JP4881327B2

JP4881327B2 - Liposome preparation of antitumor active substance

Info

Publication number: JP4881327B2
Application number: JP2007556922A
Authority: JP
Inventors: 直人奥
Original assignee: Taiho Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Taiho Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2006-01-31
Filing date: 2007-01-26
Publication date: 2012-02-22
Anticipated expiration: 2027-01-26
Also published as: JPWO2007088952A1; WO2007088952A1

Description

本発明は医療上有用な抗腫瘍活性物質を包含するリポソーム製剤に関する。 The present invention relates to a liposome preparation including a medically useful antitumor active substance.

現在までにがん治療のために多くの薬物が開発され、医療に用いられている。しかし、現在に至るまで腫瘍組織に対してのみ選択的に殺細胞効果を示す抗腫瘍活性物質は開発されていない。抗腫瘍活性物質をそのまま血管内に投与した場合、血中から速く消失したり、標的以外の臓器にも分布することがあり、必ずしも効果的にがん組織に集積するとは限らない。このため抗腫瘍活性物質の多くは、がん組織に対する抗腫瘍作用（主作用）を十分に発揮できず、またしばしば望ましくない正常組織への作用（副作用）を伴い、重篤な毒性を引き起こしている。抗腫瘍活性物質の主作用の増強、副作用の軽減は、現在のがん化学療法の重要な課題であり、薬物をがん組織、がん細胞に効率的に集積する薬物送達システム（ＤＤＳ、ＤｒｕｇＤｅｌｉｖｅｒｙＳｙｓｔｅｍ）の開発が強く求められている。
リポソームは生体成分由来のリン脂質を主成分とする閉鎖小胞であり、生体に投与したときの毒性、抗原性が低い特徴を持つ。またリポソーム内に薬物を封入することにより、その薬物の血中安定性および生体内分布を変化させて標的組織への到達性を改善できることが示されている（例えば、非特許文献１、特許文献１）。またがん組織に多く存在する新生血管の血管壁は既存の血管のそれと比較して透過性が高く、リポソームなどの小胞はがん組織に集積しやすいことが知られている（例えば、非特許文献２）。従って抗腫瘍活性物質をリポソーム内に封入した製剤は主作用を増強し、副作用を軽減することが大いに期待されるＤＤＳのひとつである。
しかし、抗腫瘍活性物質を包含するリポソーム製剤を実際のがん治療に用いる場合、通常のリポソーム組成ではがん組織への選択的な到達性が不十分であり、抗腫瘍効果が十分に発揮されない場合が多い。また、リポソームが標的以外の臓器に多量に分布することによる副作用の発現も問題となる。リポソームの脂質膜を、がん組織に選択的に集まる性質を有するペプチド（以下、腫瘍組織親和性ペプチドという）、蛋白、抗体で物理的あるいは化学的に修飾して、がん組織への移行性をより高くする試みがなされている。
腫瘍組織親和性ペプチドとしては、正常組織には少なく、腫瘍内の新生血管に特異的に発現しているｉｎｔｅｇｒｉｎｓ、ｖａｓｃｕｌａｒｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｓ、ｍａｔｒｉｘｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅｓ、ｈｉｇｈ−ｍｏｌｅｃｕｌａｒ−ｗｅｉｇｈｔｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎなどに特異的に移行し、結合するものがよく知られている。代表的なものとして、ＲＧＤ配列を含むペプチドがあり、腫瘍新生血管のインテグリンα−ｖ β−３及びα−ｖ β−５に選択的に結合することが報告されている（例えば、非特許文献３）。またＰＲＰ配列を含むペプチドは新生血管に特異的に集積することが確認されており、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）受容体の一つであるｆｍｓ−ｌｉｋｅｔｙｒｏｓｉｎｅｋｉｎａｓｅ−１（ｆｌｔ−１）へ親和性を持つことが示唆されている（例えば、非特許文献４、特許文献２）。またＰＬＰＬ配列を含むペプチドはｍｅｍｂｒａｎｅｔｙｐｅ−１ｍａｔｒｉｘｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅｓ（ＭＴ１−ＭＭＰ）に親和性を持つことが確認されている（例えば、非特許文献５）。またＮＧＲ配列を含むペプチドは腫瘍新生血管のアミノペプチダーゼＮに親和性を持つことが確認されている（例えば、非特許文献６）。
ＷＯ９５／２４２０１号公報再公表ＷＯ００／２３４７６号公報ＪｏｕｒｎａｌｏｆＬｉｐｏｓｏｍｅＲｅｓｅｒｃｈ）、４、６６７（１９９４）ＤｒｕｇＤｅｌｉｖｅｒｙＳｙｓｔｅｍ、１４、４３３（１９９９）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１２、２６５（１９９５）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、２１、２６６２（２００２）ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬＪＯＵＲＮＡＬＯＦＣＡＮＣＥＲ、１０８、３０１（２００４）ＣＡＮＣＥＲＲＥＳＥＡＲＣＨ、６０、７２２（２０００） To date, many drugs have been developed and used in medicine for cancer treatment. However, until now, no antitumor active substance has been developed that exhibits a cell-killing effect selectively only on tumor tissues. When an antitumor active substance is administered as it is into a blood vessel, it may disappear quickly from blood or be distributed to organs other than the target, and it does not always effectively accumulate in cancer tissue. For this reason, many antitumor active substances cannot fully exert their antitumor effects (main effects) on cancer tissues, and often have undesirable effects on normal tissues (side effects), causing serious toxicity. Yes. Enhancement of the main effects of antitumor active substances and reduction of side effects are important issues in current cancer chemotherapy, and drug delivery systems (DDS, Drug) that efficiently accumulate drugs in cancer tissues and cells. There is a strong demand for the development of a Delivery System.
Liposomes are closed vesicles composed mainly of phospholipids derived from biological components, and are characterized by low toxicity and low antigenicity when administered to living bodies. Moreover, it has been shown that encapsulating a drug in a liposome can improve the reachability to a target tissue by changing the blood stability and biodistribution of the drug (for example, Non-Patent Document 1, Patent Document). 1). In addition, the blood vessel walls of new blood vessels that are abundant in cancer tissues are more permeable than those of existing blood vessels, and it is known that vesicles such as liposomes are likely to accumulate in cancer tissues (for example, non-vessels). Patent Document 2). Therefore, a preparation in which an antitumor active substance is encapsulated in a liposome is one of DDS that is highly expected to enhance main effects and reduce side effects.
However, when a liposome preparation containing an antitumor active substance is used for actual cancer treatment, the selective reachability to the cancer tissue is insufficient with the normal liposome composition, and the antitumor effect is not sufficiently exhibited. There are many cases. In addition, side effects due to a large amount of liposomes distributed in organs other than the target are also problematic. The liposome lipid membrane is physically or chemically modified with a peptide (hereinafter referred to as a tumor tissue affinity peptide), protein, or antibody that has the property of selectively gathering in cancer tissue, and can be transferred to cancer tissue. Attempts have been made to make the price higher.
As a tumor tissue affinity peptide, it is rare in normal tissues, and specifically binds to integrins, vascular growthfactors, matrix metalloproteases, high-molecular-weight proteoglycans that are specifically expressed in neovascular vessels within the tumor, What you do is well known. A typical example is a peptide containing an RGD sequence, which has been reported to selectively bind to integrin α-v β-3 and α-v β-5 of tumor neovasculature (for example, non-patent literature). 3). In addition, it has been confirmed that a peptide containing a PRP sequence accumulates specifically in new blood vessels, and has an affinity for fms-liketyrosine kinase-1 (flt-1), which is one of vascular endothelial growth factor (VEGF) receptors. (For example, Non-Patent Document 4 and Patent Document 2). In addition, it has been confirmed that peptides containing a PLPL sequence have affinity for membrane type-1 matrix metalloproteases (MT1-MMP) (for example, Non-Patent Document 5). In addition, it has been confirmed that a peptide containing an NGR sequence has affinity for aminopeptidase N of tumor neovascularization (for example, Non-Patent Document 6).
WO95 / 24201 Publication Republished WO00 / 23476 Journal of Liposome Research), 4,667 (1994) Drug Delivery System, 14, 433 (1999) Biotechnology, 12, 265 (1995) Oncogene, 21, 2662 (2002) INTERNATIONAL JOURNAL OF CANCER, 108, 301 (2004) CANCER RESEARCH, 60, 722 (2000)

しかしこれらのペプチドを単独でリポソーム脂質膜に修飾した場合、がん組織への選択的な移行性、抗腫瘍効果の増大は認められるものの、不十分であることが多かった。また、多くの場合、抗腫瘍効果が現れる動物種やがん種が限定されていた。ペプチドの種類、修飾量を種々変更しても抗腫瘍効果の増加の程度には限界があり、臨床現場で実用化できる製剤とするためのハードルは高いと考えられていた。
本発明の課題は抗悪性腫瘍活性を有する物質を包含し、高いがん組織到達性を有し、抗腫瘍作用が増強された、リポソーム製剤を提供することにある。However, when these peptides were modified alone into a liposomal lipid membrane, selective migration to cancer tissues and an increase in antitumor effect were observed, but they were often insufficient. In many cases, animal species and cancer types that exhibit antitumor effects have been limited. Even if the type and amount of modification of the peptide are variously changed, there is a limit to the degree of increase in the antitumor effect, and it has been considered that the hurdle to make a preparation that can be practically used in the clinical field is high.
An object of the present invention is to provide a liposome preparation that includes a substance having an anti-malignant tumor activity, has high cancer tissue reachability, and has an enhanced antitumor action.

本発明は以下の発明に係る。
１．抗腫瘍活性物質を内包し、２種以上の腫瘍組織親和性ペプチドがリポソーム表面に結合されたリポソーム製剤。
２．腫瘍組織親和性ペプチドとして、ＲＧＤ配列を含むペプチド、ＰＲＰ配列を含むペプチド、ＰＬＰＬ配列を含むペプチド及びＮＧＲ配列を含むペプチドからなる群から選ばれる２種のペプチドを少なくとも含むリポソーム製剤。
３．腫瘍組織親和性ペプチドとして、ＲＧＤ配列を含むペプチド及びＰＲＰ配列を含むペプチドを少なくとも含むリポソーム製剤。
４．腫瘍組織親和性ペプチドが、ＲＧＤ配列を含むペプチド、ＰＲＰ配列を含むペプチド、ＰＬＰＬ配列を含むペプチド及びＮＧＲ配列を含むペプチドからなる群から選ばれる２種以上のペプチドであるリポソーム製剤。
５．腫瘍組織親和性ペプチドが、ＲＧＤ配列を含むペプチド及びＰＲＰ配列を含むペプチドであるリポソーム製剤。
６．腫瘍組織親和性ペプチドが、ＲＧＤ配列を含むペプチド、ＰＲＰ配列を含むペプチド及びＮＧＲ配列を含むペプチドであるリポソーム製剤。
７．各腫瘍組織親和性ペプチドの構成アミノ酸数が３〜１５であるリポソーム製剤。
８．脂質成分の少なくとも１種がジパルミトイルホスファチジルコリン又はジステアロイルホスファチジルコリンであるリポソーム製剤。
９．上記リポソーム製剤の腫瘍の治療のための使用。
１０．上記リポソーム製剤に含まれる抗腫瘍活性物質の有効量を哺乳動物に投与する腫瘍の治療方法。
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、複数種の腫瘍組織親和性ペプチドを組み合わせて使用することにより、腫瘍組織への移行性、親和性が相乗的に高まる可能性を考案した。実際に、抗悪性腫瘍活性を有する化合物を包含したリポソームの膜表面を複数種の腫瘍組織親和性ペプチドで修飾することによって、これらのペプチドの腫瘍組織親和性作用が相乗的に向上し、血管内に投与したときの抗腫瘍活性が、ペプチド修飾しないリポソーム及び単独の腫瘍組織親和性ペプチドで修飾したリポソームと比較して有意に増大し、かつ毒性の増加は伴わないことを見いだし、本発明を完成するに至った。
本発明のリポソーム製剤に用いられるリポソームとは、前記したように細胞膜を構成しているリン脂質を水中に分散させて形成される脂質二分子膜により囲まれた内水相部分を有する閉鎖小胞であり、そのサイズや脂質二分子の数によって多重相リポソーム（ＭｕｌｔｉｌａｍｅｌｌａｒＶｅｓｉｃｌｅ：ＭＬＶ）、大きな一枚膜リポソーム（ＬａｒｇｅＵｎｉｌａｍｅｌｌａｒＶｅｓｉｃｌｅ：ＬＵＶ）および小さな一枚膜リポソーム（ＳｍａｌｌＵｎｉｌａｍｅｌｌａｒＶｅｓｉｃｌｅ：ＳＵＶ）の３種類に分類される。本発明ではいずれの種類のリポソームも使用可能である。本発明のリポソームは生体内投与前および投与後に安定なリポソーム構造を形成する。
リポソームを構成する二分子膜の流動性、膜透過性は相転移温度を境として大きく増加するため、一般的には相転移温度が３７℃以上であるリン脂質を用いることが好ましい。このようなリン脂質としては、例えば水素添加精製卵黄ホスファチジルコリン（相転移温度５０〜６０℃、以下ＨＥＰＣとする）、水素添加精製大豆ホスファチジルコリン（相転移温度約５５℃、以下ＨＳＰＣとする）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（相転移温度約４１℃、以下ＤＰＰＣとする）およびジステアロイルホスファチジルコリン（相転移温度約５８℃、以下ＤＳＰＣとする）から選ばれ、より好ましくはＤＳＰＣ及びＤＰＰＣがあげられる。これらは１種または２種以上混合して用いることができる。本発明に用いられるリポソームは、これらリン脂質に加えて、好ましくはリポソームの安定性を改善することが報告されているコレステロール誘導体などの安定化剤と混合して使用される。コレステロール誘導体とリン脂質のモル比は、１：０．３〜３が好ましく、１：１〜２．５がさらに好ましい。
また、等張化剤として、例えば、グリセリン、ブドウ糖、塩化ナトリウムなどの添加も可能である。さらに、パラベン類、クロルブタノール、ベンジルアルコール、プロピレングリコールなどの防腐剤を加えてもよい。
本発明で用いられる腫瘍組織親和性ペプチドとしては、リポソームの表面に結合させたときに腫瘍組織に指向性を示すペプチドであれば特に制限されないが、ＲＧＤ配列を含むペプチド、ＰＲＰ配列を含むペプチド、ＰＬＰＬ配列を含むペプチド及びＮＧＲ配列を含むペプチドが例示できる。なお、上記以外のペプチドも結合していても良い。
さらに、本発明で用いられる腫瘍組織親和性ペプチドとしては、１つのペプチド内に、ＲＧＤ配列、ＰＲＰ配列、ＰＬＰＬ配列及びＮＧＲ配列からなる群から選ばれる２種以上の配列を含むペプチドが例示できる。
本発明で用いられるＲＧＤ配列を含むペプチドは、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸のアミノ酸配列を含むペプチドであればよく、ペプチド合成分野において公知の方法により作成することができる。また、本ペプチドは直鎖状であっても環状であってもよい。例えばＧＲＧＤＳ、ＧＲＧＤＬ、ＧＲＧＤＲ、ＧＲＧＤＦを例示することができる。
本発明で用いられるＰＲＰ配列を含むペプチドは、プロリン−アルギニン−プロリンのアミノ酸配列を含むペプチドであればよく、ペプチド合成分野において公知の方法により作成することができる。例えばＡＰＲＰＧ、ＧＰＲＰＬ、ＧＰＲＰＲを例示することができる。
本発明で用いられるＰＬＰＬ配列を含むペプチドは、プロリン−ロイシン−プロリン−ロイシンのアミノ酸配列を含むペプチドであればよく、ペプチド合成分野において公知の方法により作成することができる。例えばＧＰＬＰＬＲ、ＨＰＬＰＬＳ、ＰＶＰＬＰ、ＰＬＰＬＶＲを例示することができる。
本発明で用いられるＮＧＲ配列を含むペプチドは、アスパラギン−グリシン−アルギニンのアミノ酸配列を含むペプチドであればよく、ペプチド合成分野において公知の方法により作成することができる。例えばＣＮＧＲＣ、ＣＮＧＲＧを例示することができる。
後述する実施例の通り、リポソーム膜に２種以上の腫瘍組織親和性ペプチドを導入することにより、腫瘍組織親和性が向上しており、かつ副作用が低減しているリポソーム製剤を作製することができる。本発明のリポソーム製剤では、２〜４種の腫瘍組織親和性ペプチドを導入することがより好ましい。本発明のリポソーム製剤における２種の腫瘍組織親和性ペプチドの組み合わせとしては、ＲＧＤ配列を含むペプチド及びＰＲＰ配列を含むペプチド；ＲＧＤ配列を含むペプチド及びＰＬＰＬ配列を含むペプチド；ＲＧＤ配列を含むペプチド及びＮＧＲ配列を含むペプチド；ＰＲＰ配列を含むペプチド及びＰＬＰＬ配列を含むペプチド；ＰＲＰ配列を含むペプチド及びＮＧＲ配列を含むペプチド；ＰＬＰＬ配列を含むペプチド及びＮＧＲ配列を含むペプチドが例示できる。好ましくは、ＲＧＤ配列を含むペプチド及びＰＲＰ配列を含むペプチドである。
本発明のリポソーム製剤における２種の腫瘍組織親和性ペプチドのモル比は、内包する薬剤や治療対象の癌によって任意に設定できるが、例えば、ＲＧＤ配列を含むペプチド及びＰＲＰ配列を含むペプチドを用いる場合、ＲＧＤ配列を含むペプチド：ＰＲＰ配列を含むペプチド＝１：０．１〜１０が好ましく、１：０．３〜３がさらに好ましく、１：１がより好ましい。
また、本発明のリポソーム製剤における３種の腫瘍組織親和性ペプチドの組み合わせとしては、ＲＧＤ配列を含むペプチド、ＰＲＰ配列を含むペプチド及びＰＬＰＬ配列を含むペプチド；ＲＧＤ配列を含むペプチド、ＰＲＰ配列を含むペプチド及びＮＧＲ配列を含むペプチド；ＲＧＤ配列を含むペプチド、ＰＬＰＬ配列を含むペプチド及びＮＧＲ配列を含むペプチド；ＰＲＰ配列を含むペプチド、ＰＬＰＬ配列を含むペプチド及びＮＧＲ配列を含むペプチドが例示できる。好ましくは、ＲＧＤ配列を含むペプチド、ＰＲＰ配列を含むペプチド及びＮＧＲ配列を含むペプチドである。
本発明のリポソーム製剤における３種の腫瘍組織親和性ペプチドのモル比は、内包する薬剤や治療対象の癌によって任意に設定できるが、例えば、ＲＧＤ配列を含むペプチド、ＰＲＰ配列を含むペプチド及びＮＧＲ配列を含むペプチドを用いる場合、ＲＧＤ配列を含むペプチド：ＰＲＰ配列を含むペプチド：ＮＧＲ配列を含むペプチド＝１：０．１〜１０：０．１〜１０が好ましく、１：０．３〜３：０．３〜３がさらに好ましく、１：１：１がより好ましい。
さらに、発明のリポソーム製剤における４種の腫瘍組織親和性ペプチドの組み合わせとしては、ＲＧＤ配列を含むペプチド、ＰＲＰ配列を含むペプチド、ＰＬＰＬ配列を含むペプチド及びＮＧＲ配列を含むペプチドが例示できる。
本発明のリポソーム製剤における４種の腫瘍組織親和性ペプチドのモル比は、内包する薬剤や治療対象の癌によって任意に設定できるが、例えば、ＲＧＤ配列を含むペプチド、ＰＲＰ配列を含むペプチド、ＰＬＰＬ配列を含むペプチド及びＮＧＲ配列を含むペプチドを用いる場合、ＲＧＤ配列を含むペプチド：ＰＲＰ配列を含むペプチド：ＰＬＰＬ配列を含むペプチド：ＮＧＲ配列を含むペプチド＝１：０．１〜１０：０．１〜１０：０．１〜１０が好ましく、１：０．３〜３：０．３〜３：０．３〜３がさらに好ましく、１：１：１：１がより好ましい。
本発明で用いられる腫瘍組織親和性ペプチドの構成アミノ酸数は、抗原性の低さ、リポソームへの修飾の容易さ及び製造コストの低さから、３〜１５が好ましく、４〜１２がさらに好ましく、５〜１０が特に好ましい。本発明で用いられる腫瘍組織親和性ペプチドを構成するアミノ酸の具体例としては、アルギニン、グリシン、アスパラギン酸、プロリン、ロイシン、フェニルアラニン、セリン、ヒスチジン、アスパラギン、システイン等を例示することができる。
本発明で用いられるリン脂質と各腫瘍組織親和性ペプチドの総量とのモル比は、１：０．０１〜０．３が好ましく、１：０．０５〜０．２がさらに好ましく、１：０．１が特に好ましい。
リポソーム膜への腫瘍組織親和性ペプチドの導入方法は、化学的結合による方法と、化学的結合を用いない方法があるが、リポソーム膜の変性などを避けるため、後者の方法を選択することが望ましい。後者の具体的な方法としては、腫瘍組織親和性ペプチドにステアロイル基、アシル基（例えば、特許２６２０７２９号）、コレステリル基（例えば、特許２５７９７３０号）、リン脂質（例えば、特開平０４−０９９７９５）などの疎水性側鎖を結合し、疎水性側鎖を結合した腫瘍組織親和性ペプチドを他の脂質成分と混合してリポソームを調製することにより、リポソームの脂質膜部分に疎水性側鎖が配位し、腫瘍組織親和性ペプチドがリポソーム膜表面に導入されたペプチド修飾リポソームをつくることが可能である。複数種の腫瘍組織親和性ペプチドをリポソーム膜へ導入する場合も、それらのペプチドが物理化学的に不都合な相互作用を示さない限り、単独の腫瘍組織親和性ペプチドの場合と同様にして、上述の方法で調製することができる。疎水性側鎖の結合する方向は任意であり、例えばＲＧＤ配列を含むペプチドの場合、疎水性側鎖はＲ側、Ｄ側のどちらにも結合してもよいが、好ましくはＲ側である。
本発明のリポソーム製剤は公知の方法により調製される。公知のリポソーム製剤の調製方法としては、例えば、逆相蒸発法［プロシーディング・オブ・ザ・ナショナルアカデミー・オブ・サイエンシズ・ユー・エス・エー（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、７５、４１９４（１９７８）、ＷＯ９７／４８３９８号公報］、凍結融解法［アーチーズ・オブ・バイオケミストリー・アンド・バイオフィジックス（Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ）、２１２、１８６（１９８１）］、ｐＨ勾配法［バイオキミカ・エト・バイオフィジカ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ）、８１６、２９４（１９８５）、特開平７−１６５５６０号公報］などがあげられる。
これらの中で、ｐＨ勾配法は、ｐＨにより溶解度が大きく異なる薬物をリポソーム内に高い包含率で封入する際に有用である。ｐＨ勾配法による本発明のリポソーム製剤の調製方法としては、例えば、脂質成分ならびに疎水性側鎖を結合した腫瘍組織親和性ペプチドをクロロホルム、エーテル、エタノールなどの溶媒に溶解後、ナス型フラスコに入れ、減圧下溶媒留去し脂質薄膜を形成する。次いで、弱酸性緩衝液を薄膜に加え、凍結融解を行い、内水相が弱酸性である大きな多重相リポソーム（ＭＬＶ）を調製する。さらに、エクストルージョン法などにより、小さな一枚膜リポソーム（ＳＵＶ）とした後、中性緩衝液を加えて外水相を中性とする（内水相と外水相のｐＨの差は３以上であることが望ましい）。ここに薬物の水溶液を添加し、脂質二分子膜の相転移温度より約１０℃高い温度でインキュベートする。以上の操作により、薬物をリポソームの内部に高率かつ定量的に封入することができる。
リポソームの粒子サイズは内包されている薬物の生体内分布、腫瘍組織への送達性に大きな影響を与えることが報告されている［バイオロジカル・アンド・ファーマシューティカル・ブレタン（ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌａｎｄＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＢｕｌｌｅｔｉｎ）、１７、９３５（１９９４）］。従って、本発明においては、薬物内包リポソームの粒子径を適切かつ均一にするために、サイジング処理を行うのが好ましく、例えば、エクストルーダー（リペックスバイオメンブラン社製など）を使用し、適切な孔径のメンブランフィルターに数回通過させることにより、平均粒子径として５０〜２００ｎｍ、好ましくは７５〜１２５ｎｍになるように調節することが望ましい。
またリポソームの膜表面を、必要に応じ、ポリエチレングリコール誘導体などのリガンドで修飾することによって、リポソームを血管内に投与した後の血漿中タンパクとの相互作用を低減し、肝クッパー細胞などの細網内皮細胞への取り込みを抑制することができ、リポソームの腫瘍組織への移行性等をさらに向上させることができる。
以上の操作によって、本発明のリポソーム製剤が調製され、必要に応じ、超遠心処理、ゲル濾過処理、限外濾過処理および透析処理を単独または適宜組み合わせて行うことによって、リポソームに内包されなかった薬物を除去することができる。
上記の方法により得られる本発明のリポソーム製剤はそのままでも使用できるが、保存期間、保存条件などを考慮して、マンニトール、トレハロース、ラクトース、グリシンなどの賦形剤を加えて凍結乾燥することもできる。またグリセリンなどの凍結保存剤を加え、凍結保存してもよい。
本発明のリポソーム製剤に内包する薬剤の種類は特に制限されないが、本発明のリポソーム製剤は優れた腫瘍組織親和性を有するので、腫瘍組織において活性を有するものであればよく、抗腫瘍活性物質が好ましい。具体的な抗腫瘍活性物質としては、特に限定されないが、例えばアルキル化剤、各種代謝拮抗剤、抗腫瘍性抗生物質、その他抗腫瘍剤、抗腫瘍性植物成分、ＢＲＭ（生物学的応答性制御物質）、血管新生阻害剤、細胞接着阻害剤、マトリックス・メタロプロテアーゼ阻害剤またはホルモン等が挙げられる。
より具体的には、アルキル化剤として、例えば、ナイトロジェンマスタード、ナイトロジェンマスタードＮ−オキシド、イホスファミド、メルファラン、シクロホスファミド、クロラムブシル等のクロロエチルアミン系アルキル化剤、；例えば、カルボコン、チオテパ等のアジリジン系アルキル化剤；例えば、ディブロモマンニトール、ディブロモダルシトール等のエポキシド系アルキル化剤；例えば、カルムスチン、ロムスチン、セムスチン、ニムスチンハイドロクロライド、クロロゾトシン、ラニムスチン等のニトロソウレア系アルキル化剤；ブスルファン、トシル酸インプロスルファン、ピポスルファン等のスルホン酸エステル類；ダカルバジン；プロカルバジン等が挙げられる。
各種代謝拮抗剤としては、例えば、６−メルカプトプリン、アザチオプリン、６−チオグアニン、チオイノシン等のプリン代謝拮抗剤；フルオロウラシル、テガフール、テガフール・ウラシル、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤、カルモフール、ドキシフルリジン、ブロクスウリジン、シタラビン、エノシタビン等のピリミジン代謝拮抗剤；メトトレキサート、トリメトレキサート等の葉酸代謝拮抗剤等、および、その塩もしくは複合体が挙げられる。
抗腫瘍性抗生物質としては、例えば、ダウノルビシン、アクラルビシン、ドキソルビシン、ピラルビシン、エピルビシン等のアントラサイクリン系；アクチノマイシンＤ等のアクチノマイシン系；クロモマイシンＡ３等のクロモマイシン系；マイトマイシンＣ等のマイトマイシン系；ブレオマイシン、ペプロマイシン等のブレオマイシン系等；および、それらの塩もしくは複合体が挙げられる。
その他の抗腫瘍剤としては、例えば、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、ＴＡＳ−１０３、タモキシフェン、Ｌ−アスパラギナーゼ、アセブラトン、シゾフィラン、ピシバニール、ウベニメクス、クレスチン等、および、それらの塩もしくは複合体が挙げられる。
抗腫瘍性植物成分としては、例えば、カンプトテシン、ビンデシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン等の植物アルカロイド類；エトポシド、テニポシド等のエピポドフィロトキシン類；および、その塩もしくは複合体が挙げられる。また、ピポブロマン、ネオカルチノスタチン、ヒドロキシウレア等も挙げることができる。
ＢＲＭとしては、例えば、腫瘍壊死因子、インドメタシン等、および、その塩もしくは複合体が挙げられる。
血管新生阻害剤としては、例えばフマギロール誘導体、および、その塩もしくは複合体が挙げられる。
細胞接着阻害剤としては、例えば、ＲＧＤ配列を有する物質、および、その塩もしくは複合体が挙げられる。
マトリックス・メタロプロテアーゼ阻害剤としては、例えば、マリマスタット、バチマスタット等、および、その塩もしくは複合体が挙げられる。
ホルモンとしては、例えばヒドロコルチゾン、デキサメタゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、プラステロン、ベタメタゾン、トリアムシノロン、オキシメトロン、ナンドロロン、メテノロン、ホスフェストロール、エチニルエストラジオール、クロルマジノン、メドロキシプロゲステロン等、および、その塩もしくは複合体が挙げられる。
薬剤の形態としては、低分子化合物、ペプチド、蛋白、抗体、ｓｉＲＮＡあるいは遺伝子が例示できる。
本発明のリポソーム製剤は、一般的には、使用時に生理的に許容される水溶液で懸濁または希釈して注射剤（静脈内、筋肉内、皮下投与製剤）として用いられるが、経口剤、点鼻剤、吸入剤、坐剤、経皮吸収剤、経粘膜吸収剤などとして使用することもできる。最終製剤は、悪性腫瘍〔ヒトなどの哺乳動物の肺がん、消化器がん（食道がん、胃がん、直腸がん、結腸がんなど）、乳がん、頭頸部がん、肝臓がん、胆嚢がん、膵臓がん、婦人科がん（子宮がん、子宮頸がん、卵巣がんなど）、泌尿器がん（腎がん、膀胱がん、前立腺がんなど）、脳腫瘍、白血病、メラノーマ、悪性リンパ腫など〕の治療、緩解のための有効量が投与されるように設計されていればよい。例えば、静脈内投与リポソーム製剤として抗腫瘍活性物質が０．０１〜１００００ｍｇ含有されていればよい。本発明のリポソーム製剤に含まれる有効成分の投与量は、０．０１〜１０００ｍｇ／ｄａｙとするのが好ましい。The present invention relates to the following inventions.
1. A liposome preparation comprising an antitumor active substance and two or more kinds of tumor tissue affinity peptides bound to the liposome surface.
2. A liposome preparation comprising at least two peptides selected from the group consisting of peptides containing an RGD sequence, peptides containing a PRP sequence, peptides containing a PLPL sequence, and peptides containing an NGR sequence as tumor tissue affinity peptides.
3. A liposome preparation comprising at least a peptide containing an RGD sequence and a peptide containing a PRP sequence as a tumor tissue affinity peptide.
4). A liposome preparation in which the tumor tissue affinity peptide is two or more peptides selected from the group consisting of a peptide containing an RGD sequence, a peptide containing a PRP sequence, a peptide containing a PLPL sequence, and a peptide containing an NGR sequence.
5. A liposome preparation in which the tumor tissue affinity peptide is a peptide containing an RGD sequence and a peptide containing a PRP sequence.
6). A liposome preparation, wherein the tumor tissue affinity peptide is a peptide containing an RGD sequence, a peptide containing a PRP sequence, and a peptide containing an NGR sequence.
7). A liposome preparation in which each tumor tissue affinity peptide has 3 to 15 constituent amino acids.
8). A liposome preparation wherein at least one of the lipid components is dipalmitoyl phosphatidylcholine or distearoyl phosphatidylcholine.
9. Use of the above-mentioned liposome preparation for the treatment of tumors.
10. A method for treating a tumor, comprising administering an effective amount of an antitumor active substance contained in the liposome preparation to a mammal.
As a result of intensive studies to solve the above-mentioned problems, the present inventors have synergistically improved the migration and affinity to tumor tissue by using a combination of multiple types of tumor tissue affinity peptides. I devised a possibility. In fact, by modifying the membrane surface of liposomes containing a compound having anti-malignant tumor activity with multiple types of tumor tissue affinity peptides, the tumor tissue affinity action of these peptides is synergistically improved, and intravascular The present inventors completed the present invention by finding that the antitumor activity when administered to the liposome was significantly increased as compared with liposomes without peptide modification and liposomes modified with a single tumor tissue affinity peptide, and without an increase in toxicity. It came to do.
The liposome used in the liposome preparation of the present invention is a closed vesicle having an inner aqueous phase portion surrounded by a lipid bilayer formed by dispersing phospholipids constituting a cell membrane in water as described above. There are three types of multiphase liposomes (MLV), large unilamellar liposomes (LUV), and small unilamellar liposomes (SUV) depending on the size and number of lipid bimolecules. are categorized. Any kind of liposome can be used in the present invention. The liposome of the present invention forms a stable liposome structure before and after administration in vivo.
Since the fluidity and membrane permeability of the bilayer membrane constituting the liposome greatly increase with the phase transition temperature as a boundary, it is generally preferable to use a phospholipid having a phase transition temperature of 37 ° C. or higher. Examples of such phospholipids include hydrogenated purified egg yolk phosphatidylcholine (phase transition temperature 50-60 ° C., hereinafter referred to as HEPC), hydrogenated purified soybean phosphatidylcholine (phase transition temperature approximately 55 ° C., hereinafter referred to as HSPC), dipalmitoyl. It is selected from phosphatidylcholine (phase transition temperature of about 41 ° C., hereinafter referred to as DPPC) and distearoyl phosphatidylcholine (phase transition temperature of about 58 ° C., hereinafter referred to as DSPC), more preferably DSPC and DPPC. These can be used alone or in combination. In addition to these phospholipids, the liposomes used in the present invention are preferably used in admixture with stabilizers such as cholesterol derivatives that have been reported to improve liposome stability. The molar ratio of cholesterol derivative and phospholipid is preferably 1: 0.3 to 3, more preferably 1: 1 to 2.5.
Further, as an isotonic agent, for example, glycerin, glucose, sodium chloride and the like can be added. Furthermore, antiseptics such as parabens, chlorobutanol, benzyl alcohol, propylene glycol and the like may be added.
The tumor tissue affinity peptide used in the present invention is not particularly limited as long as it is a peptide that exhibits directivity to tumor tissue when bound to the surface of a liposome, but a peptide containing an RGD sequence, a peptide containing a PRP sequence, Examples include peptides containing a PLPL sequence and peptides containing an NGR sequence. In addition, peptides other than those described above may be bound.
Furthermore, examples of the tumor tissue affinity peptide used in the present invention include a peptide containing two or more sequences selected from the group consisting of an RGD sequence, a PRP sequence, a PLPL sequence, and an NGR sequence in one peptide.
The peptide containing the RGD sequence used in the present invention may be a peptide containing the amino acid sequence of arginine-glycine-aspartic acid, and can be prepared by a known method in the peptide synthesis field. The peptide may be linear or cyclic. For example, GRGDS, GRGDL, GRGDR, GRGDF can be exemplified.
The peptide containing the PRP sequence used in the present invention may be a peptide containing the amino acid sequence of proline-arginine-proline, and can be prepared by a known method in the peptide synthesis field. For example, APRPG, GPRPL, and GPRPR can be exemplified.
The peptide containing the PLPL sequence used in the present invention may be a peptide containing the amino acid sequence of proline-leucine-proline-leucine, and can be prepared by a known method in the field of peptide synthesis. For example, GPLPLR, HPLPLS, PVPLP, and PLPLVR can be exemplified.
The peptide containing the NGR sequence used in the present invention may be any peptide containing the amino acid sequence of asparagine-glycine-arginine, and can be prepared by a known method in the peptide synthesis field. For example, CNGRC and CNGRG can be exemplified.
As described in Examples below, by introducing two or more kinds of tumor tissue-affinity peptides into the liposome membrane, a liposome preparation having improved tumor tissue affinity and reduced side effects can be prepared. . In the liposome preparation of the present invention, it is more preferable to introduce 2 to 4 kinds of tumor tissue affinity peptides. The combination of two types of tumor tissue affinity peptides in the liposome preparation of the present invention includes a peptide containing an RGD sequence and a peptide containing a PRP sequence; a peptide containing an RGD sequence and a peptide containing a PLPL sequence; a peptide containing an RGD sequence and an NGR Peptides containing sequences; peptides containing PRP sequences and peptides containing PLPL sequences; peptides containing PRP sequences and peptides containing NGR sequences; peptides containing PLPL sequences and peptides containing NGR sequences. Preferable are a peptide containing an RGD sequence and a peptide containing a PRP sequence.
The molar ratio of the two kinds of tumor tissue affinity peptides in the liposome preparation of the present invention can be arbitrarily set depending on the drug to be encapsulated and the cancer to be treated. For example, when using a peptide containing an RGD sequence and a peptide containing a PRP sequence Peptide containing RGD sequence: Peptide containing PRP sequence = 1: 0.1-10 is preferable, 1: 0.3-3 is more preferable, and 1: 1 is more preferable.
The combination of the three types of tumor tissue affinity peptides in the liposome preparation of the present invention includes a peptide containing an RGD sequence, a peptide containing a PRP sequence and a peptide containing a PLPL sequence; a peptide containing an RGD sequence, and a peptide containing a PRP sequence And a peptide containing an NGR sequence; a peptide containing an RGD sequence, a peptide containing a PLPL sequence and a peptide containing an NGR sequence; a peptide containing a PRP sequence, a peptide containing a PLPL sequence, and a peptide containing an NGR sequence. Preferable are a peptide containing an RGD sequence, a peptide containing a PRP sequence, and a peptide containing an NGR sequence.
The molar ratio of the three types of tumor tissue-affinity peptides in the liposome preparation of the present invention can be arbitrarily set depending on the drug to be encapsulated and the cancer to be treated. For example, a peptide containing an RGD sequence, a peptide containing a PRP sequence, and an NGR sequence When a peptide containing RGD is used, a peptide containing RGD sequence: a peptide containing PRP sequence: a peptide containing NGR sequence = 1: 0.1-10: 0.1-10 is preferred, and 1: 0.3-3: 0 3 to 3 is more preferable, and 1: 1: 1 is more preferable.
Furthermore, examples of the combination of four types of tumor tissue affinity peptides in the liposome preparation of the invention include a peptide containing an RGD sequence, a peptide containing a PRP sequence, a peptide containing a PLPL sequence, and a peptide containing an NGR sequence.
The molar ratio of the four types of tumor tissue-affinity peptides in the liposome preparation of the present invention can be arbitrarily set according to the drug to be encapsulated and the cancer to be treated. For example, a peptide containing an RGD sequence, a peptide containing a PRP sequence, and a PLPL sequence When a peptide containing NGR and a peptide containing NGR sequence are used, a peptide containing RGD sequence: a peptide containing PRP sequence: a peptide containing PLPL sequence: a peptide containing NGR sequence = 1: 0.1-10: 0.1-10 : 0.1-10 is preferable, 1: 0.3-3: 0.3-3: 0.3-3 are more preferable, and 1: 1: 1: 1 are more preferable.
The number of amino acids constituting the tumor tissue affinity peptide used in the present invention is preferably from 3 to 15, more preferably from 4 to 12, from the viewpoint of low antigenicity, ease of modification to liposomes and low production costs. 5 to 10 is particularly preferable. Specific examples of amino acids constituting the tumor tissue affinity peptide used in the present invention include arginine, glycine, aspartic acid, proline, leucine, phenylalanine, serine, histidine, asparagine, cysteine and the like.
The molar ratio between the phospholipid used in the present invention and the total amount of each peptide having affinity for tumor tissue is preferably 1: 0.01 to 0.3, more preferably 1: 0.05 to 0.2, and 1: 0. .1 is particularly preferred.
There are two methods for introducing a tumor tissue affinity peptide into the liposome membrane: a method using chemical bonding and a method that does not use chemical bonding, but it is desirable to select the latter method in order to avoid denaturation of the liposome membrane. . Specific examples of the latter include a stearoyl group, an acyl group (for example, Japanese Patent No. 2620729), a cholesteryl group (for example, Japanese Patent No. 2579730), a phospholipid (for example, Japanese Patent Application Laid-Open No. 04-099795) and the like. The hydrophobic side chain is bound to the lipid membrane part of the liposome by mixing the hydrophobic side chain of the tumor and preparing the liposome by mixing the tumor tissue affinity peptide to which the hydrophobic side chain is bound with other lipid components. In addition, it is possible to produce peptide-modified liposomes in which a tumor tissue affinity peptide is introduced on the surface of the liposome membrane. When multiple types of tumor tissue affinity peptides are introduced into the liposome membrane, as long as these peptides do not show adverse physicochemical interactions, the above-described case of a single tumor tissue affinity peptide is used. Can be prepared by the method. The binding direction of the hydrophobic side chain is arbitrary. For example, in the case of a peptide containing an RGD sequence, the hydrophobic side chain may bind to either the R side or the D side, but is preferably the R side.
The liposome preparation of the present invention is prepared by a known method. Known methods for preparing liposome preparations include, for example, the reverse phase evaporation method [Proc. Natl. Acad. Sci. USA], 75, 4194 (1978), WO 97/48398], freeze-thaw method [Arches of Biochemistry and Biophysics, 212, 186 (1981)], pH gradient method [Biokimika et. Biophysica Acta (Biochem. Biophys. Acta), 816, 294 (1985), JP-A-7-165560] and the like.
Among these, the pH gradient method is useful when encapsulating drugs having greatly different solubility depending on pH in liposomes at a high inclusion rate. As a method for preparing the liposome preparation of the present invention by the pH gradient method, for example, a tumor tissue affinity peptide bound with a lipid component and a hydrophobic side chain is dissolved in a solvent such as chloroform, ether, ethanol, etc., and then placed in an eggplant type flask. The solvent is distilled off under reduced pressure to form a lipid film. Next, a weakly acidic buffer is added to the thin film, freeze-thawed, and a large multiphase liposome (MLV) having a weakly acidic inner aqueous phase is prepared. Furthermore, after making small unilamellar liposomes (SUV) by the extrusion method, etc., neutral buffer is added to make the outer aqueous phase neutral (the difference in pH between the inner aqueous phase and the outer aqueous phase is 3 or more) Is desirable). An aqueous solution of the drug is added thereto and incubated at a temperature about 10 ° C. higher than the phase transition temperature of the lipid bilayer membrane. By the above operation, the drug can be encapsulated at a high rate and quantitatively inside the liposome.
It has been reported that the particle size of liposomes has a great influence on the biodistribution of encapsulated drugs and the delivery to tumor tissue [Biological and Pharmaceutical Bulletin, 17, 935 (1994)]. Therefore, in the present invention, it is preferable to carry out sizing treatment in order to make the particle size of the drug-encapsulating liposomes appropriate and uniform. For example, using an extruder (manufactured by Lipex Biomembrane, etc.), an appropriate pore size is used. It is desirable that the average particle size is adjusted to 50 to 200 nm, preferably 75 to 125 nm, by passing through a membrane filter several times.
In addition, the membrane surface of the liposome is modified with a ligand such as a polyethylene glycol derivative, if necessary, to reduce the interaction with the plasma protein after the liposome has been administered into the blood vessel, and to reticulate the liver Kupffer cells. Uptake into endothelial cells can be suppressed, and the transferability of liposomes to tumor tissue and the like can be further improved.
Through the above operation, the liposome preparation of the present invention is prepared, and if necessary, a drug that has not been encapsulated in the liposome by performing ultracentrifugation treatment, gel filtration treatment, ultrafiltration treatment and dialysis treatment alone or in combination as appropriate. Can be removed.
The liposome preparation of the present invention obtained by the above method can be used as it is, but it can be freeze-dried by adding excipients such as mannitol, trehalose, lactose, glycine in consideration of the storage period, storage conditions, etc. . Further, a cryopreservation agent such as glycerin may be added and stored frozen.
The type of drug encapsulated in the liposomal preparation of the present invention is not particularly limited, but the liposomal preparation of the present invention has excellent affinity for tumor tissue, so long as it has activity in tumor tissue. preferable. Specific antitumor active substances are not particularly limited. For example, alkylating agents, various antimetabolites, antitumor antibiotics, other antitumor agents, antitumor plant components, BRM (biological response control) Substance), angiogenesis inhibitors, cell adhesion inhibitors, matrix metalloprotease inhibitors or hormones.
More specifically, examples of the alkylating agent include chloroethylamine alkylating agents such as nitrogen mustard, nitrogen mustard N-oxide, ifosfamide, melphalan, cyclophosphamide, and chlorambucil; for example, carbocon, thiotepa Aziridine-based alkylating agents such as dibromomannitol and dibromodulcitol; for example, nitrosourea-based alkylating such as carmustine, lomustine, semustine, nimustine hydrochloride, chlorozotocin and ranimustine Agents; sulfonic acid esters such as busulfan, improsulfan tosylate and pipersulfan; dacarbazine; procarbazine and the like.
Examples of various antimetabolites include, for example, purine antimetabolites such as 6-mercaptopurine, azathioprine, 6-thioguanine, thioinosine; fluorouracil, tegafur, tegafur uracil, tegafur, gimeracil, oteracil potassium, carmofur, doxyfluridine, Examples include pyrimidine antimetabolites such as broxuridine, cytarabine, and enocitabine; antifolate antimetabolites such as methotrexate and trimetrexate, and salts or complexes thereof.
Antitumor antibiotics include, for example, anthracyclines such as daunorubicin, aclarubicin, doxorubicin, pirarubicin and epirubicin; actinomycins such as actinomycin D; chromomycins such as chromomycin A3; mitomycins such as mitomycin C; And bleomycins such as bleomycin and peplomycin; and salts or complexes thereof.
Examples of other antitumor agents include cisplatin, carboplatin, oxaliplatin, TAS-103, tamoxifen, L-asparaginase, acebraton, schizophyllan, picibanil, ubenimex, krestin and the like, and salts or complexes thereof.
Examples of the antitumor plant component include plant alkaloids such as camptothecin, vindesine, vincristine and vinblastine; epipodophyllotoxins such as etoposide and teniposide; and salts or complexes thereof. In addition, examples include pipbloman, neocartinostatin, and hydroxyurea.
Examples of the BRM include tumor necrosis factor, indomethacin, and salts or complexes thereof.
Examples of the angiogenesis inhibitor include fumagillol derivatives and salts or complexes thereof.
Examples of the cell adhesion inhibitor include substances having an RGD sequence, and salts or complexes thereof.
Examples of matrix metalloprotease inhibitors include marimastat, batimastat and the like, and salts or complexes thereof.
Examples of hormones include hydrocortisone, dexamethasone, methylprednisolone, prednisolone, plasterone, betamethasone, triamcinolone, oxymetholone, nandrolone, methenolone, phosfestol, ethinyl estradiol, chlormadinone, medroxyprogesterone, and salts or complexes thereof. Can be mentioned.
Examples of drug forms include low molecular weight compounds, peptides, proteins, antibodies, siRNA, and genes.
The liposome preparation of the present invention is generally used as an injection (intravenous, intramuscular or subcutaneous preparation) after being suspended or diluted with a physiologically acceptable aqueous solution at the time of use. It can also be used as a nasal agent, inhalant, suppository, transdermal absorbent, transmucosal absorbent and the like. The final product is a malignant tumor (lung cancer of mammals such as humans, digestive organ cancer (esophageal cancer, stomach cancer, rectal cancer, colon cancer, etc.), breast cancer, head and neck cancer, liver cancer, gallbladder cancer. , Pancreatic cancer, gynecological cancer (uterine cancer, cervical cancer, ovarian cancer, etc.), urological cancer (renal cancer, bladder cancer, prostate cancer, etc.), brain tumor, leukemia, melanoma, malignant It may be designed so that an effective amount for the treatment and remission of lymphoma etc. is administered. For example, 0.01 to 10,000 mg of an antitumor active substance may be contained as a liposome preparation for intravenous administration. The dosage of the active ingredient contained in the liposome preparation of the present invention is preferably 0.01 to 1000 mg / day.

図１は試験例３の抗腫瘍効果を示すグラフである。
図２は試験例３のマウスの体重変化を示すグラフである。
図３は試験例４の抗腫瘍効果を示すグラフである。
図４は試験例４のマウスの体重変化を示すグラフである。FIG. 1 is a graph showing the antitumor effect of Test Example 3.
FIG. 2 is a graph showing changes in body weight of the mice of Test Example 3.
FIG. 3 is a graph showing the antitumor effect of Test Example 4.
FIG. 4 is a graph showing changes in body weight of the mice of Test Example 4.

以下に実施例および試験例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to Examples and Test Examples, but the present invention is not limited thereto.

実施例１（複数のペプチドで修飾したＴＡＳ−１０３リポソーム製剤）
ＤＳＰＣ４０μｍｏｌ、コレステロール２０μｍｏｌ、ステアロイル化したＰＲＰ配列を含むペプチド（Ｃ１８−ＡＰＲＰＧ）４μｍｏｌ及びステアロイル化したＲＧＤ配列を含むペプチド（Ｃ１８−ＧＲＧＤＳ）４μｍｏｌをナス型フラスコに入れ（脂質構成：ＤＳＰＣ／コレステロール／Ｃ１８−ＡＰＲＰＧ／Ｃ１８−ＧＲＧＤＳ＝１０／５／０．５／０．５）、５ｍＬのクロロホルムを加えた。エバポレーターで減圧下、クロロホルムを留去し、ナス型フラスコの内壁面に脂質薄膜を形成させた。さらにデシケーター内で１時間真空乾燥した。次に０．３Ｍクエン酸溶液（ｐＨ４．０）１ｍＬで水和後、凍結融解を３回行った。バス型ソニケーターを用いて１０分間超音波処理した後、エクストルーダー（リペックスバイオメンブラン社製）を用い、孔径１００ｎｍのポリカーボネートメンブランフィルター（ヌクレポア）に３回通過させてリポソームの平均粒子径を約１００ｎｍに調節した。次に０．５Ｍ炭酸ナトリウム溶液０．７６７ｍＬを加えてｐＨ７．５とし、さらに２０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）を加えて全量を２ｍＬとし、得られたリポソーム溶液を６０℃に静置した。
次に、トポイソメラーゼ阻害活性を有する抗腫瘍活性物質ＴＡＳ−１０３（化学名：６−［〔２−（ジメチルアミノ）エチル〕アミノ］−３−ヒドロキシ−７Ｈ−インデノ［２、１−ｃ］キノリン−７−オン・二塩酸塩）を２０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液に５ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解した溶液１ｍＬを加え、６０℃で３０分間振とうインキュベートすることによりＴＡＳ−１０３をリポソーム内に封入した。さらに、封入されていないＴＡＳ−１０３を除去するために、超遠心分離（９００００ｒｐｍ、１５ｍｉｎ、４℃）を３回行い上清を除去した後、リン酸緩衝液〔ＰＢＳ（−）〕を用いて懸濁し、ＡＰＲＰＧペプチド及びＧＲＧＤＳペプチドで修飾したＴＡＳ−１０３包含リポソーム製剤（ＡＰＲＰＧ・ＧＲＧＤＳ−ｌｉｐｏ．ＴＡＳ−１０３）を調製した。リポソームの平均粒子径は０．２μｍであった。
比較例１（単独のペプチドで修飾したＴＡＳ−１０３リポソーム製剤）
ＤＳＰＣ４０μｍｏｌ、コレステロール２０μｍｏｌ、Ｃ１８−ＡＰＲＰＧ４μｍｏｌをナス型フラスコに入れ（脂質構成：ＤＳＰＣ／コレステロール／Ｃ１８−ＡＰＲＰＧ＝１０／５／１）、５ｍＬのクロロホルムを加えた。以下、実施例１の方法に従い、ＡＰＲＰＧペプチドで修飾したＴＡＳ−１０３包含リポソーム製剤（ＡＰＲＰＧ−ｌｉｐｏ．ＴＡＳ−１０３）を調製した。リポソームの平均粒子径は０．２μｍであった。
比較例２（単独のペプチドで修飾したＴＡＳ−１０３リポソーム製剤）
ＤＳＰＣ４０μｍｏｌ、コレステロール２０μｍｏｌ、Ｃ１８−ＧＲＧＤＳ４μｍｏｌをナス型フラスコに入れ（脂質構成：ＤＳＰＣ／コレステロール／Ｃ１８−ＧＲＧＤＳ＝１０／５／１）、５ｍＬのクロロホルムを加えた。以下、実施例１の方法に従い、ＧＲＧＤＳペプチドで修飾したＴＡＳ−１０３包含リポソーム製剤（ＧＲＧＤＳ−ｌｉｐｏ．ＴＡＳ−１０３）を調製した。リポソームの平均粒子径は０．２μｍであった。
比較例３（ペプチドで修飾していないＴＡＳ−１０３リポソーム製剤）
ＤＳＰＣ４０μｍｏｌ、コレステロール２０μｍｏｌをナス型フラスコに入れ（脂質構成：ＤＳＰＣ／コレステロール＝１０／５）、５ｍＬのクロロホルムを加えた。以下、実施例１の方法に従い、ペプチドで修飾しないコントロールＴＡＳ−１０３包含リポソーム製剤（ｃｏｎｔ−ｌｉｐｏ．ＴＡＳ−１０３）を調製した。リポソームの平均粒子径は０．２μｍであった。
試験例１（リポソームへのＴＡＳ−１０３の封入率）
実施例１及び比較例１〜３で調製したリポソーム溶液の１０倍希釈液１０μＬに１０％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００ｒｅｄｕｃｅｄ溶液２００μＬおよび０．３Ｍクエン酸緩衝液１７９０μＬを加え混合し、さらに超音波処理を行うことによりリポソーム膜を可溶化した。蛍光光度計を用いて励起波長４６８ｎｍ、蛍光波長５６８ｎｍの条件下における混合溶液の蛍光強度を測定し、あらかじめ作成しておいた検量線からリポソーム内のＴＡＳ−１０３量を求めた。その結果、いずれのリポソーム製剤も、リポソーム内へのＴＡＳ−１０３の封入率は９０％以上であり、高い効率で封入されていることが確認された。
試験例２（ＴＡＳ−１０３リポソームの血清中での安定性）
実施例１及び比較例１〜３で調製したリポソーム溶液を３７℃の５０％未非動化ウシ血清−ＰＢＳ（−）で３時間インキュベートし、放出したＴＡＳ−１０３を遠心分離機で除去した後、試験例１の方法でリポソーム内のＴＡＳ−１０３量を求めた。その結果、インキュベート前と比較して９９％以上の封入率を維持しており、血清中で安定であることが確認された。

試験例３（ＴＡＳ−１０３リポソームの抗腫瘍効果と毒性評価）
抗腫瘍効果の評価に用いる高肺転移性腫瘍細胞株ＬｅｗｉｓＬｕｎｇＣａｒｃｉｎｏｍａを５％ＣＯ_２存在下、３７℃１０％ＦＢＳ（ＦｅｔａｌＢｏｖｉｎｅＳｅｒｕｍ、ウシ胎児血清）−ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓＭｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅ’ｓＭｅｄｉｕｍ、ダルベッコ改変イーグル培地）中で培養し、継代した。５×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製した高肺転移性腫瘍細胞株ＬｅｗｉｓＬｕｎｇＣａｒｃｉｎｏｍａを６週齢雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウスの左腹側部に０．２ｍＬ皮下投与して固形がん担がんマウスを作成した。ＬｅｗｉｓＬｕｎｇＣａｒｃｉｎｏｍａ移植７、１１および１５日後の計３回、コントロールとしてリン酸緩衝液〔ＰＢＳ（−）〕および実施例１ならびに比較例１〜３で調製されたＴＡＳ−１０３封入リポソーム溶液（ＴＡＳ−１０３として２０ｍｇ／ｋｇ）を０．２ｍＬ／ｂｏｄｙ／ｄａｙをマウスの尾静脈内に投与した。がん移植３日後から腫瘍容積を測定することにより、ＴＡＳ−１０３封入リポソーム溶液の抗腫瘍効果を調べた。腫瘍容積は以下の式を用いて算出した。
腫瘍容積（ＴｕｍｏｒＶｏｌｕｍｅ）＝０．４×ａ×ｂ^２
（ａ：腫瘍部位の長径、ｂ：腫瘍部位の短径）
その結果、図１に示すように、ＡＰＲＰＧ・ＧＲＧＤＳ−ｌｉｐｏ．ＴＡＳ−１０３処置群は、ＡＰＲＰＧ−ｌｉｐｏ．ＴＡＳ−１０３処置群、ＧＲＧＤＳ−ｌｉｐｏ．ＴＡＳ−１０３処置群及びｃｏｎｔ−ｌｉｐｏ．ＴＡＳ−１０３処置群に比べ有意な腫瘍増殖抑制効果を示した。なお、ｃｏｎｔ−ｌｉｐｏ．ＴＡＳ−１０３の抗腫瘍効果は、リポソーム化していないＴＡＳ−１０３溶液よりも高いことは以前に確認されている。図１において、＊＊は有意差検定の結果がｐ＜０．０１であることを示し、＊は有意差検定の結果がｐ＜０．０５であることを示す。
また副作用の指標として体重変化を調べた。図２に示すように、すべての群において体重の減少が見られたが、ＡＰＲＰＧ・ＧＲＧＤＳ−ｌｉｐｏ．ＴＡＳ−１０３処置群ではその程度が最も小さかった。
実施例２（複数のペプチドで修飾したドキソルビシンリポソーム製剤）
ＤＳＰＣ２０μｍｏｌ、コレステロール１０μｍｏｌ、ステアロイル化したＰＲＰ配列を含むペプチド（Ｃ１８−ＡＰＲＰＧ）２μｍｏｌ及びステアロイル化したＲＧＤ配列を含むペプチドＣ１８−ＧＲＧＤＳ２μｍｏｌをナス型フラスコに入れ（脂質構成：ＤＳＰＣ／コレステロール／Ｃ１８−ＡＰＲＰＧ／Ｃ１８−ＧＲＧＤＳ＝１０／５／０．５／０．５）、５ｍＬのクロロホルムを加えた。エバポレーターで減圧下、クロロホルムを留去し、ナス型フラスコの内壁面に脂質薄膜を形成させた。さらにデシケーター内で１時間真空乾燥した。次に０．３Ｍクエン酸溶液（ｐＨ４．０）０．５ｍＬで水和後、凍結融解を３回行った。バス型ソニケーターを用いて１０分間超音波処理した後、エクストルーダー（リペックスバイオメンブラン社製）を用い、孔径１００ｎｍのポリカーボネートメンブランフィルター（ヌクレポア）に３回通過させてリポソームの平均粒子径を約１００ｎｍに調節した。次に０．５Ｍ炭酸ナトリウム溶液０．２ｍＬを加えてｐＨ７．５とし、さらに２０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）を加えて全量を１ｍＬとし、調整したリポソーム溶液を６０℃に静置した。
次に、抗腫瘍活性物質塩酸ドキソルビシンを２０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液に２ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解した溶液１ｍＬを加え、６０℃で３０分間振とうインキュベートすることによりドキソルビシンをリポソーム内に封入した。さらに、封入されていない薬物を除去するために、超遠心分離（１０００００ｇ、１０ｍｉｎ、４℃）を３回行い上清を除去した後、０．３Ｍスクロースリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を用いて懸濁し、ＡＰＲＰＧペプチド及びＧＲＧＤＳペプチドで修飾したドキソルビシン包含リポソーム製剤（ＡＰＲＰＧ・ＧＲＧＤＳ−ｌｉｐｏ．ＤＯＸ）を調製した。リポソームの平均粒子径は０．２μｍであった。
比較例５（単独のペプチドで修飾したリポソーム製剤）
ＤＳＰＣ２０μｍｏｌ、コレステロール１０μｍｏｌ、Ｃ１８−ＡＰＲＰＧ２μｍｏｌをナス型フラスコに入れ（脂質構成：ＤＳＰＣ／コレステロール／Ｃ１８−ＡＰＲＰＧ＝１０／５／１）、５ｍＬのクロロホルムを加えた。以下、実施例２の方法に従い、ＡＰＲＰＧペプチドで修飾したドキソルビシン包含リポソーム製剤（ＡＰＲＰＧ−ｌｉｐｏ．ＤＯＸ）を調製した。リポソームの平均粒子径は０．２μｍであった。
比較例６（単独のペプチドで修飾したリポソーム製剤）
ＤＳＰＣ２０μｍｏｌ、コレステロール１０μｍｏｌ、Ｃ１８−ＧＲＧＤＳ２μｍｏｌをナス型フラスコに入れ（脂質構成：ＤＳＰＣ／コレステロール／Ｃ１８−ＧＲＧＤＳ＝１０／５／１）、５ｍＬのクロロホルムを加えた。以下、実施例２の方法に従い、ＧＲＧＤＳペプチドで修飾したドキソルビシン包含リポソーム製剤（ＧＲＧＤＳ−ｌｉｐｏ．ＤＯＸ）を調製した。リポソームの平均粒子径は０．２μｍであった。
比較例７（ペプチドで修飾していないリポソーム製剤）
ＤＳＰＣ２０μｍｏｌ、コレステロール１０μｍｏｌをナス型フラスコに入れ（脂質構成：ＤＳＰＣ／コレステロール＝１０／５）、５ｍＬのクロロホルムを加えた。以下、実施例１の方法に従い、ペプチドで修飾しないコントロールドキソルビシン包含リポソーム製剤（ｃｏｎｔ−ｌｉｐｏ．ＤＯＸ）を調製した。リポソームの平均粒子径は０．２μｍであった。
試験例４（ドキソルビシンリポソームの抗腫瘍効果と毒性評価）
抗腫瘍効果の評価に用いるマウス大腸がん細胞株Ｃｏｌｏｎ２６ＮＬ１７を５％ＣＯ_２存在下、３７℃１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭ／ＨａｍＦ１２中で培養し、継代した。５×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製したＣｏｌｏｎ２６ＮＬ１７を６週齢雄性Ｂａｌｂ／ｃマウスの左腹側部に０．２ｍＬ皮下投与して固形がん担がんマウスを作成した。Ｃｏｌｏｎ２６ＮＬ１７移植１０、１３および１６日後の計３回、コントロールとして０．３Ｍスクロースリン酸緩衝液および実施例２で調製されたドキソルビシン封入リポソーム溶液（ドキソルビシンとして５ｍｇ／ｋｇ）を０．２ｍＬ／ｂｏｄｙ／ｄａｙをマウスの尾静脈内に投与した。がん移植８日後から腫瘍容積を測定することにより、ドキソルビシン封入リポソーム溶液の抗腫瘍効果を調べた。評価方法は試験例３と同じである。
その結果、図３に示すように、ＡＰＲＰＧ・ＧＲＧＤＳ−ｌｉｐｏ．ＤＯＸ処置群は、ＡＰＲＰＧ−ｌｉｐｏ．ＤＯＸ処置群、ＧＲＧＤＳ−ｌｉｐｏ．ＤＯＸ処置群及びｃｏｎｔ−ｌｉｐｏ．ＤＯＸ処置群に比べ有意な腫瘍増殖抑制効果を示した。なお、ｃｏｎｔ−ｌｉｐｏ．ＤＯＸの抗腫瘍効果は、リポソーム化していない塩酸ドキソルビシン溶液よりも高いことは以前に確認されている。図３において、＊は有意差検定の結果がｐ＜０．０５であることを示す。
また副作用の指標として体重変化を調べた。図４に示すように、ＡＰＲＰＧ・ＧＲＧＤＳ−ｌｉｐｏ．ＤＯＸ処置群では体重減少は認められなかった。
これらの試験結果より、複数の腫瘍組織親和性ペプチドで修飾した抗腫瘍活性物質封入リポソーム製剤は、リポソーム化していない溶液、通常のリポソーム製剤はもとより単独のペプチドで修飾したリポソームと比較しても有意に抗腫瘍活性を増強し、毒性を軽減することが示された。抗がん活性の増強の原因は、標的分子の異なる複数の腫瘍組織親和性ペプチドが相乗的に寄与することによって、抗腫瘍活性物質の腫瘍組織への到達性、親和性が著しく向上したためと考えられる。 Example 1 (TAS-103 liposome preparation modified with a plurality of peptides)
DSPC 40 μmol, cholesterol 20 μmol, stearoylated PRP sequence-containing peptide (C18-APRPG) 4 μmol and stearoylated RGD sequence-containing peptide (C18-GRGDS) 4 μmol were placed in an eggplant flask (lipid composition: DSPC / cholesterol / C18- APRPG / C18-GRGDS = 10/5 / 0.5 / 0.5) 5 mL of chloroform was added. Chloroform was distilled off under reduced pressure with an evaporator to form a lipid thin film on the inner wall surface of the eggplant type flask. Furthermore, it was vacuum-dried in a desiccator for 1 hour. Next, it was hydrated with 1 mL of 0.3 M citric acid solution (pH 4.0), and freeze-thawed three times. After ultrasonic treatment for 10 minutes using a bath-type sonicator, the average particle size of the liposome was about 100 nm by passing it through a polycarbonate membrane filter (Nuclepore) having a pore size of 100 nm three times using an extruder (manufactured by Lipex Biomembrane). Adjusted. Next, 0.767 mL of 0.5 M sodium carbonate solution was added to adjust the pH to 7.5, and 20 mM HEPES buffer (pH 7.5) was further added to adjust the total volume to 2 mL. The resulting liposome solution was allowed to stand at 60 ° C.
Next, an antitumor active substance TAS-103 having a topoisomerase inhibitory activity (chemical name: 6-[[2- (dimethylamino) ethyl] amino] -3-hydroxy-7H-indeno [2,1-c] quinoline- 1 mL of a solution of 7-one dihydrochloride) dissolved in 20 mM HEPES buffer at a concentration of 5 mg / mL was added and incubated at 60 ° C. for 30 minutes to encapsulate TAS-103 in liposomes. Furthermore, in order to remove TAS-103 which has not been encapsulated, ultracentrifugation (90000 rpm, 15 min, 4 ° C.) was performed three times to remove the supernatant, and then a phosphate buffer [PBS (−)] was used. The suspension was suspended, and a TAS-103-containing liposome preparation (APRPG · GRGDS-lipo.TAS-103) modified with the APRPG peptide and the GRGDS peptide was prepared. The average particle diameter of the liposome was 0.2 μm.
Comparative Example 1 (TAS-103 liposome preparation modified with a single peptide)
DSPC 40 [mu] mol, cholesterol 20 [mu] mol, C18-APRPG 4 [mu] mol were placed in an eggplant type flask (lipid composition: DSPC / cholesterol / C18-APRPG = 10/5/1), and 5 mL of chloroform was added. Hereinafter, according to the method of Example 1, a TAS-103-containing liposome preparation (APRPG-lipo.TAS-103) modified with an APRPG peptide was prepared. The average particle diameter of the liposome was 0.2 μm.
Comparative Example 2 (TAS-103 liposome preparation modified with a single peptide)
DSPC 40 μmol, cholesterol 20 μmol, and C18-GRGDS 4 μmol were placed in an eggplant type flask (lipid composition: DSPC / cholesterol / C18-GRGDS = 10/5/1), and 5 mL of chloroform was added. Hereinafter, according to the method of Example 1, a TAS-103-containing liposome preparation (GRGDS-lipo.TAS-103) modified with a GRGDS peptide was prepared. The average particle diameter of the liposome was 0.2 μm.
Comparative Example 3 (TAS-103 liposome preparation not modified with peptide)
DSPC 40 μmol and cholesterol 20 μmol were placed in an eggplant-shaped flask (lipid composition: DSPC / cholesterol = 10/5), and 5 mL of chloroform was added. Hereinafter, according to the method of Example 1, a control TAS-103-containing liposome preparation (cont-lipo.TAS-103) not modified with a peptide was prepared. The average particle diameter of the liposome was 0.2 μm.
Test Example 1 (Encapsulation rate of TAS-103 in liposome)
200 μL of 10% Triton X-100 reduced solution and 1790 μL of 0.3 M citrate buffer solution are mixed with 10 μL of the 10-fold diluted solution of the liposome solution prepared in Example 1 and Comparative Examples 1 to 3, and then sonicated. Solubilized the liposome membrane. The fluorescence intensity of the mixed solution under the conditions of an excitation wavelength of 468 nm and a fluorescence wavelength of 568 nm was measured using a fluorometer, and the amount of TAS-103 in the liposome was determined from a calibration curve prepared in advance. As a result, it was confirmed that any of the liposome preparations had an encapsulation rate of TAS-103 in the liposome of 90% or more and was encapsulated with high efficiency.
Test Example 2 (Stability of TAS-103 liposome in serum)
The liposome solution prepared in Example 1 and Comparative Examples 1 to 3 was incubated with 50% non-immobilized bovine serum-PBS (−) at 37 ° C. for 3 hours, and the released TAS-103 was removed by a centrifuge. The amount of TAS-103 in the liposome was determined by the method of Test Example 1. As a result, it was confirmed that the encapsulation rate of 99% or more was maintained compared with that before the incubation, and that it was stable in serum.

Test Example 3 (Anti-tumor effect and toxicity evaluation of TAS-103 liposome)
High lung metastatic tumor cell line Lewis Lung Carcinoma used for evaluation of anti-tumor effect was obtained by adding 10% FBS (Fetal Bovine Serum, Fetal Bovine Serum) -DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) in the presence of 5% CO _2. , Dulbecco's modified Eagle medium) and subcultured. A solid lung cancer-bearing mouse was prepared by subcutaneously administering 0.2 mL of the highly lung metastatic tumor cell line Lewis Lung Carcinoma prepared at 5 × 10 ⁶ cells / mL to the left ventral side of 6-week-old male C57BL / 6 mice. Created. Lewis Lung Carcinoma transplantation Three times after 7, 11 and 15 days, as a control, phosphate buffer [PBS (−)] and TAS-103 encapsulated liposome solution prepared in Example 1 and Comparative Examples 1 to 3 (TAS−) 20 mg / kg) was administered at 0.2 mL / body / day into the tail vein of mice. The antitumor effect of the TAS-103-encapsulated liposome solution was examined by measuring the tumor volume 3 days after cancer transplantation. Tumor volume was calculated using the following formula.
Tumor Volume = 0.4 × a × b ²
(A: major axis of the tumor site, b: minor axis of the tumor site)
As a result, as shown in FIG. 1, APRPG · GRGDS-lipo. The TAS-103 treatment group is APRPG-lipo. TAS-103 treatment group, GRGDS-lipo. TAS-103 treatment group and cont-lipo. Compared with the TAS-103 treatment group, the tumor growth inhibitory effect was significant. Note that cont-lipo. It has been previously confirmed that the antitumor effect of TAS-103 is higher than that of TAS-103 solution that is not liposome-modified. In FIG. 1, ** indicates that the result of the significant difference test is p <0.01, and * indicates that the result of the significant difference test is p <0.05.
In addition, changes in body weight were examined as an index of side effects. As shown in FIG. 2, weight loss was observed in all groups, but APRPG · GRGDS-lipo. The degree was the smallest in the TAS-103 treatment group.
Example 2 (doxorubicin liposome preparation modified with a plurality of peptides)
20 μmol of DSPC, 10 μmol of cholesterol, 2 μmol of peptide containing stearoylated PRP sequence (C18-APRPG) and 2 μmol of peptide C18-GRGDS containing stearoylated RGD sequence were placed in an eggplant type flask (lipid composition: DSPC / cholesterol / C18-APRPG / C18-GRGDS = 10/5 / 0.5 / 0.5) and 5 mL of chloroform was added. Chloroform was distilled off under reduced pressure with an evaporator to form a lipid thin film on the inner wall surface of the eggplant type flask. Furthermore, it was vacuum-dried in a desiccator for 1 hour. Next, it was hydrated with 0.5 mL of 0.3 M citric acid solution (pH 4.0), and freeze-thawed three times. After ultrasonic treatment for 10 minutes using a bath-type sonicator, the average particle size of the liposome was about 100 nm by passing it through a polycarbonate membrane filter (Nuclepore) having a pore size of 100 nm three times using an extruder (manufactured by Lipex Biomembrane). Adjusted. Next, 0.2 mL of 0.5 M sodium carbonate solution was added to adjust the pH to 7.5, and 20 mM HEPES buffer (pH 7.5) was further added to adjust the total volume to 1 mL. The prepared liposome solution was allowed to stand at 60 ° C.
Next, 1 mL of a solution obtained by dissolving the antitumor active substance doxorubicin hydrochloride in a 20 mM HEPES buffer solution at a concentration of 2 mg / mL was added, and the mixture was incubated at 60 ° C. for 30 minutes to encapsulate doxorubicin in liposomes. Furthermore, in order to remove the unencapsulated drug, ultracentrifugation (100,000 g, 10 min, 4 ° C.) was performed three times to remove the supernatant, and then 0.3 M sucrose phosphate buffer (pH 7.4) was used. And a doxorubicin-containing liposome preparation (APRPG · GRGDS-lipo.DOX) modified with the APRPG peptide and the GRGDS peptide. The average particle diameter of the liposome was 0.2 μm.
Comparative Example 5 (Liposome preparation modified with a single peptide)
DSPC 20 μmol, cholesterol 10 μmol, and C18-APRPG 2 μmol were placed in an eggplant type flask (lipid composition: DSPC / cholesterol / C18-APRPG = 10/5/1), and 5 mL of chloroform was added. Hereinafter, according to the method of Example 2, a doxorubicin-containing liposome preparation (APRPG-lipo.DOX) modified with an APRPG peptide was prepared. The average particle diameter of the liposome was 0.2 μm.
Comparative Example 6 (Liposome preparation modified with a single peptide)
DSPC 20 μmol, cholesterol 10 μmol, and C18-GRGDS 2 μmol were placed in an eggplant type flask (lipid composition: DSPC / cholesterol / C18-GRGDS = 10/5/1), and 5 mL of chloroform was added. Hereinafter, according to the method of Example 2, a doxorubicin-containing liposome preparation (GRGDS-lipo.DOX) modified with a GRGDS peptide was prepared. The average particle diameter of the liposome was 0.2 μm.
Comparative Example 7 (Liposome preparation not modified with peptide)
20 μmol of DSPC and 10 μmol of cholesterol were placed in an eggplant-shaped flask (lipid composition: DSPC / cholesterol = 10/5), and 5 mL of chloroform was added. Hereinafter, according to the method of Example 1, a controlled doxorubicin-containing liposome preparation (cont-lipo.DOX) not modified with a peptide was prepared. The average particle diameter of the liposome was 0.2 μm.
Test Example 4 (Anti-tumor effect and toxicity evaluation of doxorubicin liposome)
The mouse colon cancer cell line Colon26NL17 used for evaluation of the antitumor effect was cultured in 37% C 10% FBS-DMEM / Ham F12 in the presence of 5% CO ₂ and subcultured. Colon 26NL17 prepared to 5 × 10 ⁶ cells / mL was subcutaneously administered to the left ventral part of 6-week-old male Balb / c mice by 0.2 mL to prepare solid cancer-bearing mice. Colon 26NL17 transplantation Three times after 10, 13 and 16 days, 0.3M sucrose phosphate buffer as a control and doxorubicin-encapsulated liposome solution prepared in Example 2 (5 mg / kg as doxorubicin) at 0.2 mL / body / day Was administered into the tail vein of mice. The antitumor effect of the doxorubicin-encapsulated liposome solution was examined by measuring the tumor volume 8 days after cancer transplantation. The evaluation method is the same as in Test Example 3.
As a result, as shown in FIG. 3, APRPG · GRGDS-lipo. The DOX treatment group is APRPG-lipo. DOX treatment group, GRGDS-lipo. DOX treatment group and cont-lipo. Compared to the DOX treatment group, it showed a significant tumor growth inhibitory effect. Note that cont-lipo. It has been previously confirmed that the antitumor effect of DOX is higher than that of non-liposomal doxorubicin hydrochloride solution. In FIG. 3, * indicates that the result of the significant difference test is p <0.05.
In addition, changes in body weight were examined as an index of side effects. As shown in FIG. 4, APRPG · GRGDS-lipo. No weight loss was observed in the DOX treatment group.
From these test results, antitumor active substance-encapsulated liposome preparations modified with multiple tumor tissue-affinity peptides are significant compared to non-liposomal solutions, normal liposome preparations, and liposomes modified with a single peptide. Has been shown to enhance antitumor activity and reduce toxicity. The reason for the enhancement of anti-cancer activity is thought to be that the reachability and affinity of anti-tumor active substances to tumor tissues has been significantly improved by the synergistic contribution of multiple tumor tissue affinity peptides with different target molecules. It is done.

本発明のリポソーム製剤は、内包した抗悪性腫瘍活性を有する物質の効果を増強し、毒性を低下する作用が従来のリポソーム製剤よりも明らかに優れていることが示されたことから、悪性腫瘍の実際の治療において、副作用を軽減しながらがんの進行を抑えることが大いに期待できる。 Since the liposome preparation of the present invention has been shown to enhance the effect of the encapsulated anti-malignant tumor activity effect and reduce the toxicity, it is clearly superior to conventional liposome preparations. In actual treatment, it is highly expected to suppress the progression of cancer while reducing side effects.

Claims

A liposome preparation comprising an antitumor active substance and two kinds of tumor tissue affinity peptides bound to the liposome surface , wherein the tumor tissue affinity peptide is a peptide containing an RGD sequence and a peptide containing a PRP sequence A liposome preparation characterized by the above .

2. The liposome preparation according to claim 1, wherein each tumor tissue affinity peptide has 3 to 15 amino acids.

The liposome preparation according to any one of claims 1 to 2, wherein the peptide containing an RGD sequence is GRGDS and the peptide containing a PRP sequence is APRPG.

The liposome preparation according to any one of claims 1 to 3, wherein the molar ratio of the peptide containing an RGD sequence to the peptide containing a PRP sequence is 1: 0.1 to 10.

The liposome preparation according to any one of claims 1 to 4 , wherein at least one of the lipid components is dipalmitoyl phosphatidylcholine or distearoyl phosphatidylcholine.