JP4342890B2

JP4342890B2 - ミスマッチ結合ポリヌクレオチドの除去方法

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Publication number: JP4342890B2
Application number: JP2003339714A
Authority: JP
Inventors: 徹土谷
Original assignee: Fujifilm Corp
Current assignee: Fujifilm Corp
Priority date: 2003-09-30
Filing date: 2003-09-30
Publication date: 2009-10-14
Anticipated expiration: 2023-09-30
Also published as: JP2005102580A; US20050123958A1

Description

本発明は、ＤＮＡ等のポリヌクレオチド中に含まれる特定の配列の検出、解析等に使用される生化学解析マイクロアレイにおいて、ミスマッチをしたポリヌクレオチドを除去する方法に関するものである。

ＤＮＡマイクロアレイは、遺伝子発現モニタリング、遺伝子の塩基配列決定、遺伝子多型ＳＮＰの解析、癌における遺伝子増幅や欠失、癌等の疾患の分類、薬物応答性の予測、疾患遺伝子の探索など生命科学の広い範囲での応用が期待されている。

ＤＮＡマイクロアレイの原理はハイブリダイゼーションに基づく核酸の検出に基づいており、ガラス、シリコンあるいはメンブレンフィルタなどの表面上の多数の領域に、異なったプローブＤＮＡを高密度に整列化（アレイ化）して固定し、この上で、ターゲットＤＮＡ（標識物質で標識されたＤＮＡ）とハイブリダイズさせて各々の領域（スポット）からのシグナルを検出するものである。例えば、標識物質が放射性標識物質である場合には、多数の領域に選択的に含まれている放射性標識物質によって蓄積性蛍光体シートの蓄積性蛍光体層を露光し、露光された蓄積性蛍光体層を励起光によって走査して、蓄積性蛍光体層に含まれている蓄積性蛍光体を励起し、蓄積性蛍光体から放出された光を光電的に検出することにより、標識物質が蛍光物質である場合には、多数の領域を励起光によって走査して多数の領域に選択的に含まれている蛍光物質を励起し、蛍光物質から放出された蛍光を光電的に検出することにより、標識物質が化学発光標識物質である場合には、多数の領域に選択的に含まれている化学発光標識物質を化学発光基質と接触させ、化学発光標識物質から放出される化学発光を光電的に検出することにより解析が行われている（例えば特許文献１参照）。

ＤＮＡマイクロアレイはアレイ化するＤＮＡの種類やその作製法により、大きく２つの種類に分かれる。一つは、半導体の露光技術であるフォトリソグラフィーを利用してシリコン基板にマスクと呼ばれる遮光板をかぶせて露光させる作業を繰り返し、基板上にＤＮＡを１分子ずつ積み上げていく方法で作製されるオリゴヌクレオチドアレイ（以下、単にオリゴヌクレオチドアレイという）、もう一つはあらかじめＰＣＲ増幅したｃＤＮＡをスライドガラス上に細いピンやインクジェット方式などで滴下して作製されるｃＤＮＡマイクロアレイである。

ところで、領域に固定されているプローブＤＮＡには、それぞれ最適なハイブリダイズのための条件（温度、塩濃度など）があるが、高密度に形成された領域に固定されているプローブＤＮＡのそれぞれにおいて最適な条件で反応を行うことは困難であるため、一般的にはすべての領域において同一の条件で反応が行われている。このため、アレイ上のプローブＤＮＡと完全には相補的ではないが似たような配列をもったターゲットＤＮＡが、アレイ上のプローブＤＮＡと誤ってハイブリダイズする、いわゆるミスマッチ結合を起こす場合がある。このミスマッチ結合しているターゲットＤＮＡは、検出の際に生じるノイズの一因となり検出精度を低下させるものとなる。

特に、ｃＤＮＡマイクロアレイは、細胞から単離したｃＤＮＡをそのままＰＣＲ増幅してスライドガラス上に固定したものであって、オリゴヌクレオチドアレイのように、あらかじめプローブＤＮＡをミスマッチを起こさないように設計して作製しているものではないため、アレイ上のプローブＤＮＡがミスマッチを起こす可能性が高い。このため、ｃＤＮＡマイクロアレイにおいても、検出したい遺伝子に特異的な配列を選び出し、その配列に従って合成したオリゴＤＮＡをプローブに用いるなど、アレイに載せるプローブを調製することによってミスマッチの軽減が図られている。

しかし、オリゴヌクレオチドアレイにしても合成オリゴアレイにしても、ミスマッチ結合を全く起こさないように設計することは困難であり、特にｃＤＮＡのような長い遺伝子について解析する場合に、ミスマッチ結合を起こさないように設計することは殆ど不可能である。

このようなミスマッチ結合に関する問題を、アレイ上のプローブＤＮＡにターゲットＤＮＡをハイブリダイズさせる際の、温度あるいはｐＨを細かに調製するなどして解決しようとする試みがなされている。たとえば、特許文献２にはオリゴヌクレオチドプローブとポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションにおいて、個々のプローブ固定面で、ハイブリダイゼーションに最適な温度で生化学反応をさせることが可能な生化学反応検出チップが提案されている。これはオリゴヌクレオチドプローブの相補鎖結合の融解温度（Ｔｍ値）に着目し、このＴｍ値よりも低温の条件ではミスマッチ結合によるバックグラウンドのノイズが増加し、Ｔｍ値よりも高温の条件ではポリヌクレオチドがプローブと結合しにくいことから、ミスマッチを起こさずにポリヌクレオチドとハイブリダイゼーションするための温度を、それぞれのプローブについて最適に調整するというものである。

また、特許文献３には基板表面の各領域にオリゴヌクレオチドプローブを固定し、これにポリヌクレオチドをハイブリダイゼーションさせた後、基板の特定の領域のみを選択的に加熱して、プローブに相補的に結合しているポリヌクレオチドのみをプローブから分離させることにより所望のポリヌクレオチドを選択的に分離、回収する方法が記載されている。

しかし、特許文献２に記載されている方法では、生化学反応検出チップに複数のアイランドを設け、そのアイランド毎に温度調整を細かくモニターすることが必要であり、特許文献３に記載されている技術を利用する場合にも、基板の特定の領域のみを選択的に加熱する必要がある。さらにアイランドや領域に含まれるプローブのＴｍ値をほぼ同じ値で揃えておかなければならないという、操作において極めて煩雑であり、かつ特殊な装置を必要とするものである。また、煩雑さの点からすれば、反応させる溶液の塩濃度を上げたり下げたりして微調整を行わなければミスマッチ結合を抑制することができない、ｐＨ調製をしながらハイブリダイゼーション行う場合も同様である。

このように、ハイブリダイゼーションのミスマッチ結合を抑制することは煩雑な調製が伴う上、時間もかかり、ミスマッチ結合を抑制する条件によっては完全に相補的結合をしている、いわゆるパーフェクトマッチ結合を弱めてしまうという新たな問題が生じる。

一方、ミスマッチ結合したものを取り除くという観点から、従来のアッセイ法ではプローブＤＮＡが固定されたアレイにターゲットＤＮＡを含むハイブリダイゼーション溶液を反応させた後に、領域に残っている余剰なターゲットＤＮＡを取り除くため洗浄液を用いた液洗浄が行われている。

しかし、領域に固定されているプローブＤＮＡとミスマッチ結合しているターゲットＤＮＡはプローブＤＮＡと部分的にまたは何らかの相互作用により結合しているため従来の液洗浄による洗浄方法ではその洗浄強度を均一にコントロールすることが困難で、その結果精度の良い洗浄ができなかった。

ところで、特許文献４には電極上に遺伝子を取り付けたユニットが記載されている。これは遺伝子がマイナスに印加することを利用してミスマッチ結合を取り除こうとするものである。
特開２００２−３５５０３６号公報特開２００１−２３５４７４号公報特開２０００−２７９１６９号公報米国特許第５６０５６６２号明細書

しかし、プローブＤＮＡに結合しているターゲットＤＮＡの長さがまちまちであると、電圧を印可しても各ターゲットＤＮＡにかかる物理的な力が異なり、ミスマッチ結合しているターゲットＤＮＡのみならず、パーフェクトマッチ結合しているターゲットＤＮＡも剥がれてしまうことが予想される。

本発明は上記事情に鑑みなされたものであり、ミスマッチ結合しているターゲットＤＮＡ等のポリヌクレオチドのみを除去することが可能な、ミスマッチ結合ポリヌクレオチドの除去方法を提供することを目的とするものである。

本発明のミスマッチ結合ポリヌクレオチドの除去方法は、担体上の複数の領域に固定されたオリゴヌクレオチドプローブに標識物質で標識されたポリヌクレオチドをハイブリダイズさせた後、前記オリゴヌクレオチドプローブと二本鎖を形成していない１本鎖部分の標識ポリヌクレオチドを、該標識ポリヌクレオチドの末端から１本鎖ポリヌクレオチドを分解する制限酵素を作用させて、前記オリゴヌクレオチドプローブと前記標識ポリヌクレオチドとで形成された二本鎖から切り離し、その後、前記領域に電圧を印加できるように電極を配置し、該電極に電圧を印加して前記オリゴヌクレオチドプローブとミスマッチ結合している標識ポリヌクレオチドを剥がすことを特徴とするものである。

印可した電圧に対して同じ物理的な力がかかるように、オリゴヌクレオチドプローブは担体上の全ての領域において、ほぼ同じ長さのヌクレオチドから形成される。また、印可する電圧はオリゴヌクレオチドプローブとパーフェクトマッチ結合している標識ポリヌクレオチドは剥がさないで、オリゴヌクレオチドプローブとミスマッチ結合している標識ポリヌクレオチドを剥がすように調製される。

前記制限酵素はエキソヌクレアーゼVIIであることが好ましい。

本発明のミスマッチ結合ポリヌクレオチドの除去方法は、担体上の複数の領域に固定されたオリゴヌクレオチドプローブに標識物質で標識されたポリヌクレオチドをハイブリダイズさせた後、オリゴヌクレオチドプローブと二本鎖を形成していない１本鎖部分の標識ポリヌクレオチドを、この標識ポリヌクレオチドの末端から１本鎖ポリヌクレオチドを分解する制限酵素を作用させて、オリゴヌクレオチドプローブと標識ポリヌクレオチドとで形成された二本鎖から切り離し、標識ポリヌクレオチドのヌクレオチドの塩基長さを担体上で同じにすることが可能であり、その後、領域に電圧を印加できるように電極を配置し、電極に電圧を印加するので、オリゴヌクレオチドプローブとパーフェクトマッチ結合している標識ポリヌクレオチドを剥がすことなく、オリゴヌクレオチドプローブとミスマッチ結合している標識ポリヌクレオチドを剥がすことができ、ミスマッチ結合によるバックグラウンドのノイズの軽減を図ることが可能となり、検出精度を向上させることができる。

以下、図面を参照して本発明の実施の形態について、担体上の複数の領域にオリゴＤＮＡプローブが固定されている、ＤＮＡアレイを用いる場合を例にとって説明する。図１はミスマッチ結合ＤＮＡの除去方法の流れを示す概略図である。

まず、メンブレンフィルタ１の表面にカルボキシル基（ＣＯＯＨ）あるいはアルデヒド基（ＣＯＨ）が露出するように処理を行う。一方、ＤＮＡプローブ２となる合成オリゴＤＮＡの５′末端にアミノ基（ＮＨ₂）を導入し、このアミノ基が末端に導入されたＤＮＡプローブを表面処理がなされたメンブレンフィルタ１にスポットする。メンブレンフィルタの表面のカルボキシル基あるいはアルデヒド基とＤＮＡプローブの末端のアミノ基間に共有結合が形成されることによって、図１(a)に示すようにＤＮＡプローブ２がメンブレンフィルタ１に固定される。

図１(a)のＤＮＡプローブ２のメンブレンフィルタ１に垂直に立っている部分はＤＮＡの配列を示し、この垂直部分から枝状に出ている部分が相補的に塩基対を形成する部分である。各領域にはそれぞれ異なる配列のＤＮＡプローブがスポットされるが、ＤＮＡプローブは担体上の全ての領域において、ほぼ同じ長さのＤＮＡに調製される。なお、図１では、説明を簡単にするため、１つの領域（スポット）に１つのＤＮＡプローブが固定されているが、領域に固定されるＤＮＡプローブはこのように、１つであっても複数であってもよい。また、ＤＮＡプローブは、合成したオリゴＤＮＡであってもよいし、細胞から単離したｃＤＮＡであっても差し支えない。

次にターゲットとなる標識ＤＮＡを準備する。標識ＤＮＡのＤＮＡは細胞や組織から抽出精製されたTotal ＲＮＡやPoly-A⁺ＲＮＡ等を逆転写酵素を用いて逆転写しｃＤＮＡを調整するが、この逆転写酵素による逆転写反応時に標識物質を取り込ませることで標識ＤＮＡを調整することができる。なお、逆転写時にビオチンやＤＮＰ（Dinitrophenyl）を取り込ませて、抗体反応、酵素反応を仲介することでシグナルを増幅するように調製してもよい。

標識物質は、ｃＤＮＡに取り込まれる規則性があらかじめわかっているものであればよく、標識物質としては、Ｃｙ３、Ｃｙ５、フルオレセインイソチオシアネートなどの蛍光色素、^３２Ｐ、^３３Ｐなどの放射性同位体、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、ビオチン、ジゴキシゲニンなどの化学発光用の標識物質を好ましく用いることができる。

続いてメンブレンフィルタ１に固定されたＤＮＡプローブ２と、標識ＤＮＡ３とでハイブリダイゼーション反応を行う。ハイブリダイゼーション反応は、ＤＮＡプローブ２が固定されたメンブレンフィルタ１と、標識ＤＮＡが添加された反応液をハイブリダイゼーションバッグ内に入れハイブリダイゼーションバッグに振動を加えて、標識ＤＮＡを対流あるいは拡散により移動させて結合させることによって、あるいは反応液を領域を横切るように強制的に流動させることが可能なポンプやシリンジなどを有するリアクタを用いて結合させることによって行うことができる。

なお、ハイブリダイゼーション後、ＤＮＡプローブ２とハイブリダイゼーションをしなかった標識ＤＮＡを除去するために、ハイブリダイゼーションバッグ内あるいはリアクタ内に洗浄液を入れて洗浄することが好ましい。

反応後は、図１(b)に示すように標識物質４で標識されたさまざまな長さの標識ＤＮＡ３がＤＮＡプローブ２に相補的に水素結合により塩基対を形成している状態となる（なお、図１(b)の右端のプローブＤＮＡと標識ＤＮＡは完全には相補的結合をしていない部分を有している状態を示している）。このためこのままの状態で電圧を印可すると、ターゲットＤＮＡにかかる物理的な力が異なり、ミスマッチ結合しているターゲットＤＮＡのみならず、完全に相補的に結合している、いわゆるパーフェクトマッチ結合しているターゲットＤＮＡも剥がれてしまい、ミスマッチ結合している標識ＤＮＡのみを選択的に剥がすことはできない。そこで、ＤＮＡプローブ２と二本鎖を形成していない１本鎖の標識ＤＮＡ部分をエキソヌクレアーゼVIIを用いて切断する。エキソヌクレアーゼVIIは１本鎖のＤＮＡに末端から特異的に作用することができる制限酵素である。この酵素を好ましくは５〜２０℃で作用させることによって、図１(c)に示すように、二本鎖を形成していない１本鎖の標識ＤＮＡ部分が切断された、ＤＮＡプローブ２と標識ＤＮＡ３が二本鎖を形成している部分だけが残った状態となる。

図１(c)に示す状態となったところで、領域に電圧を印加できるように電極を配置し、電極に電圧を印加する（図１(d)）。ここで、領域に電圧を印加できるように電極を配置する１つの実施の形態を示す。図２は、電極配置をした洗浄装置の一の実施の形態を示す概略断面図である。図２に示すようにこの装置は、洗浄液１１を収容する洗浄器１２と制御手段としての電界生成デバイス１０を備え、洗浄器１２内にはメンブレンフィルタ１を保持可能なメンブレンフィルタ保持部１３が形成されている。電界生成デバイス１０は、電極１４とプラス電源１５とから構成され、電極１４はメンブレンフィルタ１の領域に対応する表面に配置されている。

洗浄液１１を洗浄容器１２内に収容した後、電極１４とプラス電源１５とを接続させると、電極１４にプラスの電圧が印加されて表面に電極１４が配置されている領域に電流が流れる。ＤＮＡプローブとミスマッチ結合している標識ＤＮＡは、ＤＮＡプローブとパーフェクトマッチ結合している標識ＤＮＡに比べて結合力が弱くなっているので、ＤＮＡプローブとパーフェクトマッチ結合している標識ＤＮＡは剥がさないで、ＤＮＡプローブとミスマッチ結合している標識ＤＮＡを剥がすように、印可する電圧を調整することによって、領域に結合されたプローブＤＮＡにミスマッチしている標識ＤＮＡを選択的に電極１４により吸引することができる。プラス電源１５をオフにすると、電極１４表面に吸引された標識ＤＮＡは離脱して洗浄液に移り、プローブＤＮＡにミスマッチしている標識ＤＮＡが除去され、図１(e)に示す状態となる。

ＤＮＡプローブとパーフェクトマッチ結合している標識ＤＮＡは剥がさないで、ＤＮＡプローブとミスマッチ結合している標識ＤＮＡを剥がすように調製される印可電圧は、ＤＮＡプローブの長さにもよるが、１〜２Ｖ程度であることが好ましい。なお、印加する電圧は直流であっても交流であってもよい。

図１(e)に示す状態となったところで検出を行う。検出は標識ＤＮＡを標識する標識物質によって異なり、標識物質が蛍光色素である場合には、各領域を励起光によって走査して各領域に選択的に含まれている蛍光物質を励起し、蛍光物質から放出された蛍光をＣＣＤカメラやレーザー＋ＰＭＴ等によって光電的に検出する。また、標識物質が放射性同位体である場合には、各領域に選択的に含まれている放射性標識物質によって蓄積性蛍光体シートの蓄積性蛍光体層を露光し、露光された蓄積性蛍光体層を励起光によって走査して、蓄積性蛍光体層に含まれている蓄積性蛍光体を励起し、蓄積性蛍光体から放出された光を光電的に検出する。さらに、標識物質が酵素のような化学発光標識物質である場合には、各領域に選択的に含まれている化学発光標識物質を化学発光基質と接触させ、化学発光標識物質から放出される化学発光を光電的に検出する。

このようにして検出されたデータは、ミスマッチ結合を起こした標識ＤＮＡが除去された状態から得られたデータであり、ミスマッチ結合している標識ＤＮＡによるノイズのないものである。

以上のように、ＤＮＡプローブに標識ＤＮＡをハイブリダイズさせた後、ＤＮＡプローブと二本鎖を形成していない１本鎖部分の標識ＤＮＡを、エキソヌクレアーゼVIIを作用させることによって、ＤＮＡプローブと標識ＤＮＡとで形成された二本鎖から切り離し、標識ＤＮＡのＤＮＡの長さを担体上で同じ長さとし、その後に電極に電圧を印加して領域に電流を流すので、ＤＮＡプローブとパーフェクトマッチ結合している標識ＤＮＡを剥がすことなく、ＤＮＡプローブとミスマッチ結合している標識ＤＮＡを選択的に剥がすことができ、ミスマッチ結合によるバックグラウンドのノイズを防止することが可能となる。

なお、ここではオリゴヌクレオチドプローブとしてＤＮＡプローブを標識ポリヌクレオチドとして標識ＤＮＡを用いた場合を例にとって説明したが、これに限定されるものではなく、例えばＲＮＡや核酸の前駆体や補酵素などにも用いることができる。

ミスマッチ結合ＤＮＡの除去方法の流れを示す概略図電極配置をした洗浄装置の一の実施の形態を示す概略断面図

符号の説明

１メンブレンフィルタ
２ＤＮＡプローブ
３標識ＤＮＡ
４標識物質
11 洗浄液
14 電極
15 プラス電源

Claims

担体上の複数の領域に固定されたオリゴヌクレオチドプローブに標識物質で標識されたポリヌクレオチドをハイブリダイズさせた後、前記オリゴヌクレオチドプローブと二本鎖を形成していない１本鎖部分の標識ポリヌクレオチドを、１本鎖のＤＮＡに末端から特異的に作用して１本鎖ポリヌクレオチドを分解することができる制限酵素を作用させて、前記オリゴヌクレオチドプローブと前記標識ポリヌクレオチドとで形成された二本鎖から切り離し、その後、前記領域に電圧を印加できるように電極を配置し、該電極に電圧を印加して前記オリゴヌクレオチドプローブとミスマッチ結合している標識ポリヌクレオチドを剥がすことを特徴とするミスマッチ結合ポリヌクレオチドの除去方法。
前記制限酵素がエキソヌクレアーゼVIIであることを特徴とする請求項１記載のミスマッチ結合ポリヌクレオチドの除去方法。