JP4685229B2

JP4685229B2 - レーザ顕微鏡

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Inventors: 浩佐々木; 佳弘島田
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Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、特に生物学や医学等の用途に用いられるもので、複数の発振波長からなるレーザ光を対物レンズを通して標本に照射し、この標本からの蛍光を検出するレーザ顕微鏡に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生物学や医学等の用途に用いられるレーザ顕微鏡では、例えば細胞や組織を生きたまま長時間にわたって観察することが要求される。例えば細胞や組織内のカルシウム濃度の変化を観察する場合には、カルシウム濃度に応じた蛍光を発する蛍光指示薬で標本を染色し、この蛍光指示薬に適する波長のレーザ光（励起光）を標本に照射し、この標本からの蛍光を検出する。この場合、一般的に細胞や組織からのシグナル（蛍光）の変化は極めて小さいので、標本に照射するレーザ光の強度は長時間にわたって高い精度で安定していることが要求される。
【０００３】
標本に照射するレーザ光の強度が安定しない原因としてはいくつか考えられる。一般的なヘリウムネオンレーザでは、発振出力をモニターして、これをフィードバックして制御することは行われておらず、このために環境温度の変化等によりその発振出力は変動する。
【０００４】
又、多波長発振、例えば４８８ｎｍ、５１４．５ｎｍの波長のレーザ光で発振するアルゴンレーザには、発振出力をモニターして、フィードバック制御するものがある。しかし、波長４８８ｎｍ、５１４．５ｎｍのアルゴンレーザ光の総合出力をモニターしているので、各ラインの出力は発振モード（波長４８８ｎｍ、５１４．５ｎｍ）の間で競合し、このために各発振波長は変動してしまう。さらに、アルゴンガスの消費により波長４８８ｎｍ、５１４．５ｎｍのアルゴンレーザ光の発振出力の強度比が使用時間とともに変化する。
【０００５】
一方、レーザ光を光ファイバーに導入してレーザ顕微鏡本体に導光するようなレーザ顕微鏡では、環境温度の変化により光ファイバーによる出力変動や、構成要素の熱変形による導光効率の変動により標本に照射するレーザ光の強度が変動する。
【０００６】
以上のような原因によりレーザ光の強度が変動すると、実際には標本からのシグナル（蛍光）は変化していないにも拘わらず、あたかもシグナルの変化があったような誤った結果が生じる可能性がある。
【０００７】
このような事から標本に照射するレーザ光の強度を安定化するための技術として例えば特開平１１−２３１２２２号公報、特開２０００−２０６４１５号公報がある。特開平１１−２３１２２２号公報には、複数の波長のレーザ光を結合した後、そのレーザ光の一部をビームスプリッタにより分割し、次に交換可能なフィルターにより波長を選択し、この選択された波長のレーザ光を光検出器（第一検出エレメント）により受光してその波長のレーザ光の強度を検出し、この検出信号に基づいてレーザ出力又はレーザ強度調整を行う、例えばレーザと光ファイバーとの間に配置された音響光学素子（例えばＡＯＴＦ）によりレーザ光の強度を制御することが記載されている。
【０００８】
特開２０００−２０６４１５号公報には、走査モジュールに接続されたレーザ放射を恒常的に監視するために、制御ユニットが駆動した線型フィルタ輪又は領域選択フィルター輪、又はフィルタースライダと組み合わせて動作制御し、これにより選択されたレーザラインの出力を検出してその検出信号に基づいてＡＯＴＦを駆動して、選択されたレーザラインの出力の安定を図ることが記載されている。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、最近では、細胞や組織の機能探索をさらに深めるために、これら標本から２種類以上のシグナル（蛍光）を同時に検出して、その機能解析を行うことが強く要求されている。例えば、異なる波長の蛍光蛋白、ＧＦＰ（緑色の蛍光を発する蛋白：GREEN FLUORESCENT PROTEIN）とＲＦＰ（赤色の蛍光を発する蛋白：RED FLUORESCENT PROTEIN）とを細胞に遺伝子発現させ、これらの時間観察を行うことである。
【００１０】
この場合、標本に照射するレーザ光は、これら蛍光蛋白ＧＦＰ、ＲＦＰに最適な波長である必要があり、しかもその２波長のレーザ光はどちらもその光強度が安定していることが必要である。
【００１１】
ところが、上記２つの公報に記載されている技術は、一つの波長のレーザ光の強度のみを安定化するためのものであって、同時に２波長以上の波長のレーザ光の強度を安定するように制御することはできない。
【００１２】
そこで本発明は、標本に照射する複数の波長からなるレーザ光強度を同時に安定に制御できるレーザ顕微鏡を提供することを目的とする。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
請求項１記載による本発明は、複数の発振波長からなるレーザ光を対物レンズを通して標本に照射し、この標本からの蛍光を検出するレーザ顕微鏡において、プリズム又は回折光子で構成され、前記標本に照射される前記複数の発振波長からなる前記レーザ光をスペクトル分解するスペクトル分解手段と、前記スペクトル分解手段によりスペクトル分解されたレーザ光を受光する１つの受光素子列と、前記１つの受光素子列の出力信号を受けて前記標本に照射される前記レーザ光の強度を前記発振波長ごとに制御する制御手段とを具備したことを特徴とするレーザ顕微鏡である。
【００１４】
請求項２記載による本発明は、請求項１記載のレーザ顕微鏡において、さらに、前記スペクトル分解手段と前記受光素子列との間に配置され、前記スペクトル分解された前記レーザ光を前記受光素子列に集光する集光レンズを有することを特徴とする。
【００１５】
請求項３記載による本発明は、請求項１又は２記載のレーザ顕微鏡において、前記受光素子列は、固体撮像素子であることを特徴とする。
【００１６】
請求項４記載による本発明は、請求項２又は３記載のレーザ顕微鏡において、前記複数の発振波長からなる前記レーザ光は、複数のレーザ光源からそれぞれ発振されて各レーザ光をダイクロイックミラーにより１本に合成されたものであり、前記合成された前記レーザ光の光路には、前記制御手段である音響光学素子が配置され、前記音響光学素子は、波長選択制御と各波長の光強度の制御とを行うことを特徴とする。
【００１７】
請求項５記載による本発明は、請求項１乃至４のうちいずれか１項記載のレーザ顕微鏡において、前記複数の発振波長からなる前記レーザ光をレーザ顕微鏡本体に導く光ファイバーを設けたことを特徴とする。
請求項６記載による本発明は、請求項５項記載のレーザ顕微鏡において、前記レーザ光をコリメートするコリメータレンズと、このコリメータレンズによりコリメートされた前記レーザ光の一部を分離するビームスプリッタと、このビームスプリッタにより分離された前記レーザ光をスペクトル分解するスペクトル分解手段と、このスペクトル分解手段によりスペクトル分解されたレーザ光を集光する集光レンズと、この集光レンズにより集光されたレーザ光を受光する前記受光素子列とを１つにブロック化し、レーザ顕微鏡本体に対して着脱自在に構成したことを特徴とする。
請求項７記載による本発明は、請求項１乃至６のうちいずれか１項記載のレーザ顕微鏡において、前記制御手段は、前記スペクトル分解手段と前記レーザの光源との間に配置されていることを特徴とする。
【００１８】
【発明の実施の形態】
（１）以下、本発明の第１の実施の形態について図面を参照して説明する。
【００１９】
図１は走査型レーザ顕微鏡の構成図である。支持台１上には、アルゴンレーザ２が固定されている。このアルゴンレーザ２は、波長λ１＝４８８ｎｍとλ２＝５１４．５ｎｍとの２波長のレーザ光を発振するものである。
【００２０】
このアルゴンレーザ２から発振されるレーザ光の光路上には、レーザ顕微鏡本体を構成する走査ユニット３が設けられている。この走査ユニット３は、レーザ光を標本４に走査するもので、レーザ光の光路上にビームスプリッタ５を配置し、このビームスプリッタ５の反射光路上にＸ−Ｙスキャナ６を配置したものとなっている。
【００２１】
標本４は、例えばＧＦＰとＹＦＰ（YELLOW FLUORESCENT PROTEIN）とを遺伝子発現させた細胞である。
【００２２】
又、ビームスプリッタ５の透過光路（Ｘ−Ｙスキャナ６からビームスプリッタ５に入射する方向の光路）上には、ミラー７を介してダイクロイックミラー８とミラー９とが直列に配置されている。ダイクロイックミラー８は、波長４８８ｎｍと５１４．５ｎｍの２波長のレーザ光を標本４に照射したときに発する２つの波長λ１’、λ２’の蛍光を分離するもので、一方の波長λ１’の蛍光を反射し、他方の波長λ２’の蛍光を透過する性能を有している。このうちダイクロイックミラー８の反射光路上には、共焦点レンズ１０ａ、共焦点ピンホール１１ａ、バンドパスフィルタ１２ａ及び光検出器１３ａが配置され、かつダイクロイックミラー８の透過光路上の上記ミラー９の反射光路上には、共焦点レンズ１０ｂ、共焦点ピンホール１１ｂ、バンドパスフィルタ１２ｂ及び光検出器１３ｂが配置されている。
【００２３】
上記Ｘ−Ｙスキャナ６による走査上には、瞳投影レンズ１４を介してミラー１５と観察用プリズム１６とが設けられている。これらミラー１５と観察用プリズム１６とは、切り替え装置１７によりいずれか一方が光路上に配置されるようになっている。ミラー１５の反射光路上には、結像レンズ１８を介して対物レンズ１９が設けられている。なお、観察用プリズム１６が光路中に入ると、接眼レンズ２０を通して標本４を目視観察できる。
【００２４】
上記走査ユニット３内のＡＯＴＦ２５からビームスプリッタ５までのレーザ光の光路上には、ビームスプリッタ２１が配置されている。このビームスプリッタ２１は、波長λ１＝４８８ｎｍとλ２＝５１４．５ｎｍとの２波長のレーザ光の一部を取り出すもので、その取り出し光路上には、プリズム２２が配置されている。
【００２５】
このプリズム２２は、波長λ１＝４８８ｎｍとλ２＝５１４．５ｎｍとの２波長のレーザ光をスペクトル分解するもので、この場合には波長λ１＝４８８ｎｍとλ２＝５１４．５ｎｍとの２本のレーザ光に分離するものである。
【００２６】
このプリズム２２のスペクトル出射方向には、２分割フォトダイオード２３が配置されている。この２分割フォトダイオード２３は、プリズム２２によりスペクトル分解されたレーザ光を受光する受光素子列としての機能を有するもので、その分割面は、スペクトルの分解される方向と同一方向に配置されている。
【００２７】
制御器２４は、２分割フォトダイオード２３から出力される検出信号を入力し、この検出信号に基づいて波長λ１＝４８８ｎｍとλ２＝５１４．５ｎｍとの両方のラインの光強度がそれぞれ一定になるように、アルゴンレーザ２の出力端に固定されたＡＯＴＦ２５を制御する機能を有している。
【００２８】
このＡＯＴＦ２５は、制御器２４の制御により、波長λ１＝４８８ｎｍとλ２＝５１４．５ｎｍとの２本の発振波長に対して、波長選択を行うとともに、出射出力を連続的に制御するものとなっている。
【００２９】
次に、上記の如く構成された走査型レーザ顕微鏡の作用について説明する。
【００３０】
アルゴンレーザ２から波長λ１＝４８８ｎｍとλ２＝５１４．５ｎｍとの２波長のレーザ光が発振出力されると、このレーザ光は、ＡＯＴＦ２５を通過してビームスプリッタ２１に入射し、その一部が取り出されてプリズム２２に入射する。
【００３１】
このプリズム２２では、波長λ１＝４８８ｎｍとλ２＝５１４．５ｎｍとの２波長のレーザ光がスペクトル分解され、２分割フォトダイオード２３の分割面に各ラインの２本のレーザ光が入射する。
【００３２】
この２分割フォトダイオード２３は、プリズム２２によりスペクトル分解されたレーザ光を分割面で受光してその検出信号を出力する。
【００３３】
制御器２４は、２分割フォトダイオード２３から出力される検出信号を入力し、この検出信号に基づいて波長λ１＝４８８ｎｍとλ２＝５１４．５ｎｍとの両方のラインの光強度がそれぞれ一定になるように、アルゴンレーザ２の出力端に固定されたＡＯＴＦ２５を制御（波長選択制御、振幅制御）する。
【００３４】
このとき、アルゴンレーザ２から発振出力される波長λ１＝４８８ｎｍとλ２＝５１４．５ｎｍとの２波長のレーザ光のラインに出力変動があると、これらラインの光強度の変動が２分割フォトダイオード２３により検出され、制御器２４により波長λ１＝４８８ｎｍとλ２＝５１４．５ｎｍとの両方のラインの光強度がそれぞれ一定になるようにＡＯＴＦ２５が制御される。
【００３５】
このように波長λ１＝４８８ｎｍとλ２＝５１４．５ｎｍとの両方のラインの光強度がそれぞれ一定になるように制御されたレーザ光は、ビームスプリッタ５で反射され、Ｘ−Ｙスキャナ６によりＸ−Ｙ方向に走査される。
【００３６】
この走査されたレーザ光は、瞳投影レンズ１４を通過し、ミラー１５で反射され、結像レンズ１８を通過し、対物レンズ１９によりスポットを結んで標本４上に走査される。
【００３７】
この標本４から発せられる各波長λ１’、λ２’の各蛍光は、光路を逆方向に戻り、すなわち対物レンズ１９から結像レンズ１８、ミラー１５、瞳投影レンズ１４、Ｘ−Ｙスキャナ６を通り、さらにビームスプリッタ６を透過し、ミラー７で反射してダイクロイックミラー８に入射する。
【００３８】
このダイクロイックミラー８は、２つの波長λ１’、λ２’の蛍光のうち一方の波長λ１’の蛍光を反射し、他方の波長λ２’の蛍光を透過する。このうちダイクロイックミラー８で反射した波長λ１’の蛍光は、共焦点レンズ１０ａ、共焦点ピンホール１１ａ、バンドパスフィルタ１２ａを通って光検出器１３ａに入射する。
【００３９】
これと共にダイクロイックミラー８を透過した波長λ２’の蛍光は、共焦点レンズ１０ｂ、共焦点ピンホール１１ｂ、バンドパスフィルタ１２ｂを通って光検出器１３ｂに入射する。
【００４０】
従って、これら光検出器１３ａ、１３ｂから出力される各蛍光強度信号を入力して蓄積し、それぞれＸ−Ｙスキャナ６の駆動信号に同期して画像が作像される。
【００４１】
このように上記第１の実施の形態においては、ビームスプリッタ２１により波長λ１＝４８８ｎｍとλ２＝５１４．５ｎｍとの２波長のレーザ光の一部を取り出し、プリズム２２によりこれら波長λ１＝４８８ｎｍとλ２＝５１４．５ｎｍとの２波長のレーザ光をスペクトル分解し、このスペクトル分解された２ラインの強度を２分割フォトダイオード２３により検出し、制御器２４により２分割フォトダイオード２３から出力される検出信号に基づいて波長λ１＝４８８ｎｍとλ２＝５１４．５ｎｍとの両方のラインの光強度がそれぞれ一定になるように、アルゴンレーザ２の出力端に固定されたＡＯＴＦ２５を制御するので、波長λ１＝４８８ｎｍとλ２＝５１４．５ｎｍとの両方のラインの光強度を同時にかつ安定して一定に制御でき、例えば標本４としてＧＦＰとＹＦＰとを遺伝子発現させた細胞の長時間観察を、極めて高い信頼性をもって行うことができる。又、２分割フォトダイオード２３を用いるので、安価に構成できる。
【００４２】
（２）次に、本発明の第２の実施の形態について図面を参照して説明する。なお、図１と同一部分には同一符号を付してその詳しい説明は省略する。
【００４３】
図２は走査型レーザ顕微鏡の構成図である。ベース３０には、主に波長λ１＝４８８ｎｍ、λ２＝５１４．５ｎｍ、λ３＝４５７．９ｎｍの３波長のレーザ光を発振出力するアルゴンレーザ３１と、波長λ４＝５４３ｎｍのレーザ光を発振出力するヘリウムネオンレーザ３２と、波長λ５＝６３３ｎｍのレーザ光を発振出力するヘリウムネオンレーザ３３とが設けられている。このうちアルゴンレーザ３１の出射光路上にはダイクロイックミラー３４が配置され、ヘリウムネオンレーザ３２の出射光路上にはダイクロイックミラー３５が配置され、ヘリウムネオンレーザ３３の出射光路上にはミラー３６が配置され、これらレーザ３１、３２、３３からそれぞれ発振出力されるレーザ光は合成されて１本のレーザ光になっている。
【００４４】
又、ベース３０における１本のレーザ光の出射端には、ＡＯＴＦ２５が固定されている。このＡＯＴＦ２５は、制御器２４の制御により、波長λ１＝４８８ｎｍ、λ２＝５１４．５ｎｍ、λ３＝４５７．９ｎｍ、λ４＝５４３ｎｍ、λ５＝６３３ｎｍの５本の発振波長に対して、任意の組み合わせで波長選択が行えるとともに、出射出力を連続的に制御するものとなっている。
【００４５】
このＡＯＴＦ２５の出射端には、集光レンズ３７を備えると共に、光ファイバー３８の一端を固定するファイバーカプラ３９が固定されている。なお、光ファイバー３８の一方の光ファイバー端３８ａは、ファイバーカプラ３９内の集光レンズ３７の集光位置に位置決めされている。
【００４６】
一方、レーザ顕微鏡本体を構成する走査ユニット３には、スペクトルを分解し監視するための１つのブロック４０が着脱自在に設けられている。このブロック４０内には、図３の拡大構成図に示すように光ファイバー３８の他方の光ファイバー端３８ｂが挿入・固定され、この光ファイバー端３８ｂから出射されるレーザ光の光路上にコリメータレンズ４１を介してビームスプリッタ４２が配置されている。このビームスプリッタ４２は、コリメータレンズ４１によりコリメートされたレーザ光の一部を取り出すものである。
【００４７】
このビームスプリッタ４２により取り出されたレーザ光の光路上には、プリズム４３が配置されている。
【００４８】
このプリズム４３は、光ファイバー端３８ｂから出射されたレーザ光を波長λ１＝４８８ｎｍ、λ２＝５１４．５ｎｍ、λ３＝４５７．９ｎｍ、λ４＝５４３ｎｍ、λ５＝６３３ｎｍの５波長のレーザ光にスペクトル分解するものである。
【００４９】
このプリズム４３のスペクトル出射方向には、集光レンズ４４を介して一次元ＣＣＤ４５が配置されている。この一次元ＣＣＤ４５は、プリズム４５によりスペクトル分解されたレーザ光を受光する受光素子列としての機能を有するもので、その分割面は、波長λ１＝４８８ｎｍ、λ２＝５１４．５ｎｍ、λ３＝４５７．９ｎｍ、λ４＝５４３ｎｍ、λ５＝６３３ｎｍの各ラインに対応する５個のブロック面に分割され、これらブロック面ごとに各検出信号を出力するものとなっている。なお、これら検出信号は、各ブロック面ごとに各素子の出力信号の和である。
【００５０】
制御器２４は、一次元ＣＣＤ４５から出力される各検出信号を入力し、これら検出信号に基づいて波長λ１＝４８８ｎｍ、λ２＝５１４．５ｎｍ、λ３＝４５７．９ｎｍ、λ４＝５４３ｎｍ、λ５＝６３３ｎｍの各ラインの光強度がそれぞれ一定になるように、ＡＯＴＦ２５を制御する機能を有している。
【００５１】
なお、走査ユニット３には、最大で４種類に蛍光標識された標本４を同時に観察できるように、ダイクロイックミラー８ａ、８ｂ、８ｃ、共焦点レンズ１０ａ、１０ｂ、１０ｃ、１０ｄ、共焦点ピンホール１１ａ、１１ｂ、１１ｃ、１１ｄ、バンドパスフィルタ１２ａ、１２ｂ、１２ｃ、１２ｄ及び光検出器１３ａ、１３ｂ、１３ｃ、１３ｄと、ミラー９が設けられている。
【００５２】
次に、上記の如く構成された走査型レーザ顕微鏡の作用について説明する。
【００５３】
アルゴンレーザ３１から波長λ１＝４８８ｎｍ、λ２＝５１４．５ｎｍ、λ３＝４５７．９ｎｍの３波長のレーザ光が発振出力され、ヘリウムネオンレーザ３２から波長λ４＝５４３ｎｍのレーザ光が発振出力され、かつヘリウムネオンレーザ３３から波長λ５＝６３３ｎｍのレーザ光が発振出力されると、これらレーザ光は、ダイクロイックミラー３４、３５及びミラー３６により１本のレーザ光に合成される。
【００５４】
この合成されたレーザ光の中で任意組み合わせで選択された波長のレーザ光は、ＡＯＴＦ２５を通過し、集光レンズ３７により集光されて光ファイバー３８の一方の光ファイバー端３８ａから入射し、この光ファイバー３８を伝播してブロック４０に挿入された他方の光ファイバー端３８ｂから出射する。
【００５５】
この光ファイバー端３８ｂから出射されたレーザ光は、コリメータレンズ４１によりコリメートされ、ビームスプリッタ４２によりその一部が取り出されてプリズム４３に入射する。
【００５６】
このプリズム４３では、光ファイバー端３８ｂから出射されたレーザ光が波長λ１＝４８８ｎｍ、λ２＝５１４．５ｎｍ、λ３＝４５７．９ｎｍ、λ４＝５４３ｎｍ、λ５＝６３３ｎｍの５波長のレーザ光がスペクトル分解され、これらλ１＝４８８ｎｍ、λ２＝５１４．５ｎｍ、λ３＝４５７．９ｎｍ、λ４＝５４３ｎｍ、λ５＝６３３ｎｍの各ラインが一次元ＣＣＤ４５の５個のブロック面に入射する。
【００５７】
この一次元ＣＣＤ４５は、プリズム４５によりスペクトル分解されたレーザ光を受光し、そのブロック面ごとに各検出信号を出力する。
【００５８】
制御器２４は、一次元ＣＣＤ４５から出力される各検出信号を入力し、これら検出信号に基づいて波長λ１＝４８８ｎｍ、λ２＝５１４．５ｎｍ、λ３＝４５７．９ｎｍ、λ４＝５４３ｎｍ、λ５＝６３３ｎｍの各ラインの光強度がそれぞれ一定になるように、ＡＯＴＦ２５を制御する。
【００５９】
このとき、波長λ１＝４８８ｎｍ、λ２＝５１４．５ｎｍ、λ３＝４５７．９ｎｍ、λ４＝５４３ｎｍ、λ５＝６３３ｎｍのラインの中で任意の組み合わせで発振された波長のレーザ光に出力変動があると、これらラインの光強度の変動が一次元ＣＣＤ４５により検出され、制御器２４によりλ１＝４８８ｎｍ、λ２＝５１４．５ｎｍ、λ３＝４５７．９ｎｍ、λ４＝５４３ｎｍ、λ５＝６３３ｎｍの中で選択された各ラインの光強度がそれぞれ一定になるようにＡＯＴＦ２５が制御される。
【００６０】
このように各波長のラインの光強度がそれぞれ一定になるように制御されたレーザ光は、ビームスプリッタ５で反射し、Ｘ−Ｙスキャナ６によりＸ−Ｙ方向に走査される。
【００６１】
この走査されたレーザ光は、瞳投影レンズ１４を通過し、ミラー１５で反射され、結像レンズ１８を通過し、対物レンズ１９によりスポットを結んで標本４上に走査される。
【００６２】
この標本４から発せられる各蛍光は、光路を逆方向に戻り、すなわち対物レンズ１９から結像レンズ１８、ミラー１５、瞳投影レンズ１４、Ｘ−Ｙスキャナ６を通り、さらにビームスプリッタ５を透過し、ミラー７で反射してダイクロイックミラー８ａ以後の光検出器１３ａ、１３ｂ、１３ｃ、１３ｄに入射し、これら光検出器から出力される各蛍光強度信号を入力して蓄積し、それぞれＸ−Ｙスキャナ６の駆動信号に同期して画像を形成し、最大４種類に蛍光標識した標本１５の蛍光画像が作像される。
【００６３】
このように上記第２の実施の形態においては、ビームスプリッタ４２により波長λ１＝４８８ｎｍ、λ２＝５１４．５ｎｍ、λ３＝４５７．９ｎｍ、λ４＝５４３ｎｍ、λ５＝６３３ｎｍの５波長のレーザ光の中で、任意の組み合わせで選択された波長のレーザ光の一部を取り出し、プリズム４３によりこれら波長のレーザ光をスペクトル分解し、このスペクトル分解された各ラインの強度を一次元ＣＣＤ４５により検出し、制御器２４により一次元ＣＣＤ４５から出力される各検出信号に基づいて各ラインの光強度がそれぞれ一定になるように、ＡＯＴＦ２５を制御するので、波長λ１＝４８８ｎｍ、λ２＝５１４．５ｎｍ、λ３＝４５７．９ｎｍ、λ４＝５４３ｎｍ、λ５＝６３３ｎｍの５ラインの光強度を同時にかつ安定して一定に制御でき、標本４を遺伝子発現させた細胞の長時間観察を、極めて高い信頼性をもって行うことができる。又、一次元ＣＣＤ４５を用いたので、複数のレーザラインに対応でき、自由度の高い設計が可能となる。
【００６４】
さらに、コリメータレンズ４１、ビームスプリッタ４２、プリズム４３、集光レンズ４４及び一次元ＣＣＤ４５を１つのブロック４０として構成したので、例えば倒立型の顕微鏡本体に走査ユニット３が接続されている走査型レーザ顕微鏡がもう一台ある場合、使用目的によって、これら正立型、倒立型を使い分けたいときに、レーザ光源及び各ラインの光強度を検出するＣＣＤを含むブロックを共通に使用でき、安価にすることができる。
【００６５】
なお、本発明は、上記第１及び第２の実施の形態に限定されるものでなく、実施段階ではその要旨を逸脱しない範囲で種々に変形することが可能である。
【００６６】
さらに、上記実施形態には、種々の段階の発明が含まれており、開示されている複数の構成要件における適宜な組み合わせにより種々の発明が抽出できる。例えば、実施形態に示されている全構成要件から幾つかの構成要件が削除されても、発明が解決しようとする課題の欄で述べた課題が解決でき、発明の効果の欄で述べられている効果が得られる場合には、この構成要件が削除された構成が発明として抽出できる。
【００６７】
例えば、上記第１及び第２の実施の形態におけるスペクトル分解手段としては、プリズム２２、４３に限らず、回折光子、又はビームスプリッタを用いてもよい。
【００６８】
【発明の効果】
以上詳記したように本発明によれば、標本に照射する複数の波長からなるレーザ光強度を同時に安定に制御できるレーザ顕微鏡を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に係わる走査型レーザ顕微鏡の第１の実施の形態を示す構成図。
【図２】本発明に係わる走査型レーザ顕微鏡の第２の実施の形態を示す構成図。
【図３】本発明に係わる走査型レーザ顕微鏡の第２の実施の形態におけるブロック内の拡大構成図。
【符号の説明】
１：支持台
２：アルゴンレーザ
３：走査ユニット
４：標本
５：ビームスプリッタ
６：Ｘ−Ｙスキャナ
７：ミラー
８：ダイクロイックミラー
９：ミラー
１０ａ，１０ｂ：共焦点レンズ
１１ａ，１１ｂ：共焦点ピンホール
１２ａ，１２ｂ：バンドパスフィルタ
１３ａ，１３ｂ：光検出器
１４：瞳投影レンズ
１５：ミラー
１６：観察用プリズム
１７：切り替え装置
１８：結像レンズ
１９：対物レンズ
２０：接眼レンズ
２１：ビームスプリッタ
２２：プリズム
２３：２分割フォトダイオード
２４：制御器
２５：ＡＯＴＦ
３０：ベース
３１：アルゴンレーザ
３２，３３：ヘリウムネオンレーザ
３４，３５：ダイクロイックミラー
３６：ミラー
３７：集光レンズ
３８：光ファイバー
３９：ファイバーカプラ
４０：ブロック
４１：コリメータレンズ
４２：ビームスプリッタ
４３：プリズム
４４：集光レンズ
４５：一次元ＣＣＤ

Claims

複数の発振波長からなるレーザ光を対物レンズを通して標本に照射し、この標本からの蛍光を検出するレーザ顕微鏡において、
プリズム又は回折光子で構成され、前記標本に照射される前記複数の発振波長からなる前記レーザ光をスペクトル分解するスペクトル分解手段と、
前記スペクトル分解手段によりスペクトル分解されたレーザ光を受光する１つの受光素子列と、
前記１つの受光素子列の出力信号を受けて前記標本に照射される前記レーザ光の強度を前記発振波長ごとに制御する制御手段と、
を具備したことを特徴とするレーザ顕微鏡。
さらに、前記スペクトル分解手段と前記受光素子列との間に配置され、前記スペクトル分解された前記レーザ光を前記受光素子列に集光する集光レンズを有することを特徴とする請求項１記載のレーザ顕微鏡。
前記受光素子列は、固体撮像素子であることを特徴とする請求項１又は２記載のレーザ顕微鏡。
前記複数の発振波長からなる前記レーザ光は、複数のレーザ光源からそれぞれ発振されて各レーザ光をダイクロイックミラーにより１本に合成されたものであり、
前記合成された前記レーザ光の光路には、前記制御手段である音響光学素子が配置され、
前記音響光学素子は、波長選択制御と各波長の光強度の制御とを行う、
ことを特徴とする請求項２又は３記載のレーザ顕微鏡。
前記複数の発振波長からなる前記レーザ光をレーザ顕微鏡本体に導く光ファイバーを設けたことを特徴とする請求項１乃至４のうちいずれか１項記載のレーザ顕微鏡。
前記レーザ光をコリメートするコリメータレンズと、このコリメータレンズによりコリメートされた前記レーザ光の一部を分離するビームスプリッタと、このビームスプリッタにより分離された前記レーザ光をスペクトル分解するスペクトル分解手段と、このスペクトル分解手段によりスペクトル分解されたレーザ光を集光する集光レンズと、この集光レンズにより集光されたレーザ光を受光する前記受光素子列とを１つにブロック化し、レーザ顕微鏡本体に対して着脱自在に構成したことを特徴とする請求項５項記載のレーザ顕微鏡。
前記制御手段は、前記スペクトル分解手段と前記レーザの光源との間に配置されていることを特徴とする請求項１乃至６のうちいずれか１項記載のレーザ顕微鏡。