JP4573563B2 - 核酸抽出装置 - Google Patents

Description

本発明は、核酸を含む試料から迅速かつ簡単に核酸を抽出し、その抽出した核酸を担体に付着させるための装置、及び、担体に付着した核酸を担体との分離操作を必要とすることなく、核酸分析（例えば核酸増幅）を行うための容器に収容させることができる装置に関する。

遺伝子を扱う分野、例えば臨床、細菌又は食品等の分野において、核酸の抽出は、目的とする核酸を分析する上で、重要かつ必須の操作段階である。核酸を含む試料から核酸を抽出する技術は、古くから、フェノール／クロロホルム抽出法、アルカリ溶解法又はグアニジン法等が知られているが、核酸を含む試料と試薬とを容器に収容し、その容器を遠心分離機にかけて遠心分離した後、上澄み液をピペットやろ紙等を使って除去して核酸を抽出するようにした技術が知られている（特許文献１参照）。ここで、核酸を含む試料は、例えば、全血、血清もしくは血漿、尿、糞便、組織、唾液または精液等の内在性の核酸、寄生虫、細菌またはウイルスを含む微生物等の外来性の核酸、細胞培養物、微生物等で汚染された食品もしくは飲料水または遺伝子組換え植物等に含まれる核酸を含む試料が含まれる。

しかしながら、このような従来の核酸抽出技術では、作業者の操作が煩雑で抽出に時間がかかり、また、遠心分離機等の特殊な装置が必要となり、核酸抽出するために大きなスペースを必要とするという問題を有している。

近年、核酸を回収する方法が絶えず探求され、抽出した核酸を、例えば核酸増幅等に供するため、１）まず、核酸を含む試料の夾雑物を所望の方法で除去し、２）核酸を固相等の担体に付着させて回収後、その担体を洗浄し、３）前記担体から核酸を液相に回収するという、いわゆる固相に核酸を付着・固定化等の手段によって核酸を抽出・精製する技術が提案されている。

しかしながら、このような技術は、担体から核酸を離脱させる工程が含まれる分だけ、作業者の操作が煩雑となり、作業時間に長時間を要するという問題を有している。

このような、従来技術の問題に鑑み、操作が煩雑でなく、時間がかかる遠心分離機を使用することなく、迅速に核酸抽出することができたり、また、試料内の特定物質を迅速に分析できるようにした装置の提供が望まれていた。

また、試料の付着が可能な担体を容器内の複数の処理工程部分に順次移動させ、試料から特定物質を迅速に抽出したり、また、試料中の特定物質を迅速に分析できるようにした技術が開発されている。これらの装置によれば、場所を選ばず特定物質の分析作業等を行うことができ、ＰＯＣ（Ｐｏｉｎｔ ｏｆ Ｃａｒｅ）の装置としても利用が期待される（特許文献２及び特許文献３参照）。

特開平２−２８３２７９号公報 特表２００３−５０１６７３号公報 特表２００１−５２４６８１号公報

しかしながら、特許文献２や特許文献３に開示された技術では、試料が付着した担体を装置本体内から取り出す場合、試料が付着した担体が露出した状態で装置本体の外部に取り出されることになるため、試料の種類によっては担体の取扱いに特に注意を払う必要があるという問題を有していた。

そこで、本発明は、核酸が付着した担体から核酸を分離することなく、核酸が付着した状態の担体を装置本体内で容器に収容することができるようにすること、及び、複雑な操作や大型又は特殊な装置を必要とすることなく、簡便かつ迅速に核酸を含む試料から核酸を抽出・精製することができる核酸抽出装置を提供することを目的とする。

本発明の核酸抽出装置は、（１）核酸が含まれる試料を核酸保持用の担体に供給する試料供給部と、前記担体に付着された試料に含まれる核酸に不溶化処理を行う第１処理部と、前記担体に付着された核酸以外の成分を除去するための第２処理部と、前記担体が収容される容器を担体収容位置に着脱可能に支持する容器取付部と、が順次形成されると共に、第１の案内面を有し、前記試料供給部、前記第１処理部、前記第２処理部及び前記容器取付部に支持された前記容器の開口部のそれぞれに連通される内部空間が形成されてなる、本体と、（２）前記担体が着脱可能に支持され、前記本体の前記内部空間内において、前記担体が前記試料供給部から前記容器取付部に支持された前記容器の前記開口部まで、前記第１の案内面に沿って移動可能に形成された担体移動手段と、（３）前記担体移動手段によって前記容器の前記開口部まで移動された前記担体を、前記担体移動手段から分離して前記容器内に収容する担体分離手段と、を備えている。この発明において、前記本体には、前記容器取付部に着脱可能に支持された前記容器を前記担体収容位置から担体取り出し位置まで移動させることができるように、前記容器取付部を移動可能に支持する第２の案内面が形成されている。また、前記容器の前記開口部には、開閉可能な蓋が取り付けられている。
そして、前記容器取付部に着脱可能に支持された前記容器は、
前記開口部が前記蓋で閉じられた状態で前記担体収容位置にセットされた後、前記内部空間内を移動してきた前記担体移動手段の開蓋部で前記蓋が開けられ、前記開口部が前記内部空間に連通した後、前記担体分離手段によって前記担体移動手段から分離された前記担体を収容し、
前記容器取付部が前記第２の案内面に沿って移動させられることにより、前記担体収容位置から前記担体取り出し位置まで移動させられる際に、開いた状態の前記蓋が前記本体の閉蓋手段によって閉じられるようになっている。

また、上記本発明の核酸抽出装置において、核酸増幅用試薬が予め前記容器内に収容されていることを特徴としている。

また、上記本発明の核酸抽出装置において、前記核酸増幅用試薬がＬＡＭＰ法で使用される核酸増幅用試薬であることを特徴としている。

本発明によれば、核酸を保持した担体自体を本体内において容器に収容するようになっているため、核酸が付着した担体を露出した状態で本体外に取り出すようなことがなく、担体の取扱が容易になる。しかも、本発明によれば、核酸が付着した担体を容器内に収容するようになっているため、その容器内で核酸増幅等を行うことができ、担体に保持された核酸を担体から分離する必要がない。その結果、本発明によれば、核酸を担体から分離するための複雑な操作や大型又は特殊な装置が不要となり、核酸を含む試料から簡便かつ迅速に核酸を抽出・精製することが可能になる。

以下、本発明の実施の形態を図面に基づき詳述する。

図１乃至図３は、本発明の実施の形態に係る核酸抽出装置１を示す図である。このうち、図１は、核酸抽出装置１の正面図であり、後述する試料供給容器，処理剤供給容器及び洗浄剤供給容器を省略して示す核酸抽出装置１の正面図である。また、図２は、核酸抽出装置１の平面図であり、後述する試料供給容器，処理剤供給容器及び洗浄剤供給容器を省略して示す核酸抽出装置１の平面図である。また、図３は、図２のＡ−Ａ線に沿って切断して示す核酸抽出装置１の断面図である。

［核酸抽出装置の概略］
これらの図に示すように、本実施の形態に係る核酸抽出装置１は、樹脂材料製の本体２の内部空間３内に第１スライダ（担体移動手段）４が移動可能に係合されるようになっている。ここで、第１スライダ４は、図４乃至図６に詳細を示すように、その先端側にほぼ円板状の担体５（ろ紙、メンブレンフィルター又は不織布からなるもの）が着脱できるように取り付けられている。また、樹脂材料製の本体２には、第２スライダ（容器取付部）６がスライドできるように取り付けられている。ここで、第２スライダ６は、第１スライダ４から押圧ロッド（担体分離手段）７によって分離された担体５が収容される容器８を、着脱可能に支持するようになっている。

［核酸抽出装置の本体］
本体２は、図３の左側から順に、試料供給部１０、第１処理部１１、第２処理部１２、第３処理部１３及び担体分離部１４が適当な間隔をあけて配置されている。このうち、まず、試料供給部１０は、第１スライダ４の先端側の担体５に核酸を含む試料を供給するようになっている。次ぎに、第１処理部１１は、第１スライダ４の先端側の担体５に核酸共沈剤及び不溶化剤を滴下するようになっている。ここで、核酸共沈剤は、不溶化された核酸を凝集させることによって大きな不溶化物を生成させ、担体表面に担持させることで、その後の洗浄工程において、ろ紙のような目の粗い担体では、不溶化物内に存在する核酸がろ紙を通過することを防ぐ役割を果たすものである。次ぎに、第２処理部１２は、第１スライダ４の先端側の担体５に洗浄液を滴下するようになっている。次ぎに、第３処理部１３は、第１スライダ４の先端側の担体５に供給又は滴下された試料、核酸共沈剤、不溶化剤及び洗浄液の余分な液体成分を吸収体１５（ろ紙、メンブレンフィルター、綿、不織布、スポンジ等）によって吸収除去するようになっている。そして、担体分離部１４は、第１スライダ４の先端側に支持された担体５を押圧ロッド７で押し下げることにより、担体５を第１スライダ４から分離し、その分離した担体５を核酸増幅用の容器８内に収容するようになっている（図８（ｇ）参照）。

ここで、容器８は、図８（ｅ）〜（ｉ）に示すように、ヒンジ部を介して蓋１７が取り付けられており、その開口部１６に蓋１７が開閉できるように構成されており、本体２にスライド可能に支持された第２スライダ６に、蓋１７を閉じた状態で着脱できるように支持されている（セットされている）。そして、この容器８の蓋１７は、第１スライダ４の先端に形成された開蓋部１８によって押されて開けられ、第１スライダ４に支持された担体５を開口部１６の直上（担体収容位置）に迎え入れることができるようになっている（図８（ｆ）、（ｇ）参照）。

図９乃至図１０は、本体２を分解した状態を示す図である。本体２は、図９に示すように、下側に位置する第１本体２０と、この第１本体２０の上側に位置する第２本体２１と、を重ね合わせて固定し、第１本体２０と第２本体２１とをねじ（図示せず）で締め付け固定して一体化することにより構成されている（図１乃至図３参照）。

（第１本体）
この本体２のうち、第１本体２０は、図３及び図９（ａ），（ｂ）に示すように、その上面２２側に板状の第１スライダ４をスライド可能に支持するスライドガイド用凹部２３が形成されている。このスライドガイド用凹部２３は、第１本体２０の一方の側面（図９の左側面）２４側に開口し、第１本体２０の他方の側面（図の右側面）２５の近傍までほぼ一定の幅及びほぼ一定の深さで形成されている。そして、この第１本体２０の上部に第２本体２１を重ね合わせた際に、第１本体２０とスライドガイド用凹部２３の上部が第２本体２１の合わせ面（下面）２６によって塞がれ、本体２に内部空間３が形成されるようになっている。ここで、第１スライダ４は、スライドガイド用凹部２３の凹部側面２３ａ，２３ｂと凹部底面２３ｃ、又は第２本体２１の下面２６のいずれかが第１の案内面となり、その第１の案内面に沿って内部空間３内を移動するようになっている。

また、第１本体２０は、図３及び図９に示すように、試料供給部１０及び第１〜第３処理部１１〜１３のそれぞれに対応する吸収体収容穴２７が合わせ面（上面２２）側に開口するように形成されている。これら各吸収体収容穴２７は、平面形状がほぼ正方形の立方体形状を呈しており、内部に液状の試料や試薬を吸収することができる吸収体１５を収容してある。そして、第１本体２０の吸収体収容穴２７の開口縁を取り囲む領域には、吸収体収容穴２７の開口縁の形状とほぼ相似形状の溝２８が形成されている。この溝２８は、隣接する吸収体収容穴２７間で試料や試薬が混ざり合うのを防止するためのものであり、内部空間３（スライドガイド用凹部２３の表面）を伝って流動する試料や試薬を堰き止めるように機能する。

また、第１本体２０は、図９に示すように、その他方の側面（図９の右側面）２５側に開口し、第３処理部１３の吸収体収容穴２７の近傍まで延びるガイド溝３０が形成されており、このガイド溝３０で第２スライダ６の移動を案内するようになっている。そして、第１本体２０のガイド溝３０が形成された部分の下面側には、図９に示すように、スライダ押さえ板３１ａ，３１ｂを取り付けるための切り欠き部３２が形成されている。ガイド溝３０は、図１２に示す第２スライダ６の両側面３３の突起３４をスライド可能に収容する第１ガイド溝部３５と、第２スライダ６の突起３４よりも上方の両側面３３に摺接する第２ガイド溝部３６と、からなっている。

また、第１本体２０は、図９（ａ）及び図９（ｃ）に示すように、その図中右側端部の幅方向略中央に、第２本体２１のストッパ突起３７を係合するストッパ突起係合溝３８が形成されており、このストッパ突起係合溝３８が第２ガイド溝部３６に連通するようになっている。なお、このストッパ突起係合溝３８の溝幅は、スライドガイド用凹部２３の幅寸法よりも小さく、第２ガイド溝部３６の溝幅よりも小さい寸法に形成されている。

（第２スライダ）
図１２は、この第１本体２０のガイド溝３０に移動可能に取り付けられる樹脂材料製の第２スライダ６を示すものである。

この第２スライダ６は、平面形状がほぼ矩形形状を呈している。そして、この第２スライダ６の両側面３３は、第１本体２０の第２ガイド溝部３６にスライド可能に係合されるようになっており、第１本体２０の第１ガイド溝部３５にスライド可能に係合される突起３４が長手方向（スライド方向）に沿ってレールのように一体形成されている。なお、突起３４は、断面形状が矩形形状であり、下方からスライダ押さえ板３１ａ，３１ｂで支えられながら、第１ガイド溝部３５内を円滑に移動できるようになっている。

また、この第２スライダ６は、その一端側から下方へ延びる操作部４０を備えており、側面形状がほぼＬ字形状を呈している（図１２（ｂ）参照）。この操作部４０は、第１本体２０の下方に出っ張る長さに形成されており、第１本体２０に第２スライダ６を取り付けた状態において、作業者が指先で掴むことができ、第２スライダ６を第１本体２０に対して簡単にスライド操作させることができるようになっている。

また、この第２スライダ６は、その他端側（図中左端部側）に、板厚方向に貫通する容器収容穴４１が形成されている。そして、この容器収容穴４１の上面側開口縁には、容器８と蓋１７とを連結しているヒンジを係合し、容器８の蓋１７の向きを合わせると共に容器８の回転を防止するための位置決め溝４２が形成されている。この第２スライダ６の容器収容穴４１には、開口部１６に開閉可能の蓋１７を備えた核酸増幅用の容器（プラスチックチューブ）８が着脱可能に収容されるようになっている。

また、この第２スライダ６の上面（第２本体に対向する面）４３側には、第２本体２１のストッパ突起３７にスライド可能に係合するストッパ溝４４が一端側（図１２（ａ）の右端）から位置決め溝４２の近傍位置まで形成されている。この第２スライダ６は、第１本体２０に対して引き出し方向にスライド移動し、容器収容穴４１に収容した容器８が所定の取り出し位置まで移動すると、ストッパ溝４４の端部４４ａが第２本体２１のストッパ突起３７に突き当たり、スライド移動を停止させられるようになっている（図３及び図８（ｉ）参照）。

また、この第２スライダ６は、そのストッパ溝４４の端部４４ａ側に、その板厚方向に貫通するストッパ穴４５が形成されている。このストッパ穴４５は、第２スライダ６に支持された容器８が担体５を収容する位置（担体分離部１４に対応する位置、以下、単に担体収容位置（１４）と略称する）にセットされた状態で、第２本体２１に保持された押圧ロッド７の先端が係合するようになっている（図３参照）。このストッパ穴４５に押圧ロッド７の先端が係合した状態においては、第２スライダ６が第１本体２０及び第２本体２１に対してスライド移動できなくなり、第１スライダ４の先端で容器８の蓋１７を開けようとする際の第１スライダ４の押圧力によっても、容器８が担体収容位置（１４）からずれてしまうようなことがない。

なお、第２スライダ６は、その両側面３３、突起３４の外表面、上面４３、ストッパ溝４４のいずれかに対向する部材の表面を第２の案内面として、ガイド溝３０内を移動させることができる。

（スライダ押さえ板）
スライダ押さえ板３１ａ，３１ｂは、図１１に示すように、平面形状が略長方形の板状体であり、左右対称形状のものが一対使用される。このスライダ押さえ板３１ａ，３１ｂは、図３及び図９に示すように、第１本体２０の裏面側の切り欠き部３２で、且つ、第１ガイド溝部３５の両側の位置にそれぞれネジ（図示せず）で固定され、第２スライダ６の側面３３に隙間をもって係合すると共に、第２スライダ６の突起３４を下方からスライド可能に支持するようになっている。なお、図１１に示すように、複数のネジ係合穴４６が形成されており、また、第１本体２０及び第２本体２１に対してスライダ押さえ板３１ａ，３１ｂを位置決め固定するための図外の位置決めピンが挿入される位置決め穴４７が形成されている。

（第２本体）
図１０は、樹脂材料製の第２本体２１を示すものである。

この第２本体２１は、試料供給部１０に対応する位置に、試料供給容器４８を収容するための穴５０が形成され、さらに、この穴５０の底面５０ａから下面（第１本体と対向する面）２６までを貫通する試料供給穴５１が形成されている。また、この第２本体２１は、第１処理部１１に対応する位置に、処理剤供給容器５２を収容する穴５３が形成され、この穴５３の底面５３ａから下面２６までを貫通する処理剤供給穴５４が形成されている。また、この第２本体２１は、第２処理部１２に対応する位置に、洗浄液供給容器５５を収容する穴５６が形成され、この穴５６の底面５６ａから下面２６までを貫通する洗浄液供給穴５７が形成されている。また、この第２本体２１は、第３処理部１３に対応する位置に、図１３に示す吸収体５８を下面２６側に突出させるための吸収体移動穴６０が板厚方向に貫通形成されている。また、この第２本体２１は、担体分離部１４に対応する位置に、第２スライダ６に支持された容器８の蓋１７の開閉を可能にする凹部６１が形成されている。そして、第２本体２１の担体分離部１４に対応する位置において、上面６２から凹部６１までを貫通する押圧ロッド挿入穴６３が形成されている。

また、第２本体２１は、凹部６１の天井面６１ａから第２スライダ６の引き出し方向（図の右側方向）に向かって傾斜する傾斜壁６４を備えており、第２スライダ６に支持された容器８を担体収容位置（１４）から担体取り出し部６６に対応する位置（以下、担体取り出し位置（６６）と略称する）まで移動させる際に、開いた状態の容器８の蓋１７を傾斜壁６４で押し倒して閉じるようになっている。したがって、第２本体２１に形成された傾斜壁６４は、容器８の蓋１７を閉じる閉蓋手段として機能する。なお、傾斜壁６４の幅方向略中央部には、第２スライダ６の引き出し方向に延びる溝６５が形成されている。この傾斜壁６４の溝６５は、蓋１７が開いた状態の容器８を担体収容位置から担体取り出し位置まで移動させる際に、蓋１７が第２スライダ６の引き出し方向と直交する方向へズレながら閉じることのないように、蓋１７の略半球形の頭部に係合して、蓋１７の閉じる方向を規制し、蓋１７が容器８の開口部を確実に閉じるようにしている。

また、第２本体２１は、押圧ロッド挿入穴６３に隣接する位置に、押圧ロッド７を収容しておく押圧ロッド収容穴６７が上面６２から傾斜壁６４までを貫通するように形成されている。この押圧ロッド収容穴６７に押圧ロッド７を収容すると、容器８を担体収容位置（１４）に支持する第２スライダ６のストッパ穴４５に押圧ロッド７の先端側の軸部７ａが係合し、第２スライダ６を押圧ロッド７によってロックすることができる（図３参照）。

また、第２本体２１は、凹部６１に隣合う位置に担体取り出し部６６が形成されており、この担体取り出し部６６に、容器８を出し入れできる程度の大きさの容器脱着穴６８が形成されている。そして、この容器脱着穴６８の上部側を一方の側面側に切り欠くことにより、容器脱着穴６８の上部側に容器取り出しスペース７０が形成され、この容器取り出しスペース７０に容器８を掴むための把持具や作業者の指を差し入れることができるようになっている。これにより、第２スライダ６に支持されて担体取り出し位置（６６）まで移動した容器８を、容器脱着穴６８から容易に取り出すことができる。

また、第２本体２１は、その第２スライダ６の引き出し方向端部側（図１０の右側端部）で、且つ容器脱着穴６８の隣りに（図１０（ｃ）の右側に）、下方に突出するストッパ突起３７が一体に形成されている。このストッパ突起３７は、直方体形状を呈しており、第１本体２０のストッパ突起係合溝３８にスライド可能に係合し、且つ、第２スライダ６のストッパ溝４４にスライド可能に係合するようになっている。そして、このストッパ突起３７は、第２スライダ６に支持された容器８が担体取り出し位置（６６）まで移動すると、第２スライダ６のストッパ溝４４の端部４４ａに突き当たり、第２スライダ６の引き出し方向への移動を阻止し、容器８を担体取り出し位置（６６）に位置決めするようになっている。

また、第２本体２１の下面２６には、試料供給穴５１、処理剤供給穴５４及び洗浄液供給穴５７をそれぞれ取り囲むような環状の溝７１〜７３が形成されている。この環状の溝７１〜７３は、隣合う試料供給穴５１側の試料と処理剤供給穴５４側の処理剤とが混ざりあったり、処理剤供給穴５４側の処理剤と洗浄液供給穴５７側の洗浄液とが混ざり合ったりするのを防止するために形成されたものであり、内部空間３内の表面を伝って流動する液体を堰き止める機能を発揮する。

また、第２本体２１の吸収体移動穴６０の上面側開口部には、図１３に示す吸収体操作ロッド７７の頭部７８の下端に形成された突起８０を収容する溝８１が形成されている。この溝８１に吸収体操作ロッド７７の頭部７８の突起８０が収容されることにより、吸収体操作ロッド７７の先端に取り付けられた吸収体５８が吸収体操作ロッド７７の自重で第１スライダ４上の担体５やその周囲に当接して余分な液体を吸収するセット位置に移動する。また、吸収体操作ロッド７７の頭部７８の突起８０を溝８１から抜いて第２本体２１の上面６２で支持させることにより、吸収体５８を担体５から離間した退避位置に保持することができるようになっている。

［核酸抽出装置の第１スライダ］
図４乃至図５は、第１スライダ４を示す図である。

これらの図に示すように、第１スライダ４は、第１本体２０と第２本体２１との重ね合わせた部分に形成される内部空間３において、前述の第１の案内面に沿って移動可能に収容される樹脂材料製の板状体であり、平面形状がほぼ長方形であって、その一端側（先端側）を切り欠いて、容器８の蓋１７をこじ開ける開蓋部１８が形成されている。この第１スライダ４の開蓋部１８は、第１スライダ４の一端の幅方向中央部分に、容器８の蓋１７の下側部分を収容できる程度の幅寸法に矩形形状に切り欠いて容器係合溝８２を形成し、この容器係合溝８２の側面側最深部８２ａの上面４ａから側面側先端部８２ｂの下面４ｂに向けて斜めに切り欠いて傾斜部分８２ｃを形成し、容器係合溝８２の側面側先端部８２ｂを薄くし、容器係合溝８２の側面側先端部８２ｂから側面側最深部８２ａに向けて容器係合溝８２の側面側の厚さを漸増させるようになっている。その結果、この容器係合溝８２の側面側先端部８２ｂを蓋１７と容器８の開口部１６との間に差し入れたのち、さらに第１スライダ４を内部空間３内に押し込むと、容器係合溝８２の肉厚が漸増する側面側の傾斜部分８２ｃで蓋１７を徐々に押し開くようになっている（図８（ｆ）参照）。

この第１スライダ４の他端側（後端側）には、作業者が掴むことができる厚肉の把持部８３が形成されており、この把持部８３が本体２の内部空間３の開口端部に突き当たることにより、第１スライダ４のスライド移動が阻止され、容器８の蓋１７が全開状態となり、容器８の開口部１６が完全に開口する（図８（ｆ）参照）。

また、第１スライダ４は、容器係合溝８２の近傍で且つ幅方向中央部に、略円板状の担体５を着脱可能に支持する担体支持部８４が形成されている。この担体支持部８４は、担体５の外周とほぼ同径の担体離脱穴８５が貫通形成されており、この担体離脱穴８５の内壁面の周方向に複数の担体支持突起８６が突出形成されている。そして、この担体離脱穴８５の上部には、この担体離脱穴８５よりも大径の押さえ板係合穴８７が形成されている。なお、本実施の形態において、担体５は、前述のように、ろ紙、メンブレンフィルター又は不織布からなるものが挙げられるが、核酸共沈体と核酸の巨大不溶化物を担体表面で保持できれば特にその材料・材質を限定するものではない。なお、担体５は、取扱い易さという観点から判断すると、ろ紙を使用することが好ましい。

このような第１スライダ４の担体支持部８４は、先ず、担体５が担体支持突起８６上に載置された後、図１４に示す押さえ板８８が押さえ板係合穴８７に軽く圧入され、担体５が担体支持突起８６と押さえ板８８とによって挟持される。なお、押さえ板８８は、図１４に詳細を示すように、略中空円板形状を呈しており、担体５の外径とほぼ同径の穴９０が形成されている。したがって、第１スライダ４に支持された担体５には、押さえ板８８の穴９０を通過して試料や試薬等が滴下される。また、第１スライダ４に支持された担体５は、押さえ板８８の穴９０を通した押圧ロッド７の軸部７ａによって押し下げられると、僅かに変形して担体支持突起８６から離脱し、担体離脱穴８５を落下するようになっている。

また、第１スライダ４は、その先端側の一方の側面９１に、側面９１から突出する突起９２を備えたバネ作用部９３が形成されている。このバネ作用部９３は、突起９２が押されると、突起９２が側面９１から出っ張らない位置まで引っ込むことができる程度のスリット９４を備えており、突起９２が形成された薄肉部９５が弾性変形してバネ作用を発揮する。

このような第１スライダ４が本体２の内部空間３内に押し込まれると、スライドガイド用凹部２３の凹部側面２３ａに形成された位置決め溝９６にバネ作用部９３の突起９２が順次係合し、担体５が試料供給部１０、第１処理部１１、第２処理部１２、第３処理部１３及び担体分離部１４に対して位置決めされるようになっている。なお、第１スライダ４のバネ作用部９３の突起９２がスライドガイド用凹部２３の位置決め溝９６に係合すると、クリック音が生じると共に第１スライダ４の移動に対する抵抗力が変化するため、作業者は担体５が試料供給部１０、第１処理部１１、第２処理部１２、第３処理部１３及び担体分離部１４の各部に位置決めされたことを体感できる。

なお、図３に示すように、第１処理部１１の穴５３には、核酸共沈剤及び不溶化剤を滴下する処理剤供給容器５２が収容されている。また、第２処理部１２には、洗浄液を滴下する洗浄剤供給容器５５が収容されている。

［核酸抽出装置の使用状態］
図７乃至図８は、本実施の形態に係る核酸抽出装置１の使用状態を説明するための図である。

先ず、図７（ａ）は、第２スライダ６の容器収容穴４１に収容された容器８が担体収容位置（１４）に配置され、第２スライダ６が押圧ロッド７によりロックされている状態を示している。そして、本体２の内部空間３内に第１スライダ４の先端側が挿入されており、その第１スライダ４の先端側に支持された担体５が試料供給部１０に位置するようになっている。

次いで、図７（ｂ）に示すように、試料供給容器４８内に収容されている核酸を含む試料が、試料供給容器４８から担体５に滴下される。これにより、担体５には核酸を含んだ試料が付着する。本明細書において、付着とは、核酸又は核酸の不溶化物が、担体５に単に保持されている状態を示し、核酸と担体５の結合による化学的相互作用を積極的に利用したものではないとの意である。なお、担体５を透過した余剰試料が吸収体１５によって吸収されるようになっている。

次いで、図７（ｃ）に示すように、試料供給容器４８から担体への試料滴下が終了すると、第１スライダ４が更に本体２の内部空間３内に押し込まれ、担体５が第１処理部１１に移動させられる。この第１処理部１１では、担体５に処理剤供給容器５２から所定量の核酸共沈剤及び不溶化剤が滴下される。ここで、担体５を透過した余剰核酸共沈剤及び不溶化剤が吸収体１５で吸収されるようになっている。

次いで、図７（ｄ）に示すように、更に第１スライダ４が本体２の内部空間３内に押し込まれ、担体５が第２処理部１２に移動させられる。この第２処理部１２において、担体５には洗浄液が洗浄剤供給容器５５から滴下される。担体５を透過した余剰洗浄液や洗浄液によって除去された不溶化処理された核酸以外の成分が吸収体１５によって吸収されるようになっている。

次いで、図８（ｅ）に示すように、更に第１スライダ４が本体２の内部空間３内に押し込まれ、担体５が第３処理部１３に移動させられる。ここで、吸収体操作ロッド７７が押し下げられ、吸収体操作ロッド７７の先端に取り付けられた吸収体５８が担体５及びその担体５の周囲に押し付けられると共に、担体５とその下の吸収体１５とが接触し、担体５及びその周辺に付着した余剰液体が吸収体５８と吸収体１５とで吸収されるようになっている。

次いで、図８（ｆ）に示すように、吸収体操作ロッド７７を退避位置まで持ち上げて、第１スライダ４を更に本体２の内部空間３に押し込むようになっている。この際、第１スライダ４の先端の開蓋部１８によって容器８の蓋１７が開かれ、担体５が容器８の開口部１６の直上（担体収容位置（１４））まで移動する。

次いで、図８（ｇ）に示すように、押圧ロッド７を押圧ロッド収容穴６７から押圧ロッド挿入穴６３に差し替えて、押圧ロッド７を押し下げると、押圧ロッド７の軸部７ａの先端が担体５を第１スライダ４から分離し、核酸増幅用試薬が収容された容器８内部に核酸が付着した担体５を落とし込むようになっている。ここで、この作業工程のように、洗浄処理を施されて不溶性核酸が付着した担体５を、すでに核酸増幅用試薬の入った容器８に収容することで、担体５に付着した不溶化核酸が核酸増幅反応で使用される緩衝液に溶出することになり、その後直ちに核酸増幅反応に供することができる。

次いで、図８（ｈ）に示すように、押圧ロッド７が本体２から抜き取られ、第２スライダ６が担体収容位置（１４）から担体取り出し位置（６６）へ向けてスライド移動させられる。この際、開いた状態の容器８の蓋１７が傾斜壁６４によって閉じられる。

次いで、図８（ｉ）に示すように、第２スライダ６を引き出し方向にスライドさせて、蓋１７を傾斜壁６４によって完全に閉じられた容器８が担体取り出し位置（６６）まで移動すると、第２スライダ６の移動がストッパ突起３７によって阻止され、第２スライダ６に支持された容器８が容器脱着穴６８から取り出されるようになっている。この取り出された容器８は、内部に核酸が付着した担体５を収容しており、核酸増幅反応に供されることになる。なお、核酸増幅反応は、蛍光装置ｉＣｙｃｌｅｒ（ Biorad社製 ）による蛍光検出により行った。

このように、本実施の形態によれば、担体５に付着した核酸を、担体５ごと直接核酸増幅用の緩衝液に接触させて増幅させるため、従来の溶出工程や担体５からの核酸の分離という操作を省くことができる。また、本実施の形態によれば、特に微量にしか採取できない試料では全量の核酸を回収することができ、さらに核酸含有量が低い試料でも担体５に濃縮させて回収することができるため、少量の核酸をロスなく増幅反応に供することができるという特徴を有している。

ここで、本発明で使用される核酸共沈剤とは、核酸と親和性が高く、不溶化された核酸を大きく包み込むことができるもので、アミロペクチン、グリコーゲン等のデンプン類が好ましい。また、不溶化剤としては、エタノール、イソプロピルアルコール、ブチルアルコール等の低級アルコールが挙げられるが、核酸の分解酵素であるヌクレアーゼ活性を抑制できるクエン酸ナトリウム等の活性抑制剤、さらには、細胞膜等を破壊し、複合体中の蛋白質を変性させるグアニジン等の蛋白変性剤を併用することによって、核酸の回収効率を向上させることができる。さらに、洗浄工程に用いられる試薬は、不溶化した核酸を担持させたまま、変性した蛋白質を溶解して洗い流すためのもので、不溶化剤として使用した濃度より低濃度のアルコール類が使用される。

また、本発明で使用される核酸増幅用試薬は、例えば、in vitroにおける核酸の増幅技術として現在最も一般的な方法であるＰＣＲ（ Polymerase Chain Reaction ）法の他、ＬＡＭＰ（ Loop-Mediated Isothermal
Amplification ）法と呼ばれる増幅法（特許第３３１３３５８号等）、ＳＤＡ（ Strand Displacement Amplification ）法（特公平７−１１４７１８号公報等)、ＮＡＳＢＡ( Nucleic
Acid Sequence Based Amplification ）法（特許第２６５０１５９号）等で使用する増幅試薬が挙げられるが、核酸増幅から増幅産物の検出をまで簡単に実施できるＬＡＭＰ用試薬が好ましい。

ＬＡＭＰ法はループ媒介等温増幅法と呼ばれ、鋳型となるヌクレオチドに自身の３'末端をアニールさせて相補鎖合成の起点とするとともに、このとき形成されるループにアニールするプライマーを組み合わせることにより、等温での相補鎖合成反応を可能とした核酸増幅法である。

ＬＡＭＰ法は、標的核酸の計６領域の塩基配列を認識する４種類のオリゴヌクレオチドプライマー、すなわちインナープライマー２種類（ＦＩプライマーとＲＩプライマー）とアウタープライマー２種類（Ｆ３プライマーとＲ３プライマー）、鎖置換合成活性を有する核酸合成酵素、及び基質を用い、熱変性工程を必要とせずに、終始等温で速やかに特異性の高い遺伝子増幅反応が進行することを特徴とする。さらに、増幅反応途中に形成されるダンベル型構造の５’末端側のループ１本鎖の塩基配列に相補的なプライマー（ループプライマー）を使用することにより、核酸合成の起点を増やし、反応時間の短縮と検出感度の向上を図ることも可能である（ＷＯ０２／２４９０２）。

ＬＡＭＰ法での核酸増幅産物の検出は、ＰＣＲ法同様、電気泳動法や蛍光性インターカレーター法を用いて検出できる（特開２００１−２４２１６９）。また、ＬＡＭＰ法の特徴を生かした増幅副生成物である不溶性のピロリン酸マグネシウムによる反応液の濁度や沈殿の生成を指標とした検出法（ＷＯ０１／８３８１７）や、金属イオンと金属指示薬とのキレート化に伴う呈色や蛍光を指標とした検出法（特願２００３−５７３４２）もある。前記濁度や沈殿、または蛍光を指標とした検出法では、増幅の有無を、反応容器の外側からでも目視で確認できるため、緩衝液に核酸が溶出した後の不要の担体は、特段除去しなくても、そのまま反応液中に放置しておくことができる。上述した本実施の形態の核酸抽出装置を使用すれば、ＬＡＭＰ法での核酸増幅産物の検出を効率的に行うことが可能になる。

以上のような構成の本実施の形態に係る核酸抽出装置１によれば、核酸を保持した担体５自体を本体２内において容器８に収容するようになっているため、核酸が付着した担体５を露出した状態で本体２の外部（大気中）に取り出すようなことがなく、担体５に付着した核酸による環境汚染や担体に付着した核酸に大気中の不純物が付着するような虞がなく、担体５の取扱いが容易になる。しかも、本実施の形態に係る核酸抽出装置１によれば、核酸が付着した担体５を容器８内に収容するようになっているため、その容器８内で核酸増幅等を行うことができ、担体５に保持された核酸を担体５から分離する必要がない。その結果、本実施の形態によれば、核酸を担体５から分離するための複雑な操作や大型又は特殊な装置が不要となり、核酸を含む試料から簡便かつ迅速に核酸を抽出・精製することが可能になる。

また、本実施の形態において、核酸抽出装置１は、全てが透明である必要はないが、少なくとも、視認性を要求される部分が透明材料によって形成されることが好ましい。このようにすれば、作業者が、処理工程を視認することができ、作業が効率的になると共に、作業が確実化する。

以下、本発明に係る核酸抽出装置１を使用した核酸抽出について、実施例によって具体的に説明する。なお、以下の説明は、図７乃至図８に示した核酸抽出装置１の使用状態を前提としている。

先ず、試料供給部１０において、核酸を含む試料として牛胚培養細胞懸濁液１μＬ（１００細胞／μＬ）を使用し、この牛胚培養細胞懸濁液１μＬを担体（定性ろ紙Ｎｏ．１（ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製））に滴下した。

次に、第１処理部１１において、核酸共沈剤１μＬ及び不溶化剤５００μＬを滴下した。ここで、核酸共沈剤は、４０ｍｇ／ｍＬアミロペクチン溶液を使用した。また、不溶化剤は、６０％イソプロパノール、２．４ｍｏｌ／Ｌグアニジン、０．５％Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム及び１５ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウムを含む混合液を使用した。

次に、第２処理部１２において、担体に洗浄液１００μＬを滴下し、担体を洗浄した。ここで、洗浄液は、４０％イソプロパノール、２００ｍｍｏｌ／Ｌの塩化カリウムの混合液を使用した。

次に、第３処理部１３において、担体が含む不溶な液体成分を吸収体５８及び吸収体１５で吸収除去した。

次に、担体分離部１４において、押圧ロッド７によって第１スライダ４から担体５を分離し、その分離した担体５を核酸増幅用試薬が注入されている容器８内に収容した。

なお、前記牛胚培養細胞懸濁液の代わりに、蒸留水を使用して、核酸抽出装置１において同様の操作を行ったものを陰性対照とした。

次に、担体が収容された容器８を担体取り出し部６６から取り出し、その容器８を蛍光装置ｉＣｙｃｌｅｒ（ Biorad社製 ）に取り付けて、以下に詳述するＬＡＭＰ法を使用した核酸増幅（６３℃、３０ｍｉｎ）を行うと共に、核酸増幅の進行を蛍光強度を測定することにより、リアルタイムで確認した。

次に、ＬＡＭＰ法を使用した核酸増幅について、実施例によって具体的に説明する。
〔反応液組成〕
ＬＡＭＰ用反応液組成(２５μＬ中)
２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）
１０ｍＭ ＫＣｌ
１０ｍＭ （ＮＨ4）2ＳＯ4
８ｍＭ ＭgＳＯ4
８０ｎＭ オキサゾールイエロー０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０
０．８Ｍ Ｂｅｔａｉｎ
１．４ｍＭ ｄＮＴＰｓ
８Ｕ ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ( New England Biolab社製 )
１．６μＭ ＦＩプライマー
１．６μＭ ＲＩプライマー
０．２μＭ Ｆ３プライマー
０．２μＭ Ｒ３プライマー
０．８μＭ ループプライマーＦ
０．８μＭ ループプライマーＲ

なお、前記反応液組成中の６種類のプライマーは、雄牛の特異的塩基配列プラスミドＳ４の塩基配列に基づいて以下のように設計されたものである。
・ＦＡプライマー
5'-AGCTATGTGG CATGTGGGAT CCTTCCCTGG
AAATGTTTAA GTG-3'(配列番号１)
・ＲＡプライマー
5'-TAAAGCCAGA CACAGAGGTC ACTTTTGCTT
CTCTTTCCTG CTTC-3'(配列番号２)
・Ｆ３プライマー
5'-AGCCAAGAAG TGGATGAATC-3'(配列番号３)
・Ｒ３プライマー
5'-GCAGTGCATT TCCTCCTC-3'(配列番号４)
・ループプライマーＦ
5'-GGGATGGAAA CTGTGCAT-3'(配列番号５)
・ループプライマーＲ
5'-ATTGCATGTG GAAGAACTGT AG-3'(配列番号６)

前記ＬＡＭＰ用反応液に、ＬＡＭＰ反応の鋳型としてウシゲノムＤＮＡを６×１０^-20 ｍｏｌを添加し、ＬＡＭＰ法による増幅反応を６３℃で３０分を行った。増幅反応は、蛍光装置ｉＣｙｃｌｅｒ（ Biorad社製 ）による蛍光検出により行った。

その結果、図１５に示すように、反応時間が１４分経過すると蛍光強度が増加し始め、反応時間が１６分を経過すると蛍光強度が急激に増加していることが確認された。これにより、本発明の核酸抽出装置１を使用することにより、核酸を抽出できることが確認された。なお、図１５において、陰性対照（細胞数０の反応曲線）においては、増幅が見られないことから、一連の処理を経たろ紙担体は、非特異的な増幅反応を誘起しないことを確認した。

本発明の実施の形態に係る核酸抽出装置の正面図であり、試料供給容器，処理剤供給容器及び洗浄剤供給容器を省略して示す正面図である。 本発明の実施の形態に係る核酸抽出装置の平面図であり、試料供給容器，処理剤供給容器及び洗浄剤供給容器を省略して示す平面図である。 本発明の実施の形態に係る核酸抽出装置の正面側の縦断面図であり、図２のＡ−Ａ線に沿って切断して示す核酸抽出装置の断面図である。 本発明の実施の形態に係る第１スライダを示す図である。（ａ）は第１スライダの平面図であり、（ｂ）は第１スライダの側面図である。 図４のＢ−Ｂ線に沿って切断して示す第１スライダの断面図である。 担体を装着した状態を示す第１スライダの平面図である。 本発明の実施の形態に係る核酸抽出装置の作動状態を示す図であり、作動状態（ａ）〜（ｄ）を示す図である。 本発明の実施の形態に係る核酸抽出装置の作動状態を示す図であり、作動状態（ｅ）〜（ｉ）を示す図である。 第１本体を示す図である。（ａ）は第１本体の平面図、（ｂ）は（ａ）のＣ−Ｃ線に沿って切断して示す断面図、（ｃ）は第１本体の裏面図である。 第２本体を示す図である。（ａ）は第２本体の平面図、（ｂ）は第２本体の側面図、（ｃ）は（ａ）のＤ−Ｄ線に沿って切断して示す断面図、（ｄ）は第２本体の裏面図である。 一対のスライダ押さえ板を示す図である。（ａ）はガイド溝の一側に配置されるスライダ押さえ板の平面図、（ｂ）は（ａ）のＥ−Ｅ線に沿って切断して示す断面図、（ｃ）は（ａ）のスライダ押さえ板の右側面図、（ｄ）はガイド溝の他側に配置されるスライダ押さえ板の平面図、（ｅ）は（ｄ）のＦ−Ｆ線に沿って切断して示す断面図、（ｆ）は（ｄ）のスライダ押さえ板の右側面図である。 第２スライダを示す図である。（ａ）は第２スライダの平面図、（ｂ）は（ａ）のＧ−Ｇ線に沿って切断して示す断面図、（ｃ）は第２スライダの裏面図、（ｄ）は（ａ）の第２スライダの右側面図である。 吸収体操作ロッドを示す図である。（ａ）は吸収体操作ロッドの正面図、（ｂ）は吸収体操作ロッドを吸収体側から見た図（裏面図）である。 押さえ板を示す図である。（ａ）は押さえ板の平面図、（ｂ）は押さえ板の縦断面図である。 直接法における蛍光による増幅反応曲線である。

符号の説明

１……核酸抽出装置、２……本体、３……内部空間、４……第１スライダ（担体移動手段）、５……担体、６……第２スライダ（容器取付部）、７……押圧ロッド（担体分離手段）、８……容器、１０……試料供給部、１１……第１処理部（処理部）、１２……第２処理部（処理部）、１４……担体分離部（担体収容位置）、１６……開口部、１７……蓋、１８……開蓋部、６４……傾斜壁（閉蓋手段）、６６……担体取り出し部（担体取り出し位置）

Claims (3)

1. （１）核酸が含まれる試料を核酸保持用の担体に供給する試料供給部と、前記担体に付着された試料に含まれる核酸に不溶化処理を行う第１処理部と、前記担体に付着された核酸以外の成分を除去するための第２処理部と、前記担体が収容される容器を担体収容位置に着脱可能に支持する容器取付部と、が順次形成されると共に、
   第１の案内面を有し、前記試料供給部、前記第１処理部、前記第２処理部及び前記容器取付部に支持された前記容器の開口部のそれぞれに連通される内部空間が形成されてなる、
   本体と、
   （２）前記担体が着脱可能に支持され、前記本体の前記内部空間内において、前記担体が前記試料供給部から前記容器取付部に支持された前記容器の前記開口部まで、前記第１の案内面に沿って移動可能に形成された担体移動手段と、
   （３）前記担体移動手段によって前記容器の前記開口部まで移動された前記担体を、前記担体移動手段から分離して前記容器内に収容する担体分離手段と、
   を備えた核酸抽出装置であって、
   前記本体には、前記容器取付部に着脱可能に支持された前記容器を前記担体収容位置から担体取り出し位置まで移動させることができるように、前記容器取付部を移動可能に支持する第２の案内面が形成され、
   前記容器の前記開口部には、開閉可能な蓋が取り付けられ、
   前記容器取付部に着脱可能に支持された前記容器は、
   前記開口部が前記蓋で閉じられた状態で前記担体収容位置にセットされた後、前記内部空間内を移動してきた前記担体移動手段の開蓋部で前記蓋が開けられ、前記開口部が前記内部空間に連通した後、前記担体分離手段によって前記担体移動手段から分離された前記担体を収容し、
   前記容器取付部が前記第２の案内面に沿って移動させられることにより、前記担体収容位置から前記担体取り出し位置まで移動させられる際に、開いた状態の前記蓋が前記本体の閉蓋手段によって閉じられる、
   ことを特徴とする核酸抽出装置。
2. 核酸増幅用試薬が予め前記容器内に収容されていることを特徴とする請求項１に記載の核酸抽出装置。
3. 前記核酸増幅用試薬がＬＡＭＰ法で使用される核酸増幅用試薬であることを特徴とする請求項１又は２に記載の核酸抽出装置。

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