像（高密度、分化誘導（+））を示す。 図７は、(a)ヒト歯髄細胞の移植により得られた組織のHE染色像（高密度、分化誘導（+））、及び(b)ヒト歯髄細胞の移植により得られた組織のフォンコッサ染色像（高密度、分化誘導（+））を示す。 図８は、ヒト歯髄細胞の移植により得られた組織のHE染色像（高密度）を示す。 図９は、ヒト歯髄細胞の移植により得られた組織のHE染色像（高密度、分化誘導（+））を示す。

Claims (4)

1. 分離したヒト歯髄細胞を、１，２５（ジヒドロキシ）ビタミンＤ_３を添加しながら三次元的に、培養時の細胞密度が２×１０^４個／ｍｍ^３〜５×１０^６個／ｍｍ^３になるように培養することを含む、分化誘導された象牙芽細胞の製造方法。
2. 細胞を担体上又は担体中で培養する、請求項1に記載の方法。
3. １，２５（ジヒドロキシ）ビタミンＤ_３の培地中の濃度が１×１０^−１０〜１×１０^−５ｍｏｌ／ｌである、請求項１又は２に記載の方法。
4. 請求項１から３の何れかに記載の方法により得られる分化誘導された象牙芽細胞を培養することを含む、象牙質の再生方法。