JP4681784B2 - インスリンおよびインスリン類似体の製造を改善するｃペプチド - Google Patents
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/62—Insulins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
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- Health & Medical Sciences (AREA)
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
【０００１】
本発明はプロインスリンＣペプチドの合成誘導体に関する。本誘導体を含むプロインスリンは、従来のサルプロインスリンよりも様々な点で優れている。特に個々のインスリン誘導体の最終収量はその組換え体の製造について改善される。
【０００２】
糖尿病の患者数は世界中で引き続き増加している。それに比例してインスリンまたはインスリン誘導体の必要性も増加している。したがって、本発明の目的は現存の方法を活性成分の収量について最適化することである。欧州特許ＥＰ−Ｂ１ ０４８９ ７８０はインスリンまたはインスリン誘導体の製造方法を提案している。ヒトインスリンを製造するために前記欧州特許に記載されているベクターは、プラスミドｐＩＮＴ９０ｄまたは他の出発プラスミドとともに用いられ、プラスミドｐＩＮＴ３０２ｄまたはベクターｐＩＮＴ３２９ｄが構築される。ｐＩＮＴ３０２ｄは欧州特許出願ＥＰ−Ａ０ ８２１ ００６に開示されており、Ｈｉｓ(Ｂ31) Ｈｉｓ(Ｂ32) Ｇｌｙ(Ａ21)−インスリン誘導体の製造に用いられる。ｐＩＮＴ３２９ｄは欧州特許出願ＥＰ−Ａ０ ８８５ ９６１に記載されており、Ｌｙｓ(Ｂ３) Ｇｌｕ(Ｂ29)−インスリン誘導体の製造に用いられる。
【０００３】
特に有利なプロインスリン誘導体は、下記式Ｉのものであることが発見された：
Ｆｕｓ−Ｂ(１−30)−ＲＤＶＰ−Ｙn−Ａ(１−21) （Ｉ）
式中、Ｆｕｓは場合によって存在する任意の適当な配列の融合部分であり；
Ｂ(１−30) はヒトインスリンのＢ鎖であり；
ＹはそのＣ末端が塩基性アミノ酸で終わるアミノ酸鎖であり；
ｎは２から５０でアミノ酸鎖Ｙの長さを示し；さらに
Ａ(１−21) はヒトインスリンのＡ鎖であり、
さらに、Ａ鎖および／またはＢ鎖は、アミノ酸交換、欠失および／または付加によって改変可能である。これについては、驚くべきことにインスリンＡまたはＢ鎖の組成に応じて同じまたは相互に異なる利点が観察される。
【０００４】
ヒトＢ鎖をヒトＡ鎖と有利なＣペプチドを介して結合させることによって、発現収量については野生型プロインスリンに類似した挙動を示すが、インスリンへの酵素的プロセシングはより容易に制御され、その結果アルギニンが伸長したＢ鎖の破壊痕跡が生じず、医薬の製造中にこれを除去する必要がなく収量低下をもたらさないプロインスリンが得られる。
【０００５】
Ｃ末端にジヒスチジン伸長を含むＢ鎖とＡ21位にグリシンを含むヒトインスリンＡ鎖とを本発明のＣペプチドを用いて結合した場合、プラスミドｐＩＮＴ９０ｄで達成できる収量より約２０％高い発現収量、およびプラスミドｐＩＮＴ３０２ｄで認められる収量の約５倍高い発現収量が得られることが判明した。さらに、酵素的プロセシングの制御が上記と同じように簡略化される。
【０００６】
Ｌｙｓ(Ｂ３) Ｇｌｕ(Ｂ29)−改変Ｂ鎖を改変Ｃペプチドを介してヒトインスリンのＡ鎖と結合させた場合、前記プロインスリン誘導体の折り畳み特性はｐＩＮＴ３２９ｄによってコードされるプロインスリンと比較して改善されることが判明した。前記粗融合蛋白質の収量は増加し、プラスミドｐＩＮＴ９０ｄで認められたものと同じレベルに達する。さらに、酵素的プロセシングの制御が簡略化される。
【０００７】
本新規なＣペプチドの特に有益なものは以下のアミノ酸配列の特徴を有する:
【化１】
前記提示Ｃペプチドをコードする多くの可能なＤＮＡ配列のうちの１つも同様に提示した。
【０００８】
本発明の特徴の１つは下記式Ｉのヒトインスリンまたはインスリン類似体の前駆体である：
Ｆｕｓ−Ｂ(１−30)−ＲＤＶＰ−Ｙn−Ａ(１−21) （Ｉ）
式中、Ｆｕｓは場合によって存在する任意の適当な配列の融合部分であり；
Ｂ(１−30) はヒトインスリンのＢ鎖であり；
ＹはそのＣ末端が塩基性アミノ酸で終わるアミノ酸鎖であり；
ｎは２から５０でアミノ酸鎖Ｙの長さを示し；さらに
Ａ(１−21) はヒトインスリンのＡ鎖であり、
さらに、Ａ鎖および／またはＢ鎖は、アミノ酸交換、欠失および／または付加によって改変可能で、特に、式中ＹnはヒトまたはサルインスリンのＣペプチドのアミノ酸５から３５、好ましくは式中Ｙnはヒトインスリンのアミノ酸１１から３５である。
【０００９】
本発明の別の特徴は上記の前駆体であるが、式中、ヒトインスリンのＢ鎖は以下の改変Ｌｙｓ(Ｂ３) Ｇｌｕ(Ｂ29) を含むか、またはヒトインスリンのＢおよびＡ鎖は以下の改変Ｈｉｓ(Ｂ31) Ｈｉｓ(Ｂ32) Ｇｌｙ(Ａ21) を含む。
本発明のさらに別の特徴は上記の前駆体をコードするＤＮＡである。
さらにまた、本発明の特徴は上記の前駆体をコードするＤＮＡを含むベクターで、好ましくは前記ベクターは大腸菌（E. coli）での発現に適した発現ベクターである。
本発明のさらに別の特徴は上記のベクターを含む大腸菌細胞である。
【００１０】
本発明のさらに別の特徴は、以下のように上記の前駆体を製造する方法である：
(ａ) 上記のＤＮＡを上記のベクターに導入し；
(ｂ) (ａ)のベクターを大腸菌細胞に導入し；
(ｃ) (ａ)のベクターを含む(ｂ)の大腸菌細胞を発現に用い；さらに
(ｄ) 培養上清から前記前駆体を単離する。
【００１１】
本発明のさらに別の特徴は、以下のように上記のＤＮＡを製造する方法である：
(ａ) ＰＣＲおよび他の分子生物学的技術によってヒトまたはサルインスリンのｃＤＮＡから出発して前記ＤＮＡを製造し、さらに
(ｂ) 前記ＤＮＡを単離する。
【００１２】
本発明のさらに別の特徴は、以下のようにヒトインスリンまたはインスリン類似体を製造する方法である：
(ａ) 上記の前駆体を上記の方法によって製造し；
(ｂ) (ａ)の前駆体を適当な条件下で折り畳み、それによってヒトインスリンのようにジスルフィド架橋を形成し、さらにＲＤＶＰ−Ｙn部分、および適当な場合には融合部分Ｆｕｓを酵素によって欠失させ；さらに
(ｃ) ヒトインスリンまたはインスリン類似体を精製する。
【００１３】
本発明のさらに別の特徴は、インスリンまたはインスリン類似体の製造において上記の前駆体を使用することで、好ましくはインスリンまたはインスリン類似体の製造は上記の方法によって実施される。
本発明のさらに別の特徴は、上記の前駆体の製造に上記のＤＮＡを使用することである。
本発明の特徴の１つはまた、上記の前駆体の製造に上記のベクターを使用することである。
本発明のさらに別の特徴は、上記の前駆体の製造に上記の大腸菌細胞を使用することである。
【００１４】
【実施例】
本発明をこれから実施例を用いて詳細に説明するが、本発明はそれら実施例に限定されない。
実施例１：プロインスリン誘導体の発現
この発現はＥＰ−Ｂ１ ０ ４８９ ７８０の記載のように実施される。本事例では、大容量発酵で改変を導入することができる。しかしながら発現速度の比較のために常に同じ条件が維持される。
以下の一般的な発酵条件が大規模稼働に適用され、例として７.５リットル容量について記載する。
発酵容積：７.５Ｌ
滅菌条件：pH３.５で１２１℃、２０分、滅菌後ＮＨ3で７.０に調整
発酵温度：３７℃
ｐＨ制御：pH７.０、２５％アンモニア水で調整
撹拌速度：１５００rpm
通気 ：１５Sl／分（２vvm）
時間 ：約２４時間
養分補給：ＯＴＲが２００mmol-1ｈ-1に達したとき６５％ブドウ糖溶液を１２gl-1ｈ-1の一定速度で計測しながら加える。
予備培養：振盪培養に種菌アンプルを接種し、３７℃で３〜４時間２５０rpmでＯＤＡ540が約１になるまでインキュベートする
接種 ：発酵槽に約４０mlの予備培養を接種
誘発 ：Ａ540が≧４０で、約１０mlのＮａ2ＣＯ3水溶液（０.１７ｇのＮａ2ＣＯ3）に溶解した４０mg／Ｌ（３００mg／発酵槽）のインドールプロピオン酸で誘発。
略語の意味は以下の通りである：Sl＝標準条件リットル、vvn＝容積／容積／分、およびＯＴＲ＝酸素伝達速度。
【００１５】
発酵培養液：
処方番号 GAI100 ／ 95-000 量ｇ／Ｌ
グルコース１水和物、Ｄ(＋)ミニマム、８０％ ４４
クエン酸１水和物 ３.４８
硫酸アンモニウム、ミニマム、９５％ ６.０
リン酸、オルト、８５％ ２.９９
リン酸水素二カリウム １.１８
硫酸ナトリウム ３.０
硫酸マグネシウム７水和物、ミニマム、９８％ ２.０
硫酸鉄（III）×Ｈ2Ｏ ０.５
微量元素溶液：RL1/85-000 １.０ml
チアミンＨＣｌ ０.００５
デスモフェン 3600 ０.５
【００１６】
微量元素溶液：
RL1 ／ 85 − 000 量ｇ／Ｌ
硫酸銅（II）５水和物 １.６
ヨウ化カリウム ４.０
モリブデン酸アンモニウム４水和物 ８.０
硫酸マンガン（II）１水和物 １２.３
硫酸亜鉛７水和物 １６
ホウ酸 ２０
【００１７】
振盪フラスコ中の量： 量ｇ／Ｌ
酵母抽出物 ８.０
グルコース １.０
ＮａＣｌ ３.５
ＫＨ2ＰＯ4 １.３２
Ｋ2ＨＰＯ4 ３.６８
【００１８】
実施例２：インスリンの製造
インスリンは、例えばＥＰ−Ｂ１ Ｄ ４８９ ７８０またはＥＰ−Ａ０ ８８５ ９６１に開示または提案された既知の方法によって製造する。ＥＰ−Ｂ１ ０ ６６８ ２８２（実施例２を参照されたい）に開示された方法が個々の融合蛋白質の折り畳みおよび加工に好ましい。さらにまた、混合物を折り畳み後または更なる加工前にＥＰ ０ ２８８ ８０９にしたがって濾過してもよい。
【００１９】
実施例３：Ｃ鎖誘導ヒトプロインスリンＢ−ＲＤＶＰＣ11-35−ＡをコードするプラスミドｐＩＮＴ３５８ｄの構築
プラスミドはＥＰ−Ｂ１ ０ ４８９ ７８０に記載されたプライマーＴirおよびＩnsu11を用いて調製した。さらに、２つの新規なプライマー配列を合成した。
プライマーＰＩＮＴ３５８fIIIは以下の配列を有する：
5′-CCC AAG ACC CGC GAT GTT CCT CAG GTG GAG CTG GGC GGG GGC CCT-3′
（配列番号：３）
B28 B29 B30 Arg Asp Val Pro C11 C12 C13 C14 C15 C16 C17 C18
（配列番号：４）
プライマーＰＩＮＴ３５８revIIは以下の配列を有する：
5′-CAGCTCCACCTGAGGAACATCGCGGGTCTTGGGTGTGTAG-3′ （配列番号：５）
【００２０】
ＰＣＲは、プライマー対Ｔｉｒ／ＰＩＮＴ３５８revIIおよびＩnsu11／ＰＩＮＴ３５８fIIIの各々、並びに鋳型としてプラスミドｐＩＮＴ９０ｄのＤＮＡを用いてＥＰ−Ｂ１ ０ ４８９ ７８０にしたがって実施する。前記２つの反応の生成物のアリコートを一緒にし、第三のＰＣＲでプライマー対Ｔir／Ｉnsu11とともに用いた。本反応生成物を酵素ＳalＩ／ＮcoＩで二度消化し、精製後、プラスミドｐＩＮＴ９１ｄのベクターＤＮＡ（ＮcoＩ／ＳalＩで切り開く）に挿入する（プラスミドｐＩＮＴ９１ｄは同様にＥＰ−Ｂ１ ０ ４８９ ７８０に記載されている）。このようにして構築したプラスミドをｐＩＮＴ３５８ｄと呼ぶ。前記の構造はＤＮＡ配列分析によって確認する。コンピテント大腸菌細胞を前記プラスミドＤＮＡで形質転換する。細菌でのプロインスリンの発現は実施例１のように惹起される。実施例２に示したように折り畳んだ後、プロインスリンを酵素によってインスリンに変換し、ＥＰ−Ｂ１ ０ ４８９ ７８０に記載されたようにさらに精製する。さらにまた、ｐＩＮＴ９０ｄに由来する方法との比較により、イオン交換クロマトグラフィー工程での境界部分をさらに採集することも可能である。なぜならば、この部分はＡrg(Ｂ31)−インスリンの混入がないからである。
【００２１】
実施例４：Ｌys(Ｂ３) Ｇlu(Ｂ29)−ＲＤＶＰ−Ｃ11-35−プロインスリン製造のためのプラスミドｐＩＮＴ３６２ｄの構築
プラスミドの構築に必要とされるものは、鋳型としてプラスミドｐＩＮＴ３２９ｄおよびｐＩＮＴ３５８ｄのＤＮＡ、並びにプライマーＴｉｒおよびＩｎｓｕ１１である。さらに、２つの新規なプライマーSalforwardおよび３２９revを合成する。
【００２２】
プライマーSalforwardは以下の配列を有する：
5′-TACACACCCGAGACCCGCGATGTTCCTCAGG-3′ （配列番号：６）
下線を付した配列部分は、プラスミドｐＩＮＴ３５８ｄとハイブリダイズする配列を示し、一方残余の部分はプラスミドｐＩＮＴ３２９ｄのＢ鎖をコードする部分の配列と相同である。
【００２３】
プライマー３２９revは以下の配列を有する：
5′-CCTGAGGAACATCGCGGGTCTCGGGTGTGTAG-3′ （配列番号：７）
前記の下線を付した部分は、プラスミドｐＩＮＴ３２９ｄのＢ鎖の末端を構成し、さらにアルギニンのトリプレットを表すアンチセンス鎖と相同な領域を示している。残余の配列はプラスミドｐＩＮＴ３５８ｄとハイブリダイズする。２通りのＰＣＲを実施する。これらのＰＣＲでは、ｐＩＮＴ３２９ｄのＤＮＡはプライマー対Ｔｉｒ／３２９revのための鋳型として機能し、ｐＩＮＴ３５８ｄＤＮＡはプライマー対Salforward／Ｉｎｓｕ１１のための鋳型として機能する。
【００２４】
両反応によって、プライマーSalforwardの配列とオーバーラップするフラグメントが生成される。したがって、第三のＰＣＲでこれら２つのフラグメントを一緒にし、さらにプライマーＴirおよびＩnsu11を用いてそれらを結合させ、インスリン類似体をコードするＤＮＡ配列を生成することができる。この反応生成物を制限酵素ＮcoＩ／ＳalＩで切断し、続いてＳalＩ／ＮcoＩで切り開いたｐＩＮＴ９１ｄベクターに挿入する。大腸菌株Ｋ１２ＭＭ２９４のコンピテント細胞を適当な連結物の混合物で形質転換する。プラスミドＤＮＡを形質転換細胞から単離し、性状を調べる。正しいプラスミドはｐＩＮＴ３６２ｄと呼ぶ。
【００２５】
発現後の融合蛋白質の粗収量はｐＩＮＴ９０ｄに匹敵することがわかった。しかしながら、折り畳み収量はｐＩＮＴ３２９ｄの場合よりも約４０％良好であることが判明した。
【００２６】
ｐＩＮＴ３６２ｄによってコードされた融合蛋白質の構造は以下の通りである：
【化２】
【００２７】
実施例５：Ｈis(Ｂ31) Ｈis(Ｂ32) Ｇly(Ａ21)−ＲＤＶＰ−Ｃ11-35−プロインスリンの製造のためのプラスミドｐＩＮＴ３４９ｄの構築
先ず最初に、そのＤＮＡがインスリン類似体Ｇly(Ａ21) インスリンをコードするプラスミドｐＩＮＴ１４０ｄを調製する。
このために必要なものは、ＰＣＲでプライマーとして使用する２つのオリゴヌクレオチドである。すなわち、オリゴヌクレオチドＴｉｒはセンスプライマーとして用いられ、オリゴヌクレオチド１４０ｄrevはアンチセンスプライマーとして用いられる。
【化３】
【００２８】
上記２つのプライマーをプラスミドｐＩＮＴ９０ｄのＤＮＡとともに標準的なＰＣＲで用いる。反応生成物をＥＰ−Ｂ１ ０ ４８９ ７８０に記載されたように制限酵素ＮcoＩおよびＳalＩと反応させ、続いて同じように切り開いたベクターｐＩＮＴ６９ｄに挿入する。プラスミドｐＩＮＴ１４０ｄが得られ、これで大腸菌Ｋ１２ＭＭ２９４を形質転換した後で再度単離し、制限酵素分析および配列分析によって性状を調べる。
【００２９】
プラスミドｐＩＮＴ１４０ｄのＤＮＡから出発して２通りのＰＣＲを実施する。最初の反応はプライマーＴｉｒおよび逆方向プライマーとして以下の配列を有するＰＩＮＴ３４９ａを用いる：
【化４】
上記の配列の中で星印を付した配列は新しく挿入されたアミノ酸のためのコドンを示す。
【００３０】
第二のＰＣＲはプライマーＩｎｕ１１およびＰＩＮＴ３４９ｂを用いて実施した。
プライマーＰＩＮＴ３４９ｂは以下の配列を有する：
【化５】
【００３１】
前記ＤＮＡ配列の３４位から１位まで、前記プライマーはＰＩＮＴ３４９ａと相補的である。したがって、２つのＰＣＲの反応生成物をＴｉｒおよびＩｎｕ１１を用いる第三のＰＣＲで結合させ、所望のプロインスリン誘導体をコードするＤＮＡフラグメントを生成することができる。この反応の生成物を記載のように酵素ＮcoＩおよびＳalＩと反応させ、前記酵素で切り開いたｐＩＮＴ９１ｄベクターフラグメントに挿入し、大腸菌Ｋ１２を形質転換する。形質転換細胞から得たプラスミドの性状を調べた後、正しいプラスミド構築物をｐＩＮＴ３４９ｄと呼ぶ。
【００３２】
融合蛋白質の発現は融合蛋白質の収量の明瞭な増加を示した。収量は驚くべきことにｐＩＮＴ９０ｄで達成されたものより約２０％高く、プラスミドｐＩＮＴ３０ｄで達成されたものより約５倍高かった。折り畳み率はｐＩＮＴ９０ｄによってコードされたサルプレプロインスリンで達成される割合に匹敵する。
【配列表】
本発明はプロインスリンＣペプチドの合成誘導体に関する。本誘導体を含むプロインスリンは、従来のサルプロインスリンよりも様々な点で優れている。特に個々のインスリン誘導体の最終収量はその組換え体の製造について改善される。
【０００２】
糖尿病の患者数は世界中で引き続き増加している。それに比例してインスリンまたはインスリン誘導体の必要性も増加している。したがって、本発明の目的は現存の方法を活性成分の収量について最適化することである。欧州特許ＥＰ−Ｂ１ ０４８９ ７８０はインスリンまたはインスリン誘導体の製造方法を提案している。ヒトインスリンを製造するために前記欧州特許に記載されているベクターは、プラスミドｐＩＮＴ９０ｄまたは他の出発プラスミドとともに用いられ、プラスミドｐＩＮＴ３０２ｄまたはベクターｐＩＮＴ３２９ｄが構築される。ｐＩＮＴ３０２ｄは欧州特許出願ＥＰ−Ａ０ ８２１ ００６に開示されており、Ｈｉｓ(Ｂ31) Ｈｉｓ(Ｂ32) Ｇｌｙ(Ａ21)−インスリン誘導体の製造に用いられる。ｐＩＮＴ３２９ｄは欧州特許出願ＥＰ−Ａ０ ８８５ ９６１に記載されており、Ｌｙｓ(Ｂ３) Ｇｌｕ(Ｂ29)−インスリン誘導体の製造に用いられる。
【０００３】
特に有利なプロインスリン誘導体は、下記式Ｉのものであることが発見された：
Ｆｕｓ−Ｂ(１−30)−ＲＤＶＰ−Ｙn−Ａ(１−21) （Ｉ）
式中、Ｆｕｓは場合によって存在する任意の適当な配列の融合部分であり；
Ｂ(１−30) はヒトインスリンのＢ鎖であり；
ＹはそのＣ末端が塩基性アミノ酸で終わるアミノ酸鎖であり；
ｎは２から５０でアミノ酸鎖Ｙの長さを示し；さらに
Ａ(１−21) はヒトインスリンのＡ鎖であり、
さらに、Ａ鎖および／またはＢ鎖は、アミノ酸交換、欠失および／または付加によって改変可能である。これについては、驚くべきことにインスリンＡまたはＢ鎖の組成に応じて同じまたは相互に異なる利点が観察される。
【０００４】
ヒトＢ鎖をヒトＡ鎖と有利なＣペプチドを介して結合させることによって、発現収量については野生型プロインスリンに類似した挙動を示すが、インスリンへの酵素的プロセシングはより容易に制御され、その結果アルギニンが伸長したＢ鎖の破壊痕跡が生じず、医薬の製造中にこれを除去する必要がなく収量低下をもたらさないプロインスリンが得られる。
【０００５】
Ｃ末端にジヒスチジン伸長を含むＢ鎖とＡ21位にグリシンを含むヒトインスリンＡ鎖とを本発明のＣペプチドを用いて結合した場合、プラスミドｐＩＮＴ９０ｄで達成できる収量より約２０％高い発現収量、およびプラスミドｐＩＮＴ３０２ｄで認められる収量の約５倍高い発現収量が得られることが判明した。さらに、酵素的プロセシングの制御が上記と同じように簡略化される。
【０００６】
Ｌｙｓ(Ｂ３) Ｇｌｕ(Ｂ29)−改変Ｂ鎖を改変Ｃペプチドを介してヒトインスリンのＡ鎖と結合させた場合、前記プロインスリン誘導体の折り畳み特性はｐＩＮＴ３２９ｄによってコードされるプロインスリンと比較して改善されることが判明した。前記粗融合蛋白質の収量は増加し、プラスミドｐＩＮＴ９０ｄで認められたものと同じレベルに達する。さらに、酵素的プロセシングの制御が簡略化される。
【０００７】
本新規なＣペプチドの特に有益なものは以下のアミノ酸配列の特徴を有する:
【化１】
【０００８】
本発明の特徴の１つは下記式Ｉのヒトインスリンまたはインスリン類似体の前駆体である：
Ｆｕｓ−Ｂ(１−30)−ＲＤＶＰ−Ｙn−Ａ(１−21) （Ｉ）
式中、Ｆｕｓは場合によって存在する任意の適当な配列の融合部分であり；
Ｂ(１−30) はヒトインスリンのＢ鎖であり；
ＹはそのＣ末端が塩基性アミノ酸で終わるアミノ酸鎖であり；
ｎは２から５０でアミノ酸鎖Ｙの長さを示し；さらに
Ａ(１−21) はヒトインスリンのＡ鎖であり、
さらに、Ａ鎖および／またはＢ鎖は、アミノ酸交換、欠失および／または付加によって改変可能で、特に、式中ＹnはヒトまたはサルインスリンのＣペプチドのアミノ酸５から３５、好ましくは式中Ｙnはヒトインスリンのアミノ酸１１から３５である。
【０００９】
本発明の別の特徴は上記の前駆体であるが、式中、ヒトインスリンのＢ鎖は以下の改変Ｌｙｓ(Ｂ３) Ｇｌｕ(Ｂ29) を含むか、またはヒトインスリンのＢおよびＡ鎖は以下の改変Ｈｉｓ(Ｂ31) Ｈｉｓ(Ｂ32) Ｇｌｙ(Ａ21) を含む。
本発明のさらに別の特徴は上記の前駆体をコードするＤＮＡである。
さらにまた、本発明の特徴は上記の前駆体をコードするＤＮＡを含むベクターで、好ましくは前記ベクターは大腸菌（E. coli）での発現に適した発現ベクターである。
本発明のさらに別の特徴は上記のベクターを含む大腸菌細胞である。
【００１０】
本発明のさらに別の特徴は、以下のように上記の前駆体を製造する方法である：
(ａ) 上記のＤＮＡを上記のベクターに導入し；
(ｂ) (ａ)のベクターを大腸菌細胞に導入し；
(ｃ) (ａ)のベクターを含む(ｂ)の大腸菌細胞を発現に用い；さらに
(ｄ) 培養上清から前記前駆体を単離する。
【００１１】
本発明のさらに別の特徴は、以下のように上記のＤＮＡを製造する方法である：
(ａ) ＰＣＲおよび他の分子生物学的技術によってヒトまたはサルインスリンのｃＤＮＡから出発して前記ＤＮＡを製造し、さらに
(ｂ) 前記ＤＮＡを単離する。
【００１２】
本発明のさらに別の特徴は、以下のようにヒトインスリンまたはインスリン類似体を製造する方法である：
(ａ) 上記の前駆体を上記の方法によって製造し；
(ｂ) (ａ)の前駆体を適当な条件下で折り畳み、それによってヒトインスリンのようにジスルフィド架橋を形成し、さらにＲＤＶＰ−Ｙn部分、および適当な場合には融合部分Ｆｕｓを酵素によって欠失させ；さらに
(ｃ) ヒトインスリンまたはインスリン類似体を精製する。
【００１３】
本発明のさらに別の特徴は、インスリンまたはインスリン類似体の製造において上記の前駆体を使用することで、好ましくはインスリンまたはインスリン類似体の製造は上記の方法によって実施される。
本発明のさらに別の特徴は、上記の前駆体の製造に上記のＤＮＡを使用することである。
本発明の特徴の１つはまた、上記の前駆体の製造に上記のベクターを使用することである。
本発明のさらに別の特徴は、上記の前駆体の製造に上記の大腸菌細胞を使用することである。
【００１４】
【実施例】
本発明をこれから実施例を用いて詳細に説明するが、本発明はそれら実施例に限定されない。
実施例１：プロインスリン誘導体の発現
この発現はＥＰ−Ｂ１ ０ ４８９ ７８０の記載のように実施される。本事例では、大容量発酵で改変を導入することができる。しかしながら発現速度の比較のために常に同じ条件が維持される。
以下の一般的な発酵条件が大規模稼働に適用され、例として７.５リットル容量について記載する。
発酵容積：７.５Ｌ
滅菌条件：pH３.５で１２１℃、２０分、滅菌後ＮＨ3で７.０に調整
発酵温度：３７℃
ｐＨ制御：pH７.０、２５％アンモニア水で調整
撹拌速度：１５００rpm
通気 ：１５Sl／分（２vvm）
時間 ：約２４時間
養分補給：ＯＴＲが２００mmol-1ｈ-1に達したとき６５％ブドウ糖溶液を１２gl-1ｈ-1の一定速度で計測しながら加える。
予備培養：振盪培養に種菌アンプルを接種し、３７℃で３〜４時間２５０rpmでＯＤＡ540が約１になるまでインキュベートする
接種 ：発酵槽に約４０mlの予備培養を接種
誘発 ：Ａ540が≧４０で、約１０mlのＮａ2ＣＯ3水溶液（０.１７ｇのＮａ2ＣＯ3）に溶解した４０mg／Ｌ（３００mg／発酵槽）のインドールプロピオン酸で誘発。
略語の意味は以下の通りである：Sl＝標準条件リットル、vvn＝容積／容積／分、およびＯＴＲ＝酸素伝達速度。
【００１５】
発酵培養液：
処方番号 GAI100 ／ 95-000 量ｇ／Ｌ
グルコース１水和物、Ｄ(＋)ミニマム、８０％ ４４
クエン酸１水和物 ３.４８
硫酸アンモニウム、ミニマム、９５％ ６.０
リン酸、オルト、８５％ ２.９９
リン酸水素二カリウム １.１８
硫酸ナトリウム ３.０
硫酸マグネシウム７水和物、ミニマム、９８％ ２.０
硫酸鉄（III）×Ｈ2Ｏ ０.５
微量元素溶液：RL1/85-000 １.０ml
チアミンＨＣｌ ０.００５
デスモフェン 3600 ０.５
【００１６】
微量元素溶液：
RL1 ／ 85 − 000 量ｇ／Ｌ
硫酸銅（II）５水和物 １.６
ヨウ化カリウム ４.０
モリブデン酸アンモニウム４水和物 ８.０
硫酸マンガン（II）１水和物 １２.３
硫酸亜鉛７水和物 １６
ホウ酸 ２０
【００１７】
振盪フラスコ中の量： 量ｇ／Ｌ
酵母抽出物 ８.０
グルコース １.０
ＮａＣｌ ３.５
ＫＨ2ＰＯ4 １.３２
Ｋ2ＨＰＯ4 ３.６８
【００１８】
実施例２：インスリンの製造
インスリンは、例えばＥＰ−Ｂ１ Ｄ ４８９ ７８０またはＥＰ−Ａ０ ８８５ ９６１に開示または提案された既知の方法によって製造する。ＥＰ−Ｂ１ ０ ６６８ ２８２（実施例２を参照されたい）に開示された方法が個々の融合蛋白質の折り畳みおよび加工に好ましい。さらにまた、混合物を折り畳み後または更なる加工前にＥＰ ０ ２８８ ８０９にしたがって濾過してもよい。
【００１９】
実施例３：Ｃ鎖誘導ヒトプロインスリンＢ−ＲＤＶＰＣ11-35−ＡをコードするプラスミドｐＩＮＴ３５８ｄの構築
プラスミドはＥＰ−Ｂ１ ０ ４８９ ７８０に記載されたプライマーＴirおよびＩnsu11を用いて調製した。さらに、２つの新規なプライマー配列を合成した。
プライマーＰＩＮＴ３５８fIIIは以下の配列を有する：
5′-CCC AAG ACC CGC GAT GTT CCT CAG GTG GAG CTG GGC GGG GGC CCT-3′
（配列番号：３）
B28 B29 B30 Arg Asp Val Pro C11 C12 C13 C14 C15 C16 C17 C18
（配列番号：４）
プライマーＰＩＮＴ３５８revIIは以下の配列を有する：
5′-CAGCTCCACCTGAGGAACATCGCGGGTCTTGGGTGTGTAG-3′ （配列番号：５）
【００２０】
ＰＣＲは、プライマー対Ｔｉｒ／ＰＩＮＴ３５８revIIおよびＩnsu11／ＰＩＮＴ３５８fIIIの各々、並びに鋳型としてプラスミドｐＩＮＴ９０ｄのＤＮＡを用いてＥＰ−Ｂ１ ０ ４８９ ７８０にしたがって実施する。前記２つの反応の生成物のアリコートを一緒にし、第三のＰＣＲでプライマー対Ｔir／Ｉnsu11とともに用いた。本反応生成物を酵素ＳalＩ／ＮcoＩで二度消化し、精製後、プラスミドｐＩＮＴ９１ｄのベクターＤＮＡ（ＮcoＩ／ＳalＩで切り開く）に挿入する（プラスミドｐＩＮＴ９１ｄは同様にＥＰ−Ｂ１ ０ ４８９ ７８０に記載されている）。このようにして構築したプラスミドをｐＩＮＴ３５８ｄと呼ぶ。前記の構造はＤＮＡ配列分析によって確認する。コンピテント大腸菌細胞を前記プラスミドＤＮＡで形質転換する。細菌でのプロインスリンの発現は実施例１のように惹起される。実施例２に示したように折り畳んだ後、プロインスリンを酵素によってインスリンに変換し、ＥＰ−Ｂ１ ０ ４８９ ７８０に記載されたようにさらに精製する。さらにまた、ｐＩＮＴ９０ｄに由来する方法との比較により、イオン交換クロマトグラフィー工程での境界部分をさらに採集することも可能である。なぜならば、この部分はＡrg(Ｂ31)−インスリンの混入がないからである。
【００２１】
実施例４：Ｌys(Ｂ３) Ｇlu(Ｂ29)−ＲＤＶＰ−Ｃ11-35−プロインスリン製造のためのプラスミドｐＩＮＴ３６２ｄの構築
プラスミドの構築に必要とされるものは、鋳型としてプラスミドｐＩＮＴ３２９ｄおよびｐＩＮＴ３５８ｄのＤＮＡ、並びにプライマーＴｉｒおよびＩｎｓｕ１１である。さらに、２つの新規なプライマーSalforwardおよび３２９revを合成する。
【００２２】
プライマーSalforwardは以下の配列を有する：
5′-TACACACCCGAGACCCGCGATGTTCCTCAGG-3′ （配列番号：６）
下線を付した配列部分は、プラスミドｐＩＮＴ３５８ｄとハイブリダイズする配列を示し、一方残余の部分はプラスミドｐＩＮＴ３２９ｄのＢ鎖をコードする部分の配列と相同である。
【００２３】
プライマー３２９revは以下の配列を有する：
5′-CCTGAGGAACATCGCGGGTCTCGGGTGTGTAG-3′ （配列番号：７）
前記の下線を付した部分は、プラスミドｐＩＮＴ３２９ｄのＢ鎖の末端を構成し、さらにアルギニンのトリプレットを表すアンチセンス鎖と相同な領域を示している。残余の配列はプラスミドｐＩＮＴ３５８ｄとハイブリダイズする。２通りのＰＣＲを実施する。これらのＰＣＲでは、ｐＩＮＴ３２９ｄのＤＮＡはプライマー対Ｔｉｒ／３２９revのための鋳型として機能し、ｐＩＮＴ３５８ｄＤＮＡはプライマー対Salforward／Ｉｎｓｕ１１のための鋳型として機能する。
【００２４】
両反応によって、プライマーSalforwardの配列とオーバーラップするフラグメントが生成される。したがって、第三のＰＣＲでこれら２つのフラグメントを一緒にし、さらにプライマーＴirおよびＩnsu11を用いてそれらを結合させ、インスリン類似体をコードするＤＮＡ配列を生成することができる。この反応生成物を制限酵素ＮcoＩ／ＳalＩで切断し、続いてＳalＩ／ＮcoＩで切り開いたｐＩＮＴ９１ｄベクターに挿入する。大腸菌株Ｋ１２ＭＭ２９４のコンピテント細胞を適当な連結物の混合物で形質転換する。プラスミドＤＮＡを形質転換細胞から単離し、性状を調べる。正しいプラスミドはｐＩＮＴ３６２ｄと呼ぶ。
【００２５】
発現後の融合蛋白質の粗収量はｐＩＮＴ９０ｄに匹敵することがわかった。しかしながら、折り畳み収量はｐＩＮＴ３２９ｄの場合よりも約４０％良好であることが判明した。
【００２６】
ｐＩＮＴ３６２ｄによってコードされた融合蛋白質の構造は以下の通りである：
【化２】
実施例５：Ｈis(Ｂ31) Ｈis(Ｂ32) Ｇly(Ａ21)−ＲＤＶＰ−Ｃ11-35−プロインスリンの製造のためのプラスミドｐＩＮＴ３４９ｄの構築
先ず最初に、そのＤＮＡがインスリン類似体Ｇly(Ａ21) インスリンをコードするプラスミドｐＩＮＴ１４０ｄを調製する。
このために必要なものは、ＰＣＲでプライマーとして使用する２つのオリゴヌクレオチドである。すなわち、オリゴヌクレオチドＴｉｒはセンスプライマーとして用いられ、オリゴヌクレオチド１４０ｄrevはアンチセンスプライマーとして用いられる。
【化３】
上記２つのプライマーをプラスミドｐＩＮＴ９０ｄのＤＮＡとともに標準的なＰＣＲで用いる。反応生成物をＥＰ−Ｂ１ ０ ４８９ ７８０に記載されたように制限酵素ＮcoＩおよびＳalＩと反応させ、続いて同じように切り開いたベクターｐＩＮＴ６９ｄに挿入する。プラスミドｐＩＮＴ１４０ｄが得られ、これで大腸菌Ｋ１２ＭＭ２９４を形質転換した後で再度単離し、制限酵素分析および配列分析によって性状を調べる。
【００２９】
プラスミドｐＩＮＴ１４０ｄのＤＮＡから出発して２通りのＰＣＲを実施する。最初の反応はプライマーＴｉｒおよび逆方向プライマーとして以下の配列を有するＰＩＮＴ３４９ａを用いる：
【化４】
【００３０】
第二のＰＣＲはプライマーＩｎｕ１１およびＰＩＮＴ３４９ｂを用いて実施した。
プライマーＰＩＮＴ３４９ｂは以下の配列を有する：
【化５】
前記ＤＮＡ配列の３４位から１位まで、前記プライマーはＰＩＮＴ３４９ａと相補的である。したがって、２つのＰＣＲの反応生成物をＴｉｒおよびＩｎｕ１１を用いる第三のＰＣＲで結合させ、所望のプロインスリン誘導体をコードするＤＮＡフラグメントを生成することができる。この反応の生成物を記載のように酵素ＮcoＩおよびＳalＩと反応させ、前記酵素で切り開いたｐＩＮＴ９１ｄベクターフラグメントに挿入し、大腸菌Ｋ１２を形質転換する。形質転換細胞から得たプラスミドの性状を調べた後、正しいプラスミド構築物をｐＩＮＴ３４９ｄと呼ぶ。
【００３２】
融合蛋白質の発現は融合蛋白質の収量の明瞭な増加を示した。収量は驚くべきことにｐＩＮＴ９０ｄで達成されたものより約２０％高く、プラスミドｐＩＮＴ３０ｄで達成されたものより約５倍高かった。折り畳み率はｐＩＮＴ９０ｄによってコードされたサルプレプロインスリンで達成される割合に匹敵する。
【配列表】
Claims (17)
- 下記式Ｉのヒトインスリンまたはインスリン類似体の前駆体。
Ｆｕｓ−Ｂ(１−30)−ＲＤＶＰ−Ｙn−Ａ(１−21) （Ｉ）
〔式中、Ｆｕｓは場合によって存在する任意の適当な配列の融合部分であり；
Ｂ(１−30) はヒトインスリンのＢ鎖であり；
ＹはそのＣ末端が塩基性アミノ酸で終わるアミノ酸鎖であり；
ｎは２から５０でアミノ酸鎖Ｙの長さを示し；さらに
Ａ(１−21) はヒトインスリンのＡ鎖であり、
さらに、ここで、ヒトインスリンのＢ鎖が、改変Ｌｙｓ(Ｂ３) Ｇｌｕ(Ｂ29)を含むことができるか、または、ヒトインスリンのＢおよびＡ鎖が、改変Ｈｉｓ(Ｂ31) Ｈｉｓ(Ｂ32) Ｇｌｙ(Ａ21) を含むことができる。〕 - ＹnがヒトまたはサルインスリンのＣペプチドのアミノ酸５から３５
である請求項１に記載の前駆体。 - ＹnがヒトインスリンのＣペプチドのアミノ酸１１から３５である請
求項１に記載の前駆体。 - 請求項１〜３のいずれかに記載の前駆体をコードするＤＮＡ。
- 請求項４に記載のＤＮＡを含むベクター。
- 前記ベクターが大腸菌での発現に適した発現ベクターである請求項５に記載のベクター。
- 請求項６に記載のベクターを含む大腸菌細胞。
- 請求項１〜３のいずれかに記載の前駆体を、
(ａ) 請求項４に記載のＤＮＡを請求項５に記載のベクターに導入し；
(ｂ) (ａ)のベクターを大腸菌細胞に導入し；
(ｃ) (ａ)のベクターを含む（ｂ）の大腸菌細胞を発現に用い；さらに
(ｄ) 培養上清から前記前駆体を単離する
ことにより製造する方法。 - 請求項４に記載のＤＮＡを、
(ａ) 請求項４に記載のＤＮＡをＰＣＲおよび他の分子生物学的技術によってヒトまたはサルインスリンのｃＤＮＡから出発して製造し、さらに
(ｂ) 前記ＤＮＡを単離する
ことにより製造する方法。 - ヒトインスリンまたはインスリン類似体を、
(ａ) 前駆体を請求項８に記載の方法によって製造し；
(ｂ) (ａ)の前駆体を適当な条件下で折り畳み、それによってヒトインスリンのように
ジスルフィド架橋を形成し、前記ＲＤＶＰ−Ｙn部分を酵素によって欠失させ；さらに
(ｃ) 前記ヒトインスリンまたはインスリン類似体を精製する
ことにより製造する方法。 - （ｂ）において前記融合部分Ｆｕｓがさらに酵素により欠失させられる請求項１０に記載の方法。
- インスリンまたはインスリン類似体を製造するために請求項１〜３のいずれかに記載の前駆体の使用。
- インスリンまたはインスリン類似体が請求項１０または１１に記載の方法によって製造される請求項１２に記載の使用。
- 請求項１〜３のいずれかに記載の前駆体を製造するために請求項４に記載のＤＮＡの使用。
- 請求項１〜３のいずれかに記載の前駆体を製造するために請求項６に記載のベクターの使用。
- 請求項１〜３のいずれかに記載の前駆体を製造するために請求項７に記載の大腸菌細胞の使用。
- 前記前駆体が請求項８の方法によって製造される請求項１４、１５または１６のいずれかに記載の使用。
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