JP4492156B2

JP4492156B2 - 血清アルブミンドメインを含む蛋白質

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Publication number: JP4492156B2
Application number: JP2004058582A
Authority: JP
Inventors: 優樹小田切; 善規木田; 直久片山; 俊哉甲斐
Original assignee: Nipro Corp
Current assignee: Nipro Corp
Priority date: 2004-03-03
Filing date: 2004-03-03
Publication date: 2010-06-30
Anticipated expiration: 2024-03-03
Also published as: JP2005245268A; US7253259B2; US20050256303A1

Description

本発明は、血清アルブミンドメインを含む蛋白質に関する。さらに、詳細には、遺伝子組換え技術により、血清アルブミンドメインの種々の組み合わせからなる蛋白質を製造することにより、各ドメインが有する抗菌活性、抗酸化作用、炎症抑制作用、生体内での物質運搬作用、酵素的作用等、多種の機能活性のうち、目的に応じた活性が増強された蛋白質に関する。

ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）は、成人の血清中に存在する主要な蛋白質であり、肝臓で生産され、種々の血清分子を運搬する担体としての機能をもっている。また、アルブミンは、毛細管の細孔を通過し得ない溶質（コロイド）によって起こる血漿コロイド浸透圧を正常に維持し、血中の液体含量を維持する上で重要な働きをする。従って、アルブミンは、外科手術、ショック、火傷、浮腫を起こす低タンパク血症の場合の投与のように、血管からの液体の損失があるような状態を処置する際の様々な治療に用いられている。

一方で、血液由来のアルブミンを使用した製剤は、未知ウィルスの混入などの恐れがあり、安全面で人体等への使用については問題があった。しかし、遺伝子組換え技術を用いて形質転換した微生物によって、血清アルブミンを製造する方法が既に提案されており（特許文献１および２参照）、これによって、安全な血清アルブミン製剤を提供できる可能性がある。

血清アルブミンは、上記以外にも、抗菌活性、抗酸化作用、炎症抑制作用、生体内での物質運搬作用、酵素的作用等、多種の機能を有している。従って、遺伝子組換え技術により製造された血清アルブミンは、これらの活性を利用した優れた薬物投与担体等として、医療の場で使用されることを期待されている。そして、血清アルブミンは、585個のアミノ酸からなる一本鎖構造のタンパクであり、３つの相同的なドメインから構成されているが、血清アルブミンの各種機能の多くはドメイン内に局在していると考えられている。
しかしながら、これら種々の血清アルブミンの活性と各ドメインとの関連がどのようになっているかは、これまで明らかにされておらず、血清アルブミンをドメイン単位で効率よく発現する系は構築されていなかった。

特開昭５８−５６６８４号公報特開平５−２９２９９３号公報

本発明は、血清アルブミンが有する抗菌活性、抗酸化作用、炎症抑制作用、生体内での物質運搬作用、酵素的作用等、多種の機能活性のうち、目的に応じた活性を増強した蛋白質を提供することを課題とする。

本発明者らは、ドメインＩ、II及びIIIからなる血清アルブミンの各ドメインをコードするＤＮＡ配列を製造し、該ＤＮＡ配列を含むベクターを用いて宿主細胞を形質転換し、細胞内で血清アルブミンドメインを含む蛋白質を製造できる発現系を構築した。こうして、血清アルブミンをドメイン単位で効率よく発現する系を構築するとともに、各ドメインの機能解析を行った。その結果、ある特定のアルブミン生物活性のほとんどを特定のドメインが担っている場合があることを見出した。さらに、本発明者らは遺伝子組換え技術を用いて該特定のドメインを多量に含む蛋白質を製造することにより、アルブミンの各種機能活性を増強した蛋白質が提供されることを見出し、本発明に到達した。特にアルブミンのドメインＩは高い抗酸化能を有し、低い酵素活性を示すことを見出した。したがって、ドメインＩを用いた蛋白質によって、抗酸化作用の増強された蛋白質を提供できる。

本発明は、血清アルブミンのドメインＩ、II及びIIIのうち、いずれかのドメインをコードする遺伝子を少なくとも1つ以上含む、血清アルブミンドメインを含む蛋白質をコードする改変された遺伝子、並びに該遺伝子を用いて遺伝子組換え技術を用いて製造された蛋白質であることを特徴とする。

すなわち、本発明は、
（１）血清アルブミンのドメインＩ、II及びIIIのうち、少なくとも１つのドメインを含み、天然アルブミンとは異なる構造を有する蛋白質、
（２）血清アルブミンのドメインＩ、II及びIIIのうち、いずれか１種または２種のドメインがその他のドメインよりも多量に含まれる、上記（１）記載の蛋白質。
（３）血清アルブミンのドメインＩ、II及びIIIのうち、いずれか１種又は２種のドメインのみを含む、上記（１）記載の蛋白質、
（４）血清アルブミンのドメインＩ、II及びIIIのうち、いずれか１種のドメインのみを含む、上記（１）記載の蛋白質、
（５）血清アルブミンのドメインＩのみを含む、上記（１）記載の蛋白質、
（６）血清アルブミンが、ヒト血清アルブミンである上記（１）記載の蛋白質、
（７）上記（１）記載の蛋白質を含む、医療用製剤、
（８）天然アルブミンをコードするＤＮＡ断片とは異なるＤＮＡ断片であり、かつ血清アルブミンのドメインＩ、II及びIIIのうち、少なくとも１つのドメインをコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片、
（９）血清アルブミンのドメインＩ、II及びIIIのうち、いずれか１種または２種のドメインをコードするＤＮＡ配列が、その他のドメインをコードするＤＮＡ配列よりも多量に含まれる、上記（８）記載のＤＮＡ断片、
（１０）血清アルブミンのドメインをコードする各ＤＮＡ配列の間に、制限酵素切断部位を介在させた、上記（８）記載のＤＮＡ断片、
（１１）上記（８）記載のＤＮＡ断片を含む組換えベクター、
（１２）上記（１１）記載の組換えベクターで宿主細胞を形質転換してなる、形質転換体、
（１３）上記（１）記載の蛋白質を製造する方法であって、上記（８）記載のＤＮＡ断片を組み込んだ組換えベクターを構築し、該ベクターで宿主細胞を形質転換した後、その形質転換された細胞を培養して生成された蛋白質を回収することを特徴とする、蛋白質の製造方法、
（１４）血清アルブミンのドメインをコードする各ＤＮＡ配列の間に制限酵素切断部位を介在させたＤＮＡ断片を、増殖能の高い宿主細胞に導入して、得られた形質転換体を培養し、増殖した細胞からＤＮＡを抽出後、特定の制限酵素で消化することを特徴とする、上記（８）記載のＤＮＡ断片の製造方法
である。

本発明の蛋白質は、アルブミンの持つ特定の活性を増強することができるため、抗酸化作用、物質運搬能等から必要に応じた活性を選択し、効果的に人体等に適用することができる。また、遺伝子組換え技術によって製造された蛋白質であることにより、血液由来製剤特有の問題である未知ウィルスの混入などの恐れがなく、人体等に安全に使用することができる。さらに、本来の生体に存在する成分からなる蛋白質であるため、人体等へ投与しても副作用等の影響が少ない。
本発明において、血清アルブミンのドメインをコードする各ＤＮＡ配列の間に制限酵素切断部位を介在させたＤＮＡ断片を、増殖能の高い宿主細胞に導入して、得られた形質転換体を培養し、増殖した細胞からＤＮＡを抽出後、特定の制限酵素で消化することによって、目的のアルブミンドメインをコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片を選択的かつ効率的に得ることができる。

本発明の蛋白質は、血清アルブミンのドメインＩ、II及びIIIのうち、少なくとも１つのドメインを含み、天然アルブミンとは異なる構造を有する蛋白質である。好ましくは、血清アルブミンのドメインＩ、II及びIIIのうち、いずれか１種または２種のドメインがその他のドメインよりも多量に含まれ、さらに好ましくは、血清アルブミンのドメインＩ、II及びIIIのうち、いずれか１種又は２種のドメインのみを含む。最も好ましくは、血清アルブミンのドメインＩ、II及びIIIのうち、いずれか１種のドメインのみを含む。特に、抗酸化作用を有する蛋白質を得るためには血清アルブミンのドメインＩを含むことが好ましい。また、ドメインＩはそのＮＯ供与性を有するため、血管弛緩作用を増強させるためにはドメインＩを含むことが好ましい。さらに、エステラーゼ様活性を増強するためには、ドメインIIIを含むことが好ましい。

また、本発明の蛋白質は、天然アルブミンとはペプチド配列が異なり、立体的にも異なる構造を有するものである。それによって、天然アルブミンの活性とは異なる新たな活性を有する蛋白質が得られる。本発明の蛋白質としては、アルブミンのドメインＩ、IIおよびIIIからなる蛋白質であって、各ドメインの配列順序が天然アルブミンとは異なるものも包含される。
本発明において、血清アルブミンとは、ヒト血清アルブミンであることが好ましい。

本発明で用いるＤＮＡ断片は、天然アルブミンをコードするＤＮＡ断片とは異なるＤＮＡ断片であり、かつ血清アルブミンのドメインＩ、II及びIIIのうち、少なくとも１つのドメインをコードするＤＮＡ配列を含むものである。好ましくは、血清アルブミンのドメインＩ、II及びIIIのうち、いずれか１種または２種のドメインをコードするＤＮＡ配列が、その他のドメインをコードするＤＮＡ配列よりも多量に含まれるＤＮＡ断片である。また、血清アルブミンのドメインをコードする各ＤＮＡ配列の間に、制限酵素切断部位を介在させたＤＮＡ断片であることが好ましい。

上記ＤＮＡ断片を含むベクターに組み込む方法としては、種々公知の方法を用いることができるが、例えば、各種制限酵素で処理した上記ＤＮＡ断片およびベクターの混合液中にリガーゼを添加し、ベクターと上記ＤＮＡ断片を結合させる方法が用いられる。ベクターは、遺伝子組換え技術において用いられるベクターであればよく、通常、プラスミドが用いられる。

次いで上記組換えベクターを宿主細胞内に導入し、形質転換体を得る。組換えベクターの宿主細胞内への導入法は、従来慣用的に用いられている方法により行うことができ、コンピテント細胞法、プロトプラスト法、リン酸カルシウム共沈法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、リポソーム融合法、パーティクル・ガン法等、種々のものが挙げられるが、用いる宿主に応じてそれぞれ任意の方法を取り得る。シゾサッカロミセス・ポンベを宿主とする場合は、例えば酢酸リチウム法（K. Okazaki et al., Nucleic Acids Res., 18, 6485-6489(1990)）等によって効率よく形質転換体を得ることができる。
宿主細胞としては、真核細胞を用いることが好ましい。真核細胞としては、Phichia pastoris、Saccharomyces cerevisiae、ShizoSaccharomyces pombe等が挙げられ、好ましくは、Phichia pastorisである。

このようにして得られた形質転換体を培養することにより、培養物中に蛋白質が産生される。これを公知の方法で単離し、場合により精製することにより、目的とする蛋白質が得られる。

形質転換体を培養するための培地は公知であり、ＹＰＤ培地などの栄養培地や、ＭＢ培地などの最少培地、ＢＭＭＹ培地、ＢＭＧＹ培等を用いることができる。形質転換体の培養は、通常約１６〜４２℃、好ましくは約２５〜３７℃で、約８〜１６８時間、好ましくは約２４〜１２０時間行う。振盪培養と静置培養のいずれも可能であるが、必要に応じて攪拌や通気を加えてもよい。

培養物中に産生した融合蛋白質の単離・精製法としては、公知の塩析または溶媒沈殿法等の溶解度の差を利用する方法、透析、限外濾過またはゲル電気泳動法等の分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィー等の荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィー等の特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体フロマトグラフィー等の疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法等の等電点の差を利用する方法等が挙げられる。

単離・精製した蛋白質の確認方法としては、公知のウエスタンブロッティング法や活性測定法等が挙げられる。また、精製された蛋白質は、アミノ酸分析、アミノ末端分析、一次構造解析などによりその構造を明らかにすることができる。

実施例１のヒト血清アルブミンドメインＩの三量体の作製における概略手順を図１に示す。
（ヒト血清アルブミンのドメインＩをコードするＤＮＡ断片の増幅）
プラスミドpKF18Kにヒト血清アルブミンをコードする遺伝子を組み込んだプラスミド（以下、pKF18K-HAS、東燃ゼネラル石油株式会社より入手）（図２参照）を鋳型とし、配列番号１のセンスプライマーと配列番号２のアンチセンスプライマー、配列番号４のセンスプライマーと配列番号５のアンチセンスプライマー、並びに配列番号７のセンスプライマーと配列番号８アンチセンスプライマーを合成プライマーとして、ＤＮＡポリメラーゼ（KOD-plus-、東洋紡製）を用いたＰＣＲを行った。ＰＣＲの反応条件としては、ＤＮＡを94℃で10分間処理した後、変性（94℃、1分）、アニーリング（64℃、1分）及びエクステンション（72℃、１分）の一連の反応を30サイクル行い、その後72℃で３分間処理した。ＰＣＲによって、ヒト血清アルブミンのドメインＩをコードするＤＮＡ配列の3'末端および5'末端に制限酵素切断部位を有するＤＮＡ配列を付加したＤＮＡ断片が増幅され、配列番号１のセンスプライマーと配列番号２のアンチセンスプライマーによって増幅されたＤＮＡ断片（以下、Ｉ-1、配列番号３および図３参照）、配列番号４のセンスプライマーと配列番号５のアンチセンスプライマーによって増幅されたＤＮＡ断片（以下、Ｉ-2、配列番号６および図４参照）、並びに配列番号７のセンスプライマーと配列番号８のアンチセンスプライマーによって増幅されたＤＮＡ断片（以下、Ｉ-3、配列番号９および図５参照）を得た。

（ヒト血清アルブミンドメインＩをコードするＤＮＡ断片の連結）
ＤＮＡ断片Ｉ-1、Ｉ-2及びＩ-3を連結するため、それぞれ制限酵素処理を行った。Ｉ-1は制限酵素Hind III（Gibco製）、Ｉ-2は制限酵素Pst I及びHind III（Gibco製）、Ｉ-3は制限酵素Pst Iで消化し、それぞれフェノール抽出、エタノール沈殿による精製の後、ＤＮＡライゲーションキット（DNA Ligation kit Ver.1、宝酒造製）を用いて16℃で２時間ライゲーション反応を行い、Ｉ-1、Ｉ-2及びＩ-3が連結したＤＮＡ断片（以下、Ｉ³）を得た。ライゲーション反応後のＤＮＡ断片は、70℃で10分間の熱処理を行い、再度フェノール抽出、エタノール沈殿による精製の後、アガロースゲル電気泳動し、ゲル抽出キット（QIAquik Gel Extraction Kit、QIAGEN製）を用いてゲル抽出した。
次に、ゲル抽出後のＤＮＡ断片Ｉ³を鋳型とし、配列番号１０のセンスプライマーと配列番号１１のアンチセンスプライマーを合成プライマーとして、ＤＮＡポリメラーゼ（KOD-plus-、東洋紡製）を用いたＰＣＲを行った。ＰＣＲの反応条件としては、ＤＮＡを94℃で２分間処理した後、変性（94℃、15秒）、アニーリング（63℃、30秒）及びエクステンション（68℃、2分）の一連の反応を30サイクル行い、その後68℃で５分間処理した。このＰＣＲによって、3'末端および5'末端に制限酵素Xho I及びEco RIの切断部位を有するＤＮＡ断片Ｉ³が増幅され、十分な量を合成することができた。

（ＤＮＡ断片とプラスミドの連結）
ＰＣＲによって増幅されたＤＮＡ断片Ｉ³を、フェノール抽出、エタノール沈殿及びゲル抽出による精製の後、制限酵素Xho I及びEco RI（宝酒造製）で消化した。一方、プラスミドpPIC9は、制限酵素Xho I及びEco RI（宝酒造製）で消化し、フェノール抽出、エタノール沈殿により精製した。制限酵素処理後のＤＮＡ断片Ｉ³及びプラスミドpPIC9は、アガロースゲル電気泳動し、それぞれのＤＮＡ断片に相当するバンドを切り出し、ゲル抽出キット（QIAquik Gel Extraction Kit、QIAGEN製）を用いてゲル抽出した。ゲル抽出後、ＤＮＡ断片Ｉ³及びプラスミドpPIC9を混合し、ＤＮＡライゲーションキット（DNA Ligation kit Ver.1、宝酒造製）を用いて16℃で４時間ライゲーション反応を行い、pPIC9にＩ³を組み込んだプラスミド（以下、pPIC9-Ｉ³）を作製した。
次に、このpPIC9Ｉ-3を、E.coli JM109に導入した。得られた形質転換体を培養した後、プラスミド精製キット（QIAprep Spin Miniprep Kit、QIAGEN製）を用いて、培養液からプラスミドを抽出・精製し、目的とするプラスミドpPIC9-Ｉ³が増幅されていることを確認した。確認方法としては、制限酵素Xho I及びEco RI（宝酒造製）による二重消化、ならびに制限酵素Hind III、及びPst I（Gibco製）による二重消化を行い、制限酵素地図を作成し、同時にＤＮＡシーケンサ（ABI Prism 310 Genetic Analizer、Perkin-Elmer Applied Biosystems製）を用いてＤＮＡ配列の解読を行った。

（ヒト血清アルブミンドメインＩ三量体の発現）
pPIC9-Ｉ³は、制限酵素Sal Iで消化し、フェノール抽出、エタノール沈殿による精製の後、エレクトロポレーション装置（Gene Pulser II Electroporation System、BIO RAD製）を用いて、Pichia pastoris GS115にエレクトロポレーション法により導入して形質転換した。得られた形質転換体は、G418に耐性を示すポジティブクローンのみをスクリーニングし、ＢＭＭＹ液体培地中で培養し、アルブミン蛋白質の発現を確認した後グリセロールストックした。

（ヒト血清アルブミンドメインＩ三量体の精製）
形質転換したPichia pastoris GS115を、BMGY液体培地中で48時間培養し、その後、ＢＭＭＹ培地中で12時間毎に１％メタノールを添加しながら96時間培養した。培養液から遠心分離（6000g×10分間）により酵母を分離した後、培地上清を0.22μmフィルターでろ過し、精製カラム（Blie affinity CL-6B column）を用いて精製した。
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本願発明の蛋白質は、タンパク工学的な修飾を施すことにより、ＤＤＳへの応用が期待される。特に血中滞留性を向上させたい場合の薬物投与担体として、ウィルス混入の畏れもなく効果的に使用することができる。
さらに、本発明の蛋白質に、構成アミノ酸のうち１つ以上のアミノ酸残基が置換または挿入されたアルブミン変異体がニトロソ化された、ニトロソ化アルブミン変異体を付加した蛋白質を製造すれば、抗菌作用を併せ持つ蛋白質を製造することができる。

実施例１のヒト血清アルブミンドメインＩの三量体の作製における概略手順を示す説明図である。 pKF18K-HASの模式図である。実施例１におけるＤＮＡ断片Ｉ-1の模式図である。実施例１におけるＤＮＡ断片Ｉ-2の模式図である。実施例１におけるＤＮＡ断片Ｉ-3の模式図である。

Claims

ヒト血清アルブミンを構成するアミノ酸の１番目から２０４番目までを順に含むアミノ酸配列からなるペプチドの三量体からなる蛋白質。
請求項１の蛋白質を発現させるＤＮＡ断片が、配列表番号３，６および９からなる、請求項１記載の蛋白質。