JP4768417B2 - バイオセンサー - Google Patents

Description

本発明は、バイオセンサー、及びそれを用いて生体分子間の相互作用を分析し、相互作用する物質を回収する方法に関する。特に、本発明は、表面プラズモン共鳴バイオセンサーに用いるためのバイオセンサー、及びそれを用いて生体分子間の相互作用を分析し、相互作用する物質を回収する方法に関する。

現在、臨床検査等で免疫反応など分子間相互作用を利用した測定が数多く行われているが、従来法では煩雑な操作や標識物質を必要とするため、標識物質を必要とすることなく、測定物質の結合量変化を高感度に検出することのできるいくつかの技術が使用されている。例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定技術、水晶発振子マイクロバランス（ＱＣＭ）測定技術、金のコロイド粒子から超微粒子までの機能化表面を使用した測定技術である。ＳＰＲ測定技術はチップの金属膜に接する有機機能膜近傍の屈折率変化を反射光波長のピークシフト又は一定波長における反射光量の変化を測定して求めることにより、表面近傍に起こる吸着及び脱着を検知する方法である。ＱＣＭ測定技術は水晶発振子の金電極（デバイス）上の物質の吸脱着による発振子の振動数変化から、ｎｇレベルで吸脱着質量を検出できる技術である。また、金の超微粒子（ｎｍレベル）表面を機能化させて、その上に生理活性物質を固定して、生理活性物質間の特異認識反応を行わせることによって、金微粒子の沈降、配列から生体関連物質の検出ができる。

上記した技術においては、いずれの場合も、生理活性物質を固定化する表面が重要である。以下、当技術分野で最も使われている表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を例として、説明する。

一般に使用される測定チップは、透明基板（例えば、ガラス）、蒸着された金属膜、及びその上に生理活性物質を固定化できる官能基を有する薄膜からなり、その官能基を介し、金属表面に生理活性物質を固定化する。該生理活性物質と検体物質間の特異的な結合反応を測定することによって、生体分子間の相互作用を分析する。

生理活性物質を固定化できる官能基を有する薄膜としては、金属と結合する官能基、鎖長の原子数が１０以上のリンカー、及び生理活性物質と結合できる官能基を有する化合物を用いて、生理活性物質を固定化した測定チップが報告されている（特許文献１を参照）。また、金属膜と、該金属膜の上に形成されたプラズマ重合膜からなる測定チップが報告されている（特許文献２を参照）。

バイオセンサーを用いて、特定の物質（ペプチド、タンパク質又は薬剤など）と特異的に結合するタンパク質の有無や結合量をセンサーで測定し、任意のタンパク質を生体試料中から回収することは可能である。ただし、従来から採用されている方法では、流路表面に対する非特異的吸着、高分子量タンパク質の回収効率の低さなどの問題点から、タンパク質回収能と非特異的タンパク質の混入の抑制能に関して不十分であった。これを解決する方法として、検出面の表面修飾に自己組織化膜を使用する、流路表面を修飾するなどの手法が採られているが、未だ十分な解決はなされていない。

特許第２８１５１２０号 特開平９−２６４８４３号

本発明は上記した従来技術の問題を解消することを解決すべき課題とした。即ち、本発明は、非特異的なタンパク質吸着の抑制能が高く、また目的のタンパク質の抽出能が高いバイオセンサーを提供することを解決すべき課題とした。

本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、流路の検出面及び非検出面の表面に、自己組織化膜による修飾を行うことによって、非特異的なタンパク質吸着の抑制能が高く、また目的のタンパク質の抽出能が高いバイオセンサーを提供できることを見出し、本発明を完成するに至った。

即ち、本発明によれば、基板上に形成された流路であって、生理活性物質と被験物質との相互作用を検出するための検出面、及び上記相互作用を検出しない非検出面から構成される流路を有するバイオセンサーにおいて、基板が金属表面又は金属膜であり、上記の検出面及び非検出面の表面が、水酸基と生理活性物質を結合するための官能基とを有する自己組織化膜で修飾されていることを特徴とするバイオセンサーが提供される。

好ましくは、水酸基と生理活性物質を結合するための官能基とを有する自己組織化膜は、水酸基を有するチオール化合物と、生理活性物質を結合するための官能基を有するチオール化合物との混合物から構成されている。
好ましくは、生理活性物質を結合するための官能基は、カルボキシル基又はアミノ基である。

好ましくは、本発明のバイオセンサーは、生理活性物質と相互作用する物質を回収する機構をさらに有する。
好ましくは、金属表面あるいは金属膜は、金、銀、銅、白金、及びアルミニウムからなる群より選ばれる自由電子金属からなるものである。
好ましくは、本発明のバイオセンサーは、非電気化学的検出に使用され、さらに好ましくは表面プラズモン共鳴分析に使用される。

本発明の別の側面によれば、流路の検出面及び非検出面の表面を、水酸基と生理活性物質を結合できる官能基とを有する自己組織化膜で修飾する工程を含む、上記した本発明のバイオセンサーの製造方法が提供される。

上記方法において好ましくは、水酸基と生理活性物質を結合するための官能基とを有する自己組織化膜は、水酸基を有するチオール化合物と、生理活性物質を結合するための官能基を有するチオール化合物との混合物から構成されている。
上記方法において好ましくは、生理活性物質を結合するための官能基は、カルボキシル基又はアミノ基である。

本発明のさらに別の側面によれば、上記した本発明のバイオセンサーと生理活性物質とを接触させて、該バイオセンサーの流路の検出面及び非検出面の表面に該生理活性物質を共有結合により結合させる工程；及び生理活性物質が共有結合により流路の検出面及び非検出面の表面に結合しているバイオセンサーと被験物質とを接触させる工程；を含む、該生理活性物質と相互作用する物質を検出または測定する方法が提供される。
好ましくは、生理活性物質をバイオセンサーに結合させる工程と、被験物質をバイオセンサーに接触させて生理活性物質と相互作用する物質を検出または測定する工程とを、異なる装置で行う。

本発明の別の側面によれば、上記した本発明のバイオセンサーの製造方法を実施する工程；該工程で製造されるバイオセンサーと生理活性物質とを接触させて、該バイオセンサーの流路の検出面及び非検出面の表面に該生理活性物質を共有結合により結合させる工程；及び生理活性物質が共有結合により流路の検出面及び非検出面の表面に結合しているバイオセンサーと被験物質とを接触させる工程；を同一の装置を用いて連続して行う、バイオセンサーの製造及び生理活性物質と相互作用する物質を検出または測定する方法が提供される。

好ましくは、生理活性物質と相互作用する物質を非電気化学的方法により検出または測定し、さらに好ましくは、生理活性物質と相互作用する物質を表面プラズモン共鳴分析により検出または測定する。

本発明のさらに別の側面によれば、上記した本発明のバイオセンサーを用いて生理活性物質と相互作用する物質を検出及び回収し、回収された物質の構造を質量分析器を用いて決定することを含む、生理活性物質と相互作用する物質の分析方法が提供される。

本発明により、ノイズとなる、センサー表面及び流路表面に対する非特異的な吸着が抑制され、生理活性物質と特異的に相互作用する被験物質の抽出能が高いバイオセンサーを提供することが可能になった。

以下、本発明の実施の形態について説明する。
本発明のバイオセンサーは、基板、及びその上に形成された流路から構成されている。本発明で言うバイオセンサーとは最も広義に解釈され、生体分子間の相互作用を電気的信号等の信号に変換して、対象となる物質を測定・検出するセンサーを意味する。通常のバイオセンサーは、検出対象とする化学物質を認識するレセプター部位と、そこに発生する物理的変化又は化学的変化を電気信号に変換するトランスデューサー部位とから構成される。生体内には、互いに親和性のある物質として、酵素／基質、酵素／補酵素、抗原／抗体、ホルモン／レセプターなどがある。バイオセンサーでは、これら互いに親和性のある物質の一方を基板に固定化して分子認識物質として用いることによって、対応させるもう一方の物質を選択的に計測するという原理を利用している。

本発明で言う流路は、液を流すことができるように基板上に形成されたものであればその構造は特に限定されない。本発明における流路は、生理活性物質と被験物質との相互作用を検出するための検出面と、上記相互作用を検出しない非検出面とから構成されている。また、流路の断面の形状は特に限定されず、正方形、長方形、台形、円、半円、楕円など任意の形状とすることができる。

本発明で言う流路は、薬品やタンパク質を注入するためのシリンジ、ピペットを含まない。但し、コンタミネーション防止の観点からはディスポーザブルなピペットを使用して薬品やタンパク質を注入することが好ましい。本発明の流路の一例を図２に示す。

図２の左図においては、液を注入する領域と、検出面を含む領域と、液を排出する領域の３個の領域から形成されており、液を注入する領域と液を排出する領域は、検出面を含む領域に対してほぼ直角方向に形成されている。図２の左図の場合、液を注入する領域と液を排出する領域については、当該流路の内面は全て非検出面となり、検出面を含む領域については、流路の底面が検出面となり、流路の側面と上面は非検出面となる。

また、図２の右図においては、流路は直線上に形成されている。この場合、流路の底面が検出面となり、流路の側面と上面は非検出面となる。

本発明で用いる流路部材は特に限定されないが、ポリジメチルシロキサン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリメチルメタクリレート、ポリスチレンなどが挙げられる。

本明細書で言う検出面とは、流路の内表面のうち、生理活性物質と被験物質との相互作用が検出される表面と意味する。また、本明細書で言う非検出面とは、流路の内表面のうち、上記相互作用を検出しない表面を意味する。

本発明のバイオセンサーには好ましくは、生理活性物質と相互作用する物質を回収する機構をさらに設けることができる。当該機構としては、ピペットなどを使用することができる。

本発明では、上記した検出面及び非検出面の表面の全体が、生理活性物質を固定化できるように自己組織化膜で修飾されている。

本発明で言う自己組織化膜とは、外からの細かい制御を加えていない状態で、膜材料そのものがもつ機構によって形成される一定の秩序をもつ組織をもった単分子膜やＬＢ膜などの超薄膜のことを言う。この自己組織化により、非平衡な状況で長距離にわたって秩序がある構造やパターンが形成される。

チオールやジスルフィド類などの含硫黄化合物は金等の貴金属基板上に自発的に吸着し単分子サイズの超薄膜を与える。またその集合体は基板の結晶格子や吸着分子の分子構造に依存した配列を示すことから自己組織化膜と呼ばれている。

例えば、自己組織化膜は、含硫黄化合物により形成することができる。含硫黄化合物によって金表面に自己組織化膜を形成することは、例えば、Nuzzo RG等（1983年）、J Am Chem Soc、105巻、4481〜4483頁、Porter MD等（1987年）、J Am Chem Soc、109巻、3559〜3568頁、Troughton EB等（1988年）、Langmuir、４巻、365〜385頁などに記載されている。

自己組織化膜を構成する分子としては、Ｘ¹−Ｒ¹−Ｙ¹で示される化合物を使用することができる。以下、Ｘ¹−Ｒ¹−Ｙ¹について説明する。

Ｘ¹は金属膜に対する結合性を有する基である。具体的には、非対称又は対称スルフィド（−SSR¹¹Ｙ¹¹、−SSR¹Y¹）、スルフィド（−SR¹¹Ｙ¹¹、−SR¹Y¹）、ジセレニド（−SeSeR¹¹Ｙ¹¹、−SeSeR¹Y¹）、セレニド（SeR¹¹Ｙ¹¹、−SeR¹Y¹）、チオール（−SH）、ニトリル（−CN）、イソニトリル、ニトロ（−NO₂）、セレノール（−SeH）、３価リン化合物、イソチオシアネート、キサンテート、チオカルバメート、ホスフィン、チオ酸またはジチオ酸（−COSH、−CSSH）が好ましく用いられる。

Ｒ¹（とＲ¹¹）は場合によりヘテロ原子により中断されており、好ましくは適当に密な詰め込みのため直鎖（枝分かれしていない）であり、場合により二重及び／又は三重結合を含む炭化水素鎖である。鎖の長さは10原子を越えることが好ましい。炭素鎖は場合により過弗素化されることができる。

Ｙ¹とＹ¹¹は、生理活性物質を結合するための官能基である。Ｙ¹とＹ¹¹は好ましくは同一であり、生理活性物質に直接又は活性化後結合できるような性質を持つ。具体的にはヒドロキシル、カルボキシル、アミノ、アルデヒド、ヒドラジド、カルボニル、エポキシ、又はビニル基などを用いることができる。

有機分子Ｘ¹−Ｒ¹−Ｙ¹の具体例としては、10-カルボキシ-1-デカンチオール、4,4'-ジチオジブチリックアシッド、11-ヒドロキシ-1-ウンデカンチオール、11-アミノ-1-ウンデカンチオール、7−カルボキシ−１−ヘプタンチオール、16-メルカプトヘキサデカン酸などが挙げられる。

本発明では、水酸基と生理活性物質を結合するための官能基とを有する自己組織化膜を使用するが、好ましくは、水酸基を有するチオール化合物と、生理活性物質を結合するための官能基（例えば、上記したカルボキシル、アミノ、アルデヒド、ヒドラジド、カルボニル、エポキシ、又はビニル基など）を有するチオール化合物との混合物を使用することができる。

本発明において、流路の検出面及び非検出面の表面を修飾するためには、例えば、流路の検出面および非検出の表面に金蒸着を施し、次いで、水酸基を有するチオール化合物と、生理活性物質を結合するための官能基を有するチオール化合物を含む混合液（例えば、エタノール溶液など）を上記の金表面に接触させて反応させることによって、金表面に自己組織化膜を形成すればよい。

本発明の流路の非検出面は、検出面と同一な修飾がなされていても、異なった修飾がなされていてもかまわない。但し、同一な修飾がされていることが好ましい。

本発明のバイオセンサーは、金属表面又は金属膜を自己組織化膜で修飾したものであることが好ましい。金属表面あるいは金属膜を構成する金属としては、例えば、表面プラズモン共鳴バイオセンサー用を考えた場合、表面プラズモン共鳴が生じ得るようなものであれば特に限定されない。好ましくは金、銀、銅、アルミニウム、白金等の自由電子金属が挙げられ、特に金が好ましい。それらの金属は単独又は組み合わせて使用することができる。また、上記基板への付着性を考慮して、基板と金属からなる層との間にクロム等からなる介在層を設けてもよい。

金属膜の膜厚は任意であるが、例えば、表面プラズモン共鳴バイオセンサー用を考えた場合、０．１ｎｍ以上５００ｎｍ以下であるのが好ましく、特に１ｎｍ以上２００ｎｍ以下であるのが好ましい。５００ｎｍを超えると、媒質の表面プラズモン現象を十分検出することができない。また、クロム等からなる介在層を設ける場合、その介在層の厚さは、０．１ｎｍ以上、１０ｎｍ以下であるのが好ましい。

金属膜の形成は常法によって行えばよく、例えば、スパッタ法、蒸着法、イオンプレーティング法、電気めっき法、無電解めっき法等によって行うことができる。

金属膜は好ましくは基板上に配置されている。ここで、「基板上に配置される」とは、金属膜が基板上に直接接触するように配置されている場合のほか、金属膜が基板に直接接触することなく、他の層を介して配置されている場合をも含む意味である。本発明で使用することができる基板としては例えば、表面プラズモン共鳴バイオセンサー用を考えた場合、一般的にはＢＫ７等の光学ガラス、あるいは合成樹脂、具体的にはポリメチルメタクリレート、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、シクロオレフィンポリマーなどのレーザー光に対して透明な材料からなるものが使用できる。このような基板は、好ましくは、偏光に対して異方性を示さずかつ加工性の優れた材料が望ましい。

本発明の流路の検出面及び非検出面に固定される生理活性物質としては、測定対象物と相互作用するものであれば特に限定されず、例えば免疫蛋白質、酵素、微生物、核酸、低分子有機化合物、非免疫蛋白質、免疫グロブリン結合性蛋白質、糖結合性蛋白質、糖を認識する糖鎖、脂肪酸もしくは脂肪酸エステル、あるいはリガンド結合能を有するポリペプチドもしくはオリゴペプチドなどが挙げられる。

免疫蛋白質としては、測定対象物を抗原とする抗体やハプテンなどを例示することができる。抗体としては、種々の免疫グロブリン、即ちＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤを使用することができる。具体的には、測定対象物がヒト血清アルブミンであれば、抗体として抗ヒト血清アルブミン抗体を使用することができる。また、農薬、殺虫剤、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、抗生物質、麻薬、コカイン、ヘロイン、クラック等を抗原とする場合には、例えば抗アトラジン抗体、抗カナマイシン抗体、抗メタンフェタミン抗体、あるいは病原性大腸菌の中でＯ抗原26、86、55、111 、157 などに対する抗体等を使用することができる。

酵素としては、測定対象物又は測定対象物から代謝される物質に対して活性を示すものであれば、特に限定されることなく、種々の酵素、例えば酸化還元酵素、加水分解酵素、異性化酵素、脱離酵素、合成酵素等を使用することができる。具体的には、測定対象物がグルコースであれば、グルコースオキシダーゼを、測定対象物がコレステロールであれば、コレステロールオキシダーゼを使用することができる。また、農薬、殺虫剤、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、抗生物質、麻薬、コカイン、ヘロイン、クラック等を測定対象物とする場合には、それらから代謝される物質と特異的反応を示す、例えばアセチルコリンエステラーゼ、カテコールアミンエステラーゼ、ノルアドレナリンエステラーゼ、ドーパミンエステラーゼ等の酵素を使用することができる。

微生物としては、特に限定されることなく、大腸菌をはじめとする種々の微生物を使用することができる。
核酸としては、測定の対象とする核酸と相補的にハイブリダイズするものを使用することができる。核酸は、ＤＮＡ（ｃＤＮＡを含む）、ＲＮＡのいずれも使用できる。ＤＮＡの種類は特に限定されず、天然由来のＤＮＡ、遺伝子組換え技術により調製した組換えＤＮＡ、又は化学合成ＤＮＡの何れでもよい。
低分子有機化合物としては通常の有機化学合成の方法で合成することができる任意の化合物が挙げられる。

非免疫蛋白質としては、特に限定されることなく、例えばアビジン（ストレプトアビジン）、ビオチン又はレセプターなどを使用できる。
免疫グロブリン結合性蛋白質としては、例えばプロテインＡあるいはプロテインＧ、リウマチ因子（ＲＦ）等を使用することができる。
糖結合性蛋白質としては、レクチン等が挙げられる。
脂肪酸あるいは脂肪酸エステルとしては、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、ステアリン酸エチル、アラキジン酸エチル、ベヘン酸エチル等が挙げられる。

生理活性物質が抗体や酵素などの蛋白質又は核酸である場合、その固定化は、生理活性物質のアミノ基、チオール基等を利用し、金属表面の官能基に共有結合させることで行うことができる。

上記のようにして生理活性物質を固定化したバイオセンサーは、当該生理活性物質と相互作用する物質の検出及び／又は測定のために使用することができる。

更に、流路の検出面及び非検出面の表面に結合した生理活性物質と相互作用する物質を回収することができる。

即ち、本発明によれば、生理活性物質が固定化された本発明のバイオセンサーを用いて、これに被験物質を接触させることにより、該バイオセンサーに固定化されている生理活性物質と相互作用する物質を検出及び／又は測定及び／又は回収する方法が提供される。

被験物質としては例えば、上記した生理活性物質と相互作用する物質を含む試料などを使用することができる。

本発明では、バイオセンサー用表面に固定化されている生理活性物質と被験物質との相互作用を非電気化学的方法により検出及び／又は測定することが好ましい。非電気化学的方法としては、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定技術、水晶発振子マイクロバランス（ＱＣＭ）測定技術、金のコロイド粒子から超微粒子までの機能化表面を使用した測定技術などが挙げられる。

本発明の好ましい態様によれば、本発明のバイオセンサーは、例えば、透明基板上に配置される金属膜を備えていることを特徴とする表面プラズモン共鳴用バイオセンサーとして用いることができる。

表面プラズモン共鳴用バイオセンサーとは、表面プラズモン共鳴バイオセンサーに使用されるバイオセンサーであって、該センサーより照射された光を透過及び反射する部分、並びに生理活性物質を固定する部分とを含む部材を言い、該センサーの本体に固着されるものであってもよく、また脱着可能なものであってもよい。
本発明のバイオセンサーを表面プラズモン共鳴分析に使用する場合、特開2004-271514の段落番号００４１から００５４に記載されたような各種の表面プラズモン測定装置の一部として適用することができる。

さらにまた、本発明では、本明細書中に上記した本発明のバイオセンサーの製造方法を実施する工程；該工程で製造されるバイオセンサーと生理活性物質とを接触させて、該バイオセンサーの流路の検出面及び非検出面の表面に該生理活性物質を共有結合により結合させる工程；及び生理活性物質が共有結合により流路の検出面及び非検出面の表面に結合しているバイオセンサーと被験物質とを接触させる工程；を同一の装置を用いて連続して行うことによって、バイオセンサーの製造及び生理活性物質と相互作用する物質の検出または測定を行うことができる。ここで言う「同一の装置を用いて連続して行う」とは、流路の形態を変化させずに連続して操作を行うことを意味し、具体的には、流路を組み立てた状態で流路の表面の修飾（即ち、水酸基と生理活性物質を結合するための官能基とを有する自己組織化膜による修飾）を行い、さらに連続してアッセイ（即ち、生理活性物質をバイオセンサーに結合させ、続いて被験物質をバイオセンサーに接触させて生理活性物質と相互作用する物質を検出または測定する）を行うことを意味する。

さらにまた、本発明のバイオセンサーを用いて生理活性物質と相互作用する物質を検出及び回収した後に、回収された物質の質量数を質量分析器を用いて決定することができる。質量分析器としては、MALDI-TOF-MS（Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization-Time of Flight-Mass Spectrometry（マトリックス支援レーザ脱離イオン化法飛行時間質量分析器））や、ESI-MS（Electrospray Ionization(エレクトロスプレーイオン化質量分析器)）などを使用することができる。また、回収された物質がタンパク質の場合、プロテアーゼで消化した後にペプチドの質量分析スペクトルを取得し、既に測定した既知のタンパク質の質量分析スペクトルやゲノム情報から予測した質量分析スペクトルと認証して、生理活性物質と相互作用したタンパク質を検出・同定することも可能である。
以下の実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。

実施例１：SAMで被覆したセンサチップ表面のタンパク質結合性評価
（１）SAM液の調液
11-Hydroxy-1-undecanethiol (ALDRICH製)9.2 mg、16-Mercaptohexadecanoic acid（ALDRICH製）1.4 mg、超純水2ml及びエタノール8mlを40℃にて十分混合して使用した。

（２）SAM被覆
金被覆ガラスチップ（Sensor Chip Au, Biacore社製）をModel-208ＵＶ−オゾンクリーニングシステム（TECHNOVISION INC.）で12分処理した後、上記SAM液を接触させ、40℃１時間反応させた後、エタノールおよび超純水にて各１回づつ洗浄を行った。

（３）疎水性高分子被覆
特願2003-405704に記載の方法でポリメチルメタクリレート−ポリスチレンコポリマー（PMMA/PSt）（モル比50対50、平均分子量20000）を金蒸着面上に20nmの膜厚で製膜した。即ち、金ブロックをModel-208ＵＶ−オゾンクリーニングシステム（TECHNOVISION INC.）で12分処理した後、金蒸着表面上に0.2%PMMA/PStを滴下し、1,000rpm 45sec.にてスピンコートを行う。さらに、特願2003-405704に記載の条件（即ち、NaOH水溶液（１Ｎ）に４０℃１６時間浸漬した後、水で3回洗浄し、窒素ブローで水を除去した）で加水分解してカルボン酸を生成させた。生成したカルボン酸表面を１−エチル−２，３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド（400nM）とＮ−ヒドロキシスクシンイミド（100mM）との混合液に60分浸漬したのち、5-アミノ吉草酸（1mol/l、pH8.5に調整）溶液に16時間浸漬し、超純水で洗浄をおこなった。

（４）SAMで被覆した表面に対する吸着性評価
SAM被覆処理センサチップと疎水性高分子被覆センサチップおよびカルボキシデキストラン被覆センサチップ（Sensor Chip CM5 Biacore社製）上に固定化されたリガンド（Actin）に対するアナライトの結合量をBiacore3000（Biacore社製）を用いて、測定を行った。

（５）各種試薬の調液
（ｉ）リガンド溶液の調製：
Muscle Actin（Cytoskeleton社製）1mgを100ulの超純水で溶解させて、10mg/ml Stock（5mM Tris-HCl バッファー中）を調製した。本Stockを10mM酢酸バッファー（pH4.5）で希釈し、0.04mg/ml溶液に調製した。

（ｉｉ）活性化液の調製：
下記溶液を使用直前に体積比１：１で混合した。
a. 0.1M NHS溶液、0.4M EDC溶液（各Biacore社製）
b. 0.1M Sulfo-NHS溶液（PIERCE社製）、0.4M EDC溶液

（ｉｉｉ）ブロッキング液：
a.1Mエタノールアミン液(pH8.5)
b.1Mテトラエチレングリコールアミン（pH9.0）

（ｉｖ）アナライト液：
抗Actin マウスIgG（Abcam Ltd製）、抗Actin マウスIgM（DBS社製）をHBS-Pバッファー（Biacore社製）で50倍希釈した。抗GFP IgG（Rockland社製）、BSA（SIGMA社製）をHBS-Pバッファーで0.5mg/mlに調整した。なお、HBS-Pバッファーの組成は、HEPES（N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonicAcid）0.01mol/l（pH7.4）、NaCl 0.15mol/l、Surfactant P20 0.005重量％である。

（６）リガンドの固定化
（ｉ）SAM被覆センサチップおよび、疎水性高分子被覆センサチップへの固定化
本操作は全てBiacore3000（Biacore社製）を用いて行った。センサチップを装置にセットし、HBS-Pバッファーを10μl/min.の一定速度で流し、流し始めから3分経った時の信号値を0とした。活性化液b（Sulfo-NHS/EDC）を30分間流しつづけその後、リガンド溶液を30分間流しつづけ、更にブロッキング剤bを30分間流しつづけた。10mM Gly-HCl（pH1.5）、10mM NaOHをそれぞれ1分間づつ流して洗浄後、更にHBS-Pで5分間平衡化を行った後の信号値をリガンドの固定化量とした。

（ｉｉ）CM5センサチップへの固定化
本操作は全てBiacore3000（Biacore社製）を用いて行った。センサチップを装置にセットし、HBS-Pバッファーを10μl/min.の一定速度で流し、流し始めから3分経った時の信号値を0とした。活性化液a（NHS/EDC）を7分間流しつづけその後、リガンド溶液を7分間流しつづけ、更にブロッキング剤aを7分間流しつづけた。10mM Gly-HCl（pH1.5）、10mM NaOHをそれぞれ1分間づつ流して洗浄後、更にHBS-Pで5分間平衡化を行った時の信号値をリガンドの固定化量とした。

（７）アナライトの結合量測定
各チップを装置にセットしたまま、アナライトの結合量測定を行った。HBS-Pバッファーを10μl/min.の一定速度で流し、その状態で測定を開始し、測定開始後3分後の信号値を0とした。各アナライト液30μlを流路に3分間で注入し、注入後3分間放置する。3分後の信号値をアナライトの結合量として見積もった。

アナライトの結合量を物質量（mol数）で見積もり、その値をリガンドの結合物質量で割ることによって一分子のリガンド当たりに結合したアナライトの分子数を算出した。この値を結合活性値として定義する。図１に各種の結合活性値をCM5における結合活性値に対して規格化した値にして示す。ただし、ネガティブコントロールのアナライトである、抗GFP IgG、およびBSAは結合量をCM5における値に対して規格化（CM5における結合活性値を1とする）して示す。

（８）結果の評価
図１の結果から、本発明で用いるSAM被覆表面はCM5や疎水性高分子被覆表面より特異的結合物質の結合能に大幅に優れ（図中 抗Actin IgG, IgM）、かつ非特異的な吸着の抑制能にも大幅に優れている（図中 抗GFP IgG、BSA）ことが示された。このことから、本SAM被覆表面は特異的に物質を検出、抽出するバイオセンサーに適していることが示された。

実施例2：SAMによる全面被覆を行った流路を用いた特異的タンパク質の抽出
（１）金蒸着
スパッタ装置の基板ホルダに流路外枠（フローセルキャリア タイプ2 Biacore社製）を取付け、真空（ベースプレッシャー1×10^-3Pa以下）に引いてからArガスを導入し（1Pa）、基板ホルダを回転（20rpm）させながら、基板ホルダにRFパワー（0.5kW）を約9分間印加してFETをプラズマ処理（基板エッチング、逆スパッタとも呼ばれる）する。次に、Arガスを止めて真空に引き、Arガスを再び導入し（0.5Pa）、基板ホルダを回転（10〜40rpm）させながら、8inchのCrターゲットにDCパワー（0.2kW）を約30秒間印加して2nmのCr薄膜を成膜する。次に、Arガスを止めて再び真空に引き、Arガスを再び導入し（0.5Pa）、基板ホルダを回転（20rpm）させながら、8inchのAuターゲットにDCパワー（1kW）を約50秒間印加して50nm程度のAu薄膜を成膜する。Auの粒子サイズは、20nm程度である。

（２）流路全面のSAM被覆
金蒸着した流路外枠（フローセルキャリア）を金被覆ガラスチップと組み合わせて、流路（図２の左図）を作製する。作製流路にSAM液（実施例1と同じ方法にて作製）を接触させ、40℃1時間反応させた後、エタノールと超純水にて流路全面の洗浄を行う。

（３）リガンドの固定化
実施例1と同じ手法を用いて、各流路に抗マウスIgM IgG（Alpha Diagnostic International社製）の固定化を行った。ただし、固定化時のIgG濃度は0.1mg/mlとした。

（４）細胞破砕液からの特異的タンパク質抽出
測定表面と本発明の流路の組み合わせにより作成された流路と、測定表面と処理をしていない流路の組み合わせにより作製された流路を、Biacore3000 Surface Prep Unitにセットし、細胞破砕液からの特異的タンパク質の回収実験を行った。

（５）細胞破砕液の調製
Hela細胞をPBSで洗浄したあと、NP-40 1%を含むバッファー中でピペッティングを行う。室温で15分間静置したものを1000rpmで2分間遠心分離操作を行い、上清を回収する。回収した上清を今度は15000rpmで30分間遠心操作をした際の上清を回収した。本回収液に対して、抗ActinマウスIgM（DBS社製）を最終濃度0.05mg/mlになるように混合した。

（６）細胞破砕液からの特異的タンパク質の抽出
HBS-Pバッファーを5μl/min.の一定速度で流し、その状態で測定を開始し、3分間平衡化を行ったあと、細胞破砕液を3分間流した状態にて接触させた。再度、HBS-Pバッファーを10分間流し続け、洗浄を行った。その後、50mMのNaOH水溶液を20秒間接触させて、本溶液を回収した。細胞破砕液接触から回収までの処理を10回繰り返し、得られたタンパク質抽出液をSDS-PAGEにて分離し、銀染色を行い、タンパク質の確認を行った。SDS-PAGEはBio-Rad社製のゲルと泳動装置を用い、推奨プロトコールに従って操作を行った。また、銀染色はGE Healthcare社製のキットを用いて、推奨プロトコールに従って操作を行った。

本操作を、非検出部を含む流路全面のSAM被覆処理を行った流路、検出面のみにSAM被覆処理を行った流路、検出面のみにCM5が被覆されている流路に対して行い、得られたゲルの観察結果を表1に示した。

A：銀染色操作Developingにおいて30秒以内に容易に黙視で検出が可能
B：銀染色操作Developingにおいて5分以内に黙視にて検出が可能
C：銀染色操作Developingにおいて5分以上経過してもバックグラウンドと比較して優位な差が検出不可能

（７）結果の評価
表１の結果から、本発明の全面SAM被覆流路は比較例と比べて、Keratinなどの非特異的なタンパク質吸着の抑制能が高く、また目的のタンパク質の抽出能が高いことが示された。このように本発明により、特異的なタンパク質の抽出能に優れた、バイオセンサーを提供することができた。

実施例３ ：SAMによる全面被覆を行った流路を用いた特異的タンパク質の抽出
（１）蒸着
スパッタ装置の基板ホルダにポリシクロオレフィン製プリズム及びポリプロピレン製流路（図２の左図）を取付け、真空（ベースプレッシャー1×10^-3Pa以下）に引いてからArガスを導入し（1Pa）、基板ホルダを回転（20rpm）させながら、基板ホルダにRFパワー（0.5kW）を約9分間印加してFETをプラズマ処理（基板エッチング、逆スパッタとも呼ばれる）する。次に、Arガスを止めて真空に引き、Arガスを再び導入し（0.5Pa）、基板ホルダを回転（10〜40rpm）させながら、8inchのCrターゲットにDCパワー（0.2kW）を約30秒間印加して2nmのCr薄膜を成膜する。次に、Arガスを止めて再び真空に引き、Arガスを再び導入し（0.5Pa）、基板ホルダを回転（20rpm）させながら、8inchのAuターゲットにDCパワー（1kW）を約50秒間印加して50nm程度のAu薄膜を成膜する。Auの粒子サイズは、20nm程度である。

（２）SAM被覆化
金蒸着したポリシクロオレフィン製プリズム表面及びポリプロピレン製流路表面にSAM液（実施例1と同じ方法にて作製）を接触させ、40℃1時間反応させた後、エタノールと超純水を用いて洗浄を行った。

（３）リガンドの固定化
チップを装置にセットし、HBS-Pバッファーで流路を満たす。活性化液（実施例1 活性化剤bと同じ手法にて調製）100μlを流路に１秒間で注入し、30分放置する。続けて、HBS-Pバッファー100μlを流路に１秒間で注入し、そのあと、リガンド溶液（実施例２と同じ手法にて調製）100μlを流路に１秒間で注入し、30分放置する。続けて、HBS-Pバッファー100μlを流路に１秒間で注入し、そのあと、ブロッキング液（実施例1ブロッキング剤b と同じ手法にて調製）100μlを流路に１秒間で注入し、30分放置する。続けて、HBS-Pバッファー100μlを流路に１秒間で注入し、続けて、10mM NaOH溶液100μlを流路に１秒間で注入することを２回連続で行い、さらに、HBS-Pに置換して30秒放置した。

（４）細胞破砕液からの特異的タンパク質抽出
測定表面と本発明の流路の組み合わせにより作成されたバイオセンサーと、測定表面と処理をしていない流路の組み合わせにより作製された流路を用いて、細胞破砕液からの特異的タンパク質の回収実験を行った。

（５）細胞破砕液からの抽出してきたタンパク質の解析
流路をHBS-Pバッファーで満たし、その状態で、アナライト液100μlを流路に１秒間で注入し、3分放置する。さらに、HBS-Pバッファー100μlを流路に１秒間で注入し、その後、50mMのNaOH水溶液で流路を満たし、180秒放置した。放置後、流路中のNaOH水溶液を回収した。回収液は、実施例２と同じ手法にてSDS-PEGEをかけ銀染色を行い、ゲルの観察を行った。結果を表２に示す。

A：銀染色操作Developingにおいて30秒以内に容易に黙視で検出が可能
B：銀染色操作Developingにおいて5分以内に黙視にて検出が可能
C：銀染色操作Developingにおいて5分以上経過してもバックグラウンドと比較して優位な差が検出不可能

（６）結果の評価
表２の結果から、本発明の全面SAM被覆流路は比較例と比べて、Keratinなどの非特異的なタンパク質吸着の抑制能が高く、また目的のタンパク質の抽出能が高いことが示された。このように本発明により、特異的なタンパク質の抽出能に優れた、バイオセンサーを提供することができた。

図１は、各種膜に対する結合活性値の比較を示す。 図２は、本発明の流路の例を示す。

Claims (16)

1. 基板上に形成された流路であって、生理活性物質と被験物質との相互作用を検出するための検出面、及び上記相互作用を検出しない非検出面から構成される流路を有するバイオセンサーにおいて、基板が金属表面又は金属膜であり、上記の検出面及び非検出面の表面が、水酸基と生理活性物質を結合するための官能基とを有する自己組織化膜で修飾されていて、検出面及び非検出面の表面の全体が、生理活性物質を固定化できるように自己組織化膜で修飾されていることを特徴とするバイオセンサー。
2. 水酸基と生理活性物質を結合するための官能基とを有する自己組織化膜が、水酸基を有するチオール化合物と、生理活性物質を結合するための官能基を有するチオール化合物との混合物から構成されている、請求項１に記載のバイオセンサー。
3. 生理活性物質を結合するための官能基が、カルボキシル基又はアミノ基である、請求項１又は２に記載のバイオセンサー。
4. 生理活性物質と相互作用する物質を回収する機構をさらに有する、請求項１から３の何れかに記載のバイオセンサー。
5. 金属表面あるいは金属膜が、金、銀、銅、白金、及びアルミニウムからなる群より選ばれる自由電子金属からなるものである、請求項１から４の何れかに記載のバイオセンサー。
6. 非電気化学的検出に使用される、請求項１から５の何れかに記載のバイオセンサー。
7. 表面プラズモン共鳴分析に使用される、請求項１から６の何れかに記載のバイオセンサー。
8. 流路の検出面及び非検出面の表面を、水酸基と生理活性物質を結合できる官能基とを有する自己組織化膜で修飾する工程を含む、請求項1から７の何れかに記載のバイオセンサーの製造方法。
9. 水酸基と生理活性物質を結合するための官能基とを有する自己組織化膜が、水酸基を有するチオール化合物と、生理活性物質を結合するための官能基を有するチオール化合物との混合物から構成されている、請求項８に記載の方法。
10. 生理活性物質を結合するための官能基が、カルボキシル基又はアミノ基である、請求項８又は９に記載の方法。
11. 請求項１から７の何れかに記載のバイオセンサーと生理活性物質とを接触させて、該バイオセンサーの流路の検出面及び非検出面の表面に該生理活性物質を共有結合により結合させる工程；及び生理活性物質が共有結合により流路の検出面及び非検出面の表面に結合しているバイオセンサーと被験物質とを接触させる工程；を含む、該生理活性物質と相互作用する物質を検出または測定する方法。
12. 請求項８から１０の何れかに記載の方法を実施する工程；該工程で製造されるバイオセンサーと生理活性物質とを接触させて、該バイオセンサーの流路の検出面及び非検出面の表面に該生理活性物質を共有結合により結合させる工程；及び生理活性物質が共有結合により流路の検出面及び非検出面の表面に結合しているバイオセンサーと被験物質とを接触させる工程；を同一の装置を用いて連続して行う、バイオセンサーの製造及び生理活性物質と相互作用する物質を検出または測定する方法。
13. 生理活性物質をバイオセンサーに結合させる工程と、被験物質をバイオセンサーに接触させて生理活性物質と相互作用する物質を検出または測定する工程とを、異なる装置で行う、請求項１１に記載の方法。
14. 生理活性物質と相互作用する物質を非電気化学的方法により検出または測定する、請求項１１から１３の何れかに記載の方法。
15. 生理活性物質と相互作用する物質を表面プラズモン共鳴分析により検出または測定する、請求項１１から１４の何れかに記載の方法。
16. 請求項１から７の何れかに記載のバイオセンサーを用いて生理活性物質と相互作用する物質を検出及び回収し、回収された物質の質量数を質量分析器を用いて決定することを含む、生理活性物質と相互作用する物質の分析方法。

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