JP4721053B2 - 名古屋コーチン識別用プライマーセット、検出キット及び名古屋コーチンの識別方法 - Google Patents
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Description
本発明は、名古屋コーチン識別用ＤＮＡマーカー、検出キット及び名古屋コーチンの識別方法に関する。更に詳しくは本発明は、供試されたニワトリ個体又は鶏卵が名古屋コーチンであるか否か、あるいは供試されたニワトリの体組織（例えば鶏肉等）又は細胞が名古屋コーチン由来であるか否かを識別できるＤＮＡマーカーと、これを含んで構成される名古屋コーチン識別用の検出キットと、これらを利用して行う名古屋コーチンの識別方法とに関する。
名古屋コーチンは、その特徴的な外観と共に優れた食味でも有名であり、ニワトリの多様な品種の中でも特に高いブランド価値を持っている。そのため、市場に提供された鶏肉や鶏卵等が名古屋コーチンであるか否かによって市場価格が異なるのは、通常に見られることである。
このような点から、ニワトリ品種としての名古屋コーチンの純粋性とブランド価値を維持し、消費者利益を保護する種々の努力が行われている。
例えば、一部の流通業者は、名古屋コーチンの鶏肉に外観的特徴である鉛色（灰色）の脚を付けて販売したり、パソコンや携帯電話から生産者を検索できるラベルを鶏肉のパックに貼ったりして、品質保証に努めてきた。しかしながら、これらの取り組みは、名古屋コーチンと他のニワトリの鶏肉を完全に識別できるものではない。
そのため、鶏肉や鶏卵が名古屋コーチン由来であるか否かを識別できる技術の提供が強く要求される。又、ニワトリ個体が名古屋コーチンであるか否かを識別したい場合に、ニワトリの外観的特徴等から正確に識別することは、必ずしも容易ではない。従って、ニワトリ個体が名古屋コーチンであるか否かを識別できる技術の提供も強く要求される。
近年、ニワトリゲノムの解析により、多くのマイクロサテライトが同定されている。マイクロサテライトとは、周知のように、ゲノム中に散在する単純な塩基配列の繰り返し領域であり、その繰り返し数に依存する当該領域の長さは極めて多型性に富むことが知られている。ニワトリに関して、上記したゲノム解析に基づき、マイクロサテライトの両側に位置する特異的な塩基配列を含む１２００種類以上に及ぶ多くのＤＮＡマーカーが提案されている（非特許文献：Hu et al.
2001, Takahashi et al. 2005 ）。又、ニワトリのマイクロサテライトＤＮＡ多型を用い、日本在来のニワトリ品種間の遺伝的類縁関係の推定が可能であることが指摘されている（非特許文献：Takahashi et al. 1998, Osman et al. 2005）。
2001, Takahashi et al. 2005 ）。又、ニワトリのマイクロサテライトＤＮＡ多型を用い、日本在来のニワトリ品種間の遺伝的類縁関係の推定が可能であることが指摘されている（非特許文献：Takahashi et al. 1998, Osman et al. 2005）。
下記の特許文献１〜６においては、ニワトリ以外の種々の植物又は動物に関して、ゲノムＤＮＡ情報を基に品種識別する多様な方法が提案されている。
特許文献１は、豚の制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）を利用する方法であり、特許文献２は、レタスのランダム増幅ＤＮＡ多型（ＲＡＰＤ）を利用する方法であり、特許文献３は、イグサの一塩基多型（ＳＮＰ）を利用する方法であり、特許文献４は、イグサのランドマークゲノムスキャニング法を利用するものであり、特許文献５は、イチゴの増幅断片長多型（ＡＦＬＰ）を利用する方法であり、特許文献６は、イグサの単純反復配列間増幅断片長多型（ＩＳＳＲ）を利用する方法である。
ところで、上記した Hu et al. 2001 、Takahashi et al. 2005 、Takahashi
et al. 1998 、Osman et al. 2005 等の非特許文献は、貴重な報告ではあるが、これらの非特許文献の知識に基づいて名古屋コーチンの識別が可能か、と言う点に関しては、否定的に考えられる。即ち、上記した各々の非特許文献では、提案されたＤＮＡマーカーが「他のニワトリ品種からの名古屋コーチンの識別に利用できるか否か」についての知見や示唆を与えない。又、提案された多数のＤＮＡマーカーの中にそのようなＤＮＡマーカーが含まれる可能性があると仮定しても、「いずれのＤＮＡマーカーが該当するのか」の知見や示唆も与えない。
et al. 1998 、Osman et al. 2005 等の非特許文献は、貴重な報告ではあるが、これらの非特許文献の知識に基づいて名古屋コーチンの識別が可能か、と言う点に関しては、否定的に考えられる。即ち、上記した各々の非特許文献では、提案されたＤＮＡマーカーが「他のニワトリ品種からの名古屋コーチンの識別に利用できるか否か」についての知見や示唆を与えない。又、提案された多数のＤＮＡマーカーの中にそのようなＤＮＡマーカーが含まれる可能性があると仮定しても、「いずれのＤＮＡマーカーが該当するのか」の知見や示唆も与えない。
一方、上記の各特許文献に関して述べれば、特許文献２〜６のような、イネやイグサ等の植物の栽培品種は遺伝的に斉一なホモ個体集団であるのに対し、ニワトリは、他家生殖し、同じ「品種」と言っても多様なヘテロ個体から構成される集団である。又、ニワトリ品種間の遺伝的距離が非常に近いことが「 Osman et
al. 2005」に記載されている。従ってニワトリの品種識別の困難性をイネやイグサの場合と同列に論じることはできない。
al. 2005」に記載されている。従ってニワトリの品種識別の困難性をイネやイグサの場合と同列に論じることはできない。
更に、上記の特許文献１は豚の品種識別方法に関するものであり、その他にも家畜の品種識別方法として特開２００５−２７６５５号公報に開示する「ウシの品種の鑑別方法」等も例示できる。しかし、前者は制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）を利用する方法であり、後者は１１種類の一塩基多型（ＳＮＰ）マーカーを組み合わせて品種識別する方法である。即ち、いずれもマイクロサテライトＤＮＡ多型を利用する方法とは基本的に技術内容が異なり、余り参考にならない。
そこで本発明は、名古屋コーチンの識別に有効なマイクロサテライトＤＮＡマーカーが存在するかどうかを究明し、もし存在する場合にはそれを特定し、かつ、可及的に少数種類のマイクロサテライトＤＮＡマーカーを用いて名古屋コーチンを正確に識別できる技術を提供することを、解決すべき技術的課題とする。
（第１発明）
上記課題を解決するための本願第１発明の構成は、以下の１）〜５）のいずれかに示すオリゴヌクレオチドの組み合わせで構成される５種類のマイクロサテライトＤＮＡマーカーのいずれか１種類以上からなり、供試されたニワトリ個体又は鶏卵が名古屋コーチンであるか否か、あるいは供試されたニワトリの体組織が名古屋コーチン由来であるか否かを識別できる、名古屋コーチン識別用ＤＮＡマーカーである。
上記課題を解決するための本願第１発明の構成は、以下の１）〜５）のいずれかに示すオリゴヌクレオチドの組み合わせで構成される５種類のマイクロサテライトＤＮＡマーカーのいずれか１種類以上からなり、供試されたニワトリ個体又は鶏卵が名古屋コーチンであるか否か、あるいは供試されたニワトリの体組織が名古屋コーチン由来であるか否かを識別できる、名古屋コーチン識別用ＤＮＡマーカーである。
１）配列表の配列番号１に示す塩基配列（特定塩基配列Ａ）を有し、又は特定塩基配列Ａの一部の塩基が置換、欠失又は付加されると共に特定塩基配列Ａに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列（雑種形成塩基配列Ａ’）を有するオリゴヌクレオチドと、配列表の配列番号２に示す塩基配列（特定塩基配列Ｂ）を有し、又は特定塩基配列Ｂの一部の塩基が置換、欠失又は付加されると共に特定塩基配列Ｂに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列（雑種形成塩基配列Ｂ’）を有するオリゴヌクレオチドとの組み合わせ。
２）配列表の配列番号３に示す塩基配列（特定塩基配列Ｃ）を有し、又は特定塩基配列Ｃの一部の塩基が置換、欠失又は付加されると共に特定塩基配列Ｃに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列（雑種形成塩基配列Ｃ’）を有するオリゴヌクレオチドと、配列表の配列番号４に示す塩基配列（特定塩基配列Ｄ）を有し、又は特定塩基配列Ｄの一部の塩基が置換、欠失又は付加されると共に特定塩基配列Ｄに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列（雑種形成塩基配列Ｄ’）を有するオリゴヌクレオチドとの組み合わせ。
３）配列表の配列番号５に示す塩基配列（特定塩基配列Ｅ）を有し、又は特定塩基配列Ｅの一部の塩基が置換、欠失又は付加されると共に特定塩基配列Ｅに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列（雑種形成塩基配列Ｅ’）を有するオリゴヌクレオチドと、配列表の配列番号６に示す塩基配列（特定塩基配列Ｆ）を有し、又は特定塩基配列Ｆの一部の塩基が置換、欠失又は付加されると共に特定塩基配列Ｆに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列（雑種形成塩基配列Ｆ’）を有するオリゴヌクレオチドとの組み合わせ。
４）配列表の配列番号７に示す塩基配列（特定塩基配列Ｇ）を有し、又は特定塩基配列Ｇの一部の塩基が置換、欠失又は付加されると共に特定塩基配列Ｇに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列（雑種形成塩基配列Ｇ’）を有するオリゴヌクレオチドと、配列表の配列番号８に示す塩基配列（特定塩基配列Ｈ）を有し、又は特定塩基配列Ｈの一部の塩基が置換、欠失又は付加されると共に特定塩基配列Ｈに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列（雑種形成塩基配列Ｈ’）を有するオリゴヌクレオチドとの組み合わせ。
５）配列表の配列番号９に示す塩基配列（特定塩基配列Ｉ）を有し、又は特定塩基配列Ｉの一部の塩基が置換、欠失又は付加されると共に特定塩基配列Ｉに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列（雑種形成塩基配列Ｉ’）を有するオリゴヌクレオチドと、配列表の配列番号１０に示す塩基配列（特定塩基配列Ｊ）を有し、又は特定塩基配列Ｊの一部の塩基が置換、欠失又は付加されると共に特定塩基配列Ｊに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列（雑種形成塩基配列Ｊ’）を有するオリゴヌクレオチドとの組み合わせ。
本願発明者は、愛知県畜産総合センター種鶏場で維持している名古屋コーチンの原種鶏４系統（ＮＧ１系統、ＮＧ２系統、ＮＧ３系統、ＮＧ４系統）の３８２個体の血液よりゲノムＤＮＡを抽出した。
そして、詳しくは後述するが、これらのゲノムＤＮＡを鋳型として前記非特許文献により既知であるマイクロサテライトＤＮＡマーカー２４個をＰＣＲ増幅し、増幅産物をＤＮＡ自動シーケンサーでキャピラリー電気泳動を行い、各マーカーの遺伝子型を判定したところ、第１発明の１）〜５）に規定する５種類のマイクロサテライトＤＮＡマーカーにおいて、それぞれ一つの対立遺伝子に固定していることを見出した。これらの各々の対立遺伝子は、実施例で示すＰＣＲ条件とＤＮＡ自動分析装置を用いた時、実施例の表６（後述）のサイズを示すことが明らかにされている。
そこで、これら５種類のマーカーの１以上をＰＣＲで特異的に増幅させ、増幅ＤＮＡ断片の長さの違いを検出した時、上記の対立遺伝子と異なるサイズの対立遺伝子が一つでも検出された場合には、「名古屋コーチンではない」と否定できるのではないか、と考えた。
以上の考え方に基づき、後述するように合計３８２個体に及ぶ「名古屋コーチン交雑種」、名古屋コーチン以外の「他の純粋種」及び「市場鶏肉（市販ブロイラー）」のサンプリング調査を行った結果、これらの全てのサンプルにおいて、名古屋コーチンではないと判定することができたのである。
従って、第１発明における特定塩基配列に係るマイクロサテライトＤＮＡマーカーを利用すれば、供試されたニワトリ個体又は鶏卵が名古屋コーチンであるか否か、あるいは供試されたニワトリの体組織が名古屋コーチン由来であるか否かを、正確に識別することが可能になる。又、上記の特定塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする雑種形成塩基配列に係るマイクロサテライトＤＮＡマーカーを利用しても、同等の効果を得ることが期待できる。
そのため、名古屋コーチンと他のニワトリの鶏肉や鶏卵等が市場流通で混同しないよう、簡易かつ有効に監視できるため、名古屋コーチンの鶏卵、鶏肉等を、安心と信頼感を伴って消費者に提供することが可能になる。
（第２発明）
上記課題を解決するための本願第２発明の構成は、前記第１発明に係るマイクロサテライトＤＮＡマーカーが以下のａ）〜ｅ）のいずれかに該当するものである、名古屋コーチン識別用ＤＮＡマーカーである。
上記課題を解決するための本願第２発明の構成は、前記第１発明に係るマイクロサテライトＤＮＡマーカーが以下のａ）〜ｅ）のいずれかに該当するものである、名古屋コーチン識別用ＤＮＡマーカーである。
ａ）前記名古屋コーチン識別用ＤＮＡマーカーが、前記５種類のマイクロサテライトＤＮＡマーカーの内から任意に選択された１種類からなる。
ｂ）前記名古屋コーチン識別用ＤＮＡマーカーが、前記５種類のマイクロサテライトＤＮＡマーカーの内から任意に選択された２種類からなる。
ｃ）前記名古屋コーチン識別用ＤＮＡマーカーが、前記５種類のマイクロサテライトＤＮＡマーカーの内から任意に選択された３種類からなる。
ｄ）前記名古屋コーチン識別用ＤＮＡマーカーが、前記５種類のマイクロサテライトＤＮＡマーカーの内から任意に選択された４種類からなる。
ｅ）前記名古屋コーチン識別用ＤＮＡマーカーが、前記５種類のマイクロサテライトＤＮＡマーカーの全部からなる。
本発明の名古屋コーチン識別用ＤＮＡマーカーは、より具体的には、第２発明のように、前記５種類の特定されたマイクロサテライトＤＮＡマーカーのうち、任意に選択された１種類、任意に選択された２種類、任意に選択された３種類、任意に選択された４種類、あるいは５種類の全てを以て構成することができる。第２発明に係るいずれの名古屋コーチン識別用ＤＮＡマーカーも、供試されたニワトリ個体又は鶏卵が名古屋コーチンであるか否か、あるいは供試されたニワトリの体組織が名古屋コーチン由来であるか否かについて有効な識別ができる。
（第３発明）
上記課題を解決するための本願第３発明の構成は、前記第１発明又は第２発明に係る特定塩基配列Ａ〜Ｊに対して前記雑種形成塩基配列Ａ’〜Ｊ’がハイブリダイズするストリンジェントな条件が、適宜なハイブリダイゼーション法における以下（１）〜（３）のいずれかの条件である、名古屋コーチン識別用ＤＮＡマーカーである。
上記課題を解決するための本願第３発明の構成は、前記第１発明又は第２発明に係る特定塩基配列Ａ〜Ｊに対して前記雑種形成塩基配列Ａ’〜Ｊ’がハイブリダイズするストリンジェントな条件が、適宜なハイブリダイゼーション法における以下（１）〜（３）のいずれかの条件である、名古屋コーチン識別用ＤＮＡマーカーである。
（１）特定塩基配列Ａ〜Ｊのいずれかに係るヌクレオチドと、これに対応する雑種形成塩基配列Ａ’〜Ｊ’のいずれかに係るヌクレオチドとの内、フィルターに固定化された一方のヌクレオチドに対し、０．７〜１ＭのＮａＣｌの存在下、所定温度（Ｘ°Ｃ）下で他方のヌクレオチドのハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍程度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、１５ｍＭ クエン酸ナトリウムよりなる）を用いてＸ°Ｃの条件下で洗浄した場合に、他方のヌクレオチドを同定できると言う条件であって、前記Ｘ°Ｃが５０°Ｃ以上である。
（２）上記の（１）において、前記Ｘ°Ｃが６０°Ｃ以上である。
（３）上記の（１）において、前記Ｘ°Ｃが６５°Ｃ以上である。
前記した雑種形成塩基配列の有効な選択条件として、第３発明の（１）に規定するハイブリダイゼーション条件を挙げることができる。より好ましくは、第３発明の（２）に規定するハイブリダイゼーション条件を挙げることができる。特に好ましくは、第３発明の（３）に規定するハイブリダイゼーション条件を挙げることができる。
（第４発明）
上記課題を解決するための本願第４発明の構成は、第１発明〜第３発明に記載のいずれか１以上の名古屋コーチン識別用ＤＮＡマーカーを含んで構成され、供試されたニワトリ個体又は鶏卵が名古屋コーチンであるか否か、あるいは供試されたニワトリの体組織又は細胞が名古屋コーチン由来であるか否かを識別するために用いるものである、検出キットである。
上記課題を解決するための本願第４発明の構成は、第１発明〜第３発明に記載のいずれか１以上の名古屋コーチン識別用ＤＮＡマーカーを含んで構成され、供試されたニワトリ個体又は鶏卵が名古屋コーチンであるか否か、あるいは供試されたニワトリの体組織又は細胞が名古屋コーチン由来であるか否かを識別するために用いるものである、検出キットである。
第４発明によれば、供試されたニワトリ個体又は鶏卵が名古屋コーチンであるか否か、あるいは供試されたニワトリの体組織又は細胞が名古屋コーチン由来であるか否かを識別するための簡易な手段としての検出キットが提供される。
（第５発明）
上記課題を解決するための本願第５発明の構成は、供試されたニワトリ個体、鶏卵、ニワトリの体組織又は細胞に由来するゲノムＤＮＡを鋳型として、第１発明〜第３発明に係るいずれかの名古屋コーチン識別用ＤＮＡマーカーを、あるいは第４発明に係る検出キットに含まれる名古屋コーチン識別用ＤＮＡマーカーを特異的に増幅し、増幅ＤＮＡ断片長多型を検出して、供試されたニワトリ個体又は鶏卵が名古屋コーチンであるか否か、あるいは供試されたニワトリの体組織又は細胞が名古屋コーチン由来であるか否かを識別する、名古屋コーチンの識別方法である。
上記課題を解決するための本願第５発明の構成は、供試されたニワトリ個体、鶏卵、ニワトリの体組織又は細胞に由来するゲノムＤＮＡを鋳型として、第１発明〜第３発明に係るいずれかの名古屋コーチン識別用ＤＮＡマーカーを、あるいは第４発明に係る検出キットに含まれる名古屋コーチン識別用ＤＮＡマーカーを特異的に増幅し、増幅ＤＮＡ断片長多型を検出して、供試されたニワトリ個体又は鶏卵が名古屋コーチンであるか否か、あるいは供試されたニワトリの体組織又は細胞が名古屋コーチン由来であるか否かを識別する、名古屋コーチンの識別方法である。
第５発明によって、供試されたニワトリ個体又は鶏卵が名古屋コーチンであるか否か、あるいは供試されたニワトリの体組織又は細胞が名古屋コーチン由来であるか否かを識別するための、正確かつ簡易な識別方法が提供される。
（第６発明）
上記課題を解決するための本願第６発明の構成は、前記第５発明に係る増幅ＤＮＡ断片長多型の検出方法が、アガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動から選択される一つ以上の方法である、名古屋コーチンの識別方法である。
上記課題を解決するための本願第６発明の構成は、前記第５発明に係る増幅ＤＮＡ断片長多型の検出方法が、アガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動から選択される一つ以上の方法である、名古屋コーチンの識別方法である。
上記した第５発明において、増幅ＤＮＡ断片長多型の検出方法は、目的に適う限りにおいて限定されないが、例えば第６発明のように、アガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動から選択される一つ以上の方法が好ましく例示される。
本発明によって、名古屋コーチンの識別に有効なマイクロサテライトＤＮＡマーカーが存在することが究明され、かつ、多数の既知のマイクロサテライトＤＮＡマーカーの中から該当するマーカーが絞り込んで特定され、従って、可及的に少数種類のマイクロサテライトＤＮＡマーカーを用いて名古屋コーチンを正確に識別できる技術が提供された。
以下に、本発明の実施形態を、その最良の形態を含めて説明する。但し、上記の第１発明〜第６発明に関して既に述べた点については、説明を省略する場合がある。
〔名古屋コーチン識別用ＤＮＡマーカー〕
本発明の名古屋コーチン識別用ＤＮＡマーカーは、第１発明の１）〜５）のいずれかに示すフォワードプライマーとリバースプライマーの組み合わせで構成される５種類のマイクロサテライトＤＮＡマーカーのいずれか１種類以上からなるものである。
本発明の名古屋コーチン識別用ＤＮＡマーカーは、第１発明の１）〜５）のいずれかに示すフォワードプライマーとリバースプライマーの組み合わせで構成される５種類のマイクロサテライトＤＮＡマーカーのいずれか１種類以上からなるものである。
これら５種類のマイクロサテライトＤＮＡマーカーは、前記した非特許文献により既知である２５種類のマイクロサテライトＤＮＡマーカー中から絞り込んで選択的に特定されたものであり、あるいはこれらと同等機能の塩基配列を備えるものであって、そのいずれもが、供試されたニワトリ個体又は鶏卵が名古屋コーチンであるか否か、あるいは供試されたニワトリの体組織又は細胞が名古屋コーチン由来であるか否かを識別できるものである。
各々のマイクロサテライトＤＮＡマーカーは、それぞれニワトリのゲノムＤＮＡにおける特定のマイクロサテライト領域の両側に位置する特異的な塩基配列を含む、フォワードプライマーとリバースプライマーとの組み合わせで構成されている。
〔検出キット〕
本発明に係る検出キットは、上記いずれかの名古屋コーチン識別用ＤＮＡマーカーを含んで構成されるものであって、供試されたニワトリ個体又は鶏卵が名古屋コーチンであるか否か、あるいは供試されたニワトリの体組織又は細胞が名古屋コーチン由来であるか否かを識別するために用いるものである。
本発明に係る検出キットは、上記いずれかの名古屋コーチン識別用ＤＮＡマーカーを含んで構成されるものであって、供試されたニワトリ個体又は鶏卵が名古屋コーチンであるか否か、あるいは供試されたニワトリの体組織又は細胞が名古屋コーチン由来であるか否かを識別するために用いるものである。
この検出キットにおける名古屋コーチン識別用ＤＮＡマーカー以外の構成要素は特段に限定されないが、例えば、この種の検出キットの通常の構成要素であるＰＣＲ用ＤＮＡポリメラーゼ（合成酵素）、同ポリメラーゼ専用緩衝液、ｄＮＴＰ（デオキシリボヌクレオシド三リン酸）等を任意に選択して構成要素とすることができる。
〔名古屋コーチンの識別方法〕
本発明に係る名古屋コーチンの識別方法は、供試されたニワトリ個体、鶏卵、ニワトリの体組織又は細胞に由来するゲノムＤＮＡを鋳型として行う。「ニワトリの体組織」としては、例えば鶏肉、骨付きの手羽、各種の内蔵等が例示されるが、要するにゲノムＤＮＡを抽出可能な体組織である限りにおいて、その種類又は内容を限定されない。
本発明に係る名古屋コーチンの識別方法は、供試されたニワトリ個体、鶏卵、ニワトリの体組織又は細胞に由来するゲノムＤＮＡを鋳型として行う。「ニワトリの体組織」としては、例えば鶏肉、骨付きの手羽、各種の内蔵等が例示されるが、要するにゲノムＤＮＡを抽出可能な体組織である限りにおいて、その種類又は内容を限定されない。
名古屋コーチン識別用ＤＮＡマーカーを増幅する方法は限定されない。好ましい増幅方法としては、例えば、ＰＣＲ（ Polymerase Chain Reaction）法が挙げられる。ＰＣＲ法は周知であって、その詳しい説明は省略する。増幅ＤＮＡ断片長多型の検出方法も特段に限定されない。好ましい検出方法としては、例えば、アガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動から選択される一つ以上の方法が挙げられる。これらの方法も周知であって、その詳しい説明は省略する。
以下に本発明の実施例を説明する。本発明の技術的範囲は以下の実施例によって限定されない。
（実施例１：名古屋コーチンのゲノムＤＮＡの調製）
愛知県で商業生産に利用している名古屋コーチンの原種鶏４系統（ＮＧ１系統８２個体、ＮＧ２系統１００個体、ＮＧ３系統１００個体、ＮＧ４系統１００個体）を用いた。
愛知県で商業生産に利用している名古屋コーチンの原種鶏４系統（ＮＧ１系統８２個体、ＮＧ２系統１００個体、ＮＧ３系統１００個体、ＮＧ４系統１００個体）を用いた。
上記の各供試個体からそれぞれ血液を採取し、これらの血液からフェノール−クロロホルム抽出法を用いてゲノムＤＮＡを抽出した。抽出したゲノムＤＮＡは分光光度計（ GeneQuant pro：アマシャムバイオサイエンス社製）を用いて濃度を測定し、１０ｍｇ／μｌになるように希釈した後に、以下に述べるプロセスに供した。
（実施例２：マイクロサテライトＤＮＡ多型の検出）
ＰＣＲは、３８４ウェルプレートに下記の表１に示すＰＣＲ反応液を作成して、サーマルサイクラーを用いて行った。サーマルサイクラーとしては、アプライドバイオシステムズ社製の GeneAmp（登録商標）PCR System 9700 あるいはバイオ・ラド社製の iCyclerサーマルサイクラーを用いた。
ＰＣＲは、３８４ウェルプレートに下記の表１に示すＰＣＲ反応液を作成して、サーマルサイクラーを用いて行った。サーマルサイクラーとしては、アプライドバイオシステムズ社製の GeneAmp（登録商標）PCR System 9700 あるいはバイオ・ラド社製の iCyclerサーマルサイクラーを用いた。
上記の反応後、８マーカー分の増幅産物から各２μｌを採取し、ホルムアミドで１マーカー当たり４００倍に希釈した後、そこから２μｌをサイズスタンダード〔アプライドバイオシステムズ社製の GeneScan （登録商標）400HD ROX （登録商標）Size Standard 〕を含むホルムアミド１３μｌに更に希釈して、熱変性（９４°Ｃ、２分）した後、ＤＮＡ自動分析装置〔アプライドバイオシステムズ社製の ABI PRISM（登録商標）3100 Genetic Analyzer 〕によってキャピラリー電気泳動を行った。
ＰＣＲ断片長の解析は、コンピューターソフトウェア（アプライドバイオシステムズ社製の GeneMapper ver. 2.0）を用いて行った。検出されたバンドのピークによってマイクロサテライト多型が判定でき、更に、ピークが１本ならばホモ型、ピークが２本ならばヘテロ型と判断できる。これにより、各供試個体における各マイクロサテライト座位の遺伝子型を求めた。
（実施例３：対立遺伝子座頻度の計算）
得られたマイクロサテライトＤＮＡ多型の結果から、対立遺伝子座頻度を計算した。対立遺伝子座頻度は集団内の該当遺伝子座における各対立遺伝子数の全遺伝子数に対する割合である。
得られたマイクロサテライトＤＮＡ多型の結果から、対立遺伝子座頻度を計算した。対立遺伝子座頻度は集団内の該当遺伝子座における各対立遺伝子数の全遺伝子数に対する割合である。
調査した２５のマイクロサテライトＤＮＡ座位における対立遺伝子頻度を表３〜表５に示す。表３〜表５において、各表の上部に表記した「(82)」等の丸カッコ内の数字は個体数を示し、同じく「[164] 」等の角カッコ内の数字は対立遺伝子数を示す。
従って表３〜表５に示す各マーカーの内、表６に示すように ABR15、ABR257、 ABR417 、ABR495及び ADL262 の各マーカー、即ち、前記第１発明の１）〜５）に示すオリゴヌクレオチドの組み合わせ（フォワード／リバースプライマーの組み合わせ）に係るマイクロサテライトＤＮＡマーカーが、名古屋コーチンの識別に有効である可能性が考えられる。
以上の結果を受けて、この実施例では、表７に示す「名古屋コーチン交雑種」、「他の純粋種」及び「市場鶏肉」の所定数のサンプル個体からそれぞれ血液を採取し、ＰＣＲ反応に上記５種類のプライマーセットを用いたもとで、実施例１〜実施例２と同様の手順によってＰＣＲ断片長の解析を行った。
この場合、増幅ＤＮＡ断片の長さの違いを検出した時に、上記の対立遺伝子と異なるサイズの対立遺伝子が一つでも検出された場合には「名古屋コーチンではない」と否定的に判定することは合理的である。そして、否定的な判定結果を得た場合、上記のプライマーセットは名古屋コーチン識別用ＤＮＡマーカーとして正しく機能したことになる。そこで、サンプル個体ごとに判定結果が正しかったか否かを確認し、「名古屋コーチン交雑種」及び「他の純粋種」の品種ごとに、及び「市場鶏肉」について、識別率（正しく判定できたパーセンテージ）を算定した。その結果を表７に示す。
本発明によって、ニワトリ個体又は鶏卵が名古屋コーチンであるか否か、あるいは供試されたニワトリの体組織又は細胞が名古屋コーチン由来であるか否かを簡易かつ正確に識別できる手段が提供される。
〔配列表〕
ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＬＩＳＴＩＮＧ
<110> 愛知県／独立行政法人農業生物資源研究所
<120> 名古屋コーチン識別用ＤＮＡマーカー、検出キット及び名古屋コーチンの識別方法
<130> POK-06-003
<160> 10
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Gallus gallus
<400> 1
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<211〉20
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〔配列表〕
ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＬＩＳＴＩＮＧ
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<120> 名古屋コーチン識別用ＤＮＡマーカー、検出キット及び名古屋コーチンの識別方法
<130> POK-06-003
<160> 10
<210> 1
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Claims (5)
- 以下の１）〜５）のいずれかに示すオリゴヌクレオチドの組み合わせで構成される５種類のマイクロサテライト領域増幅用プライマーセットのいずれか１種類以上からなり、供試されたニワトリ個体又は鶏卵が名古屋コーチンであるか否か、あるいは供試されたニワトリの体組織又は細胞が名古屋コーチン由来であるか否かを識別できるものであることを特徴とする名古屋コーチン識別用プライマーセット。
１）配列表の配列番号１に示す塩基配列（特定塩基配列Ａ）を有し、又は特定塩基配列Ａの一部の塩基が置換、欠失又は付加されると共に特定塩基配列Ａに対して下記（ア）に示すストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列（雑種形成塩基配列Ａ’）を有するオリゴヌクレオチドと、配列表の配列番号２に示す塩基配列（特定塩基配列Ｂ）を有し、又は特定塩基配列Ｂの一部の塩基が置換、欠失又は付加されると共に特定塩基配列Ｂに対して下記（ア）に示すストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列（雑種形成塩基配列Ｂ’）を有するオリゴヌクレオチドとの組み合わせ。
２）配列表の配列番号３に示す塩基配列（特定塩基配列Ｃ）を有し、又は特定塩基配列Ｃの一部の塩基が置換、欠失又は付加されると共に特定塩基配列Ｃに対して下記（ア）に示すストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列（雑種形成塩基配列Ｃ’）を有するオリゴヌクレオチドと、配列表の配列番号４に示す塩基配列（特定塩基配列Ｄ）を有し、又は特定塩基配列Ｄの一部の塩基が置換、欠失又は付加されると共に特定塩基配列Ｄに対して下記（ア）に示すストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列（雑種形成塩基配列Ｄ’）を有するオリゴヌクレオチドとの組み合わせ。
３）配列表の配列番号５に示す塩基配列（特定塩基配列Ｅ）を有し、又は特定塩基配列Ｅの一部の塩基が置換、欠失又は付加されると共に特定塩基配列Ｅに対して下記（ア）に示すストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列（雑種形成塩基配列Ｅ’）を有するオリゴヌクレオチドと、配列表の配列番号６に示す塩基配列（特定塩基配列Ｆ）を有し、又は特定塩基配列Ｆの一部の塩基が置換、欠失又は付加されると共に特定塩基配列Ｆに対して下記（ア）に示すストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列（雑種形成塩基配列Ｆ’）を有するオリゴヌクレオチドとの組み合わせ。
４）配列表の配列番号７に示す塩基配列（特定塩基配列Ｇ）を有し、又は特定塩基配列Ｇの一部の塩基が置換、欠失又は付加されると共に特定塩基配列Ｇに対して下記（ア）に示すストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列（雑種形成塩基配列Ｇ’）を有するオリゴヌクレオチドと、配列表の配列番号８に示す塩基配列（特定塩基配列Ｈ）を有し、又は特定塩基配列Ｈの一部の塩基が置換、欠失又は付加されると共に特定塩基配列Ｈに対して下記（ア）に示すストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列（雑種形成塩基配列Ｈ’）を有するオリゴヌクレオチドとの組み合わせ。
５）配列表の配列番号９に示す塩基配列（特定塩基配列Ｉ）を有し、又は特定塩基配列Ｉの一部の塩基が置換、欠失又は付加されると共に特定塩基配列Ｉに対して下記（ア）に示すストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列（雑種形成塩基配列Ｉ’）を有するオリゴヌクレオチドと、配列表の配列番号１０に示す塩基配列（特定塩基配列Ｊ）を有し、又は特定塩基配列Ｊの一部の塩基が置換、欠失又は付加されると共に特定塩基配列Ｊに対して下記（ア）に示すストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列（雑種形成塩基配列Ｊ’）を有するオリゴヌクレオチドとの組み合わせ。
（ア）上記の特定塩基配列Ａ〜Ｊのいずれかに係るヌクレオチドと、これに対応する雑種形成塩基配列Ａ’〜 Ｊ’ のいずれかに係るヌクレオチドとの内、フィルターに固定化された一方のヌクレオチドに対し、０．７〜１ＭのＮａＣｌの存在下、６５°Ｃ以上の温度下で他方のヌクレオチドのハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、１５ｍＭ クエン酸ナトリウムよりなる）を用いて６５°Ｃ以上の条件下で洗浄した場合に、他方のヌクレオチドを同定できると言う条件。 - 前記マイクロサテライト領域増幅用プライマーセットが以下のａ）〜ｅ）のいずれかに該当するものであることを特徴とする請求項１に記載の名古屋コーチン識別用プライマーセット。
ａ）前記名古屋コーチン識別用プライマーセットが、前記５種類のマイクロサテライト領域増幅用プライマーセットの内から任意に選択された１種類からなる。
ｂ）前記名古屋コーチン識別用プライマーセットが、前記５種類のマイクロサテライト領域増幅用プライマーセットの内から任意に選択された２種類からなる。
ｃ）前記名古屋コーチン識別用プライマーセットが、前記５種類のマイクロサテライト領域増幅用プライマーセットの内から任意に選択された３種類からなる。
ｄ）前記名古屋コーチン識別用プライマーセットが、前記５種類のマイクロサテライト領域増幅用プライマーセットの内から任意に選択された４種類からなる。
ｅ）前記名古屋コーチン識別用プライマーセットが、前記５種類のマイクロサテライト領域増幅用プライマーセットの全部からなる。 - 請求項１又は請求項２に記載のいずれか１以上の名古屋コーチン識別用プライマーセットを含んで構成され、供試されたニワトリ個体又は鶏卵が名古屋コーチンであるか否か、あるいは供試されたニワトリの体組織又は細胞が名古屋コーチン由来であるか否かを識別するために用いるものであることを特徴とする検出キット。
- 供試されたニワトリ個体、鶏卵、ニワトリの体組織又は細胞に由来するゲノムＤＮＡを鋳型として、請求項１又は請求項２に記載のいずれかの名古屋コーチン識別用プライマーセットを、あるいは請求項３に記載の検出キットに含まれる名古屋コーチン識別用プライマーセットを特異的に増幅し、増幅ＤＮＡ断片長多型を検出して、供試されたニワトリ個体又は鶏卵が名古屋コーチンであるか否か、あるいは供試されたニワトリの体組織又は細胞が名古屋コーチン由来であるか否かを識別することを特徴とする名古屋コーチンの識別方法。
- 前記増幅ＤＮＡ断片長多型の検出方法が、アガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動から選択される一つ以上の方法であることを特徴とする請求項４に記載の名古屋コーチンの識別方法。
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