JP4856752B2

JP4856752B2 - 薬物含有ナノ粒子の製造方法

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Publication number: JP4856752B2
Application number: JP2009271437A
Authority: JP
Inventors: 広行辻本; 雄亮塚田; 香織原; 容平板東
Original assignee: Hosokawa Micron Corp
Current assignee: Hosokawa Micron Corp
Priority date: 2009-11-30
Filing date: 2009-11-30
Publication date: 2012-01-18
Anticipated expiration: 2029-11-30
Also published as: JP2011111429A

Description

本発明は、乳酸・グリコール酸共重合体に生物活性成分を封入した薬物含有ナノ粒子の製造方法に関するものである。

近年、病変部位や腫瘍組織への薬物のターゲティング能を高めるとともに、薬効を持続させることで、過剰な薬物投与を抑えようとする技術、いわゆるDrug Delivery System（以下、ＤＤＳという）が考案され、盛んに研究されている。ＤＤＳは、薬物を生体適合性の膜（キャリアー）で包むことにより、毛細血管の微小な穴を通り抜けることができる数十〜数百ナノメートル程度の粒子（以下、ナノ粒子という）とし、途中で吸収・分解されることなく目標とする患部に薬物を効果的かつ集中的に送り込み、患部で薬物を放出させる技術であり、薬物の治療効果を高めるだけでなく、副作用の軽減も期待できるというメリットがある。

ナノ粒子を構成する素材としての生体適合性高分子は、生体への刺激・毒性が低く、生体適合性で、投与後に分解して代謝される生体内分解性のものが望ましい。また、内包する薬物を持続して徐々に放出する粒子であることが好ましい。このような素材として、例えば乳酸・グリコール酸共重合体（以下、ＰＬＧＡという）が好適に用いられている。ＰＬＧＡは薬物を内包可能であり、当該薬物の効力を保持したまま長期間保存できることが知られている。さらに、ＰＬＧＡの加水分解・長期半減期の特徴から、数日から１ヶ月単位の徐放ができると考えられる。

ＰＬＧＡを用いた薬物含有ナノ粒子（以下、単にＰＬＧＡナノ粒子という）の製造方法として、例えば特許文献１には、水中エマルジョン溶媒拡散法（Emulsion Solvent Diffusion method；ＥＳＤ法）を用いたＰＬＧＡナノ粒子の製造方法が開示されている。ＥＳＤ法では、ＰＬＧＡを水混和性の有機溶媒（良溶媒）に溶解し、これを貧溶媒となる水中へ添加した際に生じる自己乳化現象により微小なエマルジョン滴が形成される。これと同時に両溶媒が相互拡散して液滴内のＰＬＧＡが沈積し、ナノ粒子が生成するため、比較的穏やかな攪拌条件下においてＰＬＧＡナノ粒子を調製することができる。

このようにして調製されたＰＬＧＡナノ粒子を無菌製剤に臨床応用するためには、何らかの方法でＰＬＧＡナノ粒子を滅菌する必要があるが、ＰＬＧＡのガラス転移点は約４５℃であるため加熱滅菌法は採用できない。そこで、放射線照射や加圧ろ過などの非加熱滅菌法を用いることが考えられる。このうち、放射線照射では薬物とＰＬＧＡが分解して薬物の放出特性等が変化するおそれがある。また、全ての分解物を同定し、それらの毒性試験を行うのは容易ではない。従って、ＰＬＧＡナノ粒子の滅菌法としては加圧ろ過法が好ましい。

加圧ろ過法では、孔径０．２μｍのろ過滅菌用メンブレンフィルターを通過可能なＰＬＧＡナノ粒子を調製する必要がある。しかし、特許文献１の方法により調製された平均粒子径２００〜３００ｎｍのＰＬＧＡナノ粒子では、メンブレンフィルターを通過する粒子は最大でも１０％未満であって、実用に適うものではなかった。

一方、特許文献２には、薬物及びＰＬＧＡを良溶媒に溶解した溶液を、異なる量の水または含水有機溶媒（貧溶媒）に拡散させることにより、ＰＬＧＡナノ粒子の粒子径を調整する方法が開示されている。また、良溶媒（アセトン）に対するＰＬＧＡの濃度を下げることでＰＬＧＡナノ粒子の粒子径を小さくできることも記載されている。

特開２００５−２１３１７０号公報特開２００６−１３１５７７号公報

ところで、ＰＬＧＡナノ粒子を実用化するためには、乾燥させたＰＬＧＡナノ粒子粉末が水中で再分散可能であることが要求される。ＰＬＧＡナノ粒子粉末の再分散性を高めるためには、貧溶媒中にポリビニルアルコール（ＰＶＡ）を添加してＰＬＧＡナノ粒子表面をＰＶＡで被覆することが有効である。

しかしながら、ＰＶＡ水溶液を貧溶媒とし、特許文献２のようにアセトンを良溶媒としてろ過滅菌可能なＰＬＧＡナノ粒子を調製しようとすると、アセトンに対するＰＬＧＡ濃度を１ｍｇ／ｍＬ未満まで下げる必要があり、多量のアセトンを使用する上、容器への付着等によりナノ粒子の歩留まりも低くなるため、実用的な製造方法とは言えなかった。

本発明は、上記問題点に鑑み、ろ過滅菌用メンブレンフィルターを通過可能であるＰＬＧＡナノ粒子の簡便且つ効率的な製造方法を提供することを目的とする。

上記目的を達成するために本発明は、ポリビニルアルコール水溶液から成る貧溶媒に、アセトンとエタノールを含む良溶媒中に少なくとも薬物と乳酸・グリコール酸共重合体とを溶解させた良溶媒溶液を加えて、薬物含有ナノ粒子を形成してナノ粒子含有溶液とするナノ粒子形成工程と、前記ナノ粒子含有溶液から前記良溶媒を留去してナノ粒子懸濁液とする留去工程と、を含む薬物含有ナノ粒子の製造方法であって、前記良溶媒及び前記貧溶媒に対する乳酸・グリコール酸共重合体の濃度が共に１ｍｇ／ｍＬ以上６ｍｇ／ｍＬ以下である薬物含有ナノ粒子の製造方法である。

また本発明は、上記構成の薬物含有ナノ粒子の製造方法において、前記留去工程の後に、前記ナノ粒子懸濁液を孔径０．２μｍのメンブレンフィルターを用いて加圧ろ過するろ過滅菌工程を有することを特徴としている。

また本発明は、上記構成の薬物含有ナノ粒子の製造方法において、前記留去工程を４５℃以下の温度で３０時間以内に行うことを特徴としている。

また本発明は、上記構成の薬物含有ナノ粒子の製造方法において、前記ナノ粒子形成工程において、貧溶媒中にカチオン性高分子を溶解させて前記ナノ粒子表面をカチオン性高分子で被覆することを特徴としている。

また本発明は、上記構成の薬物含有ナノ粒子の製造方法において、前記カチオン性高分子がキトサンであり、乳酸・グリコール酸共重合体に対するキトサンの添加量が１重量％以上２０重量％以下であることを特徴としている。

また本発明は、上記構成の薬物含有ナノ粒子の製造方法において、前記良溶媒中のエタノール濃度が１０体積％以上であることを特徴としている。

また本発明は、上記構成の薬物含有ナノ粒子の製造方法において、前記貧溶媒中のポリビニルアルコール濃度が１０重量％以下であることを特徴としている。

本発明の第１の構成によれば、良溶媒に対するＰＬＧＡの濃度を６ｍｇ／ｍＬ以下とすることにより、エマルジョン内に一定密度で形成されるＰＬＧＡナノ粒子の一次サイズを小さくすることができる。さらに貧溶媒に対するＰＬＧＡの濃度を６ｍｇ／ｍＬ以下とすることにより、反応液中でのエマルジョン滴の分散性を高めるとともにＰＬＧＡの沈積速度を速くしてエマルジョン滴の合一を抑制することができる。その結果、ＰＬＧＡナノ粒子の粒子径をろ過滅菌可能な程度まで微小化することができる。一方、良溶媒及び貧溶媒に対するＰＬＧＡの濃度を共に１ｍｇ／ｍＬ以上とすることにより、溶媒使用量を極力少なくして装置の不必要な大型化を防止するとともに、得られるＰＬＧＡナノ粒子の歩留まりも向上する。

また、本発明の第２の構成によれば、上記第１の構成の薬物含有ナノ粒子の製造方法において、留去工程の後に、ＰＬＧＡナノ粒子懸濁液を孔径０．２μｍのメンブレンフィルターを用いて加圧ろ過するろ過滅菌工程を設けることにより、医薬品や化粧品の原料として好適な無菌のＰＬＧＡナノ粒子を簡便に且つ効率良く調製できる。

また、本発明の第３の構成によれば、上記第１または第２の構成の薬物含有ナノ粒子の製造方法において、留去工程を４５℃以下の温度で３０時間以内に行うことにより、ＰＬＧＡナノ粒子同士の融着による加圧ろ過特性の低下を抑制することができる。

また、本発明の第４の構成によれば、上記第１乃至第３のいずれかの構成の薬物含有ナノ粒子の製造方法において、貧溶媒中にカチオン性高分子を溶解させてＰＬＧＡナノ粒子表面をカチオン性高分子で被覆することにより、アニオン性薬物が内包された薬物含有ナノ粒子を容易に製造することができる。また、ＰＬＧＡナノ粒子のゼータ電位を高めて懸濁液中でのＰＬＧＡナノ粒子の凝集を抑制することができる。

また、本発明の第５の構成によれば、上記第４の構成の薬物含有ナノ粒子の製造方法において、カチオン性高分子としてキトサンを用い、乳酸・グリコール酸共重合体に対するキトサンの添加量を１重量％以上２０重量％以下とすることにより、アニオン性薬物を含有するＰＬＧＡナノ粒子を生体への悪影響がなく、安全性の高い方法で製造することができる。また、キトサンの被覆によるＰＬＧＡナノ粒子の粒子径の増大も抑制できる。

また、本発明の第６の構成によれば、上記第１乃至第５のいずれかの構成の薬物含有ナノ粒子の製造方法において、良溶媒中のエタノール濃度を１０体積％以上とすることにより、ＰＬＧＡの溶解度が低下するため、エマルジョン滴内のＰＬＧＡがより短時間で沈積してエマルジョン滴の合一が抑制される。従って、ＰＬＧＡナノ粒子の粒子径を小さくすることができる。

また、本発明の第７の構成によれば、上記第１乃至第６のいずれかの構成の薬物含有ナノ粒子の製造方法において、貧溶媒中のポリビニルアルコール濃度を１０重量％以下とすることにより、貧溶媒の粘度が低くなって貧溶媒中での良溶媒の拡散が速くなるため、エマルジョン滴内の沈積速度も速くなる。従って、ＰＬＧＡナノ粒子の粒子径を小さくすることができる。

試験例１におけるＰＬＧＡナノ粒子の平均粒子径と加圧ろ過率との関係を示すグラフ

以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。本発明のＰＬＧＡナノ粒子の製造方法は、ＰＬＧＡナノ粒子を形成してＰＬＧＡナノ粒子含有溶液とするナノ粒子形成工程と、ＰＬＧＡナノ粒子含有溶液から良溶媒を留去してＰＬＧＡナノ粒子懸濁液とする留去工程とを含むものである。以下、ナノ粒子形成工程から留去工程、さらに留去工程の後にＰＬＧＡナノ粒子懸濁液を孔径０．２μｍのメンブレンフィルターを用いて加圧ろ過する、ろ過滅菌工程までを順を追って説明する。

（ナノ粒子形成工程）
本発明におけるＰＬＧＡナノ粒子の製造方法として用いられるＥＳＤ法は、エマルジョンを形成してから、良溶媒と貧溶媒との相互拡散を利用して薬物を球状に結晶化させる方法である。操作手順としては、まず、良溶媒中にＰＬＧＡを溶解後、このＰＬＧＡが析出しないように、薬物溶解液を良溶媒中へ添加混合する。このＰＬＧＡと薬物とを含む良溶媒溶液を、攪拌下で貧溶媒中に滴下すると、混合液中の良溶媒（有機溶媒）が貧溶媒中へ急速に拡散移行する。その結果、貧溶媒中で良溶媒の自己乳化が起き、サブミクロンサイズの良溶媒のエマルジョン滴が形成される。さらに、良溶媒と貧溶媒の相互拡散が進むにつれ、エマルジョン滴内のＰＬＧＡ並びに薬物の溶解度が低下し、最終的に、薬物を包含した球形結晶粒子のＰＬＧＡナノ粒子が生成する。

上記球形晶析法では、物理化学的な手法でＰＬＧＡナノ粒子を形成でき、しかも得られるＰＬＧＡナノ粒子が略球形であるため、均質なナノ粒子を、触媒や原料化合物の残留といった問題を考慮する必要なく、容易に形成することができる。

本発明に用いられるＰＬＧＡの分子量は、５，０００〜２００，０００の範囲内であることが好ましく、１５，０００〜２５，０００の範囲内であることがより好ましい。乳酸とグリコール酸との組成比は１：９９〜９９：１であればよいが、乳酸１に対しグリコール酸０．３３３であることが好ましい。

本発明のＰＬＧＡナノ粒子に内包される薬物としては、プラスミドＤＮＡ、遺伝子、ｓｉＲＮＡ、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、アプタマー、インターロイキン、細胞間情報伝達物質（サイトカイン）等の核酸化合物、カルシトニン、インスリン、ガストリン、プロラクチン、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）等のホルモン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベタネコール、臭化ピリドスチグミン等の医薬品、アルニカエキス、オトギリソウエキス、加水分解コンキオリン、キナエキス、クララエキス、セージエキス、チョウジエキス、冬虫夏草エキス、ペパーミントエキス、ホップエキス、グリチルレチン酸ジカリウム、β−グリチルレチン酸、オウゴンエキス、ローズマリーエキス、ボタンピエキス、ゴボウエキス、ニンジンエキス、ローヤルゼリーエキス、カミツレエキス、センキュウエキス、センブリエキス、トウガラシチンキ、ショウキョウチンキ、トウキエキス、ベニバナエキス、チンピエキス、セファランチン等の生薬成分、リン酸アスコルビルＭｇ、リン酸アスコルビルＮａ、塩酸クロコナゾール、塩酸ネチコナゾール等の水溶性薬物、ビタミンＣ等の水溶性ビタミン類等が挙げられるが、これらの物質に限定されるものではない。なお、上記薬物のうち何れか１種のみを封入しても良いが、効能や作用機序の異なる成分を複数種封入しておけば、各成分の相乗効果により薬効の促進が期待できる。

ところで、加圧ろ過法により滅菌可能な、即ち、孔径０．２μｍのろ過滅菌用メンブレンフィルターを通過可能なＰＬＧＡナノ粒子を製造するためには、ＰＬＧＡナノ粒子の粒子径とエマルジョン中での分散状態が重要となる。この粒子径及び分散状態は、使用する良溶媒及び貧溶媒の種類、並びに良溶媒及び貧溶媒に対するＰＬＧＡ濃度と密接な関係がある。

一般に、ＥＳＤ法において調製されるＰＬＧＡナノ粒子の粒子径は、エマルジョン内のＰＬＧＡの濃度並びにエマルジョン滴の分散性とＰＬＧＡの沈積速度の影響を受ける。ＰＬＧＡナノ粒子の粒子径を微小化するためには、エマルジョン内のＰＬＧＡの濃度を下げ、且つエマルジョン滴の分散性を高めるとともにＰＬＧＡの沈積速度を速くしてエマルジョン滴の合一を抑制する必要がある。そのためには、良溶媒及び貧溶媒に対するＰＬＧＡ濃度を下げることが効果的である。

なお、良溶媒に対するＰＬＧＡ濃度が小さくなれば、エマルジョン滴中のＰＬＧＡの沈積速度は遅くなる方向に行くが、一定密度で粒子形成されるため粒子径は小さくなる。例えば、ＰＬＧＡ濃度が２倍薄くなれば粒子サイズは２の三乗根だけ小さくなる。

本発明においては、アセトンとエタノールを含む良溶媒を用いることで、良溶媒に対するＰＬＧＡ濃度を実用的な範囲に維持しつつ、ナノ粒子の粒子径を加圧ろ過法により滅菌可能なレベルまで小径化できることを見いだした。

良溶媒に対するＰＬＧＡ濃度が６ｍｇ／ｍＬを超えると、エマルジョン滴中のＰＬＧＡの沈積速度が遅くなることでエマルジョン同士が合一するため生成するＰＬＧＡナノ粒子の粒子径が大きくなる。従って、良溶媒に対するＰＬＧＡ濃度を６ｍｇ／ｍＬ以下とする必要がある。一方、良溶媒に対するＰＬＧＡ濃度が１ｍｇ／ｍＬ未満の場合は溶媒使用量が増加するとともに大型の装置が必要となり、得られるＰＬＧＡナノ粒子の歩留まりも悪くなるため好ましくない。従って、良溶媒に対するＰＬＧＡ濃度を１ｍｇ／ｍＬ以上とすることが好ましい。

良溶媒中のアセトンとエタノールの混合比には特に制限はないが、エタノール濃度が増加するとＰＬＧＡの溶解度が低下するため、エマルジョン滴内のＰＬＧＡがより短時間で沈積してエマルジョン滴の合一が抑制される。従って、ＰＬＧＡナノ粒子内に封入される薬物の種類にもよるが、エタノール濃度を１０体積％以上とすることが好ましい。また、必要に応じて良溶媒中に水等のアセトンとエタノール以外の溶媒を混合しても良い。

次に、貧溶媒に対するＰＬＧＡ濃度について説明する。ＰＬＧＡナノ粒子を医薬製剤や化粧品の原料として用いるためには、乾燥させたＰＬＧＡナノ粒子を水中で再分散させて生体内に速やかに浸透させる必要がある。そこで、貧溶媒としてポリビニルアルコール水溶液を用いることにより、ＰＬＧＡナノ粒子表面をポリビニルアルコールで被覆させることが有効である。

貧溶媒に対するＰＬＧＡ濃度が６ｍｇ／ｍＬを超えると、貧溶媒中でのエマルジョン滴濃度が増加するためエマルジョン滴が合一し易くなり、生成するＰＬＧＡナノ粒子の粒子径が大きくなる。従って、貧溶媒に対するＰＬＧＡ濃度を６ｍｇ／ｍＬ以下とする必要がある。一方、貧溶媒に対するＰＬＧＡ濃度が１ｍｇ／ｍＬ未満の場合は溶媒使用量が増加するとともに大型の装置が必要となり、得られるＰＬＧＡナノ粒子の歩留まりも悪くなるため好ましくない。従って、貧溶媒に対するＰＬＧＡ濃度を１ｍｇ／ｍＬ以上とすることが好ましい。

貧溶媒中のポリビニルアルコール濃度には特に制限はないが、ポリビニルアルコール濃度が高くなると貧溶媒の粘度が高くなり、貧溶媒中での良溶媒の拡散速度が低下するためエマルジョン滴内の沈積速度も遅くなる。従って、ＰＬＧＡナノ粒子内に封入される薬物の種類にもよるが、ポリビニルアルコール濃度は１０重量％以下とすることが好ましい。

また、ＰＬＧＡナノ粒子に内包される薬物がアニオン性薬物である場合、上記ナノ粒子形成工程において貧溶媒にカチオン性高分子を添加することで、ＰＬＧＡナノ粒子へのアニオン性薬物の内包率を高めることができる。なお、本明細書中においてアニオン性薬物とは、水溶液中でアニオン分子として存在するような有機薬物を指すものとする。

一般に、液体中に分散された粒子の多くは正又は負に帯電しており、逆の電荷を有するイオンが粒子表面に強く引き寄せられ固定された層（固定層）と、その外側に存在する層（拡散層）とで、いわゆる拡散電気二重層が形成されており、拡散層の内側の一部と固定層とが粒子と共に移動するものと推定される。

ゼータ電位は、粒子から十分に離れた電気的に中性な領域の電位を基準とした場合の、上記移動が生じる面（滑り面）の電位である。ゼータ電位の絶対値が増加すれば、粒子間の反発力が強くなって粒子の安定性は高くなり、逆にゼータ電位が０に近づくにつれて粒子は凝集を起こしやすくなる。そのため、ゼータ電位は粒子の分散状態の指標として用いられている。

ＥＳＤ法を用いてアニオン性薬物を内包したＰＬＧＡナノ粒子を製造しようとすると、良溶媒中に溶解混合した水溶性のアニオン性薬物が貧溶媒中に漏出、溶解してしまい、ＰＬＧＡナノ粒子を形成する高分子（ＰＬＧＡ）だけが沈積するため、アニオン性薬物がほとんど内包されなかった。これに対し、上記ナノ粒子形成工程においてカチオン性高分子を貧溶媒中に添加した場合は、ＰＬＧＡナノ粒子表面を被覆したカチオン性高分子がエマルジョン滴表面に存在するアニオン性薬物と相互作用し、貧溶媒中へのアニオン性薬物の漏出を抑制できるものと考えられる。

また、生体内の細胞壁は負に帯電しているが、従来の球形晶析法で製造されたＰＬＧＡナノ粒子の表面は、一般的に負のゼータ電位を有しているため、電気的反発力によりＰＬＧＡナノ粒子の細胞接着性が悪くなるという問題点があった。従って、本発明のようにカチオン性高分子を用いてＰＬＧＡナノ粒子表面が正のゼータ電位を有するように帯電させることは、負帯電の細胞壁に対するＰＬＧＡナノ粒子の接着性を増大させ、アニオン性薬物の細胞内移行性を向上させる観点からも好ましい。

本発明に用いられるカチオン性高分子としては、キトサン及びキトサン誘導体、セルロースに複数のカチオン基を結合させたカチオン化セルロース、ポリエチレンイミン、ポリビニルアミン、ポリアリルアミン等のポリアミノ化合物、ポリオルニチン、ポリリジン等のポリアミノ酸、ポリビニルイミダゾール、ポリビニルピリジニウムクロリド、アルキルアミノメタクリレート４級塩重合物（ＤＡＭ）、アルキルアミノメタクリレート４級塩・アクリルアミド共重合物（ＤＡＡ）、細胞膜（生体膜）の構成成分であるリン脂質極性基（ホスホリルコリン基）と重合性に優れたメタクリロイル基とを併せ持つ２−メタクリロイルオキシエチルホスホルコリン（ＭＰＣ）を構成単位とする高分子に第４級アンモニウム塩等のカチオン基を結合させたカチオン性高分子（例えばＭＰＣと２−ヒドロキシ−３−メタクリロイルオキシプロピルトリメチルアンモニウムクロリドとのコポリマー）等が挙げられるが、特にキトサン或いはその誘導体が好適に用いられる。

キトサンは、エビやカニの外殻に含まれる、アミノ基を有する糖の１種であるグルコサミンが多数結合したカチオン性の天然高分子であり、乳化安定性、保形性、生分解性、生体適合性、抗菌性等の特徴を有するため、化粧品や食品、衣料品、医薬品等の原料として広く用いられている。このキトサンを貧溶媒中に添加することにより、生体への悪影響がなく、安全性の高いアニオン性薬物含有ナノ粒子を製造することができる。

なお、カチオン性高分子の被覆によってＰＬＧＡナノ粒子の粒子径が増大するため、貧溶媒中に添加するカチオン性高分子の量が多すぎるとろ過滅菌ができなくなる。そのため、カチオン性高分子としてキトサンを用いる場合はＰＬＧＡに対し１重量％以上２０重量％以下の範囲で添加する必要がある。

その他、貧溶媒の攪拌速度、貧溶媒中への良溶媒の送液速度、全溶媒に対する貧溶媒の割合、貧溶媒の温度等の操作条件も、ＰＬＧＡナノ粒子の粒子径や分散性に影響を及ぼす因子である。送液速度が遅すぎると、送液チューブ先端から良溶媒が完全に排出されないままＰＬＧＡの沈積が終了するためエマルジョン滴は合一しやすく、チューブ先端や容器壁面へのＰＬＧＡの付着も生じる。反対に送液速度が速すぎると、貧溶媒中のエマルジョン滴濃度の増加によりエマルジョン滴は合一しやすくなるため粒子径は増大する。

また、全溶媒に対する貧溶媒の割合を高めるとエマルジョン滴濃度が低下し、エマルジョン滴の合一が抑制されるためＰＬＧＡナノ粒子の粒子径は微小化する。また、貧溶媒の温度上昇に伴い、貧溶媒の粘度低下により両溶媒の拡散速度が速くなるためエマルジョン滴内のＰＬＧＡの沈積速度も速くなり、エマルジョン滴の合一が抑制されるので粒子径は小さくなる。従って、上記の操作条件は、生成するＰＬＧＡナノ粒子がろ過滅菌可能な範囲となるように、製造スケール等に応じて適宜設定すれば良い。

（留去工程）
その後、良溶媒である有機溶媒を減圧留去し、ＰＬＧＡナノ粒子懸濁液とする。この留去工程において、良溶媒である有機溶媒をＰＬＧＡのガラス転移点を超える温度で長時間に亘って減圧留去すると、ＰＬＧＡナノ粒子を構成するＰＬＧＡの剛性が低下して流動性が増すことによりＰＬＧＡナノ粒子同士が融着し、留去工程に続くろ過滅菌工程において加圧ろ過特性が著しく低下してしまう。そのため、留去工程はできるだけ低温で、且つ短時間で行う必要がある。具体的には、４５℃以下で３０時間以内に行うことが好ましい。

（ろ過滅菌工程）
留去工程で得られたＰＬＧＡナノ粒子懸濁液を精製水で希釈し、孔径０．２μｍのろ過滅菌用メンブレンフィルターが装着されたろ過装置に充填した後、窒素ガスで加圧しながらろ過滅菌する。

本発明の方法により製造されたＰＬＧＡナノ粒子は、平均粒子径が２００ｎｍ以下であり、水中ではある程度凝集した状態にあるものの、孔径０．２μｍのメンブレンフィルターに対し、加圧ろ過後のＰＬＧＡナノ粒子の回収率（以下、加圧ろ過率と略す）は９０％以上と高い値を示す。従って、本発明の製造方法は、医薬製剤や化粧品の原料として好適な無菌のＰＬＧＡナノ粒子或いはその複合粒子を効率良く製造できるものである。

そして、ろ過滅菌されたＰＬＧＡナノ粒子をそのまま乾燥させて用いるか、或いは必要に応じて複合化する（複合化工程）。この複合化により、使用前まではＰＬＧＡナノ粒子が集まった取り扱いの容易な凝集粒子となっており、使用時に水分に触れることでＰＬＧＡナノ粒子に戻って高反応性等の特性を復元可能となる。

ＰＬＧＡナノ粒子の複合化方法としては、凍結乾燥法が好適に用いられる。また、流動層乾燥造粒法（例えば、アグロマスタＡＧＭ（ホソカワミクロン（株）製を使用して流動造粒を行うこと）または乾式機械的粒子複合化法（例えば、メカノフュージョンシステムＡＭＳ（ホソカワミクロン（株）製）を使用して圧縮力および剪断力を加えること）により複合化しても良い。特に、流動層乾燥造粒法の中でも粒子化する材料を含む混合物を流動ガス中に噴霧する噴霧乾燥式流動層造粒法を用いた場合、時間と手間のかかる凍結乾燥工程を省略可能となり、複合粒子を容易に且つ短時間で製造できるため工業化にも有利となる。

さらに、ナノ粒子形成工程において貧溶媒にカチオン性高分子を添加した場合、凍結乾燥によりＰＬＧＡナノ粒子を複合化する際に、凍結乾燥前のＰＬＧＡナノ粒子懸濁液にアニオン性薬物を添加することにより、正のゼータ電位を有するＰＬＧＡナノ粒子表面へアニオン性薬物を静電気的に担持させることもできる。

上記のようにして製造されたＰＬＧＡナノ粒子は、経肺投与用、皮下、筋肉、静脈等への注射用、或いは経皮、経鼻、経口投与用等の種々の医薬製剤、或いは化粧料の原料として好適に使用することができる。また、金属や高分子材料で形成されたステントやバルーンカテーテルの表面に担持させることにより、薬物溶出型の管腔内留置用医療デバイスを製造することもできる。

なお、本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。以下、本発明のＰＬＧＡナノ粒子の製造方法について実施例及び比較例により更に具体的に説明する。

［合成オリゴヌクレオチド封入ＰＬＧＡナノ粒子懸濁液の調製］
ポリビニルアルコール（ゴーセノールＥＧ０５、日本合成化学工業製）７５ｇ、キトサン（ＣＨＩＴＯＳＡＮＧＨ−４００ＥＦ、日油製）４ｇ、クエン酸（日本薬局方クエン酸「製造専用」、和光純薬工業製）０．０３ｇを水９１００ｍＬに溶解して貧溶媒とした。また、アセトン６４５０ｍＬ、エタノール２５００ｍＬ、水７５０ｍＬの混合液を調製し良溶媒とした。ＰＬＧＡ（ＰＬＧＡ７５２０、和光純薬工業製）５０ｇ、長さ１２ｍｅｒ、配列ｔｇｃｃｔｃｇｃａｃｃａである合成オリゴヌクレオチド（ＤＮＡＯｌｉｇｏｍｅｒ（１２）ＳｅｔＡ０１、和光純薬工業製）１ｇを良溶媒中に溶解して良溶媒溶液とした。良溶媒に対するＰＬＧＡ濃度は５．２ｍｇ／ｍＬ、貧溶媒に対するＰＬＧＡ濃度は５．５ｍｇ／ｍＬである。

先の貧溶媒を４０℃、４００ｒｐｍで攪拌下、良溶媒溶液を一定速度（１５０ｍＬ／分）で滴下し、良溶媒の貧溶媒中への拡散によって合成オリゴヌクレオチド封入ＰＬＧＡナノ粒子を形成した。続いて、減圧下（−６０ｋＰａ）４０℃で攪拌を続けながら、有機溶媒のアセトンとエタノールを３０時間かけて留去してＰＬＧＡナノ粒子懸濁液を得た。

得られたＰＬＧＡナノ粒子の平均粒子径を動的光散乱法（測定装置：ＭＩＣＲＯＴＲＡＣＵＰＡ、日機装社製）により測定した。その結果、平均粒子径は１５３ｎｍで良好な分散状態を示した。また、分光光度計（Ｖ−５３０、日本分光製）を用いて粒子内の合成オリゴヌクレオチドの封入率（ＰＬＧＡ重量に対する合成オリゴヌクレオチドの重量パーセント）を定量したところ２．３％であった。

貧溶媒中に溶解するキトサンを２ｇ、良溶媒中に溶解するＰＬＧＡを２５ｇ、合成オリゴヌクレオチドを０．５ｇとする以外は実施例１の製造方法と同一条件にて、ＰＬＧＡナノ粒子を調製した。良溶媒に対するＰＬＧＡ濃度は２．６ｍｇ／ｍＬ、貧溶媒に対するＰＬＧＡ濃度は２．７ｍｇ／ｍＬである。動的光散乱法により測定した平均粒子径は１２０ｎｍで良好な分散状態を示した。

貧溶媒中に溶解するキトサンを０．８ｇ、良溶媒中に溶解するＰＬＧＡを１０ｇ、合成オリゴヌクレオチドを０．２ｇとする以外は実施例１の製造方法と同一条件にて、ＰＬＧＡナノ粒子を調製した。良溶媒に対するＰＬＧＡ濃度は１．０ｍｇ／ｍＬ、貧溶媒に対するＰＬＧＡ濃度は１．１ｍｇ／ｍＬである。動的光散乱法により測定した平均粒子径は８８ｎｍで良好な分散状態を示した。

比較例１

貧溶媒中に溶解するキトサンを１２ｇ、良溶媒中に溶解するＰＬＧＡを１５０ｇ、合成オリゴヌクレオチドを３ｇとする以外は実施例１の製造方法と同一条件にて、ＰＬＧＡナノ粒子を調製した。良溶媒に対するＰＬＧＡ濃度は１５．５ｍｇ／ｍＬ、貧溶媒に対するＰＬＧＡ濃度は１６．５ｍｇ／ｍＬである。動的光散乱法により測定した平均粒子径は２１８ｎｍで良好な分散状態を示した。

比較例２

貧溶媒中に溶解するキトサンを２０ｇ、良溶媒中に溶解するＰＬＧＡを２５０ｇ、合成オリゴヌクレオチドを５ｇとする以外は実施例１の製造方法と同一条件にて、ＰＬＧＡナノ粒子を調製した。良溶媒に対するＰＬＧＡ濃度は２５．８ｍｇ／ｍＬ、貧溶媒に対するＰＬＧＡ濃度は２７．５ｍｇ／ｍＬである。動的光散乱法により測定した平均粒子径は２６５ｎｍで良好な分散状態を示した。

比較例３

貧溶媒中に溶解するキトサンを４０ｇ、良溶媒中に溶解するＰＬＧＡを５００ｇ、合成オリゴヌクレオチドを１０ｇとする以外は実施例１の製造方法と同一条件にて、ＰＬＧＡナノ粒子を調製した。良溶媒に対するＰＬＧＡ濃度は５１．５ｍｇ／ｍＬ、貧溶媒に対するＰＬＧＡ濃度は５４．９ｍｇ／ｍＬである。動的光散乱法により測定した平均粒子径は３３２ｎｍで良好な分散状態を示した。

試験例１

［ＰＬＧＡナノ粒子の加圧ろ過特性評価］
実施例１〜３、及び比較例１〜３で得られたＰＬＧＡナノ粒子懸濁液の加圧ろ過特性について評価した。以下の（１）〜（４）の手順により加圧ろ過後の懸濁液中のＰＬＧＡ濃度を求め、加圧ろ過前後における懸濁液のＰＬＧＡ濃度の比率から、ＰＬＧＡナノ粒子の加圧ろ過率を求めた。良溶媒に対するＰＬＧＡ濃度と加圧ろ過率との関係をナノ粒子の平均粒子径と合わせて図１に示す。なお、図１では良溶媒に対するＰＬＧＡ濃度を対数で表示している。

（１）精製水で０．２５重量％に希釈した５０ｍＬのＰＬＧＡナノ粒子懸濁液を、ステンレス製の円筒型容器（内径４２ｍｍ、長さ１６０ｍｍ）の底部に孔径０．２μｍ、φ４７ｍｍ、ポリエーテルスルホン製のメンブレンフィルター（SARTOPORE ２、ザルトリウス社製）を装着したろ過装置に充填した。円筒形容器内を窒素ガスで０．１５ＭＰａに加圧し、ＰＬＧＡナノ粒子懸濁液をろ過した。
（２）ＰＬＧＡナノ粒子懸濁液約１０ｍＬをガラス瓶（容量３０ｃｃ）に充填し、充填液の重量（Ｗｓｕｓ）を精密に測定した。
（３）懸濁液を凍結乾燥した後、アセトン１０ｍＬでガラス瓶中のＰＬＧＡを溶解した。これを孔径０．２μｍのＰＴＦＥメンブレンフィルター（アドバンテック製）を用いて、予め重量（Ｗｇｂ）を測定した別のガラス瓶中へろ過した。さらに１０ｍＬのアセトンで同様の操作を繰り返した。
（４）ろ液の入ったガラス瓶を室温で静置してアセトンを乾燥後、ガラス瓶の重量を精密に測定した（Ｗｇａ）。懸濁液中のＰＬＧＡ濃度を次式により算出した。
ＰＬＧＡ濃度（重量％）＝（Ｗｇａ−Ｗｇｂ）／Ｗｓｕｓ×１００

図１から明らかなように、実施例１〜３で調製された平均粒子径（●のデータ系列で表示）が８８ｎｍ〜１５３ｎｍのＰＬＧＡナノ粒子は９５％以上の加圧ろ過率（□のデータ系列で表示）を示した。一方、比較例１〜３で調製された平均粒子径が２１８ｎｍ〜３３２ｎｍのＰＬＧＡナノ粒子では、加圧ろ過率は１０％に満たなかった。実施例１〜３で調製されたＰＬＧＡナノ粒子は、比較例１〜３で調製されたＰＬＧＡナノ粒子に比べて粒子径が小さくなることで、メンブレンフィルターの細孔を通過する粒子量が増加し、その結果、加圧ろ過率が増加したものと考えられる。

試験例２

［加圧ろ過法によるＰＬＧＡナノ粒子の滅菌効果］
試験例１の加圧ろ過条件におけるメンブレンフィルターの除菌性能を、FDA Aseptic Processing Guidelineに準拠したバクテリアチャレンジ試験にて評価した。試験菌としては通常用いられるBrevundimonas diminutaを用いた。試験に供したＰＬＧＡナノ粒子が試験菌に対する抗菌性を有していないことを事前に確認し、ＰＬＧＡナノ粒子懸濁液に試験菌を直接懸濁させる方法で試験を行った。懸濁液とメンブレンフィルターとの接触時間は、ろ過装置の一次側のバルブを閉じて通液を途中で停止し、５時間となるように調整した。使用前後のメンブレンフィルターの完全性（Integrity test）はザルトチェック（ザルトリウス社製）を用いたバブルポイント法（Bubble point test）により評価した。

ろ液を塗布した後、培養した試験培地に試験菌は存在しなかった。また、バブルポイント法により使用前後のメンブレンフィルターの完全性が確認されたことに加え、滅菌ＲＯ水を用いたコントロール試験液が無菌であったこと、試験菌の培養液を孔径０．４５μｍのメンブレンフィルターでろ過した後、培養したところ、２４時間後に菌の増殖が確認されたことから、本試験結果の有効性が確認された。

本発明は、貧溶媒としてポリビニルアルコール水溶液を用い、アセトンとエタノールを含む良溶媒中に少なくとも薬物とＰＬＧＡとを溶解させた良溶媒溶液を貧溶媒に加えて、球形晶析法により薬物含有ナノ粒子を形成するナノ粒子形成工程と、ナノ粒子含有溶液から良溶媒を留去してナノ粒子懸濁液とする留去工程と、を含む薬物含有ナノ粒子の製造方法であって、良溶媒及び貧溶媒に対するＰＬＧＡの濃度を共に１ｍｇ／ｍＬ以上６ｍｇ／ｍＬ以下とするものであり、医薬製剤や化粧品の原料として好適な無菌のＰＬＧＡナノ粒子或いはその複合粒子を効率良く製造可能となる。

また、留去工程を４５℃以下の温度で３０時間以内に行うことにより、ＰＬＧＡの加水分解によるＰＬＧＡナノ粒子の加圧ろ過特性の低下を抑制することができる。

また、貧溶媒中にキトサンを添加する場合、ＰＬＧＡに対するキトサンの添加量を１重量％以上２０重量％以下とすることにより、アニオン性薬物を含有可能であり、加圧ろ過特性が高く、且つ安全性の高いＰＬＧＡナノ粒子を製造することができる。さらに、良溶媒中のエタノール濃度を１０体積％以上、貧溶媒中のポリビニルアルコール濃度を１０重量％以下とすれば、エマルジョン滴内のＰＬＧＡがより短時間で沈積してエマルジョン滴の合一が抑制されるため、ろ過滅菌可能な粒径の小さいＰＬＧＡナノ粒子を簡便に製造することができる。

Claims

ポリビニルアルコール水溶液から成る貧溶媒に、アセトンとエタノールを含む良溶媒中に少なくとも薬物と乳酸・グリコール酸共重合体とを溶解させた良溶媒溶液を加えて、薬物含有ナノ粒子を形成してナノ粒子含有溶液とするナノ粒子形成工程と、
前記ナノ粒子含有溶液から前記良溶媒を留去してナノ粒子懸濁液とする留去工程と、
を含む薬物含有ナノ粒子の製造方法であって、
前記良溶媒及び前記貧溶媒に対する乳酸・グリコール酸共重合体の濃度が共に１ｍｇ／ｍＬ以上６ｍｇ／ｍＬ以下であることを特徴とする薬物含有ナノ粒子の製造方法。
前記留去工程の後に、前記ナノ粒子懸濁液を孔径０．２μｍのメンブレンフィルターを用いて加圧ろ過する、ろ過滅菌工程を有することを特徴とする請求項１に記載の薬物含有ナノ粒子の製造方法。
前記留去工程を４５℃以下の温度で３０時間以内に行うことを特徴とする請求項１または請求項２に記載の薬物含有ナノ粒子の製造方法。
前記ナノ粒子形成工程において、貧溶媒中にカチオン性高分子を溶解させて前記ナノ粒子表面をカチオン性高分子で被覆することを特徴とする請求項１乃至請求項３のいずれか１項に記載の薬物含有ナノ粒子の製造方法。
前記カチオン性高分子がキトサンであり、乳酸・グリコール酸共重合体に対するキトサンの添加量が１重量％以上２０重量％以下であることを特徴とする請求項４に記載の薬物含有ナノ粒子の製造方法。
前記良溶媒中のエタノール濃度が１０体積％以上であることを特徴とする請求項１乃至請求項５のいずれか１項に記載の薬物含有ナノ粒子の製造方法。
前記貧溶媒中のポリビニルアルコール濃度が１０重量％以下であることを特徴とする請求項１乃至請求項６のいずれか１項に記載の薬物含有ナノ粒子の製造方法。