JP4549528B2 - シアニン色素 - Google Patents
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Description
【０００１】
シアニン色素群は、写真適用および生物学的適用の両方において、非常に鮮明で用途の広い色素群であることが証明されている。スルホン酸の添加、およびコンジュゲーションを目的とした官能性の付加は、それらが生物学的研究適用に関して十分に開発されることを可能としている。さらなる水溶性および鮮明度の向上を目的としたスルホン酸の添加により、該色素が全体的に中性または負に帯電するようになる。米国特許第５,２６８,４８６号および同第５,４８６,６１６号に記載されているように、塩基性シアニン構造は、＋１の正の総電荷、例えば、
【化３】
を有する。
【０００２】
ある適用においては、正に帯電した原子を幾つか有する色素が有益なものとなり得る。本発明は、その必要性に応える。
【０００３】
本発明は、構造：
【化４】
［式中、
点線は、各々の環が５個または６個の炭素原子をもち、その環にＲ3、Ｒ4、Ｒ5、およびＲ6が結合した、１つの環または２つもしくは３つの縮合環システムに必要な炭素原子を表し；
ＸおよびＹは独立して、Ｏ、Ｓ、およびＣＲ8 2（ここで、Ｒ8は、Ｃ1−Ｃ4アルキルである。）から選択され；
ｎは、１、２、または３であり；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、およびＲ7のうち少なくとも１つは、反応性基または官能基を含んでなり；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、およびＲ7のうち少なくとも１つには、１個〜５個の正に帯電した窒素またはリンまたは硫黄原子が組み込まれており；
残りのＲ3、Ｒ4、Ｒ5、およびＲ6はいずれも独立して、Ｈ、ＳＯ3 -、Ｃl、Ｂr、ＯＲ9、およびＳＲ9（ここで、Ｒ9は、Ｃ1−Ｃ10アルキルまたはアリールまたはアルアルキルである。）から選択され；
残りのＲ1およびＲ2はいずれも独立して、置換されていない、またはＳＯ3 -で置換されている、Ｃ1−Ｃ10アルキルまたはアリールまたはアルアルキルから選択され；
残りのＲ7はいずれも、Ｈ、および置換されていない、またはＳＯ3 -で置換されている、Ｃ1−Ｃ10アルキルまたはアリールまたはアルアルキルから選択される。］
（ただし、窒素およびリンおよび硫黄から選択される少なくとも２個の正に帯電した原子は、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、およびＲ7基に存在し；そして
Ｒ 7 の第一原子 ( これによって、残りの分子に結合する ) は、ＨまたはＣである。）
を有するシアニン色素を提供する。
【０００４】
好ましくは、該シアニン色素は、構造（２）：
【化５】
を有する。
【０００５】
好ましくは、該シアニン色素は、＋２〜＋６の正の総電荷を有する。該色素の総電荷は、正に帯電した窒素(またはリンもしくは硫黄)原子の数からスルホネート(またはカルボキシルもしくはホスフェート)基の数を引いたものとみなされ得る。従って、例えば、３個の正に帯電した窒素原子および０または２つまたは４つのスルホネート基を有する色素は、各々、＋３または＋１または−１の総電荷を有するであろう。原子または基が帯電する度合いは、その環境のpＨに依存し得る。
【０００６】
好ましくは、反応性基または官能基は、構造：
−Ｌ−Ｑ
［式中、
Ｌは、リンカーであり；および
Ｑは、反応性基または官能基である。］
として存在する。該色素の反応性基は、標的分子の官能基と反応させることができ；または該色素の官能基は、標的分子の反応性基と反応させることができ；そのことによって、その標的分子は、該色素で標識化されるようになる。好ましくは、Ｑは、第一級アミン、第二級アミン、ヒドラジン誘導体、ヒドロキシルアミン誘導体、およびピラゾロンから選択される官能基である。あるいはまた、官能基は、スルフヒドリル、カルボキシル、ヒドロキシル、チオホスフェート、イミダゾール、並びにアルデヒドおよびケトンが含まれるカルボニルから選択され得る。
【０００７】
好ましくは、反応性基は、スクシンイミジルエステル、イソチオシアネート、ジクロロトリアジン、イソシアネート、ハロアセトアミド、マレイミド、ハロゲン化スルホニル、酸ハロゲン化物、アルキルイミドエステル、アリールイミドエステル、カルボジイミド、ホスホルアミダイト、無水物、およびアシルアジドから選択される。
【０００８】
これらの官能基および反応性基により、本発明のシアニン色素を標的物質と結合させて、コンジュゲートを形成する。適当な標的物質には、抗体、抗原、タンパク質、炭水化物、脂質、ヌクレオチド、核酸、ポリマー粒子、またはガラスビーズが含まれ得る。従って、例えば、上述した好ましい官能基を有するシアニン色素は、炭水化物と反応させて、それと共にコンジュゲートを形成するのに適当である。
【０００９】
Ｌは、Ｃ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、およびＰから選択される１−６０個の鎖原子を含み得るリンカー、例えば、１個またはそれ以上のＮ、Ｏ、Ｓ、またはＰ原子が組み込まれている１−３０個の炭素原子からなる直鎖である。例えば、そのリンカーは、
【化６】
［式中、
ｘは、１−３０、好ましくは、１−１０であり；
ｐは、１−５であり；
ｑは、０−５であり；および
ｙは、１−５である。］
であり得る。
【００１０】
本発明のシアニン色素に存在するのは、１−５個の正に帯電した窒素またはリンまたは硫黄原子が組み込まれている分枝鎖または直鎖である。(これらの正に帯電したＮまたはＰまたはＳ原子の幾つかまたは全ては、リンカー基であるＬに存在し得る)。好ましくは、各々の正に帯電した原子は、第四級アンモニウム基により与えられるか、あるいはまた、プロトン化された第三級アミノ基、グアニジニウム基、イミダゾール基、またはピリジニウム基により与えられる窒素原子である。正に帯電したＰおよびＳ原子は、各々、ホスホニウムイオンおよびスルホニウムイオンにより与えられ得る。好ましくは、１個〜５個の正に帯電した窒素原子が組み込まれている分枝鎖または直鎖は、鎖炭素原子が６０個まであって、構造：
−(ＣＨ2)mＮ+Ｒ10Ｒ10Ｒ11；または
−ＣＨ2−Ｐh−Ｎ+Ｒ10Ｒ10Ｒ11
［式中、
ｍは、１〜４であり；
Ｒ10は、Ｃ1−Ｃ10アルキルであり；および
Ｒ11は、Ｃ1−Ｃ10アルキルまたは−(ＣＨ2)mＮ+Ｒ10Ｒ10Ｒ11である。］
を有する。
【００１１】
または、リンカー基であるＬおよび／または正に帯電した窒素原子が組み込まれている鎖は、１つまたはそれ以上の天然アミノ酸残基または人工アミノ酸残基を含んでなり得る。幾つかの数、例えば、１−２０のリジン残基を導入して、所望ならば、ε−アミノ基を四級化するのは簡単な事である。そのようなリンカーは、−(ＣＯ.ＮＨＷ)r（ここで、ｒは、１〜６であるのが好ましく；およびＷは、アミノアルキル、または−(ＣＨ2)4ＮＨ2もしくは−(ＣＨ2)4Ｎ+Ｒ10 J（ここで、Ｒ10は、Ｃ1−Ｃ10アルキルである。）といったような四級化されたアミノアルキルである。）という分属を含み得る。
【００１２】
少なくとも２個の正に帯電した窒素またはリンまたは硫黄原子、および好ましくは、少なくとも１つの反応性基または官能基は、該色素のコア構造に結合した側基に存在する。それらは、同じ基または異なる基 Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、およびＲ7に位置し得る。
【００１３】
好ましくは、該シアニン色素は、構造（２）：
［式中、
ＸおよびＹは、Ｃ(ＣＨ3)2であり；
ｎは、１または２であり；
Ｒ1は、−(ＣＨ2)5−ＣＯＯＨであり；
Ｒ2は、−(ＣＨ2)3−Ｎ+(ＣＨ3)2−(ＣＨ2)3−Ｎ+(ＣＨ3)2(Ｃ2Ｈ5)であり；
および
Ｒ3およびＲ4は、Ｈである。］
を有する。
【００１４】
以下の実験セクションに記載する色素は、該色素の正の総電荷を増大させるという具体的な目的のために結合した第四級アンモニウムイオンを有する。該色素は、ＤＮＡまたは他の生体分子を活性エステル誘導体によって標識化する際のそれらの使用を可能とするよう、カルボン酸として製造されている。正の電荷の増大は、ある具体的な適用におけるＤＮＡとの静電的相互作用において、および他の目的のために特定の電荷を有する標識化ヌクレオチドを与える際に有益となり得る。少なくとも１つのスルホン酸基を＋３(またはそれ以上)の色素のいずれかに加えて、正もしくは負の総電荷を有し得る色素、または中性であり得る色素、並びに改良された写真安定性および鮮明度を有し得る色素を与えることができることもまた予想される。この改良は、染料での総電荷が重要なものとなる、ＷＯ ９６／３３４０６に記載されている差ゲル電気泳動技術のような適用において有用である。
【００１５】
カルボン酸誘導体を、１,３−ジアミノプロパンまたはエチレンジアミンのようなジアミン種と反応させて、第一級アミン官能基を得ることができ；または保護されたヒドラジンと反応させて、対応するヒドラジンを生成することができ、これを脱保護することができる(例えば、炭化水素に結合させるために)。過剰の第四級アミノ基の添加およびスルホン酸基の使用の制御により、６まで、またはさらにそれ以上の範囲にわたる正の総電荷を有する色素の範囲とすることができる。
【００１６】
Ｃy３(ｎ＝１)およびＣy５(ｎ＝２)およびＣy７(ｎ＝３)色素には、マルチプレキシング(multiplexing)、すなわち、同時分析のために様々な色素で標識化した標的の混合物の使用を可能とするというさらなる利点がある。この概念はまた、インドール、チアゾール、およびオキサゾール誘導体の間で中間誘導体を変更することにより、そして色素への融合芳香族環の数を変えることにより増大させることもできる。
【００１７】
化学的方法
このセクションは、２〜６の正の電荷を有するシアニン色素を製造する際に予想される化学を示し、この大部分は特許請求の範囲に包含されるが、全てが包含されるというわけではない。番号を付けたパラグラフは各々、円内に＋として示す単一の正の電荷を有する、長方形として示すシアニン色素の一般図で始まる。その長方形の２つの角に、少なくとも１つの正の電荷および／または少なくとも１つの官能基もしくは反応性基であるＱもしくはＱ'を含んでなり得る曲線をつなぎ；これらの曲線は、上および特許請求の範囲に示した構造（１）および（２）における、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、およびＲ7、最も通常は、Ｒ1およびＲ2に対応する。該シアニン色素の幾つかは製造されており、以下の例に記載し；他のものは、準備中であるか、または予想される。
【００１８】
＋２の色素
１．
【化７】
該色素は、固有の＋１の電荷を持つ。もう１つの＋の電荷は、一方の色素Ｎ原子に結合した鎖上にある。官能基または反応性基であるＱは、他方の色素Ｎ原子に結合した鎖の末端にある。
【００１９】
例：
【化８】
【００２０】
２．
【化９】
該色素は、固有の＋１の電荷を持つ。もう１つの＋の電荷は、一方の色素Ｎ原子に結合した鎖上にある。官能基または反応性基であるＱは、同じ鎖の末端にある。
【００２１】
例：
【化１０】
【００２２】
＋２の中間体の合成：
【化１１】
この中間体を使用して、保護された色素を製造する。塩酸中での加水分解によりフタルイミドを除去して、アミン色素を得る。
【００２３】
３．
【化１２】
【００２４】
＋１のモノ反応性色素をリンカーで伸張すると、それ自体が第二の＋の電荷を含む。可能な例は、次の通りである：
【化１３】
【００２５】
考案された＋１のリンカーの合成：
【化１４】
【００２６】
＋３の色素
これらの例は、＋２の色素に関する例と類似している。
１．
【化１５】
該色素は、固有の＋１の電荷を持つ。２つの余分な＋の電荷は、一方の色素Ｎ原子に結合した鎖上にある。官能基または反応性基であるＱは、他方の色素Ｎ原子に結合した鎖の末端にある。
【００２７】
例：
【化１６】
【００２８】
２．
【化１７】
該色素は、固有の＋１の電荷を持つ。色素Ｎ原子に結合した各々の鎖上に、１つの余分な＋の電荷がある。官能基または反応性基であるＱは、これらの鎖の一方の末端にある。
【００２９】
例：
【化１８】
【００３０】
３．
【化１９】
該色素は、固有の＋１の電荷を持つ。他の２つの＋の電荷は両方とも、色素Ｎ原子のない一方の鎖上にあり；この鎖にはまた、官能基または反応性基であるＱも含まれる。これは、官能基または反応性基を含む＋３に帯電した中間体を必要とする。
【００３１】
例：
【化２０】
【００３２】
４．＋１のリンカーの付加による＋２の色素の＋３の色素への転換
【化２１】
【００３３】
例：
【化２２】
【００３４】
５．＋２のリンカーの付加による＋１の色素の＋３の色素への転換
【化２３】
【００３５】
例：
【化２４】
【００３６】
＋４の色素
１．＋２のリンカーの付加による＋２の色素の＋４の色素への転換
【化２５】
【００３７】
例：
【化２６】
【００３８】
２．＋３のリンカーの付加による＋１の色素の＋４の色素への転換
【化２７】
【００３９】
例：
【化２８】
【００４０】
３．
【化２９】
反応性基をもつ＋２の中間体および＋３の中間体を必要とする。
【００４１】
例：
【化３０】
【００４２】
＋５および＋６の色素
１．＋３のリンカーの付加による＋２の色素の＋５の色素への転換
【化３１】
【００４３】
２．＋４のリンカーの付加による＋１の色素の＋５の色素への転換
【化３２】
【００４４】
＋４のリンカー：
【化３３】
【００４５】
３．＋４のリンカーの付加による＋２の色素の＋６の色素への転換
【化３４】
【００４６】
ポリ−リジンを基礎とするリンカー鎖
【化３５】
【化３６】
もまた有用である。
【００４７】
保持体上でオリゴマーを構築し、＋１の色素に結合させて、ｎ＋の色素を得る：
【化３７】
【００４８】
実施例１
＋３に帯電した色素、＋１に帯電したジアミンリンカーが含まれる(ＢＯＣ−保護)
ｉ）＋２に帯電したカルボキシＣy３色素の製造
【化３８】
【００４９】
Ｎ−(３−ブロモプロピル)トリエチルアンモニウムブロミド［１.１］
１,３−ジブロモプロパン(２０.０ｇ、１００mmol)およびトリエチルアミン(５.０６ｇ、５０mmol)を無水トルエン(５０ml)中で混合した。この溶液を窒素雰囲気下に１００℃で４時間加熱すると、この間に、濃白色の固体が沈殿した。次いで、その混合物を冷却し、固体を濾過により集め、トルエンおよびエーテルで洗浄し、減圧下に５０℃で乾燥させて、標記化合物［１.１］５.０ｇ(３６％)を得た。
δH（３００ＭＨz，ＤＭＳＯ）ブロードピーク。１.１７(９Ｈ，３ｘ Ｎ+−ＣＨ2−ＣＨ 3)、２.１５(２Ｈ，ＢrＣＨ2ＣＨ 2ＣＨ2−)、３.２６(８Ｈ，４ｘ Ｎ+−ＣＨ 2)、３.６２(２Ｈ，Ｂr−ＣＨ 2−)。
【００５０】
１−((３−トリエチルアンモニウム)プロピル)−２,３,３−トリメチルインドリウムジブロミド［１.２］
新たに蒸留した２,３,３−トリメチルインドレニン(０.８ｇ、５mmol)およびＮ−(３−ブロモプロピル)トリエチルアンモニウムブロミド［１.１］(１.５２ｇ、５mmol)を混合して、アルゴン雰囲気下に置いた。次いで、その混合物を１４０℃で１.５時間加熱すると、深紅色の粘性融解物を得、これを冷却してガラス上で凝固させた。それをジエチルエーテルの下に粉末となるまで粉砕し、これを濾過により集め、沸騰しているアセトンでトリチュレートし、メタノール／アセトンから再結晶化させて、標記化合物［１.２］を淡桃色の粉末７９５mg(３４％)として得た。
δH（３００ＭＨz，ＤＭＳＯ）１.２２(９Ｈ，ｔ，Ｊ ６.６Ｈz，３ｘ Ｎ+−ＣＨ2−ＣＨ 3)、１.５５(６Ｈ，ｓ，インドール Ｃ３Ｍe2)、２.２１(２Ｈ，ｍ，−ＣＨ2ＣＨ 2ＣＨ2−)、２.９２(３Ｈ，ｓ，インドール Ｃ２−Ｍe)、３.２７(６Ｈ，ｑ，Ｊ ６.６Ｈz，３ｘ Ｎ+−ＣＨ 2−ＣＨ3)、３.５１(２Ｈ，〜ｔ，−ＣＨ 2−ＮＥt3)、４.５７(２Ｈ，〜ｔ，インドール Ｎ+−ＣＨ 2−)、７.６４(２Ｈ，ｍ)、７.８６(１Ｈ，ｄ，Ｊ ６.５Ｈz)、８.１２(１Ｈ，ｄ，Ｊ ７.３Ｈz)。
【００５１】
１−(５−カルボキシペンチル)−２−(Ｎ−フェニル−２−アミノビニル)−３,３−ジメチルインドリウムブロミド［１.３］
１−(５−カルボキシペンチル)−２,３,３−トリメチルインドリウムブロミド(１.７７ｇ、５mmol)およびＮ,Ｎ'−ジフェニルホルムアミジン(１.９６ｇ、１０mmol)を酢酸(１５ml)中で混合した；次いで、その結果得られた混合物を還流温度で加熱した。その反応をＵＶ／ＶＩＳ分光法(メタノール溶液、生成物の吸光度λmax３９８nm)およびＴＬＣ(シリカ。メタノール ２０：ジクロロメタン ８０；生成物は黄色の縞として流れる、Ｒf ０.１−０.２５)によりモニターした。次いで、２.５時間後、橙色−赤色の溶液を１６時間放置して冷却した後、溶媒を減圧下に除去した。残留物をフラッシュクロマトグラフィー(シリカ。５−２０％ メタノール／ジクロロメタン)により精製して、乾燥させた後、標記化合物［１.３］１.５ｇ(６６％)を黄色−橙色の泡状物質として得た。
ＵＶ／ＶＩＳ λmax（ＭeＯＨ）３９８nm
δH（３００ＭＨz，ＣＤＣl3）１.５３(２Ｈ，ｍ)、１.６３(６Ｈ，ｓ，インドール Ｃ３ Ｍe2)、１.７０(２Ｈ，ｍ)、１.７８(２Ｈ，ｍ)、２.３５(２Ｈ，ｔ，Ｊ ７.０Ｈz，−ＣＨ 2−ＣＯ2Ｈ)、３.９９(２Ｈ，ｔ，Ｊ ７.４Ｈz，インドール Ｎ+−ＣＨ 2−)、６.３(２Ｈ，ブロード，ＮＨ＋ＣＯ2Ｈ)、７.０−７.４５(１０Ｈ，ｍ)、８.４０(２Ｈ，ｄ，Ｊ １２.５)。
【００５２】
１−(カルボキシペンチル)−１'−((トリエチルアンモニウム)プロピル)インドカルボシアニンジブロミド［１.４］
１−(５−カルボキシペンチル)−２−(Ｎ−フェニル−２−アミノビニル)−３,３−ジメチルインドリウムブロミド［１.３］(２２９mg、０.５mmol)を無水ピリジン(５ml)に溶解して、橙色の溶液を得た。これに無水酢酸(０.５ml)を加えて、その混合物を５分間撹拌した。次いで、１−((３−トリエチルアンモニウム)プロピル)−２,３,３−トリメチルインドリウムジブロミド［１.２］(２３１mg、０.５mmol)を加え、その混合物を一時的に温めて、固体の溶解を助けた。間もなく、深紅色−桃色になった。
２時間撹拌した後、溶媒を減圧下に除去して、残留物を高真空下に乾燥させた。次いで、それをフラッシュクロマトグラフィー(グレードＩの中性アルミナ。５−２０％ メタノール／クロロホルム)により精製し、主要な桃色の成分を単離して、標記色素［１.４］２７８mgを赤色の固体として得た。
ＴＬＣ（Ｃ−１８シリカ。酢酸、５０：水、４５：メタノール、５：Ｒfピンクスポット０.５５)
ＵＶ／ＶＩＳ λmax（ＭeＯＨ）５４８nm。
蛍光（ＭeＯＨ）λex ５４８nm；λem ５６４nm。
δH（３００ＭＨz，ＣＤ3ＯＤ）１.１７(９Ｈ，ｔ，Ｊ ６.５Ｈz，３ｘ Ｎ+−ＣＨ2ＣＨ 3)、１.３２(２Ｈ，ｍ)、１.７２−１.８８(１６Ｈ，ｍ)、２.２(２Ｈ，ｔ，Ｊ ７.３Ｈz，−ＣＨ 2ＣＯ2Ｈ＋２Ｈ，ブロード，Ｎ+−ＣＨ2ＣＨ 2ＣＨ2ＮＥt3)、３.３７(６Ｈ，ｑ，Ｊ ６.５，３ｘ Ｎ+−ＣＨ 2ＣＨ3)、３.５０(２Ｈ，ｍ，−ＣＨ 2ＮＥt3)、４.１９＋４.２６(２Ｈ，ｔ，Ｊ ７.７Ｈz＋２Ｈ，ｔ，Ｊ ７.３Ｈz，２ｘ インドール Ｎ+−ＣＨ 2−)、４.５９(１Ｈ，ブロード，−ＣＯ2Ｈ)、６.５５(１Ｈ，ｄ，Ｊ １３.６Ｈz，メチン＝ＣＨ−)、６.６１(１Ｈ，ｄ，Ｊ １３.２Ｈz，２ｘ メチン＝ＣＨ−インドール)、７.２８−７.４９(６Ｈ，ｍ)、７.５４-５８(２Ｈ，ｍ)、８.５７(１Ｈ，〜ｔ，Ｊ〜１３.４Ｈz，＝ＣＨ−ＣＨ＝ＣＨ−)。
【００５３】
ii）＋１に帯電したジアミンリンカーの製造(ＢＯＣ−保護)
【化３９】
Ｎ−(ｔ−ブトキシカルボニル)−Ｎ−(３−ジメチルアミノ)プロピルアミン［１.５］
３−ジメチルアミノ−１−プロピルアミン(２.０４ｇ、２０mmol)をジクロロメタン(５ml)と混合した；氷水浴を使用して、その結果得られた溶液を０℃まで冷却した。これに、ジクロロメタン(１５ml)中のジ炭酸ジ−ｔ−ブチル(４.４ｇ、２０mmol)の溶液を加えた：次いで、その混合物を室温まで温めた。２時間後、その溶液を水で２回洗浄した後、乾燥させ(ＭgＳＯ4)、濾過し、溶媒を減圧下に蒸発させて、無色の油状物質を得た。高真空で乾燥させることにより、標記化合物３.０７ｇ(７６％)を得た。
δH（３００ＭＨz，ＣＤＣl3）１.４４(９Ｈ，ｓ)、１.６４(２Ｈ，クインテット，Ｊ ６.８)、２.２１(６Ｈ，ｓ)、２.３１(２Ｈ，ｔ，Ｊ ７.０)、３.１７(２Ｈ，ブロードカルテット)、および５.１５(１Ｈ，ブロードｓ)。
【００５４】
Ｎ−(フタルイミドプロピル)−Ｎ−((ｔ−ブトキシカルボニルアミノ)プロピル)−Ｎ,Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド［１.６］
Ｎ−(ｔ−ブトキシカルボニル)−Ｎ−(３−ジメチルアミノ)プロピルアミン［１.５］(３.０３ｇ、１５mmol)および３−(ブロモプロピル)フタルイミド(４.０２ｇ、１５mmol)を無水トルエン(８ml)に溶解した。その結果得られた溶液を５０℃で１６時間加熱すると、この間に、ガラス性樹脂がフラスコの内側に形成された。その混合物を冷却して、液をデカントした；残留物をエーテルでトリチュレートして、ガラス性粉末を得た。高真空下で乾燥させることにより、標記化合物［１.６］４.１２ｇ(５８％)を得た。
δH（３００ＭＨz，ＣＤ3ＯＤ）１.４２(９Ｈ，ｓ)、１.９１(２Ｈ，ｍ)、２.１８(２Ｈ，ｍ)、３.０７(６Ｈ，ｓ)、３.１２(２Ｈ，ｔ，Ｊ ６.６)、３.３−３.５(４Ｈ，ｍ)、３.８０(２Ｈ，ｔ，Ｊ ６.４)、および７.８０−７.９０(４Ｈ，ｍ)。
【００５５】
Ｎ−(３−アミノプロピル)−Ｎ−((ｔ−ブトキシカルボニルアミノ)プロピル)−Ｎ,Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド［１.７］
Ｎ−(フタルイミドプロピル)−Ｎ−((ｔ−ブトキシカルボニルアミノ)プロピル)−Ｎ,Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド［１.６］(４.１ｇ、０.８７mmol)をエタノール性メチルアミン(３３重量％、８.０２Ｍ、１０ml)に溶解した。無色の溶液を室温で３日間撹拌すると、その間に、濃白色の沈殿が形成された(Ｎ,Ｎ'−ジメチルフタルアミド)。その混合物を濾過した；固体を少量の冷エタノールで洗浄した。濾液を減圧下に蒸発させて、油状物質を得た；これをエーテルでトリチュレートし、高真空下に乾燥させて、標記化合物［１.７］を泡状物質として得た。さらに精製することなく使用した。
δH（３００ＭＨz，ＣＤ3ＯＤ）１.４３(９Ｈ，ｓ)、１.８８−２.００(４Ｈ，ｍ)、２.７５(２Ｈ，ｔ，Ｊ ６.８)、３.１０(６Ｈ，ｓ)、３.１５(２Ｈ，ｔ，Ｊ ６.６)、および３.３−３.５(４Ｈ，ｍ)。少量のＮ,Ｎ'−ジメチルフタルアミドもまた見られる。
【００５６】
iii）＋２に帯電したＣy３カルボキシ色素［１.４］の＋１に帯電したリンカー［１.７］への結合
【化４０】
色素［１.４］(３７mg、５０μmol)およびＯ−(Ｎ−スクシンイミジル)−Ｎ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート(＝ＴＳＴＵ、１７mg、５５μmol)を無水アセトニトリル(１ml)に溶解した。次いで、その結果得られた深桃色−赤色の溶液に、Ｎ,Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン(１０μl、５７μmol)を加えて、ＴＬＣ(シリカ。メタノール ５０：水 ５０。ＮaＢrで飽和した。遊離酸［１.４］ Ｒf＝０.４ → 活性エステル Ｒf＝０.５)でモニターしながら、その混合物を室温で撹拌した。活性化が完了したら(１時間)、ＴＬＣ(上記)がほぼ完全な変換を示すまで(活性エステル Ｒf＝０.５ → ［１.８］ Ｒf＝０.３５)、アミン［１.７］を少しずつ加えた。次いで、溶媒を減圧下に蒸発させた；残留物をエーテルでトリチュレートして、真鍮色の粉末を得た。分取ＴＬＣ(シリカ。濃縮ゾーンをもつ２０×２０×０.１cm。メタノール ５０：水 ５０。ＮaＢrで飽和した)により２回精製した。主要な桃色のバンドを擦り取って、溶離液で抽出した後、メタノールで抽出した。溶媒を減圧下に除去して、残留物を乾燥させた。クロロホルムを使用して、生成物である色素をＮaＢrから抽出した：再び溶媒を減圧下に除去して、標記化合物［１.８］２４mgを得た。
ＵＶ／ＶＩＳ λmax（ＭeＯＨ）；５４８nm。
δH（３００ＭＨz，ＣＤ3ＯＤ）１.３４(９Ｈ，ｔ，Ｊ ７.２)、１.４１(９Ｈ，ｓ)、１.５８(２Ｈ，ｍ)、１.６７−２.０３(２０Ｈ，ｍ，gem−ジメチル基に関する２ｘｓが含まれる)、２.２５−２.３１(４Ｈ，ｍ)、３.０９(６Ｈ，ｓ)、３.１３(２Ｈ，ｔ，Ｊ ６.３)、３.２６(２Ｈ，ｔ，Ｊ ６.３)、３.３−３.５(１０Ｈ，ｍ，ＣＨＤ2ＯＤにより部分的に不明瞭である)、３.６０(２Ｈ，app.t)、４.２４(２Ｈ，ブロードｔ，Ｊ ７.６)、４.３３(２Ｈ，ブロードｔ，Ｊ ７.４)、６.９０(１Ｈ，ｄ，Ｊ １３.６)、６.９２(１Ｈ，ｄ，Ｊ １３.２)、７.２８−７.５８(８Ｈ，ｍ)、および８.５８(１Ｈ，ｔ，Ｊ １３.４)。
【００５７】
遊離アミンの脱保護は、メタノール／クロロホルム中のトリフルオロ酢酸を使用して成し遂げられる(方法の詳細に関しては、実施例２を参照)。
【００５８】
実施例２
＋３に帯電した色素、＋２に帯電したジアミンリンカーが含まれる(ＢＯＣ−保護)
ｉ）＋２に帯電したジアミンリンカーの製造(ＢＯＣ−保護)
【化４１】
【００５９】
Ｎ−(３−ジメチルアミノ)フタルイミド［２.１］
３−ジメチルアミノ−１−プロピルアミン(５.１ｇ、５０mmol)および無水フタル酸(８.１５ｇ、５５mmol)をクロロホルム(１００ml)と混合した；その結果得られた混合物を還流下に４.５時間加熱した(ＣaＣl2防湿管)。冷却した後、その反応混合物を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で２回洗浄した後、水で洗浄した。有機溶液を乾燥させ(ＭgＳＯ4)、濾過し、溶媒を減圧下に蒸発させて、淡黄色の油状物質を得た。高真空下に乾燥させた後、標記化合物［２.１］１０.２ｇ(８８％)を得た。
δH（３００ＭＨz，ＣＤＣl3）１.８４(２Ｈ，クインテット，Ｊ ７.２)、２.２１(６Ｈ，ｓ)、２.３４(２Ｈ，ｔ，Ｊ ７.３)、３.７５(２Ｈ，ｔ，Ｊ ７.２)、７.７０−７.７４(２Ｈ，ｍ)、および７.８２−７.８６(２Ｈ，ｍ)。
【００６０】
Ｎ−(３−フタルイミドプロピル)−Ｎ−(３−ブロモプロピル)−Ｎ,Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド［２.２］
Ｎ−(３−ジメチルアミノ)フタルイミド［２.１］(２.３２ｇ、１０mmol)および１,３−ジブロモプロパン(４.０４ｇ、２０mmol)をトルエン(１０ml)に溶解して、透明な溶液を得た。これを８０℃まで温めて、５時間撹拌した。白色の沈殿が形成された。冷却した後、この固体を集め、トルエンおよびエーテルで洗浄し、真空下に乾燥させて、生成物３.５５ｇ(８２％)を得た。
δH（３００ＭＨz，Ｄ2Ｏ）２.０８(２Ｈ，ｍ)、２.２０(２Ｈ，ｍ)、２.９７(６Ｈ，ｓ)、３.２７−３.４０(６Ｈ，ｍ)、３.６３(２Ｈ，ｔ，Ｊ ６.６)、および７.６６−７.７３(４Ｈ，ｍ)。
【００６１】
Ｎ−(３−フタルイミドプロピル)−Ｎ'−(３−(ｔ−ブトキシカルボニルアミノ)プロピル)−Ｎ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'−テトラメチル−１,３−プロパンジアンモニウムジブロミド［２.３］
Ｎ−(３−フタルイミドプロピル)−Ｎ−(３−ブロモプロピル)−Ｎ,Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド［２.２］(４.３４ｇ、１０mmol)およびＮ−(ｔ−ブトキシカルボニル)−Ｎ−(３−ジメチルアミノ)プロピルアミン［１.５］(２.０２ｇ、１０mmol)をアセトニトリル(２０ml)と混合して、撹拌し続けた。その混合物を６０℃まで加熱したが、全ての固体が溶解したわけではなかった。２０ml過剰に加えたことになるまで、アセトニトリルをさらに少しずつ加えると、全ての固体が溶解した。この溶液を６０℃で１６時間反応させた。この時間の後に、その溶液を冷却して、溶媒を減圧下に蒸発させた；その結果得られた樹脂性泡状物質をエーテルでトリチュレートした後、高真空下に乾燥させて、標記化合物６.４ｇ(１００％)を粉末として得た。
δH（３００ＭＨz，ＣＤ3ＣＮ）０.８６(９Ｈ，ｓ)、１.４５(２Ｈ，ｍ，ＣＨＤ2ＣＮにより部分的に不明瞭である)、１.６６(２Ｈ，ｍ)、２.０８(２Ｈ，ｍ)、２.５８−２.７０(オーバーラッピング６Ｈ，ｓ＋６Ｈ，ｓ＋２Ｈ，カルテット)、２.８６−３.０６(８Ｈ，ｍ)、３.２２(２Ｈ，ｔ，Ｊ ６.２)、５.７０(１Ｈ，ブロードapp.t)、および７.２３−７.３２(４Ｈ，ｍ)。
【００６２】
Ｎ−(３−アミノプロピル)−Ｎ'−(３−(ｔ−ブトキシカルボニルアミノ)プロピル)−Ｎ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'−テトラメチル−１,３−プロパンジアンモニウムジブロミド［２.４］
Ｎ−(３−フタルイミドプロピル)−Ｎ'−(３−(ｔ−ブトキシカルボニルアミノ)プロピル)−Ｎ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'−テトラメチル−１,３−プロパンジアンモニウムジブロミド［２.３］(６.４ｇ、１０mmol)をエタノール性メチルアミン(３３重量％、８.０２Ｍ、１０ml)と混合して、撹拌し続けた。これでは、全てを溶解するのが遅いので、試薬をさらに１０ml加えた；暫くした後、全ての樹脂性塊状物質が溶解した。次いで、その混合物を３日間室温で撹拌しておいた。この時間の間に、白色の固体が沈殿した(Ｎ,Ｎ'−ジメチルフタルアミド)。これを濾過により除去した後、少量の冷エタノールで濯いだ。濾液を減圧下に蒸発させた；残留物をエタノールに２回再溶解して、２回再蒸発させた。最終残留物をエーテルでトリチュレートし、高真空下に乾燥させて、標記化合物を白色の固体として得た(非常に潮解性であった)。これをアルゴン下に保存して、さらに精製することなく使用した。
δH（３００ＭＨz，ＣＤ3ＯＤ）１.３４(９Ｈ，ｓ)、１.８２−１.９３(４Ｈ，ｍ)、２.２８−２.３９(２Ｈ，ｍ)、２.６８(２Ｈ，ｔ，Ｊ ６.６)、３.０２−３.１８(１４Ｈ，ｍ)、および３.４２(８Ｈ，app.クインテット)。少量のＮ,Ｎ'−ジメチルフタルアミドもまた明白である。
【００６３】
ii）＋１に帯電したＣy３カルボキシ色素の、＋２に帯電したリンカー［２.４］への結合
【化４２】
１−プロピル−１'−(カルボキシペンチル)インドカルボシアニン色素(２５mg、約５０μmol)を無水アセトニトリル(２ml)に室温で撹拌しながら溶解した。その結果得られた桃色−赤色の溶液に、Ｏ−(Ｎ−スクシンイミジル)−Ｎ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート(＝ＴＳＴＵ、１８mg、６０μmol)およびＮ,Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン(５μl、６０μmol)を加えた。活性エステルへの変換をＴＬＣ(シリカ。メタノール ２０：クロロホルム ８０。カルボキシ色素 Ｒf＝０.３ → 活性エステル Ｒf＝０.５)によりモニターした。
【００６４】
１時間後、ＴＬＣ(シリカ。メタノール ５０：水 ５０。ＮaＢrで飽和した。活性エステル Ｒf＝０.５５ → ［２.５］ Ｒf＝０.４５)でモニターしながら、アミン［２.４］を少しずつ加えた。反応が完了したと思われたら、溶媒を減圧下に除去し、残渣をエーテルでトリチュレートして、高真空に乾燥させた。
【００６５】
粗製の生成物を分取ＴＬＣ(シリカ、濃縮ゾーンをもつ２０×２０×０.２cm。メタノール ５０：水 ５０。ＮaＢrで飽和した。メタノール溶液中に充填した。)により精製した。主要な桃色のバンドを擦り取って、溶離液で抽出した後、メタノールで抽出した。溶媒を減圧下に除去して、残留物を乾燥させた。クロロホルムを使用して、生成物である色素をＮaＢrから抽出した；再び溶媒を減圧下に除去して、標記化合物［２.５］３０mgを得た。その化合物を更に特性決定しなかったが、アミン脱保護に付した。
ＵＶ／ＶＩＳ λmax（ＭeＯＨ）；５４８nm。
【００６６】
遊離アミノ色素を得るためのアミノ基の脱保護
化合物［２.５］(３０mg)を１０％ メタノール／クロロホルム(２ml)に溶解した；次いで、トリフルオロ酢酸(０.５ml)を加えて、その混合物を室温で撹拌した。脱保護をＴＬＣ(シリカ。メタノール ５０：水 ５０。ＮaＢrで飽和した。［２.５］ Ｒf＝０.５５ → ［２.６］ Ｒf＝０.７)によりモニターした。３時間後、反応を停止させて、溶媒を減圧下に除去した。残留物をエーテルでトリチュレートして、高真空下に乾燥させた。
【００６７】
分取ＴＬＣ(シリカ、濃縮ゾーンをもつ２０×２０×０.２cm。メタノール ５０：水 ５０。ＮaＢrで飽和した。メタノール溶液中に充填した。)により精製した。主要な桃色のバンドを擦り取って、溶離液で抽出した後、メタノールで抽出した。溶媒を減圧下に除去して、残留物を乾燥させた。活性炭のフラッシュプラグを使用して、生成物である色素をＮaＢrから分離した。粗製の色素を水に充填し、そのプラグを水で溶出し、メタノールで溶出した後、メタノール １：クロロホルム １で溶出して、色素を除去した。溶媒を蒸発させ、残留物を高真空に乾燥させて、標記化合物［２.６］１０mgを得た。
δH（３００ＭＨz，ＣＤ3ＯＤ，広がったピーク）１.０８(３Ｈ，ｔ，Ｊ ７.３)、１.５２(２Ｈ，ｍ)、１.６−１.９(２０Ｈ，ｍ)、２.０２(２Ｈ，ｍ)、２.１４−２.３９(６Ｈ，ｍ)、３.０９(２Ｈ，app.t)、３.１８−３.３(１４Ｈ，ｍ)、３.４５−３.６５(８Ｈ，ブロードｍ)、４.１１−４.１９(４Ｈ，ｍ)、６.５１(１Ｈ，ｄ，Ｊ １３.２)、６.５３(１Ｈ，ｄ，Ｊ １３.６)、７.２８−７.５６(８Ｈ，ｍ)、および８.５５(１Ｈ，ｔ，Ｊ １３.４)。
ＵＶ／ＶＩＳ λmax（ＭeＯＨ）；５４８nm。
【００６８】
実施例３
＋４に帯電した色素、＋２に帯電したジアミンリンカーが含まれる(ＢＯＣ−保護)
【化４３】
＋２に帯電したカルボキシ色素［１.４］(３７mg、約５０μmol)およびＯ−(Ｎ−スクシンイミジル)−Ｎ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート(ＴＳＴＵ、１７mg、５５μmol)を無水アセトニトリル(１ml)に溶解して、深桃色−赤色の溶液を得た。これに、Ｎ,Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン(１０μl、５７μmol)を加えた；その結果得られた溶液を室温で撹拌しておいた。その反応をＴＬＣ(シリカ。メタノール ５０：水 ５０。ＮaＢrで飽和した。［１.４］ Ｒf＝０.４５ → 活性化エステル Ｒf＝０.６)によりモニターした。
【００６９】
１時間後、ＴＬＣ(上記。ＮＨＳエステル Ｒf＝０.６ → ［３.１］ Ｒf＝０.４)でさらにモニターしながら、＋２のアミンリンカー［２.４］を少しずつ加えた。反応が完了したようなら、溶媒を減圧下に除去した；残留物をエーテル下に一晩放置した。次いで、エーテルをデカントして、残留物を分取ＴＬＣ(シリカ、２０×２０×０.１cm。メタノール ５０：水 ５０。ＮaＢrで飽和した。メタノール溶液中に充填した。)により精製した。主要な桃色のバンドを擦り取って、溶離液で抽出した後、メタノールで抽出した。溶媒を減圧下に除去して、残留物を乾燥させた。クロロホルムを使用して、生成物である色素をＮaＢrから抽出した：再び溶媒を減圧下に除去して、標記化合物［３.１］４０mgを得た。
δH（３００ＭＨz，ＣＤ3ＯＤ）１.３４(９Ｈ，ｔ，Ｊ ７.２)、１.４２(９Ｈ，ｓ)、１.５７(２Ｈ，app.クインテット)、１.７０−２.０１(２０Ｈ，ｍ)、２.１９−２.３６(６Ｈ，ｍ)，３.１３−３.２０(６Ｈ，ｓ＋６Ｈ，ｓ＋２Ｈ，部分的に不明瞭である)、３.３(２Ｈ，ｍ，ＣＨＤ2ＯＤにより部分的に不明瞭である)、３.３３−３.６４(１６Ｈ，ｍ)、６.８７(１Ｈ，ｄ，Ｊ １３.６)、６.９０(１Ｈ，ｍ，Ｊ １３.２)、７.２８−７.５９(８Ｈ，ｍ)、および８.５８(１Ｈ，ｔ，Ｊ １３.４)。
ＵＶ／ＶＩＳ λmax（ＭeＯＨ）：５４８nm。
【００７０】
メタノール／クロロホルム中のトリフルオロ酢酸を使用して、遊離アミンの脱保護を成し遂げた(方法の詳細に関しては、実施例２を参照)。
シアニン色素群は、写真適用および生物学的適用の両方において、非常に鮮明で用途の広い色素群であることが証明されている。スルホン酸の添加、およびコンジュゲーションを目的とした官能性の付加は、それらが生物学的研究適用に関して十分に開発されることを可能としている。さらなる水溶性および鮮明度の向上を目的としたスルホン酸の添加により、該色素が全体的に中性または負に帯電するようになる。米国特許第５,２６８,４８６号および同第５,４８６,６１６号に記載されているように、塩基性シアニン構造は、＋１の正の総電荷、例えば、
【化３】
【０００２】
ある適用においては、正に帯電した原子を幾つか有する色素が有益なものとなり得る。本発明は、その必要性に応える。
【０００３】
本発明は、構造：
【化４】
点線は、各々の環が５個または６個の炭素原子をもち、その環にＲ3、Ｒ4、Ｒ5、およびＲ6が結合した、１つの環または２つもしくは３つの縮合環システムに必要な炭素原子を表し；
ＸおよびＹは独立して、Ｏ、Ｓ、およびＣＲ8 2（ここで、Ｒ8は、Ｃ1−Ｃ4アルキルである。）から選択され；
ｎは、１、２、または３であり；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、およびＲ7のうち少なくとも１つは、反応性基または官能基を含んでなり；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、およびＲ7のうち少なくとも１つには、１個〜５個の正に帯電した窒素またはリンまたは硫黄原子が組み込まれており；
残りのＲ3、Ｒ4、Ｒ5、およびＲ6はいずれも独立して、Ｈ、ＳＯ3 -、Ｃl、Ｂr、ＯＲ9、およびＳＲ9（ここで、Ｒ9は、Ｃ1−Ｃ10アルキルまたはアリールまたはアルアルキルである。）から選択され；
残りのＲ1およびＲ2はいずれも独立して、置換されていない、またはＳＯ3 -で置換されている、Ｃ1−Ｃ10アルキルまたはアリールまたはアルアルキルから選択され；
残りのＲ7はいずれも、Ｈ、および置換されていない、またはＳＯ3 -で置換されている、Ｃ1−Ｃ10アルキルまたはアリールまたはアルアルキルから選択される。］
（ただし、窒素およびリンおよび硫黄から選択される少なくとも２個の正に帯電した原子は、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、およびＲ7基に存在し；そして
Ｒ 7 の第一原子 ( これによって、残りの分子に結合する ) は、ＨまたはＣである。）
を有するシアニン色素を提供する。
【０００４】
好ましくは、該シアニン色素は、構造（２）：
【化５】
【０００５】
好ましくは、該シアニン色素は、＋２〜＋６の正の総電荷を有する。該色素の総電荷は、正に帯電した窒素(またはリンもしくは硫黄)原子の数からスルホネート(またはカルボキシルもしくはホスフェート)基の数を引いたものとみなされ得る。従って、例えば、３個の正に帯電した窒素原子および０または２つまたは４つのスルホネート基を有する色素は、各々、＋３または＋１または−１の総電荷を有するであろう。原子または基が帯電する度合いは、その環境のpＨに依存し得る。
【０００６】
好ましくは、反応性基または官能基は、構造：
−Ｌ−Ｑ
［式中、
Ｌは、リンカーであり；および
Ｑは、反応性基または官能基である。］
として存在する。該色素の反応性基は、標的分子の官能基と反応させることができ；または該色素の官能基は、標的分子の反応性基と反応させることができ；そのことによって、その標的分子は、該色素で標識化されるようになる。好ましくは、Ｑは、第一級アミン、第二級アミン、ヒドラジン誘導体、ヒドロキシルアミン誘導体、およびピラゾロンから選択される官能基である。あるいはまた、官能基は、スルフヒドリル、カルボキシル、ヒドロキシル、チオホスフェート、イミダゾール、並びにアルデヒドおよびケトンが含まれるカルボニルから選択され得る。
【０００７】
好ましくは、反応性基は、スクシンイミジルエステル、イソチオシアネート、ジクロロトリアジン、イソシアネート、ハロアセトアミド、マレイミド、ハロゲン化スルホニル、酸ハロゲン化物、アルキルイミドエステル、アリールイミドエステル、カルボジイミド、ホスホルアミダイト、無水物、およびアシルアジドから選択される。
【０００８】
これらの官能基および反応性基により、本発明のシアニン色素を標的物質と結合させて、コンジュゲートを形成する。適当な標的物質には、抗体、抗原、タンパク質、炭水化物、脂質、ヌクレオチド、核酸、ポリマー粒子、またはガラスビーズが含まれ得る。従って、例えば、上述した好ましい官能基を有するシアニン色素は、炭水化物と反応させて、それと共にコンジュゲートを形成するのに適当である。
【０００９】
Ｌは、Ｃ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、およびＰから選択される１−６０個の鎖原子を含み得るリンカー、例えば、１個またはそれ以上のＮ、Ｏ、Ｓ、またはＰ原子が組み込まれている１−３０個の炭素原子からなる直鎖である。例えば、そのリンカーは、
【化６】
ｘは、１−３０、好ましくは、１−１０であり；
ｐは、１−５であり；
ｑは、０−５であり；および
ｙは、１−５である。］
であり得る。
【００１０】
本発明のシアニン色素に存在するのは、１−５個の正に帯電した窒素またはリンまたは硫黄原子が組み込まれている分枝鎖または直鎖である。(これらの正に帯電したＮまたはＰまたはＳ原子の幾つかまたは全ては、リンカー基であるＬに存在し得る)。好ましくは、各々の正に帯電した原子は、第四級アンモニウム基により与えられるか、あるいはまた、プロトン化された第三級アミノ基、グアニジニウム基、イミダゾール基、またはピリジニウム基により与えられる窒素原子である。正に帯電したＰおよびＳ原子は、各々、ホスホニウムイオンおよびスルホニウムイオンにより与えられ得る。好ましくは、１個〜５個の正に帯電した窒素原子が組み込まれている分枝鎖または直鎖は、鎖炭素原子が６０個まであって、構造：
−(ＣＨ2)mＮ+Ｒ10Ｒ10Ｒ11；または
−ＣＨ2−Ｐh−Ｎ+Ｒ10Ｒ10Ｒ11
［式中、
ｍは、１〜４であり；
Ｒ10は、Ｃ1−Ｃ10アルキルであり；および
Ｒ11は、Ｃ1−Ｃ10アルキルまたは−(ＣＨ2)mＮ+Ｒ10Ｒ10Ｒ11である。］
を有する。
【００１１】
または、リンカー基であるＬおよび／または正に帯電した窒素原子が組み込まれている鎖は、１つまたはそれ以上の天然アミノ酸残基または人工アミノ酸残基を含んでなり得る。幾つかの数、例えば、１−２０のリジン残基を導入して、所望ならば、ε−アミノ基を四級化するのは簡単な事である。そのようなリンカーは、−(ＣＯ.ＮＨＷ)r（ここで、ｒは、１〜６であるのが好ましく；およびＷは、アミノアルキル、または−(ＣＨ2)4ＮＨ2もしくは−(ＣＨ2)4Ｎ+Ｒ10 J（ここで、Ｒ10は、Ｃ1−Ｃ10アルキルである。）といったような四級化されたアミノアルキルである。）という分属を含み得る。
【００１２】
少なくとも２個の正に帯電した窒素またはリンまたは硫黄原子、および好ましくは、少なくとも１つの反応性基または官能基は、該色素のコア構造に結合した側基に存在する。それらは、同じ基または異なる基 Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、およびＲ7に位置し得る。
【００１３】
好ましくは、該シアニン色素は、構造（２）：
［式中、
ＸおよびＹは、Ｃ(ＣＨ3)2であり；
ｎは、１または２であり；
Ｒ1は、−(ＣＨ2)5−ＣＯＯＨであり；
Ｒ2は、−(ＣＨ2)3−Ｎ+(ＣＨ3)2−(ＣＨ2)3−Ｎ+(ＣＨ3)2(Ｃ2Ｈ5)であり；
および
Ｒ3およびＲ4は、Ｈである。］
を有する。
【００１４】
以下の実験セクションに記載する色素は、該色素の正の総電荷を増大させるという具体的な目的のために結合した第四級アンモニウムイオンを有する。該色素は、ＤＮＡまたは他の生体分子を活性エステル誘導体によって標識化する際のそれらの使用を可能とするよう、カルボン酸として製造されている。正の電荷の増大は、ある具体的な適用におけるＤＮＡとの静電的相互作用において、および他の目的のために特定の電荷を有する標識化ヌクレオチドを与える際に有益となり得る。少なくとも１つのスルホン酸基を＋３(またはそれ以上)の色素のいずれかに加えて、正もしくは負の総電荷を有し得る色素、または中性であり得る色素、並びに改良された写真安定性および鮮明度を有し得る色素を与えることができることもまた予想される。この改良は、染料での総電荷が重要なものとなる、ＷＯ ９６／３３４０６に記載されている差ゲル電気泳動技術のような適用において有用である。
【００１５】
カルボン酸誘導体を、１,３−ジアミノプロパンまたはエチレンジアミンのようなジアミン種と反応させて、第一級アミン官能基を得ることができ；または保護されたヒドラジンと反応させて、対応するヒドラジンを生成することができ、これを脱保護することができる(例えば、炭化水素に結合させるために)。過剰の第四級アミノ基の添加およびスルホン酸基の使用の制御により、６まで、またはさらにそれ以上の範囲にわたる正の総電荷を有する色素の範囲とすることができる。
【００１６】
Ｃy３(ｎ＝１)およびＣy５(ｎ＝２)およびＣy７(ｎ＝３)色素には、マルチプレキシング(multiplexing)、すなわち、同時分析のために様々な色素で標識化した標的の混合物の使用を可能とするというさらなる利点がある。この概念はまた、インドール、チアゾール、およびオキサゾール誘導体の間で中間誘導体を変更することにより、そして色素への融合芳香族環の数を変えることにより増大させることもできる。
【００１７】
化学的方法
このセクションは、２〜６の正の電荷を有するシアニン色素を製造する際に予想される化学を示し、この大部分は特許請求の範囲に包含されるが、全てが包含されるというわけではない。番号を付けたパラグラフは各々、円内に＋として示す単一の正の電荷を有する、長方形として示すシアニン色素の一般図で始まる。その長方形の２つの角に、少なくとも１つの正の電荷および／または少なくとも１つの官能基もしくは反応性基であるＱもしくはＱ'を含んでなり得る曲線をつなぎ；これらの曲線は、上および特許請求の範囲に示した構造（１）および（２）における、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、およびＲ7、最も通常は、Ｒ1およびＲ2に対応する。該シアニン色素の幾つかは製造されており、以下の例に記載し；他のものは、準備中であるか、または予想される。
【００１８】
＋２の色素
１．
【化７】
【００１９】
例：
【化８】
２．
【化９】
【００２１】
例：
【化１０】
＋２の中間体の合成：
【化１１】
【００２３】
３．
【化１２】
＋１のモノ反応性色素をリンカーで伸張すると、それ自体が第二の＋の電荷を含む。可能な例は、次の通りである：
【化１３】
考案された＋１のリンカーの合成：
【化１４】
＋３の色素
これらの例は、＋２の色素に関する例と類似している。
１．
【化１５】
【００２７】
例：
【化１６】
２．
【化１７】
【００２９】
例：
【化１８】
３．
【化１９】
【００３１】
例：
【化２０】
４．＋１のリンカーの付加による＋２の色素の＋３の色素への転換
【化２１】
例：
【化２２】
５．＋２のリンカーの付加による＋１の色素の＋３の色素への転換
【化２３】
例：
【化２４】
＋４の色素
１．＋２のリンカーの付加による＋２の色素の＋４の色素への転換
【化２５】
例：
【化２６】
２．＋３のリンカーの付加による＋１の色素の＋４の色素への転換
【化２７】
例：
【化２８】
３．
【化２９】
【００４１】
例：
【化３０】
＋５および＋６の色素
１．＋３のリンカーの付加による＋２の色素の＋５の色素への転換
【化３１】
２．＋４のリンカーの付加による＋１の色素の＋５の色素への転換
【化３２】
＋４のリンカー：
【化３３】
３．＋４のリンカーの付加による＋２の色素の＋６の色素への転換
【化３４】
ポリ−リジンを基礎とするリンカー鎖
【化３５】
【００４７】
保持体上でオリゴマーを構築し、＋１の色素に結合させて、ｎ＋の色素を得る：
【化３７】
実施例１
＋３に帯電した色素、＋１に帯電したジアミンリンカーが含まれる(ＢＯＣ−保護)
ｉ）＋２に帯電したカルボキシＣy３色素の製造
【化３８】
Ｎ−(３−ブロモプロピル)トリエチルアンモニウムブロミド［１.１］
１,３−ジブロモプロパン(２０.０ｇ、１００mmol)およびトリエチルアミン(５.０６ｇ、５０mmol)を無水トルエン(５０ml)中で混合した。この溶液を窒素雰囲気下に１００℃で４時間加熱すると、この間に、濃白色の固体が沈殿した。次いで、その混合物を冷却し、固体を濾過により集め、トルエンおよびエーテルで洗浄し、減圧下に５０℃で乾燥させて、標記化合物［１.１］５.０ｇ(３６％)を得た。
δH（３００ＭＨz，ＤＭＳＯ）ブロードピーク。１.１７(９Ｈ，３ｘ Ｎ+−ＣＨ2−ＣＨ 3)、２.１５(２Ｈ，ＢrＣＨ2ＣＨ 2ＣＨ2−)、３.２６(８Ｈ，４ｘ Ｎ+−ＣＨ 2)、３.６２(２Ｈ，Ｂr−ＣＨ 2−)。
【００５０】
１−((３−トリエチルアンモニウム)プロピル)−２,３,３−トリメチルインドリウムジブロミド［１.２］
新たに蒸留した２,３,３−トリメチルインドレニン(０.８ｇ、５mmol)およびＮ−(３−ブロモプロピル)トリエチルアンモニウムブロミド［１.１］(１.５２ｇ、５mmol)を混合して、アルゴン雰囲気下に置いた。次いで、その混合物を１４０℃で１.５時間加熱すると、深紅色の粘性融解物を得、これを冷却してガラス上で凝固させた。それをジエチルエーテルの下に粉末となるまで粉砕し、これを濾過により集め、沸騰しているアセトンでトリチュレートし、メタノール／アセトンから再結晶化させて、標記化合物［１.２］を淡桃色の粉末７９５mg(３４％)として得た。
δH（３００ＭＨz，ＤＭＳＯ）１.２２(９Ｈ，ｔ，Ｊ ６.６Ｈz，３ｘ Ｎ+−ＣＨ2−ＣＨ 3)、１.５５(６Ｈ，ｓ，インドール Ｃ３Ｍe2)、２.２１(２Ｈ，ｍ，−ＣＨ2ＣＨ 2ＣＨ2−)、２.９２(３Ｈ，ｓ，インドール Ｃ２−Ｍe)、３.２７(６Ｈ，ｑ，Ｊ ６.６Ｈz，３ｘ Ｎ+−ＣＨ 2−ＣＨ3)、３.５１(２Ｈ，〜ｔ，−ＣＨ 2−ＮＥt3)、４.５７(２Ｈ，〜ｔ，インドール Ｎ+−ＣＨ 2−)、７.６４(２Ｈ，ｍ)、７.８６(１Ｈ，ｄ，Ｊ ６.５Ｈz)、８.１２(１Ｈ，ｄ，Ｊ ７.３Ｈz)。
【００５１】
１−(５−カルボキシペンチル)−２−(Ｎ−フェニル−２−アミノビニル)−３,３−ジメチルインドリウムブロミド［１.３］
１−(５−カルボキシペンチル)−２,３,３−トリメチルインドリウムブロミド(１.７７ｇ、５mmol)およびＮ,Ｎ'−ジフェニルホルムアミジン(１.９６ｇ、１０mmol)を酢酸(１５ml)中で混合した；次いで、その結果得られた混合物を還流温度で加熱した。その反応をＵＶ／ＶＩＳ分光法(メタノール溶液、生成物の吸光度λmax３９８nm)およびＴＬＣ(シリカ。メタノール ２０：ジクロロメタン ８０；生成物は黄色の縞として流れる、Ｒf ０.１−０.２５)によりモニターした。次いで、２.５時間後、橙色−赤色の溶液を１６時間放置して冷却した後、溶媒を減圧下に除去した。残留物をフラッシュクロマトグラフィー(シリカ。５−２０％ メタノール／ジクロロメタン)により精製して、乾燥させた後、標記化合物［１.３］１.５ｇ(６６％)を黄色−橙色の泡状物質として得た。
ＵＶ／ＶＩＳ λmax（ＭeＯＨ）３９８nm
δH（３００ＭＨz，ＣＤＣl3）１.５３(２Ｈ，ｍ)、１.６３(６Ｈ，ｓ，インドール Ｃ３ Ｍe2)、１.７０(２Ｈ，ｍ)、１.７８(２Ｈ，ｍ)、２.３５(２Ｈ，ｔ，Ｊ ７.０Ｈz，−ＣＨ 2−ＣＯ2Ｈ)、３.９９(２Ｈ，ｔ，Ｊ ７.４Ｈz，インドール Ｎ+−ＣＨ 2−)、６.３(２Ｈ，ブロード，ＮＨ＋ＣＯ2Ｈ)、７.０−７.４５(１０Ｈ，ｍ)、８.４０(２Ｈ，ｄ，Ｊ １２.５)。
【００５２】
１−(カルボキシペンチル)−１'−((トリエチルアンモニウム)プロピル)インドカルボシアニンジブロミド［１.４］
１−(５−カルボキシペンチル)−２−(Ｎ−フェニル−２−アミノビニル)−３,３−ジメチルインドリウムブロミド［１.３］(２２９mg、０.５mmol)を無水ピリジン(５ml)に溶解して、橙色の溶液を得た。これに無水酢酸(０.５ml)を加えて、その混合物を５分間撹拌した。次いで、１−((３−トリエチルアンモニウム)プロピル)−２,３,３−トリメチルインドリウムジブロミド［１.２］(２３１mg、０.５mmol)を加え、その混合物を一時的に温めて、固体の溶解を助けた。間もなく、深紅色−桃色になった。
２時間撹拌した後、溶媒を減圧下に除去して、残留物を高真空下に乾燥させた。次いで、それをフラッシュクロマトグラフィー(グレードＩの中性アルミナ。５−２０％ メタノール／クロロホルム)により精製し、主要な桃色の成分を単離して、標記色素［１.４］２７８mgを赤色の固体として得た。
ＴＬＣ（Ｃ−１８シリカ。酢酸、５０：水、４５：メタノール、５：Ｒfピンクスポット０.５５)
ＵＶ／ＶＩＳ λmax（ＭeＯＨ）５４８nm。
蛍光（ＭeＯＨ）λex ５４８nm；λem ５６４nm。
δH（３００ＭＨz，ＣＤ3ＯＤ）１.１７(９Ｈ，ｔ，Ｊ ６.５Ｈz，３ｘ Ｎ+−ＣＨ2ＣＨ 3)、１.３２(２Ｈ，ｍ)、１.７２−１.８８(１６Ｈ，ｍ)、２.２(２Ｈ，ｔ，Ｊ ７.３Ｈz，−ＣＨ 2ＣＯ2Ｈ＋２Ｈ，ブロード，Ｎ+−ＣＨ2ＣＨ 2ＣＨ2ＮＥt3)、３.３７(６Ｈ，ｑ，Ｊ ６.５，３ｘ Ｎ+−ＣＨ 2ＣＨ3)、３.５０(２Ｈ，ｍ，−ＣＨ 2ＮＥt3)、４.１９＋４.２６(２Ｈ，ｔ，Ｊ ７.７Ｈz＋２Ｈ，ｔ，Ｊ ７.３Ｈz，２ｘ インドール Ｎ+−ＣＨ 2−)、４.５９(１Ｈ，ブロード，−ＣＯ2Ｈ)、６.５５(１Ｈ，ｄ，Ｊ １３.６Ｈz，メチン＝ＣＨ−)、６.６１(１Ｈ，ｄ，Ｊ １３.２Ｈz，２ｘ メチン＝ＣＨ−インドール)、７.２８−７.４９(６Ｈ，ｍ)、７.５４-５８(２Ｈ，ｍ)、８.５７(１Ｈ，〜ｔ，Ｊ〜１３.４Ｈz，＝ＣＨ−ＣＨ＝ＣＨ−)。
【００５３】
ii）＋１に帯電したジアミンリンカーの製造(ＢＯＣ−保護)
【化３９】
３−ジメチルアミノ−１−プロピルアミン(２.０４ｇ、２０mmol)をジクロロメタン(５ml)と混合した；氷水浴を使用して、その結果得られた溶液を０℃まで冷却した。これに、ジクロロメタン(１５ml)中のジ炭酸ジ−ｔ−ブチル(４.４ｇ、２０mmol)の溶液を加えた：次いで、その混合物を室温まで温めた。２時間後、その溶液を水で２回洗浄した後、乾燥させ(ＭgＳＯ4)、濾過し、溶媒を減圧下に蒸発させて、無色の油状物質を得た。高真空で乾燥させることにより、標記化合物３.０７ｇ(７６％)を得た。
δH（３００ＭＨz，ＣＤＣl3）１.４４(９Ｈ，ｓ)、１.６４(２Ｈ，クインテット，Ｊ ６.８)、２.２１(６Ｈ，ｓ)、２.３１(２Ｈ，ｔ，Ｊ ７.０)、３.１７(２Ｈ，ブロードカルテット)、および５.１５(１Ｈ，ブロードｓ)。
【００５４】
Ｎ−(フタルイミドプロピル)−Ｎ−((ｔ−ブトキシカルボニルアミノ)プロピル)−Ｎ,Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド［１.６］
Ｎ−(ｔ−ブトキシカルボニル)−Ｎ−(３−ジメチルアミノ)プロピルアミン［１.５］(３.０３ｇ、１５mmol)および３−(ブロモプロピル)フタルイミド(４.０２ｇ、１５mmol)を無水トルエン(８ml)に溶解した。その結果得られた溶液を５０℃で１６時間加熱すると、この間に、ガラス性樹脂がフラスコの内側に形成された。その混合物を冷却して、液をデカントした；残留物をエーテルでトリチュレートして、ガラス性粉末を得た。高真空下で乾燥させることにより、標記化合物［１.６］４.１２ｇ(５８％)を得た。
δH（３００ＭＨz，ＣＤ3ＯＤ）１.４２(９Ｈ，ｓ)、１.９１(２Ｈ，ｍ)、２.１８(２Ｈ，ｍ)、３.０７(６Ｈ，ｓ)、３.１２(２Ｈ，ｔ，Ｊ ６.６)、３.３−３.５(４Ｈ，ｍ)、３.８０(２Ｈ，ｔ，Ｊ ６.４)、および７.８０−７.９０(４Ｈ，ｍ)。
【００５５】
Ｎ−(３−アミノプロピル)−Ｎ−((ｔ−ブトキシカルボニルアミノ)プロピル)−Ｎ,Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド［１.７］
Ｎ−(フタルイミドプロピル)−Ｎ−((ｔ−ブトキシカルボニルアミノ)プロピル)−Ｎ,Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド［１.６］(４.１ｇ、０.８７mmol)をエタノール性メチルアミン(３３重量％、８.０２Ｍ、１０ml)に溶解した。無色の溶液を室温で３日間撹拌すると、その間に、濃白色の沈殿が形成された(Ｎ,Ｎ'−ジメチルフタルアミド)。その混合物を濾過した；固体を少量の冷エタノールで洗浄した。濾液を減圧下に蒸発させて、油状物質を得た；これをエーテルでトリチュレートし、高真空下に乾燥させて、標記化合物［１.７］を泡状物質として得た。さらに精製することなく使用した。
δH（３００ＭＨz，ＣＤ3ＯＤ）１.４３(９Ｈ，ｓ)、１.８８−２.００(４Ｈ，ｍ)、２.７５(２Ｈ，ｔ，Ｊ ６.８)、３.１０(６Ｈ，ｓ)、３.１５(２Ｈ，ｔ，Ｊ ６.６)、および３.３−３.５(４Ｈ，ｍ)。少量のＮ,Ｎ'−ジメチルフタルアミドもまた見られる。
【００５６】
iii）＋２に帯電したＣy３カルボキシ色素［１.４］の＋１に帯電したリンカー［１.７］への結合
【化４０】
ＵＶ／ＶＩＳ λmax（ＭeＯＨ）；５４８nm。
δH（３００ＭＨz，ＣＤ3ＯＤ）１.３４(９Ｈ，ｔ，Ｊ ７.２)、１.４１(９Ｈ，ｓ)、１.５８(２Ｈ，ｍ)、１.６７−２.０３(２０Ｈ，ｍ，gem−ジメチル基に関する２ｘｓが含まれる)、２.２５−２.３１(４Ｈ，ｍ)、３.０９(６Ｈ，ｓ)、３.１３(２Ｈ，ｔ，Ｊ ６.３)、３.２６(２Ｈ，ｔ，Ｊ ６.３)、３.３−３.５(１０Ｈ，ｍ，ＣＨＤ2ＯＤにより部分的に不明瞭である)、３.６０(２Ｈ，app.t)、４.２４(２Ｈ，ブロードｔ，Ｊ ７.６)、４.３３(２Ｈ，ブロードｔ，Ｊ ７.４)、６.９０(１Ｈ，ｄ，Ｊ １３.６)、６.９２(１Ｈ，ｄ，Ｊ １３.２)、７.２８−７.５８(８Ｈ，ｍ)、および８.５８(１Ｈ，ｔ，Ｊ １３.４)。
【００５７】
遊離アミンの脱保護は、メタノール／クロロホルム中のトリフルオロ酢酸を使用して成し遂げられる(方法の詳細に関しては、実施例２を参照)。
【００５８】
実施例２
＋３に帯電した色素、＋２に帯電したジアミンリンカーが含まれる(ＢＯＣ−保護)
ｉ）＋２に帯電したジアミンリンカーの製造(ＢＯＣ−保護)
【化４１】
Ｎ−(３−ジメチルアミノ)フタルイミド［２.１］
３−ジメチルアミノ−１−プロピルアミン(５.１ｇ、５０mmol)および無水フタル酸(８.１５ｇ、５５mmol)をクロロホルム(１００ml)と混合した；その結果得られた混合物を還流下に４.５時間加熱した(ＣaＣl2防湿管)。冷却した後、その反応混合物を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で２回洗浄した後、水で洗浄した。有機溶液を乾燥させ(ＭgＳＯ4)、濾過し、溶媒を減圧下に蒸発させて、淡黄色の油状物質を得た。高真空下に乾燥させた後、標記化合物［２.１］１０.２ｇ(８８％)を得た。
δH（３００ＭＨz，ＣＤＣl3）１.８４(２Ｈ，クインテット，Ｊ ７.２)、２.２１(６Ｈ，ｓ)、２.３４(２Ｈ，ｔ，Ｊ ７.３)、３.７５(２Ｈ，ｔ，Ｊ ７.２)、７.７０−７.７４(２Ｈ，ｍ)、および７.８２−７.８６(２Ｈ，ｍ)。
【００６０】
Ｎ−(３−フタルイミドプロピル)−Ｎ−(３−ブロモプロピル)−Ｎ,Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド［２.２］
Ｎ−(３−ジメチルアミノ)フタルイミド［２.１］(２.３２ｇ、１０mmol)および１,３−ジブロモプロパン(４.０４ｇ、２０mmol)をトルエン(１０ml)に溶解して、透明な溶液を得た。これを８０℃まで温めて、５時間撹拌した。白色の沈殿が形成された。冷却した後、この固体を集め、トルエンおよびエーテルで洗浄し、真空下に乾燥させて、生成物３.５５ｇ(８２％)を得た。
δH（３００ＭＨz，Ｄ2Ｏ）２.０８(２Ｈ，ｍ)、２.２０(２Ｈ，ｍ)、２.９７(６Ｈ，ｓ)、３.２７−３.４０(６Ｈ，ｍ)、３.６３(２Ｈ，ｔ，Ｊ ６.６)、および７.６６−７.７３(４Ｈ，ｍ)。
【００６１】
Ｎ−(３−フタルイミドプロピル)−Ｎ'−(３−(ｔ−ブトキシカルボニルアミノ)プロピル)−Ｎ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'−テトラメチル−１,３−プロパンジアンモニウムジブロミド［２.３］
Ｎ−(３−フタルイミドプロピル)−Ｎ−(３−ブロモプロピル)−Ｎ,Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド［２.２］(４.３４ｇ、１０mmol)およびＮ−(ｔ−ブトキシカルボニル)−Ｎ−(３−ジメチルアミノ)プロピルアミン［１.５］(２.０２ｇ、１０mmol)をアセトニトリル(２０ml)と混合して、撹拌し続けた。その混合物を６０℃まで加熱したが、全ての固体が溶解したわけではなかった。２０ml過剰に加えたことになるまで、アセトニトリルをさらに少しずつ加えると、全ての固体が溶解した。この溶液を６０℃で１６時間反応させた。この時間の後に、その溶液を冷却して、溶媒を減圧下に蒸発させた；その結果得られた樹脂性泡状物質をエーテルでトリチュレートした後、高真空下に乾燥させて、標記化合物６.４ｇ(１００％)を粉末として得た。
δH（３００ＭＨz，ＣＤ3ＣＮ）０.８６(９Ｈ，ｓ)、１.４５(２Ｈ，ｍ，ＣＨＤ2ＣＮにより部分的に不明瞭である)、１.６６(２Ｈ，ｍ)、２.０８(２Ｈ，ｍ)、２.５８−２.７０(オーバーラッピング６Ｈ，ｓ＋６Ｈ，ｓ＋２Ｈ，カルテット)、２.８６−３.０６(８Ｈ，ｍ)、３.２２(２Ｈ，ｔ，Ｊ ６.２)、５.７０(１Ｈ，ブロードapp.t)、および７.２３−７.３２(４Ｈ，ｍ)。
【００６２】
Ｎ−(３−アミノプロピル)−Ｎ'−(３−(ｔ−ブトキシカルボニルアミノ)プロピル)−Ｎ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'−テトラメチル−１,３−プロパンジアンモニウムジブロミド［２.４］
Ｎ−(３−フタルイミドプロピル)−Ｎ'−(３−(ｔ−ブトキシカルボニルアミノ)プロピル)−Ｎ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'−テトラメチル−１,３−プロパンジアンモニウムジブロミド［２.３］(６.４ｇ、１０mmol)をエタノール性メチルアミン(３３重量％、８.０２Ｍ、１０ml)と混合して、撹拌し続けた。これでは、全てを溶解するのが遅いので、試薬をさらに１０ml加えた；暫くした後、全ての樹脂性塊状物質が溶解した。次いで、その混合物を３日間室温で撹拌しておいた。この時間の間に、白色の固体が沈殿した(Ｎ,Ｎ'−ジメチルフタルアミド)。これを濾過により除去した後、少量の冷エタノールで濯いだ。濾液を減圧下に蒸発させた；残留物をエタノールに２回再溶解して、２回再蒸発させた。最終残留物をエーテルでトリチュレートし、高真空下に乾燥させて、標記化合物を白色の固体として得た(非常に潮解性であった)。これをアルゴン下に保存して、さらに精製することなく使用した。
δH（３００ＭＨz，ＣＤ3ＯＤ）１.３４(９Ｈ，ｓ)、１.８２−１.９３(４Ｈ，ｍ)、２.２８−２.３９(２Ｈ，ｍ)、２.６８(２Ｈ，ｔ，Ｊ ６.６)、３.０２−３.１８(１４Ｈ，ｍ)、および３.４２(８Ｈ，app.クインテット)。少量のＮ,Ｎ'−ジメチルフタルアミドもまた明白である。
【００６３】
ii）＋１に帯電したＣy３カルボキシ色素の、＋２に帯電したリンカー［２.４］への結合
【化４２】
【００６４】
１時間後、ＴＬＣ(シリカ。メタノール ５０：水 ５０。ＮaＢrで飽和した。活性エステル Ｒf＝０.５５ → ［２.５］ Ｒf＝０.４５)でモニターしながら、アミン［２.４］を少しずつ加えた。反応が完了したと思われたら、溶媒を減圧下に除去し、残渣をエーテルでトリチュレートして、高真空に乾燥させた。
【００６５】
粗製の生成物を分取ＴＬＣ(シリカ、濃縮ゾーンをもつ２０×２０×０.２cm。メタノール ５０：水 ５０。ＮaＢrで飽和した。メタノール溶液中に充填した。)により精製した。主要な桃色のバンドを擦り取って、溶離液で抽出した後、メタノールで抽出した。溶媒を減圧下に除去して、残留物を乾燥させた。クロロホルムを使用して、生成物である色素をＮaＢrから抽出した；再び溶媒を減圧下に除去して、標記化合物［２.５］３０mgを得た。その化合物を更に特性決定しなかったが、アミン脱保護に付した。
ＵＶ／ＶＩＳ λmax（ＭeＯＨ）；５４８nm。
【００６６】
遊離アミノ色素を得るためのアミノ基の脱保護
化合物［２.５］(３０mg)を１０％ メタノール／クロロホルム(２ml)に溶解した；次いで、トリフルオロ酢酸(０.５ml)を加えて、その混合物を室温で撹拌した。脱保護をＴＬＣ(シリカ。メタノール ５０：水 ５０。ＮaＢrで飽和した。［２.５］ Ｒf＝０.５５ → ［２.６］ Ｒf＝０.７)によりモニターした。３時間後、反応を停止させて、溶媒を減圧下に除去した。残留物をエーテルでトリチュレートして、高真空下に乾燥させた。
【００６７】
分取ＴＬＣ(シリカ、濃縮ゾーンをもつ２０×２０×０.２cm。メタノール ５０：水 ５０。ＮaＢrで飽和した。メタノール溶液中に充填した。)により精製した。主要な桃色のバンドを擦り取って、溶離液で抽出した後、メタノールで抽出した。溶媒を減圧下に除去して、残留物を乾燥させた。活性炭のフラッシュプラグを使用して、生成物である色素をＮaＢrから分離した。粗製の色素を水に充填し、そのプラグを水で溶出し、メタノールで溶出した後、メタノール １：クロロホルム １で溶出して、色素を除去した。溶媒を蒸発させ、残留物を高真空に乾燥させて、標記化合物［２.６］１０mgを得た。
δH（３００ＭＨz，ＣＤ3ＯＤ，広がったピーク）１.０８(３Ｈ，ｔ，Ｊ ７.３)、１.５２(２Ｈ，ｍ)、１.６−１.９(２０Ｈ，ｍ)、２.０２(２Ｈ，ｍ)、２.１４−２.３９(６Ｈ，ｍ)、３.０９(２Ｈ，app.t)、３.１８−３.３(１４Ｈ，ｍ)、３.４５−３.６５(８Ｈ，ブロードｍ)、４.１１−４.１９(４Ｈ，ｍ)、６.５１(１Ｈ，ｄ，Ｊ １３.２)、６.５３(１Ｈ，ｄ，Ｊ １３.６)、７.２８−７.５６(８Ｈ，ｍ)、および８.５５(１Ｈ，ｔ，Ｊ １３.４)。
ＵＶ／ＶＩＳ λmax（ＭeＯＨ）；５４８nm。
【００６８】
実施例３
＋４に帯電した色素、＋２に帯電したジアミンリンカーが含まれる(ＢＯＣ−保護)
【化４３】
【００６９】
１時間後、ＴＬＣ(上記。ＮＨＳエステル Ｒf＝０.６ → ［３.１］ Ｒf＝０.４)でさらにモニターしながら、＋２のアミンリンカー［２.４］を少しずつ加えた。反応が完了したようなら、溶媒を減圧下に除去した；残留物をエーテル下に一晩放置した。次いで、エーテルをデカントして、残留物を分取ＴＬＣ(シリカ、２０×２０×０.１cm。メタノール ５０：水 ５０。ＮaＢrで飽和した。メタノール溶液中に充填した。)により精製した。主要な桃色のバンドを擦り取って、溶離液で抽出した後、メタノールで抽出した。溶媒を減圧下に除去して、残留物を乾燥させた。クロロホルムを使用して、生成物である色素をＮaＢrから抽出した：再び溶媒を減圧下に除去して、標記化合物［３.１］４０mgを得た。
δH（３００ＭＨz，ＣＤ3ＯＤ）１.３４(９Ｈ，ｔ，Ｊ ７.２)、１.４２(９Ｈ，ｓ)、１.５７(２Ｈ，app.クインテット)、１.７０−２.０１(２０Ｈ，ｍ)、２.１９−２.３６(６Ｈ，ｍ)，３.１３−３.２０(６Ｈ，ｓ＋６Ｈ，ｓ＋２Ｈ，部分的に不明瞭である)、３.３(２Ｈ，ｍ，ＣＨＤ2ＯＤにより部分的に不明瞭である)、３.３３−３.６４(１６Ｈ，ｍ)、６.８７(１Ｈ，ｄ，Ｊ １３.６)、６.９０(１Ｈ，ｍ，Ｊ １３.２)、７.２８−７.５９(８Ｈ，ｍ)、および８.５８(１Ｈ，ｔ，Ｊ １３.４)。
ＵＶ／ＶＩＳ λmax（ＭeＯＨ）：５４８nm。
【００７０】
メタノール／クロロホルム中のトリフルオロ酢酸を使用して、遊離アミンの脱保護を成し遂げた(方法の詳細に関しては、実施例２を参照)。
Claims (7)
- ＋３〜＋６の正の総電荷を有し、構造：
点線は、各々の環が５個または６個の炭素原子をもち、その環にＲ３、Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６が結合した、１つの環または２つもしくは３つの縮合環システムに必要な炭素原子を表し、該環または環システムは炭素原子のみから成っており；
ＸおよびＹは独立して、Ｏ、Ｓ、およびＣＲ８ ２（ここで、Ｒ８は、Ｃ１−Ｃ４アルキルである。）から選択され；
ｎは、１、２、または３であり；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、およびＲ７のうち少なくとも１つは、反応性基または官能基を含んでなり、該反応性基はスクシンイミジルエステル、イソチオシアネート、ジクロロトリアジン、イソシアネート、ハロアセトアミド、マレイミド、ハロゲン化スルホニル、酸ハロゲン化物、アルキルイミドエステル、アリールイミドエステル、カルボジイミド、ホスホルアミダイト、無水物、およびアシルアジドから選択され、該官能基は第一級アミン、第二級アミン、ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、ピラゾロン、スルフヒドリル、カルボキシル、ヒドロキシル、チオホスフェート、イミダゾール、およびアルデヒドおよびケトンが含まれるカルボニルから選択され；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、およびＲ７のうち少なくとも１つには、１個〜５個の正に帯電した窒素またはリンまたは硫黄原子が組み込まれており、ここで、該正に帯電した窒素原子は第四級アンモニウム基、第三級アミノ基、グアニジニウム基、イミダゾール基およびピリジニウム基から選択され；
残りのＲ３、Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６はいずれも独立して、Ｈ、ＳＯ３ −、Ｃl、Ｂr、ＯＲ９、およびＳＲ９（ここで、Ｒ９は、Ｃ１−Ｃ１０アルキルまたはアリールまたはアルアルキルである。）から選択され；
残りのＲ１およびＲ２はいずれも独立して、置換されていない、またはＳＯ３ −で置換されている、Ｃ１−Ｃ１０アルキルまたはアリールまたはアルアルキルから選択され；
残りのＲ７はいずれも、Ｈ、および置換されていない、またはＳＯ３ −で置換されている、Ｃ１−Ｃ１０アルキルまたはアリールまたはアルアルキルから選択される。］
（ただし、窒素およびリンおよび硫黄から選択される少なくとも２個の正に帯電した原子は、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、およびＲ７基に存在し；そして
Ｒ７の第一原子(これによって、残りの分子に結合する)は、ＨまたはＣである。）
を有するシアニン色素。 - Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、およびＲ７のうち少なくとも１つが、６０個までの炭素原子からなる分枝鎖または直鎖であり、またはアミノ酸残基を含んでなる、請求項１に記載のシアニン色素。
- 正に帯電した原子が正に帯電した窒素原子である、請求項１または２に記載のシアニン色素。
- １個〜５個の正に帯電した窒素原子が組み込まれている、６０個までの炭素原子からなる分枝鎖または直鎖が、構造：
−(ＣＨ２)ｍＮ＋Ｒ１０Ｒ１０Ｒ１１；または
−ＣＨ２−Ｐh−Ｎ＋Ｒ１０Ｒ１０Ｒ１１
［式中、
ｍは、１〜４であり；
Ｒ１０は、Ｃ１−Ｃ１０アルキルであり；および
Ｒ１１は、Ｃ１−Ｃ１０アルキルまたは−(ＣＨ２)ｍＮ＋Ｒ１０Ｒ１０Ｒ１１である。］
を有する、請求項２に記載のシアニン色素。 - Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、およびＲ７のうち少なくとも１つが、構造：
−Ｌ−Ｑ
［式中、
Ｌは、リンカーであり；および
Ｑは、反応性基または官能基である。］
を有する、請求項１に記載のシアニン色素。 - 該リンカーが、Ｃ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、およびＰから選択される１−６０個の原子からなる直鎖である、請求項５に記載のシアニン色素。
- 構造（２）：
ＸおよびＹは、Ｃ(ＣＨ３)２であり；
ｎは、１または２であり；
Ｒ１は、−(ＣＨ２)５−ＣＯＯＨであり；
Ｒ２は、−(ＣＨ２)３−Ｎ＋(ＣＨ３)２−(ＣＨ２)３−Ｎ＋(ＣＨ３)２(Ｃ２Ｈ５)であり；および
Ｒ３およびＲ４は、Ｈである。］
を有する請求項１に記載のシアニン色素。
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