JP4709489B2

JP4709489B2 - 創傷治癒のためのヒドロキシピリドン誘導体の使用

Info

Publication number: JP4709489B2
Application number: JP2003585718A
Authority: JP
Inventors: マンフレート・ボーン; カール・テーオドーア・クレーマー; ローラント・ハー・ヴェンガー
Original assignee: サノフィ−アベンティス・ドイチュラント・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング
Priority date: 2002-04-20
Filing date: 2003-04-08
Publication date: 2011-06-22
Anticipated expiration: 2023-04-08
Also published as: SI1499312T1; CA2482972C; BR0309403A; WO2003088966A1; DE60312840D1; MXPA04009186A; EP1499312B1; AU2003222802A1; AU2003222802B2; IL164536A0; DK1499312T3; JP2005529875A; IL164536A; US20040014794A1; EP1499312A1; DE60312840T2; CA2482972A1; CY1106472T1; ATE357915T1; ES2282615T3

Description

本発明は、創傷治療における式Ｉ

（式中、Ｒ¹；Ｒ²；Ｒ³およびＲ⁴は、以下の意味を有する）の化合物の使用に関する。

6-シクロヘキシル-1-ヒドロキシ-4-メチル-2 (1H)-ピリドン 2-アミノエタノール塩、別名シクロピロックスオラミン（ＣＰＸ）のような式Ｉの化合物は、この２０年来、皮膚および爪の真菌症治療用の抗菌剤として広く用いられている。ＣＰＸは、抗真菌活性の他に、グラム陽性菌およびグラム陰性菌に対しても効果がある（Dittmar, W.等 (1981年) Microbiological laboratory studies with ciclopiroxolamine. Arzneimittelforschung 31巻, 1317-1322頁）。ＣＰＸは、皮膚真菌症の治療に対しては１％クリームまたはゲルとして、爪甲真菌症の治療に対しては８％ラッカーとして適用される。ＣＰＸは、微生物において、アミノ酸、カリウムおよびリン酸の膜貫通輸送を含む、様々な菌の酵素活性を阻害することが知られている。しかし、ＣＰＸの抗菌活性の全般的な分子機構は正確には知られていない。

ウサギ皮膚に２０日間適用された１％ＣＰＸ溶液の皮膚への効果を調べる研究において、健康な皮膚の一過性の発赤（reddening）および実験的創傷皮膚の持続性発赤が観察されてきた（Alpermann, H.G.およびSchutz, E. (1981年) Studies on the pharmacology and toxicology of ciclopiroxolamine. Arzneimittelforschung 31巻, 1328-1332頁）。健康皮膚の一過性発赤はＣＰＸの副作用と説明されてきた。

組換えの血管形成性成長因子または遺伝子治療による治療的血管形成は、過去数年間で、重要な治療の様式（modality）になってきている（(Hockel, M.等 (1993年) Therapeutic angiogenesis. Arch. Surg. 128巻、423-429頁）。進行中のヒト臨床試験において、ＶＥＧＦ遺伝子治療が、重篤な四肢虚血および心筋梗塞の治療に適用されてきた。ＶＥＧＦ遺伝子治療は、胃および十二指腸の潰瘍ならびに皮膚潰瘍および培養皮膚置換物においても、実験的に研究されている。

ここで、式Ｉの化合物が、強力な血管形成活性を有し、多数の新たに形成された整列した血管によって証明されるように、血管形成を誘導することが見出されている。

さらに、ＣＰＸの局所適用が、ＶＥＧＦ発現の広い全身性変化をもたらさずに、局所適用の領域にその作用が限定されることが見出されている。これは、遺伝子治療に比較して、より安全で非常に有利な点である。そのために、式Ｉの化合物は、この強力な血管形成活性が式Ｉの化合物で知られていた抗菌活性とは全く異なっているために、創傷の処置および／または創傷治癒に使用することができる。そのために、創傷の処置の間に感染を予防するだけではなく、例えば、創傷の内部や周囲に多くの新しい血管が形成されることにより、創傷治癒が促進される。

それゆえに、本発明は、式Ｉ：

〔式中、
Ｒ¹、Ｒ²およびＲ³は、同一または異なって、水素原子または１〜４個の炭素原子を有するアルキルであり、ならびに、

Ｒ⁴は、６〜９個の炭素原子を有する飽和炭化水素基または式II、

｛式中、
Ｘは、ＳまたはＯ、
Ｙは、水素原子、または２個までの塩素および／もしくは臭素のようなハロゲン原子、
Ｚは、単結合、または、
ａ）Ｏ、もしくは
ｂ）Ｓ、もしくは
ｃ）−Ｃ（Ｒ⁵）（Ｒ⁶）−；式中、Ｒ⁵およびＲ⁶は、同一もしくは異なって、独立して、水素原子もしくは（Ｃ₁−Ｃ₄）−アルキルであり；もしくは
ｄ）他の鎖状の２〜１０個の炭素を有する二価の基であって、さらに場合によって１個または２個以上の次の：
ｉ）炭素−炭素二重結合、または
ii）Ｏ、Ｓ、もしくはその混合物であって、式中、２個もしくはそれ以上のＯおよび／もしくはＳ原子もしくはその混合物が存在する場合には、それぞれのＯもしくはＳ原子は少なくとも２個の炭素原子で離されており；ならびに
いかなる上記の二価の基においても、該二価基の炭素原子の自由結合価（free valence）は水素原子、（Ｃ₁−Ｃ₄）−アルキル、もしくはその混合物で飽和されており；ならびに、
Ａｒは、２個までの環を有する芳香環系であって、フッ素、塩素、臭素、メトキシ、（Ｃ₁−Ｃ₄）−アルキル、トリフルオロメチルおよびトリフルオロメトキシから成るグループから選ばれる３個までの基によって置換されることができる遊離もしくは塩の形態のものである｝
の基である〕
の１−ヒドロキシ−２−ピロリドンの創傷処置および／または創傷の治癒のための医薬を製造するための利用に関する。

「Ｚ」基において、炭素鎖は好ましくはーＣＨ₂基によって構成される。この−ＣＨ₂基が（Ｃ₁−Ｃ₄）−アルキルで置換されている場合は、ＣＨ₃およびＣ₂Ｈ₅が好ましい置換基である。

「Ｚ」の例となる基は：
−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＨ₂−、−（ＣＨ₂）_m−（ここで、ｍ＝２−１０）、−Ｃ（ＣＨ₃）₂−、−ＣＨ₂Ｏ−、−ＯＣＨ₂−、−ＣＨ₂Ｓ−、−ＳＣＨ₂−、−ＳＣＨ（Ｃ₂Ｈ₅）−、−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ₂Ｏ−、−Ｏ−ＣＨ₂−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ₂Ｏ−、−ＯＣＨ₂−ＣＨ₂Ｏ−、−ＯＣＨ₂−ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ−、−ＳＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₂Ｓ−、−ＳＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ−、−ＳＣＨ₂ＣＨ₂ＯＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ−、−ＳＣＨ₂ＣＨ₂ＯＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ−ＣＨ₂ＣＨ₂Ｓ−、または−Ｓ−ＣＨ₂−Ｃ（ＣＨ₃）₂−ＣＨ₂−Ｓ−である。

「Ｓ」基は硫黄原子を意味し；「Ｏ」基は酸素原子を意味する。「Ａｒ」という用語は、フェニルまたはナフチル、テトラヒドロナフチルおよびインデニルのような縮合系、ならびに、ビフェニル、ジフェニルアルカン、ジフェニルエーテルおよびジフェニルチオエーテルのような孤立した系をも意味する。

「６〜９個の炭素原子を有する飽和炭化水素基」という用語は、直鎖、分枝鎖または環状鎖であってよく、脂肪族の多重結合、すなわち、エチレンもしくはアセチレン結合は含まない。Ｒ⁴基の例は、例えば、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、シクロヘキシルまたはシクロヘプチルである。

式Ｉの化合物の中の炭化水素基Ｒ⁴は、好ましくは、（Ｃ₆−Ｃ₈）−アルキルまたはシクロヘキシル基であり、メチレンもしくはエチレン基を介してピリドン環に結合してもよく、またはエンドメチル基を含んでいてもいい。Ｒ⁴は、芳香族基であってもいいが、好ましくは、少なくとも１個の脂肪族炭素原子を介してピリドン基に結合している。

式Ｉによって特徴づけられる化合物のクラスの重要な代表例は：
6- [4-(4-クロロフェノキシ) フェノキシメチル]-1-ヒドロキシ-4-メチル-2-ピリドン、
6- [4-(2,4-ジクロロフェノキシ) フェノキシメチル]-1-ヒドロキシ-4-メチル-2-ピリドン、
6-(ビフェニリル-4-オキシメチル)-1-ヒドロキシ-4-メチル-2-ピリドン、
6- (4-ベンジル-フェノキシメチル)-1-ヒドロキシ-4-メチル-2-ピリドン、
6- [4-(2,4-ジクロロベンジルオキシ) フェノキシメチル]-1-ヒドロキシ-4-メチル-2-ピリドン、
6- [4- (4-クロロフェノキシ) フェノキシメチル]-1-ヒドロキシ-3,4-ジメチル-2-ピリドン、
6- [4-(2,4-ジクロロフェノキシ) フェノキシメチル]-1-ヒドロキシ-3,4-ジメチル-2-ピリドン、
6- [4- (シンナミルオキシ) フェノキシメチル]-1-ヒドロキシ-4-メチル-2-ピリドン、
1-ヒドロキシ-4-メチル-6- [4-(4-トリフルオロメチルフェノキシ) フェノキシメチル]-2-ピリドン、
1-ヒドロキシ-4-メチル-6-シクロヘキシル-2-ピリドン、
1-ヒドロキシ-4-メチル-6-(2,4,4-トリメチルペンチル)-2-ピリドン、
1-ヒドロキシ-4-メチル-6-n-ヘキシル-，-6-イソ-ヘキシル-，-6-n-ヘプチル-もしくは
-6-イソ-ヘプチル-2-ピリドン、

1-ヒドロキシ-4-メチル-6-オクチル-、もしくは-6-イソ-オクチル-2-ピリドン、特に好ましくは、1-ヒドロキシ-4-メチル-6-シクロヘキシル-メチル-、もしくは-6-シクロヘキシルエチル-2-ピリドンであり、それぞれの場合シクロヘキシル基はメチル基を有することができる、
1-ヒドロキシ-4-メチル-6- (2-ビシクロ[2,2,1] ヘプチル)-2-ピリドン、
1-ヒドロキシ-3,4-ジメチル-6-ベンジル-、もしくは-6-ジメチルベンジル-2-ピリドン、または
1-ヒドロキシ-4-メチル-6-(β-フェニルエチル)-2-ピリドン、
である。

上記の式Ｉの化合物は、遊離形態および塩形態で使用でき；遊離形態での使用が好ましい。

有機塩基を用いる場合は、貧揮発性の塩基が好ましく、例としては、エタノールアミン、ジエタノールアミン、Ｎ―エチルエタノールアミン、Ｎ−メチルジエタノールアミン、トリエタノールアミン、ジエチルアミノエタノール、２−アミノ−２−メチル−ｎ―プロパノール、ジメチルアミノプロパノール、２−アミノ−２−メチルプロパンジオール、トリイソプロパノールアミンのような低分子量のアルカノールアミンがあげられる。さらに、貧揮発性の塩基として、あげられるものは、例えば、エチレンジアミン、ヘキサメチレンジアミン、モルホリン、ピペリジン、ピペラジン、シクロヘキシルアミン、トリブチルアミン、ドデシルアミン、Ｎ,Ｎ−ジメチルドデシルアミン、ステアリルアミン、オレイルアミン、ベンジルアミン、ジベンジルアミン、Ｎ−エチルベンジルアミン、ジメチルステアリルアミン、Ｎ−メチルモルホリン、Ｎ−メチルピペラジン、４−メチルシクロヘキシルアミン、Ｎ−ヒドロキシエチルモルホリンがある。さらに、水酸化トリメチルベンジルアンモニウム、水酸化テトラメチルアンモニウム、または、水酸化テトラエチルアンモニウムのような第四級アンモニウム水酸化物の塩、および更にはグアニジンおよびその誘導体、特にそのアルキル化生成物も用いることができる。しかし、例えば、メチルアミン、エチルアミン、または、トリエチルアミンのような低分子アルキルアミンを塩形成剤として使用することもできる。無機陽イオンの塩は、例えば、アルカリ金属塩、とりわけナトリウム、カリウムもしくはアンモニウム塩；アルカリ土類金属塩、とりわけ、マグネシウムもしくはカルシウム塩、および、２〜４価の陽イオン、例えば亜鉛、アルミニウムもしくはジルコニウム塩もまた本発明に用いる化合物として好適である。

式Ｉの化合物は、例えば、US 2 540 218 または US 4 797 409に記載された方法により製造することができる。

本発明はまた、Ａｒがビフェニル、ジフェニルアルカンまたはジフェニルエーテルから誘導された二環系である、式Ｉの化合物の使用に関する。

本発明はまた、Ｒ⁴位にシクロヘキシル基を有する、式Ｉの化合物の使用に関する。

本発明はまた、Ｒ⁴位に式−ＣＨ₂−ＣＨ（ＣＨ₃）−ＣＨ₂−Ｃ（ＣＨ₃）₃のオクチル基を有する、式Ｉの化合物の使用に関する。

本発明はまた、1-ヒドロキシ-4-メチル-6- [4- (4-クロロフェノキシ) フェノキシメチル]-2- (1H) ピリドン、1-ヒドロキシ-4-メチル-6-シクロヘキシル-2-(1H) ピリドン、または、1-ヒドロキシ-4-メチル-6-(2,4,4-トリメチルペンチル)-2- (1H) ピリドンである、式Ｉの化合物の使用に関する。

本発明はまた、創傷処置のための医薬品を製造するための、式Ｉの化合物の使用に関する。

血管形成誘導により、新しい血管が形成され、創傷への栄養素および酸素の供給が促進されるために、創傷の治癒が改善される。そうして、非感染創傷の創傷治癒もまた、劇的に早められる。式Ｉの化合物は、酵母、細菌もしくは真菌による創傷の感染を防止するだけではなく、新たに血管形成を誘導することで創傷への供給をより良くし創傷治癒をサポートする。このようにして、式Ｉの化合物の治療により非感染および感染創傷の創傷治癒が改善される。

「創傷」という用語は、例えば、擦り傷、火傷、あかぎれ、挫滅、切り傷、糖尿病性下肢潰瘍、裂傷、深い切傷、臓器移植、銃創、切開、下肢潰瘍、圧迫性潰瘍、焦げ傷、引掻き傷、皮膚火傷、ただれ、圧迫傷、刺し傷、移植、静脈潰瘍または外科もしくは形成外科に伴う傷を意味するものと理解される。

「創傷治癒」という用語は、創傷が閉鎖される再生的なプロセス；特に、新たな毛細血管の形成、ならびに、結合組織および上皮細胞の増加を意味するものと理解される。

式Ｉの化合物およびその生理的に許容可能な塩は、動物、好ましくは哺乳類、特にヒトに対して、創傷の処置および／または創傷治癒のための医薬として、投与することができる。これらの化合物は、それ自体、または、互いの混合物もしくは局所投与のための医薬製剤として投与することができる。「哺乳類」という用語は、例えば、ヒト、ウマ
、ウシ、ブタ、ラット、マウス、ヒツジまたはイヌを意味するものと理解される。

この製剤は、経皮的または局所的に、例えば、乳剤、軟膏、溶液もしくはチンキ剤、粉剤、またはその他のエアロゾール剤もしくは発泡体の形態で投与することができる。上記の本発明の化合物の使用については、液体、半固形および固形の医薬製剤が適しており、特に、溶液、クリーム、軟膏、粉剤およびゲル調製物であって、特に後者は活性化合物の放出を増加させることにより好ましく用いられる。

本発明による医薬製剤は、式Ｉの化合物および／またはその生理学的に許容できる塩と共に、製剤的に許容できる不活性無機および／または有機の担体を用いて、それ自体公知で当業者が精通している方法により製造される。

式Ｉの化合物は、また、外科用ガーゼ、包帯または被覆材（dressing）の表面または内部に添加することもできる。
適した被覆材をさらに詳しく以下の例を用いて説明する：

アルギネート被覆材
アルネート創傷被覆材は、アルギン酸カルシウム繊維を製織したものである。アルギン酸カルシウムは、海草に由来する海洋性の生重合体である。アルギネートは非常に吸湿的である。アルギネート被覆材が創傷滲出物と接触すると、やわらかいゲルが形成され、肉芽組織形成および上皮形成が誘導される創傷面の湿気のある環境を維持する。アルギネート被覆材は、それ自体の重量の２０倍もの量を吸収する性質があるので、重度の滲出を伴った創傷に適用される。

複合被覆材
これらは、一般に重層であり、創傷との接触面の非粘着性層、ならびに種々の吸収剤、芯材（wicking）、および半密封性層が組み合わされている。吸収性層には発泡体、アルギネート、親水コロイド、またはヒドロゲルは組み込まれない。裏打ちの不織布の吸着テープが、被覆材を皮膚に固定する。これらの被覆材は創傷治癒の全ての段階の被覆材として用いられ、多くのタイプの手術後創傷に用いられる一次被覆材である。

コンタクトレイヤー
コンタクトレイヤーは、薄いシート状の被覆材で、その創傷組織を、創傷に用いられた他の薬剤または被覆材から保護するために、直接、創傷の開口部に付される。二次被覆材は常にコンタクトレイヤーと一緒に用いられる。

発泡体被覆材
発泡体被覆材は、基本的にはポリウレタンから作られるが、しかし、シリコーンもまた使用される。これらは、平面的な発泡体被覆材またはフィラーとして用いることができ、いくらかの滲出液を産生する肉芽化し上皮形成している創傷に用いることが意図されている。

ガーゼ
織ったガーゼ被覆材は、１００％の綿花糸から作られている。糸は４×４インチ平方の１２枚重ね（ply）スポンジの製造工程で、１０〜２０個の別々の処理工程を経て、水平および垂直の方向に織り上げられる。織られたガーゼ被覆材には、非常に多くのタイプがあり、パッキングと創傷清拭のために一般的に使用されている。
不織布は、織られたり編んだりされていない。繊維は織られているような概観に整列調製されている。ほとんどの不織布はレーヨンおよびポリエステルの混紡から製造される。レーヨンは柔軟性および吸収性を与え、一方ポリエステルは強度を与える。不織ガーゼの
主な適用は、吸収および包装のためである。

含浸ガーゼ被覆材
含浸（impregnated）ガーゼ被覆材は、織られたまたは不織の素材であり、物質が被覆材の素材中に組み入れられている。

ハイドロコロイド被覆材
ハイドロコロイド被覆材は、広く普及している第二世代の被覆材であり、中程度の吸湿性で、湿度を保持し、創傷に合致し（conformable）、そして、自己粘着性のものである。これらには、密封性があり、細菌感染に対するバリアーを形成する。寸法のある形態（dimensional form）での利用に加えて、ハイドロコロイドは、粉末、顆粒、ペースト、または他の特別な形態で供給される。主要な機能成分は、ゼラチン、ペクチン、または関連するハイドロコロイドである。これらは、圧迫性潰瘍、火傷、および様々な他の創傷のタイプに適用できる。

ハイドロゲル被覆材
ハイドロゲルは、水が主成分である半透過性被覆材である。グリセリンまたはプロピレングリコールが湿潤剤として用いられ、共重合体スターチが時には吸収剤として加えられる。この被覆材は、ガーゼ含浸ウエーハー、シート、および不定形ゲルとして利用可能であり、漏出のないまたは中程度の漏出のある、部分的および完全な厚みをもった創傷に適用される。

透明フィルム被覆材
透明フィルム被覆材は、粘着性層に縁取られたポリウレタン膜から成っている密封性被覆材である。被覆材は、厚み、密封性の程度、および他の特性により変わる。透明フィルム被覆材は、小さな外科の切開傷、末梢性および中心性静脈カテーテルの差込み口、表在性火傷、部分的厚さの崩壊性傷害（breakdown wounds）、ならびに二次被覆材として適用される。

生物学的および生合成の被覆材
この部類のものは、
−天然由来の吸収性で生物学的適合性のあるコラーゲンをベースにした被覆材
−関連する生物適合性のあるアミノ酸およびタンパク質の加水分解物から作られた被覆材
−合成および生物学的に誘導された素材を組み合わせた被覆材
を含む。

式Ｉの化合物は、ヒトおよび他の哺乳類、例えばイヌ、ネコ、ウマ、ブタ、ウシまたはヒツジに、局所的に投与できる。

医薬製剤は、通常、式Ｉの化合物および／またはその生理的に許容できる塩を、質量で約０.０５％〜約５％、好ましくは０.５％〜２％、特に好ましくは１％含有している。より少ない、およびより多くのパーセントの含有もまた可能である。

式Ｉおよび／またはその生理的に許容できる塩である活性成分、ならびに担体物質に加えて、医薬製剤は、添加物、例えば、充填剤、結合剤、潤滑剤、湿潤剤、安定剤、乳剤、保存剤、発色剤、増粘剤、希釈剤、緩衝物質、溶媒、可溶化剤、デポ効果を達成するための薬剤、浸透圧を変えるための塩類、コーテイング剤または抗酸化剤を含むことができる。これらの調製物は、また、２個またはそれ以上の式Ｉの化合物および／またはその生理的に許容できる塩を含むことができる。さらに、少なくとも１個の式Ｉの化合物および／またはその生理的に許容できる塩に加えて、医薬製剤はまた、１個または２個以上の他の治療用または予防用の活性成分を含むことができる。そうした加えられる活性成分には、デキスパンテノール、アラントイン、デキストラノマー、および／またはエキナシア（Echinacea）植物の抽出物があげられる。

本発明の種々の実施例の活性に実質的に影響しない変更は、ここで開示された本発明の範囲であると理解される。そのために、以下の実施例は例示のためであり本発明を限定するものではない。

［実施例１］
ＣＰＸによるＶＥＧＦ遺伝子発現の誘導
方法
細胞培養
安定的に形質導入されたＨＩＦ−１−依存性受容体遺伝子を含有するＨＲＣＨ０５細胞は既に文献に記載されている（Wanner, R. M. 等 (2000年) Epolones induce erythropoietin expression via hypoxia-inducible factor-1α activation. Blood 96巻,1558-1565頁）。ヒトＨｅｐＧ２ヘパトーマ細胞株はAmerican Type Culture Collection から入手した（ATCC番号 HB-8065）。全ての細胞株は、１０％熱不活性化ＦＣＳ、ペニシリン１００Ｕ／ｍＬ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍＬ、１×非必須アミノ酸およびピルビン酸ナトリウム１ｍＭ（全て、Life Technologies社より購入）を添加した、ダルベコ修正イーグル培地（Dulbecco's modified Eagle's medium（DMEM, グルコース高濃度, Life Technologies社））中で、５％ＣＯ₂を含む湿潤環境下、３７℃で培養した。インキュベーター（Forma Scientific, model 3131）中の酸素分圧は、１４０ｍｍＨｇ（２０％Ｏ₂ｖ／ｖ、通常酸素圧）または７ｍｍＨｇ（１％Ｏ₂ｖ／ｖ、低酸素圧）のいずれかであった。シクロピロックス・オラミン（ＣＰＸ）、デフェロキサミン・メシレート（ＤＦＸ）および２,２’−ジピリジル（ＤＰ）はSigma社から購入した。ＣＰＸおよびＤＰの保存用溶液はメタノール中で、それぞれ０.５Ｍおよび１Ｍの濃度で調製された。ＤＦＸは用時調製し、細胞培養液中に１０ｍＭの濃度で溶解した。

一時的形質転換（transient transfection）、レポーター遺伝子、および生存性測定
ＨｅｐＧ２細胞に、ＶＥＧＦプロモーター駆動性ルシフェラーゼ構築体を、エレクトロポレーション法により一時的に形質導入した。これは既に文献に記載されている（(Ikeda, E.等 (1995年) Hypoxia-induced transcriptional activation and increased mRNA stability of vascular endothelial growth factor in C6 glioma cells. J. Biol. Chem. 270巻、19761-19766頁）。刺激の後、一時的で安定した形質転換細胞をパッシブ溶解用緩衝液（passive lysis buffer）（Promega社）中で溶菌し、ルシフェラーゼ活性を製造者の指示書（Promega社）に従ってルシフェラーゼ測定キットを用いて、９６穴ルミノメーター（MicroLumat LB96P, EG & G Berthold社）の中で測定した。細胞の増殖／生存性は、臭化３−（４,５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２,５−ジフェニルテトラゾリウム（ＭＴＴ）による検定法により記載されたように評価した（３０,３１）。５７０ｎｍの吸光度を９６穴比色計（Rainbow, SLT Labsystems）により測定した。

結果
ＣＰＸは、５μＭ〜２０μＭ濃度で、通常の酸素濃度（normoxic）の下でＨｅｐＧ２ヘパトーマ細胞において、処置６〜２４時間後に、強力にＨＩＦ−１αタンパク質を誘導した。通常の酸素濃度の下の細胞では、ＨＩＦ−１αタンパク質は検出されなかったが、低酸素状態（１％Ｏ₂）でもＨＩＦ−１αは強く誘導された。ＣＰＸと低酸素状態の組合せでは、６時間後に、それ以上のＨＩＦ−１α濃度の増加は見られず、逆に処置の２４時間後にはＨＩＦ−１α濃度はかえって減少していた。

ＣＰＸ、ＤＦＸおよびＤＰで処理されたＨｅｐＧ２細胞由来の、２４、４８および７２時間後のｍＲＮＡのノザンブロッテイングで測定されたところでは、そうした鉄キレート剤も、内因性のＨＩＦ−１の標的遺伝子であるＶＥＧＦ、グルコーストランスポーター１（Ｇｌｕｔ−１）およびアルドラーゼの発現を誘導したが、対照遺伝子のＬ２８およびβ―アクチンの発現は誘導しなかった。

ＣＰＸに誘導されたＶＥＧＦｍＲＮＡ発現の機能性は、さらに処置後６または２４時間後に用量依存的に増加した、ＨｅｐＧ２細胞培養の上清中のＶＥＧＦタンパク質の蓄積により示された。

１１８０ｂｐのＶＥＧＦプロモーター断片による駆動されるルシフェラーゼレポーター遺伝子を、分割し、増加する濃度のＣＰＸで２４時間処置したＨｅｐＧ２細胞に一時的に形質導入した。ルシフェラーゼ活性の用量依存的な増加がみられ、これはＣＰＸがＶＥＧＦ発現を転写において活性化していることを示唆している。まとめれば、これらの結果は、ＣＰＸが内因性ＶＥＧＦの転写、ｍＲＮＡ発現、および分泌されたタンパク質の蓄積を活性化することが証明された。

［実施例２］
ラット単離還流腎でのＣＰＸによるＨＩＦ−１標的遺伝子誘導の不在
全身性投与されたＤＦＸは、マウスで、ユビキタスなＨＩＦ−１の安定性および腎特異的エリスロポイエチン発現を誘導する（Wang, G. L.,およびSemenza, G. L. (1993年) Desferrioxamine induces erythropoietin gene expression and hypoxia-inducible factor 1 DNA-binding activity: implications for models of hypoxia signal transduction. Blood 82巻、3610-3615頁）。治療的血管形成のためのＨＩＦ−１誘導剤としてのＣＰＸの局所投与に関して、ＣＰＸがＶＥＧＦの全身性の誘導をもたらすことができるかどうかを検討することが重要であった。エクス・ビボのモデルとして、ラット単離腎を、ＣＰＸ濃度を増加させながら通常酸素状態下で３時間還流した。しかし、ＣＰＸは、０.１μＭ〜１００μＭまでの濃度範囲で、ＨＩＦ−１の標的遺伝子であるＶＥＧＦ、Ｇｌｕｔ−１およびアルドラーゼのｍＲＮＡレベルを誘導しなかった。より高いＣＰＸ濃度（３３μＭおよび１００μＭ）では、アルブミンおよびナトリウムの排泄速度の強く増加から示されるように、腎機能のダウンレギュレーションが導かれた。３％酸素で３時間の還流の後、Ｇｌｕｔ−１のｍＲＮＡは増加したが、ＶＥＧＦおよびアルドラーゼのｍＲＮＡレベルはＣＰＸによってはそれ以上上昇しないことが観察された。

［実施例３］
ＣＰＸによる、ニワトリ絨毛尿膜（ＣＡＭ）における血管形成誘導
胚絨毛尿膜（ＣＡＭ）検定
方法
ＣＡＭ検定はOlivo, M.等が記載された方法で実施した（A comparative study on the effects of tumor necrosis factor-α (TNF-α), human angiogenic factor (h-AF) and basic fibroblast growth factor (bFGF) on the chorioallantoic membrane of the chick embryo, (1992年). Anat. Rec. 234巻、105-115頁）。略記すれば、受精卵（Lohmann Tierzucht, Cuxhaven, Germanyより購入）を加湿環境下、３７℃で培養した。卵は、側面を固定し、１日に２度上下をひっくり返した。６日後、小さな穴をドリルで殻を通して空気胞（air sac）まで開け（強力な光源により可視化される）、ついで、約０.５ｃｍ²の開口部を卵の側面に設けた。この開口部はテープでシールされ、卵をさらに９日目まで培養し、９日目に６−シクロヘキシル−１−ヒドロキシ−４−メチル−２（１Ｈ）−ピリドン２−アミノエタノール塩（ＣＰＸ）をＥｌｖａｘ^(R)法によりＣＡＭに適用した（前記Olivo, M.参照）。そのために、エチレン／ビニル酢酸共重合体ビーズ（Elvax^(R) 40L-03, DuPont社、C. H. Erbsloh KG, Krefeld, Germanyから提供された）をエタノールで十分に洗浄し減圧下で乾燥した。このＥｌｖａｘ^(R)ビーズをつぎに、塩化メチレンに１０％（ｗ／ｖ）で溶解し、ＣＰＸを所望の濃度で添加した。この溶液の１滴（４０μＬ）をピペットでシリコーン処理をしたガラススライドに載せ、完全に蒸発させた。ピンセットを用いて、Ｅｌｖａｘ^(R)デスクを注意してガラススライドから持ち上げ、ＣＡＭに設置した。１１日目に、開口部を広げて、立体顕微鏡の接眼レンズに組み込んだデジタルカメラ（オリンパス社）により、ＣＡＭを記録した。

結果
細胞培養でＣＰＸがＶＥＧＦ発現を誘導したという観察を基に（実施例１参照）、イン・ビボの血管形成モデルの血管形成能力を解析した。そのために、発生９日目のニワトリＣＡＭに、種々の濃度のＣＰＸまたは溶媒のみを含有する不活性重合体を重層した。培養２日後に、溶媒単独の対照デスクでは血管形成の兆候は全く観察されなかった。これに対して、５０ｍＭのＣＰＸを含有する重合体デスクでは、数多くの新しく形成され放射状に配置された血管により確認されたように、ＣＡＭで血管形成が一貫して誘導されていた。５０ｍＭのＣＰＸで処理された総計１０個のＣＡＭで同様な血管形成がみられ、一方、７個の対照ＣＡＭではいずれも血管形成の兆候がなかった。５ｍＭのＣＰＸでは、対照群との差異はみられず、５００ｍＭのＣＰＸはニワトリ胚に毒性を示した。

［実施例４］
マウス皮膚創傷モデル
方法
ケタミン（ナルケタン^(R)）１００ｍｇ／ｋｇおよびキシラジン（ロンプン^(R)）５ｍｇ／ｋｇによる麻酔下に、成獣ＮＭＲＩマウスの両方の耳に、標準的な耳パンチング器具を用いて、直径２ｍｍのパンチ穴を開けた。この耳は、毎日、一般的なスキンクリームの、１％（ｗ／ｖ）のＣＰＸを含む（バトラフェン^(R)）または含まないもので処置した。一方の耳はＣＰＸで処置し、他方の耳は対照クリームで処置した。クリーム量は、穴を覆うために十分なものであり、均等に耳全体を覆うように塗り広げた。

結果
ＣＰＸはマウス皮膚創傷モデルにおいて血管形成を誘導できる。
耳の直径２ｍｍのパンチ穴（動物施設でマウスを識別するための良く知られた方法）は、一方の耳には１％のＣＰＸを含有する市販の皮膚用クリーム、他方の耳にはＣＰＸを含まないがその他は一般的皮膚クリームと同じもので、それぞれ毎日処置された。ＣＰＸは創傷の縁に発赤を生じさせることができ、これは同じ耳の健常な皮膚領域では決して観察されなかった。このシリーズで、１０匹中４匹の動物が、同様な効果を示し、プラセボ処置創傷縁で、ＣＰＸ処置創傷縁に比べて、より明確な発赤を示した動物はいなかった。ＣＰＸにより誘導された発赤は促進された血管の成長かもしれない。

Claims

１−ヒドロキシ−４−メチル−６− [４− (４−クロロフェノキシ) フェノキシメチル]−２−(１Ｈ) ピリドン、１−ヒドロキシ−４−メチル−６−シクロヘキシル−２−(１Ｈ) ピリドンおよび１−ヒドロキシ−４−メチル−６−(２,４,４−トリメチルペンチル)−２−(１Ｈ) ピリドンから成る群から選ばれる少なくとも1つの化合物および/またはその塩の形態を含む血管形成誘導剤であって、乳剤、軟膏、溶液、チンキ剤、クリームもしくはゲル剤の形態、またはエアロゾール剤もしくは発泡体の形態の創傷治癒のための医薬製剤の製造に使用され、前記創傷が、擦り傷、火傷、あかぎれ、挫滅、切り傷、裂傷、深い切傷、臓器移植、銃創、切開、焦げ傷、引掻き傷、皮膚火傷、圧迫傷、刺し傷、移植または外科もしくは形成外科に伴う傷である、前記血管形成誘導剤。
化合物が、それ自体、または互いの混合物として投与される、請求項１に記載の血管形成誘導剤。
医薬製剤の中の化合物の用量が、化合物および／またはその生理的に許容できる塩の質量で約０.０５％〜約５％である、請求項１または２に記載の血管形成誘導剤。
医薬製剤がさらに、デキスパンテノール、アラントイン、デキストラノマー、もしくはエキナシア（Echinacea）植物の抽出物のような活性成分、またはそれら成分の混合物を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の血管形成誘導剤。