CN114886855B - 一种雷公藤红素纳米药物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明一种雷公藤红素纳米药物及其制备方法，所述纳米药物由雷公藤红素组装形成纳米颗粒，所述纳米颗粒中不含有除了溶剂以外的其它载体，所述纳米颗粒的平均粒径为20～2000nm。本发明以雷公藤红素作为组装基元，首次得到了不含有载体的雷公藤红素纳米药物，本发明的雷公藤红素纳米药物显著的改善了雷公藤红素的溶解性，且对于肿瘤的杀伤效果呈现显著的尺寸依赖性。
Description
技术领域
本发明涉及纳米药物技术领域，具体涉及一种雷公藤红素纳米药物及其制备方法。
背景技术
雷公藤红素(Celstrol)是一种来源于天然植物药雷公藤(Tripterygiumwilfordii Hook.f.)中的药物活性成分，具有抑制肥胖，抗肿瘤，免疫调节等一系列药理活性，被《Cell》杂志列为了最有可能被开发为现代药物的五种天然药用化合物之一，具有极高的临床应用潜力。然而，雷公藤红素缺乏极性官能团，水溶性差，在体内半衰期短，严重的影响了雷公藤红素在临床上的应用。因此，研究人员一直致力于雷公藤红素药物载体的开发，以期解决雷公藤红素存在的问题。
目前对雷公藤红素药物载体的开发多集中在脂质体，聚合物胶束，纳米微乳等领域，能够显著提升雷公藤红素的溶解度和在体内的靶向性，为雷公藤红素的临床应用提供了新的方法。然而，多数的纳米载体涉及复杂的合成路径，工艺放大比较困难，并且在体内的代谢途径尚不明确。
例如，中国授权专利CN110652596B公开了一种雷公藤红素纳米粒子、其制备方法及应用，该纳米颗粒均以生物可降解的聚氨基酸、聚乙二醇为结构单元，在体内可降解，降解产物可通过肾脏直接排除体外。
再例如，中国授权专利CN108478542B公开了一种透明质酸包被的雷公藤红素纳米药物的制备方法和应用，所述透明质酸包被的雷公藤红素纳米药物由雷公藤红素和透明质酸组成；所述雷公藤红素的摩尔浓度为10-50mM/L；所述透明质酸的摩尔浓度为10-50mM/L。
为此，研究人员需要新的技术和手段对雷公藤红素的纳米制剂进行设计，提供一种由雷公藤红素自组装形成的纳米药物及其制备方法。
发明内容
为了克服雷公藤红素纳米药物存在的问题，本发明的目的在于提供一种不含有除了溶剂以外的其它载体的雷公藤红素纳米药物及其制备方法。
为达到上述目的，本发明采取的技术方案为：
本发明一方面涉及一种雷公藤红素纳米药物，其特征在于所述纳米药物由雷公藤红素组装形成纳米颗粒，所述纳米颗粒中不含有除了溶剂以外的其它载体，所述纳米颗粒的平均粒径为20～2000nm。本发明通过将雷公藤红素组装形成纳米颗粒，显著改善了雷公藤红素的溶解性，提高了药物对肿瘤的抑制效果。
在本发明的一个优选实施方式中，所述纳米颗粒的Zeta电位为-10mV～-40mV之间。
在本发明的一个优选实施方式中，所述纳米颗粒的平均粒径为30-1000nm之间；优选地，所述纳米颗粒80％的颗粒的粒径在平均粒径±10％之间。
在本发明的一个优选实施方式中，所述纳米颗粒的平均粒径为30-100nm之间。出人意料的，本发明雷公藤红素纳米药物对肿瘤细胞的抑制活性随着粒径的减小而显著增加。
本发明另一方面涉及上述雷公藤红素纳米药物的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
将雷公藤红素溶于良溶剂中，再加入雷公藤红素不良溶剂混匀后静置，可得到尺寸范围在20～2000nm的雷公藤红素纳米颗粒。
使用良溶剂-不良溶剂法调节药物分子的组装模式，有助于研究人员设计不同形貌，不同大小的功能性纳米组装体。但是，具体何种药物可以形成纳米稳定的纳米组装体，并没有现时可行的理论。本发明通过创造性的研究，出人意料的发现雷公藤红素，在避免使用复杂且毒副作用不明的药物载体的同时，实现了雷公藤红素纳米药物的成功组装。本发明的良溶剂-不良溶剂法同时也具有方法简单，易于放大的优点，能够满足工业生产的需求。
对于本发明的雷公藤红素而言，其来源没有限定，例如，可以使用商用雷公藤提取物，其纯度在90％以上。
在本发明的一个优选实施方式中，所述良溶剂选自甲醇，乙醇，丙醇，异丙醇，叔丁醇，丙酮，N’N-二甲基甲酰胺，四氢呋喃，二甲基亚砜，N-甲基吡咯烷酮，吡啶中的一种或者多种的组合；优选的，所述良溶剂选自二甲亚砜、乙醇、四氢呋喃和吡啶中的一种或者多种。
在本发明一个特别优选的实施方式中，良溶剂为二甲亚砜，通过采用二甲亚砜，可以获得平均粒径为30-80nm的雷公藤红素纳米药物。
在本发明的领域给特别优选的实施方式中，所述良溶剂为乙醇，通过采用乙醇，可以获得平均粒径为80～160nm的雷公藤红素纳米药物。
在发明的一个优选实施方式中，所述不良溶剂为选自水，葡萄糖水溶液，NaCl溶液，细胞培养基以及水性缓冲溶液。优选的，所述不良溶剂的pH值介于6-8之间。
所述雷公藤红素良溶剂溶液的浓度为1～200mg/mL。
所述良溶剂与不良溶剂的体积比为1～5：2～10。
所述雷公藤红素纳米药物静置时间为1min～1month。
在本发明的一个优选实施方式中，所述制备方法还包括静置后进行透析，超滤或柱层析去除部分溶剂的步骤。
在本发明的一个优选实施方式中，所述去除部分溶剂的步骤是透析；优选的，所述雷公藤红素纳米药物透析时间为4～120h。通过采用透析，可以防止纳米药物颗粒的聚集。
所述雷公藤红素纳米药物选用的透析袋的分子量没有特别的限定，只要保证溶剂可以透过而纳米药物颗粒不能透过即可。
本发明另一方面还涉及上述雷公藤红素纳米药物在制备抑制肿瘤细胞增殖的药物中的应用。
在本发明的一个优选实施方式中，所述药物为注射剂或口服剂,含有或者不含有药学上可接受的辅料。对药学上可接受的辅料没有特别的限制，只要其不破坏雷公藤红素纳米药物的纳米颗粒结构即可。
本发明的有益效果至少包括以下有益效果中的至少一种或者多种：
(1)本发明以雷公藤红素作为组装基元，首次得到了不含有载体的雷公藤红素纳米药物，本发明的雷公藤红素纳米药物显著的改善了雷公藤红素的溶解性，且对于肿瘤的杀伤效果呈现显著的尺寸依赖性。
(2)本发明雷公藤红素纳米药物具有优良的稳定性，在模拟胃液和模拟肠液中能够保持稳定，而在碱性环境中可实现快速释放。
(3)本发明雷公藤红素纳米药物制备方法简单，重现性好，显著的改善了雷公藤红素的溶解性。
(4)本发明雷公藤红素纳米药物对肿瘤细胞的抑制活性随着粒径的减小而显著增加。
(5)本发明雷公藤红素纳米药物可同时满足临床注射以及口服药物剂型的需求。
附图说明
图1-4分别是实施例1-4合成的纳米药物SEM和TEM图像，其中图1-4A为SEM图像，图1-4B为TEM图像。
图5是实施例1-4合成的纳米药物DLS粒径分布图。
图6是实施例1-4合成的纳米药物Zeta电位分布图。
图7是实施例1-4合成的纳米药物在模拟胃液中孵育2h后的SEM图像。
图8是实施例1-4合成的纳米药物在模拟肠液中孵育4h后的SEM图像。
图9是实施例5合成的纳米药物在碱性PBS中的药物释放曲线。
图10是实施例6使用不同有机溶剂作为良溶剂得到的纳米药物的粒径分布。
图11是实施例7使用不同浓度雷公藤红素储备液得到的纳米药物的粒径分布。
图12是实施例8使用乙醇作为良溶剂所制备的1L纳米药物的照片。
图13实施例1-4合成的纳米颗粒以及雷公藤红素粉末的MTT细胞活性测试。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细描述，除非在本发明说明书中另有定义，否则在此所有的技术术语都是根据本领域一般技术人员所常使用和理解的惯用定义来使用。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1
一种雷公藤红素纳米药物的制备方法，包括以下步骤：
取一定量雷公藤红素，加入二甲基亚砜，配置成10mg/mL储备液，取100μL于EP管中，加入900μL水，静置5min后，透析24h，即得到雷公藤红素纳米药物。
图1所示为雷公藤红素纳米药物的SEM，TEM图，由图1及图5得知，本实施例制备的雷公藤红素纳米药物，尺寸均一，分散均匀，尺寸为30～80nm，由图6得知药物的Zeta电位为-18mV。
(1)颗粒胃肠道稳定性
配置模拟胃液以及模拟肠液，取100μL雷公藤红素纳米药物，加入900μL上述溶液，在模拟胃液中孵育2h，离心取沉淀后加入模拟肠液，孵育4h，离心得到沉淀，对沉淀进行SEM表征。
结果如图7，8所示，雷公藤红素纳米药物在模拟胃液(图7)及肠液(图8)中能够保持稳定，能够满足口服的需求。
(2)MTT细胞活性测试
将MCF-7细胞接种在96细胞培养板上，将不同浓度的雷公藤红素纳米颗粒和雷公藤药物粉末与细胞共孵育24h，后移去培养基，PBS洗涤两次，更换新鲜培养基，取MTT配置成5mg/mL储备液，加入孔板中，孵育4h后570nm处测量吸光度。
结果如图13，雷公藤红素纳米药物对肿瘤的抑制效果明显优于雷公藤红素粉末。
实施例2
一种雷公藤红素纳米药物的制备方法，包括以下步骤：
取一定量雷公藤红素，加入乙醇，配置成10mg/mL储备液，取100μL于EP管中，加入900μL水，静置5min后，透析24h，即得到雷公藤红素纳米药物。
图2所示为雷公藤红素纳米药物的SEM，TEM图，由图2及图5得知，本实施例制备的雷公藤红素纳米药物，尺寸均一，分散均匀，尺寸为80～160nm，由图6得知药物的Zeta电位为-21mV。
(1)颗粒胃肠道稳定性
配置模拟胃液以及模拟肠液，取100μL雷公藤红素纳米药物，加入900μL上述溶液，在模拟胃液中孵育2h，离心取沉淀后加入模拟肠液，孵育4h，离心得到沉淀，对沉淀进行SEM表征。
结果如图7，8所示，雷公藤红素纳米药物在模拟胃液(图7)及肠液(图8)中能够保持稳定，能够满足口服的需求。
(2)MTT细胞活性测试
将MCF-7细胞接种在96细胞培养板上，将不同浓度的雷公藤红素纳米药物和雷公藤药物粉末与细胞共孵育24h，后移去培养基，PBS洗涤两次，更换新鲜培养基，取MTT配置成5mg/mL储备液，加入孔板中，孵育4h后570nm处测量吸光度。
结果如图13，雷公藤红素纳米药物对肿瘤的抑制效果明显优于雷公藤红素粉末。
实施例3
一种雷公藤红素纳米药物的制备方法，包括以下步骤：
取一定量雷公藤红素，加入四氢呋喃，配置成10mg/mL储备液，取100μL于EP管中，加入900μL水，静置5min后，透析24h，即得到雷公藤红素纳米药物。
图3所示为雷公藤红素纳米药物的SEM，TEM图，由图3及图5得知，本实施例制备的雷公藤红素纳米药物，尺寸均一，分散均匀，尺寸为240～640nm，由图6得知药物的Zeta电位为-28mV。
(1)颗粒胃肠道稳定性
配置模拟胃液以及模拟肠液，取100μL雷公藤红素纳米药物，加入900μL上述溶液，在模拟胃液中孵育2h，离心取沉淀后加入模拟肠液，孵育4h，离心得到沉淀，对沉淀进行SEM表征。
结果如图7，8所示，雷公藤红素纳米药物在模拟胃液(图7)及肠液(图8)中能够保持稳定，能够满足口服的需求。
(2)MTT细胞活性测试
将MCF-7细胞接种在96细胞培养板上，将不同浓度的雷公藤红素纳米药物和雷公藤药物粉末与细胞共孵育24h，后移去培养基，PBS洗涤两次，更换新鲜培养基，取MTT配置成5mg/mL储备液，加入孔板中，孵育4h后570nm处测量吸光度。
结果如图13，雷公藤红素纳米药物对肿瘤的抑制效果明显优于雷公藤红素粉末。
实施例4
一种雷公藤红素纳米药物的制备方法，包括以下步骤：
取一定量雷公藤红素，加入吡啶，配置成10mg/mL储备液，取100μL于EP管中，加入900μL水，静置5min后，透析24h，即得到雷公藤红素纳米药物。
图4所示为雷公藤红素纳米药物的SEM，TEM图，由图4及图5得知，本实施例制备的雷公藤红素纳米药物，尺寸均一，分散均匀，尺寸为550～1200nm，由图6得知药物的Zeta电位为-36mV。
(1)颗粒胃肠道稳定性
配置模拟胃液以及模拟肠液，取100μL雷公藤红素纳米颗粒，加入900μL上述溶液，在模拟胃液中孵育2h，离心取沉淀后加入模拟肠液，孵育4h，离心得到沉淀，对沉淀进行SEM表征。
结果如图7，8所示，雷公藤红素纳米药物在模拟胃液(图7)及肠液(图8)中能够保持稳定，能够满足口服的需求。
(2)MTT细胞活性测试
将MCF-7细胞接种在96细胞培养板上，将不同浓度的雷公藤红素纳米药物和雷公藤药物粉末与细胞共孵育24h，后移去培养基，PBS洗涤两次，更换新鲜培养基，取MTT配置成5mg/mL储备液，加入孔板中，孵育4h后570nm处测量吸光度。
结果如图13，雷公藤红素纳米药物对肿瘤的抑制效果明显优于雷公藤红素粉末。
实施例5
一种雷公藤红素纳米药物的制备方法，包括以下步骤：
取一定量雷公藤红素，分别加入二甲基亚砜，乙醇，THF，吡啶，配置成10mg/mL储备液，取100μL于EP管中，加入900μL水，静置5min后，透析24h，即得到不同粒径的雷公藤红素纳米药物。
(1)颗粒体外药物释放实验
配置pH＝9.0，0.1M的PBS溶液(含0.5％Tween 80)，取1mL上述雷公藤红素纳米颗粒于分子量3500的透析袋中，放入50mL上述PBS溶液中，于不同时间点取1.5mL外围的PBS溶液，后补加1.5mL PBS溶液，取出的溶液用紫外-可见吸收光谱测定423nm处吸收值，以标定雷公藤红素的浓度，以得到雷公藤红素在碱性pH环境中的释放曲线。
结果如图9，雷公藤红素纳米药物在碱性缓冲液中可以实现快速释放。
实施例6
一种雷公藤红素纳米药物的制备方法，包括以下步骤：
取一定量雷公藤红素，分别加入甲醇，乙醇，丙醇，异丙醇，叔丁醇，丙酮，N’N-二甲基甲酰胺，四氢呋喃，二甲基亚砜，N-甲基吡咯烷酮，吡啶，配置成10mg/mL储备液，取100μL于EP管中，加入900μL水，静置5min后，透析24h，即得到不同粒径的雷公藤红素纳米药物。
图10所示为使用不同有机溶剂制备的雷公藤红素纳米药物的DLS分布，结果表明，通过使用不同的有机溶剂，能够得到粒径分布不同的纳米药物。
实施例7
一种雷公藤红素纳米药物的制备方法，包括以下步骤：
取一定量雷公藤红素，分别加入乙醇，分别配置成1mg/mL，5mg/mL，10mg/mL，20mg/mL储备液，取100μL于EP管中，加入900μL水，静置5min后，透析24h，即得到雷公藤红素纳米颗粒。
图11所示为不同浓度下雷公藤红素纳米颗粒的DLS分布，结果表明，通过使用不同浓度的雷公藤红素储备液，能够得到粒径分布不同的纳米药物。
实施例8
一种雷公藤红素纳米药物的制备方法，包括以下步骤：
取1g雷公藤红素加入1L的流动相溶剂瓶，加入100mL乙醇，配置成10mg/mL储备液，加入900mL水，静置5min后，透析24h，即得到雷公藤红素纳米药物。
结果如图12表明，雷公藤红素纳米药物的制备方法可以实现1L的制备规模，可实现产业化放大。
以上描述了本发明优选实施方式，然其并非用以限定本发明。本领域技术人员对在此公开的实施方案可进行并不偏离本发明范畴和精神的改进和变化。
Claims (7)
1.一种雷公藤红素纳米药物，其特征在于所述纳米药物由雷公藤红素组装形成纳米颗粒，所述纳米颗粒中不含有除了溶剂以外的其它载体，所述纳米颗粒的平均粒径为30 nm -100nm之间，
所述雷公藤红素纳米药物通过包括如下步骤的制备方法得到：
将雷公藤红素溶于良溶剂中，再加入雷公藤红素不良溶剂混匀后静置，得到尺寸范围在30 nm -100nm 的雷公藤红素纳米颗粒；
所述良溶剂为二甲基亚砜。
2.根据权利要求1所述的纳米药物，所述纳米颗粒的Zeta电位为-10mV~-40mV之间。
3.根据权利要求1或2所述的纳米药物，所述纳米颗粒80%的颗粒的粒径在平均粒径±10%之间。
4.根据权利要求1所述的纳米药物，其中，所述不良溶剂选自水，葡萄糖水溶液， NaCl溶液，细胞培养基以及水性缓冲溶液中的一种或者多种的组合。
5.根据权利要求1所述的纳米药物，所述制备方法还包括静置后进行透析，超滤或柱层析去除部分溶剂的步骤。
6.权利要求1-5任意一项所述的雷公藤红素纳米药物在制备抑制肿瘤细胞增殖的药物中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，所述药物为注射制剂或口服制剂，含有或者不含有药学上可接受的辅料。
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