JP2008048705A - 塩基配列の分析方法及び塩基配列分析用プライマー - Google Patents

Abstract

【課題】標的核酸中の特定位置の塩基配列を分析する方法において、簡便でかつ分析精度が高い分析方法を提供する。
【解決手段】標的核酸中の特定位置の塩基配列の３’側に隣接する塩基配列に相補的な塩基配列及び天然型核酸とは結合しない塩基配列であるタグ配列とを有する塩基配列分析用プライマーを用いる。
【選択図】図１

Description

本発明は、標的核酸中の特定位置の塩基配列を分析するための方法及び該方法において用いる塩基配列分析用プライマーに関する。

遺伝子多型には、一塩基多型（ＳＮＰｓ：Single Nucleotide Polymorphism）のほか、二塩基から数十塩基を１単位とする繰り返し塩基配列の反復回数が異なるマイクロサテライト及びＶＮＴＲ（variable number of tandem repeat）、あるいはＡ及びＴの連続塩基配列の個数が異なるＡｎＴｎなどがある。

ヒトのＳＮＰｓは、数百塩基に1つ程度の頻度で見られる遺伝子多型である。これらの変異は、コーディングリージョン、ノンコーディングリージョンを問わず広くゲノム上に散在しており塩基の置換のみならず挿入、欠失も見られる。ヒトゲノムの大きさは３０億塩基対であるから、１０００塩基に1カ所そのような多型があったとしても３００万のＳＮＰｓがあることになる。今のところ1つの薬剤や疾病の感受性と関係のあるＳＮＰｓセットは約３００万カ所のうち、多くて数百カ所、数十カ所程度のタイピングが必要であると考えられている。また、マイクロサテライトやＶＮＴＲ、ＡｎＴｎについても同時に検出しようとすると、サンガー法でＤＮＡシーケンサを用いてタイピングする方法があるが、これだけの数のタイピングを行うためにはシーケンシング反応の試薬や装置が高く、手間もかかるため操作の簡便化が望まれる。

一塩基伸長法とＤＮＡチップを組み合わせた方法は、一度の反応で多数の遺伝子多型を分析できる点で優れている。しかし、検出については、多型に応じて標識されたプライマーを、単に検出すべき標的核酸の塩基配列に相補的な塩基配列を有するプローブを用いて捕捉するにすぎなかった。このため、各プローブの至適ハイブリダイゼーション条件が一定ではなく、偽陽性ハイブリダイゼーションが起こりやすいため、分析の精度に問題を有していた。加えて、従来は、検出すべき標的核酸の種類が変われば、新たにそれら核酸の相補塩基配列を固相化し直さなければならないので、極めて多種類の核酸が検出対象とされる臨床検査に適用するには汎用性が十分ではないという問題をも有していた。

これらの問題を解決するために、検出すべき標的核酸の各塩基配列に、任意に設計したタグ配列、即ちほぼ同じ長さを持ちかつほぼ同じ解離温度を有しさらに標的核酸中に結合しない塩基配列を付加したポリヌクレオチド断片をプライマーとして用い、これを捕捉する方法が開示されている（非特許文献１）。しかし、この方法においても、複数の多型を同時に分析しようとする場合、タグ配列間でのそれぞれの特異性を考慮しなければならない。

タグ配列の設計方法としては、例えば、ほ乳類の多型分析時には捕捉プローブ配列として、ウイルスなどの遺伝的に遠い種の塩基配列で、ほ乳類に類似していない塩基配列を設計する方法が提案されている（特許文献１、２参照）。しかし、全てのタグ配列がほぼ同じ長さを持ちかつ同程度の解離温度を有し、同時に特異性も保つ条件を満たす必要があり、そのためタグ配列を設計するにはなお複雑な計算が必要であった。
Ｊ−Ｂ．ファン（J-B.Fan）、ゲノム・リサーチ（Genome Res.）、１０、８５３−８６０、２０００ 特表２００２−５３９８４９号公報 特表２００３−５２２５２７号公報

上述のように、一塩基伸長法ではタグ配列の設計が分析の精度に大きな影響を与えるため、複数のタグ配列を設計する際に解離温度を同程度にすること、標的核酸中に結合しない塩基配列であること、全てのタグ配列が特異性を保っていること等を考慮する必要があることから、複数のタグ配列の設計が大変困難であり、それ故に実際に使用可能な塩基配列が制限されるという問題があった。

本発明は、標的核酸中の特定位置の塩基配列を分析する方法において、上記課題を解決するものである。

即ち、本発明は、標的核酸中の特定位置の塩基配列の３’側に隣接する塩基配列に相補的な塩基配列及び天然型核酸とは結合しない塩基配列であるタグ配列を有する塩基配列分析用プライマーを用いることを特徴とする塩基配列の分析方法であって、
該標的核酸と該塩基配列分析用プライマーとを適切な条件下でハイブリダイゼーションして、該塩基配列分析用プライマーと該標的核酸との複合体を形成する第１の工程、
第１の工程で得られた複合体中の塩基配列分析用プライマーに該特定位置の塩基配列に相補的な標識されたヌクレオチドを付加する塩基伸長反応を行って標識産物を得る第２の工程、
第２の工程で得られた標識産物を該タグ配列を介して特異的に捕捉する第３の工程、
該標識産物中に含まれる標識の存在又はシグナル強度を測定し、該標識の存在又はシグナル強度を指標として特定位置の塩基配列を解析する第４の工程、
を含む、塩基配列の分析方法を提供するものである。

また、本発明は、前記の塩基配列の分析方法において用いる、標的核酸中の特定位置の塩基配列の３’側に隣接する塩基配列に相補的な塩基配列及び天然型核酸とは結合しない塩基配列であるタグ配列を有する塩基配列分析用プライマーを提供する。

さらに、前記の塩基配列分析用プライマーにおけるタグ配列と選択的な結合が可能な塩基配列を有するタグ捕捉プローブが固定化されたバイオチップを提供する。

本発明の塩基配列分析用プライマーの好ましい１つの形態は、タグ配列が、非天然型のヌクレオチドを有する塩基配列であるものである。より好ましい１つの形態は、前記非天然型のヌクレオチドがＬ型リボース又はＬ型デオキシリボース等の非天然型の糖を有するものである。

本発明を用いることにより非常に簡便にタグ配列を設計することができ、しかも標的核酸の特定位置の塩基配列を精度良く分析することが可能になる。本発明は、一塩基配列の分析や繰り返し塩基配列の反復回数の検出など、塩基配列の分析に広く応用できる。

本発明は、標的核酸中の特定位置の塩基配列を分析する方法であって、該特定位置の塩基配列の３’側に隣接する塩基配列に相補的な塩基配列及び天然型核酸とは結合しない塩基配列であるタグ配列を有する塩基配列分析用プライマーを用いるものであって、
該標的核酸と該塩基配列分析用プライマーとをハイブリダイゼーションして、該塩基配列分析用プライマーと該標的核酸との複合体を形成する第１の工程、
第１の工程で得られた複合体中の塩基配列分析用プライマーに該特定位置の塩基配列に相補的な標識されたヌクレオチドを付加する塩基伸長反応を行って標識産物を得る第２の工程、
第２の工程で得られた該標識産物を該タグ配列を介して特異的に捕捉する第３の工程、
該標識産物中に含まれる標識の存在又はシグナル強度を測定し、該標識の存在又はシグナル強度を指標として特定位置の塩基配列を解析する第４の工程、
を含む、塩基配列の分析方法である。

本発明の塩基配列分析方法について、各工程の順を追って具体的に説明する。

第１の工程は、標的核酸と塩基配列分析用プライマーとをハイブリダイゼーションして、該塩基配列分析用プライマーと該標的核酸との複合体を形成する工程である。

本発明の塩基配列分析方法において用いる塩基配列分析用プライマーは、標的核酸中の特定位置の塩基配列の３’側に隣接する塩基配列に相補的な塩基配列と、天然型核酸とは結合しないタグ配列とを有する塩基配列分析用プライマーである。図１に、塩基配列分析用プライマーを説明するための模式図を示す。標的核酸の分析したい特定位置の塩基配列の３’側に隣接する塩基配列に相補的な塩基配列を持ち、かつ５’末端には天然型核酸とは結合しないタグ配列が付加してある。当該相補的な塩基配列の長さは、通常５〜１００塩基が好ましく、ハイブリダイズの特異性と合成コストを考慮すると１０〜６０塩基がより好ましい。

本発明の塩基配列分析用プライマーは、天然型核酸とは結合しないタグ配列を有するポリヌクレオチドである。天然型核酸と結合しない塩基配列とは、天然型核酸とハイブリダイズしない塩基配列であれば特に限定されない。該塩基配列中のヌクレオチドとして、その糖部、塩基部のいずれか又は両方に天然型核酸と結合しない修飾がなされたヌクレオチドを用いる方法が利用できる。これらのうち、糖部に修飾を施す場合は、例えば、糖の水酸基に適当な官能基を導入する方法や糖自体として非天然型の糖を用いる方法が挙げられる。これらのうち、非天然型のＬ型糖を有するヌクレオチド（以下、Ｌ型ヌクレオチドということがある。）を用いることが好ましく、Ｌ型リボース又はＬ型デオキシリボース非天然型の糖を有するヌクレオチドがより好ましく用いられる。標的核酸となるゲノムをはじめとする二本鎖の天然型ＤＮＡの糖はＤ型であるため、Ｌ型糖を有するポリヌクレオチド（以下、Ｌ型ポリヌクレオチドということがある）とはハイブリダイズしない。さらに、Ｌ型リボースにさらに修飾されていても良く、例えば２’−フルオロリボース、２’−クロロリボース、２’−ｏ−メチルリボース等を用いることができる。核酸塩基に修飾がなされたヌクレオチドとしては、５−プロピニルウラシル、２−アミノアデニンなどが挙げられる。

また、複数の塩基配列分析用プライマーを使用する場合には、タグ配列の塩基配列は、それぞれのタグ配列同士が同程度の解離温度を有していること、それぞれが特異性を有している塩基配列であることが好ましい。このような塩基配列は、天然型の塩基配列においては、発現解析用DNAチップなどとして一般に公開され又は入手可能であり、天然型核酸とは結合しない修飾、例えば非天然型のＬ型糖を導入する塩基配列を選択する際においても、その基となる塩基配列としてこれらを利用し、非天然型の塩基配列に変換して転用することが出来る。

タグ配列の塩基配列の長さに特に限定は無いが、通常５〜１００塩基が好ましくは、ハイブリダイズの特異性と合成コストを考慮すると１０〜６０塩基であることがより好ましい。

天然型核酸とは結合しないタグ配列として用いるＬ型ヌクレオチドは、公知の方法によって合成することが可能である。また、例えば、市販されているBeta-L-deoxy Adenosine (n-bz) CED phosphoramidite、Beta-L-deoxy Cytidine (n-bz) CED phosphoramidite、Beta-L-deoxy Guanosine (n-ibu) CED phosphoramidite、Beta-L-deoxy Thymidine CED phosphoramidite（ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社製）等をそのまま用いることができる。

Ｌ型ヌクレオチドを用いて、通常のＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機、例えば、Applied Biosystems社製 392 DNA／RNA自動合成機を使用して、本発明の塩基配列分析用プライマーを合成することができる。ここで、合成したオリゴヌクレオチドの３’末端アミノ化は、例えば、ＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機により、GLEN RESEARCH社の３’アミノ化修飾用ガラスビーズ支持体（３’−PT Amino−Modifer C6 CPG）を用いることで行うことができる。

本発明の塩基配列分析用プライマーには、標的核酸に相補的な塩基配列とタグ配列との間に、スペーサーを設けておくことが好ましい。スペーサーを設けることにより、特にタグ配列を介して特異的に捕捉する第３の工程において、相補的な塩基配列とタグ配列が近い位置に存在することによる立体的混雑を解消し、塩基配列分析用プライマーとタグ捕捉プローブのハイブリダイゼーション効率が上昇する。

スペーサーとしては、具体的には、天然型または非天然型のポリヌクレオチド鎖、炭化水素鎖、ペプチド鎖、ペプチド核酸糖鎖などがあるが、これらのうち非天然型のポリヌクレオチド鎖が好ましい。ここで用いる非天然型ヌクレオチドとしては、糖が非天然型の糖を有するもの、例えば糖がＬ型リボース又はＬ型デオキシリボースからなるＬ型ヌクレオチドを用いるとよい。Ｌ型ポリヌクレオチドとしては、Ｌ型ポリチミジンが好適に用いられる。チミジン残基は、その電子配置から高次構造を取りにくい性質があるため、分析プライマーのスペーサーとして機能し、標的核酸に相補的な塩基配列部分、タグ配列部分のそれぞれのハイブリダイゼーションが自由に行われるようにする効果がある。スペーサーとして非天然型ポリヌクレオチド鎖を用いる場合、その残基数に限定はなく、塩基配列分析用プライマーの標的核酸に相補的な塩基配列とタグ配列に応じて適宜決定すればよいが、好ましくは３〜１０残基である。

ハイブリダイゼーション反応は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）でアニール反応が行われる通常の条件で行うことができる。ハイブリダイゼーション反応の温度は、用いる塩基配列分析用プライマーの特異性が保たれる範囲であればよく、好ましくは酵素の熱耐性、溶液の塩濃度などに応じて設定する。通常は３０℃から７０℃で実施できる。

第２の工程は、第１の工程で得られた複合体中の塩基配列分析用プライマーに特定位置の塩基配列に相補的な標識ヌクレオチドを付加する塩基伸長反応を行って標識産物を得る工程である。

塩基伸長反応は、通常のＰＣＲで行われる条件であればよい。塩基伸長反応の温度は、用いる塩基配列分析用プライマーの特異性が保たれ、かつ酵素の至適活性範囲であればよいが、好ましくは酵素の熱耐性、溶液の塩濃度などに応じて設定する。通常は３０℃から７０℃で実施できる。

付加する標識ヌクレオチドは、ジデオキシヌクレオチド（ｄｄＮＴＰ）、即ちｄｄＡＴＰ、ｄｄＴＴＰ若しくはｄｄＵＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＣＴＰ、又は、デオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰ）、即ちｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ若しくはｄＵＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰである。ジデオキシヌクレオチドは、デオキシヌクレオチドのデオキシリボースの３’位の水酸基が水素基になっている物質で、ｄＮＴＰの代わりにｄｄＮＴＰが取り込まれるとそれ以上相補鎖が合成されなくなり、特異的なターミネーターの役割を果たす。

分析したい標的核酸中の特定位置の塩基配列が一塩基配列である場合には、図２に一例を示すように、４種類のｄｄＮＴＰのみを用い、これらのうち少なくとも１種類には識別可能な標識を付加したｄｄＮＴＰを用いる。塩基配列分析用プライマーから伸長反応が進行し、特定位置の塩基に相補的なｄｄＮＴＰ（図２ではｄｄGＴＰ）が取り込まれて塩基伸長反応は一塩基で停止する。この際に取り込まれたｄｄＮＴＰの塩基の種類を、標識の存在の有無を確認して特定することにより、標的核酸中の該特定位置の塩基配列を分析することができる。塩基伸長反応時に、相互に識別可能な複数の標識をそれぞれｄｄＮＴＰに付加してあれば、取り込まれたそれぞれの標識の存在を測定することにより、１種類から４種類の同時塩基配列分析も可能である（図２では４種類の全てのｄｄＮＴＰが標識されている）。

分析したい標的核酸中の特定位置の塩基配列が、アデニン、グアニン、シトシン及びチミン若しくはウラシルからなる群から選ばれる１乃至３種類の塩基からなる繰り返し塩基配列、例えばマイクロサテライトなどの繰り返し塩基配列である場合には、図３に一例を示すように、相互に識別可能な標識を付加した、繰り返し塩基配列に含まれる塩基と相補的な全てのデオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰ）と、繰り返し塩基配列に含まれる塩基と相補的でない全てのジデオキシヌクレオチド（ｄｄＮＴＰ）を用いる。塩基配列分析用プライマーから塩基伸長反応が進行し、特定位置に相補的な標識ｄＮＴＰ（図３ではｄＣＴＰ及びｄＡＴＰ）が取り込まれる。やがて繰り返し塩基配列の後に続く繰り返し塩基配列に存在しない塩基が出現した時点で、ｄｄＮＴＰ（図３ではｄｄＴＴＰ又はｄｄＧＴＰ）が取り込まれて塩基伸長反応は停止する。識別可能な標識を付加したｄＮＴＰのシグナル強度を測定することにより、特定位置の繰り返し塩基配列における繰り返し回数を検量することができる。

第２の工程で用いるｄｄＮＴＰ又はｄＮＴＰに付加する識別可能な標識は、公知の標識物が使用可能である。

識別可能な標識物としては、例えば、酵素、蛍光物質、ハプテン、抗原、抗体、放射性物質又は発光団などの標識物が例示される。酵素としては、アルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼなどが挙げられる。蛍光物質としては、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５などのシアニン系蛍光色素のほか、ＦＩＴＣ、６−ＦＡＭ、ＨＥＸ、Ｒ６Ｇ、ＲＯＸ、Ｒ１１０、ＴＥＴ、ＴＡＭＲＡ、テキサスレッド等の蛍光物質、が挙げられる。ハプテンとしては、ビオチン、ジゴキシゲニンなどが挙げられる。放射性物質としては、³²Ｐ、³⁵Ｓなどが挙げられる。発光団としては、ルテニウムなどが挙げられる。これらの中でも、酵素への取り込み効率を標識間で一定にするために、シアニン系蛍光色素や半導体微粒子を用いることが好ましい。

シアニン系蛍光色素としては、異なる励起、蛍光波長をもつＣｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３Ｂ、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７などが市販されている（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス（株））。Ｃｙ２は一般式１において、Ｘ＝Ｏ、ｎ＝１で表され、Ｃｙ３は一般式１において、Ｘ＝Ｃ（ＣＨ_３）_２、ｎ＝１で表され、Ｃｙ５は一般式１において、Ｘ＝Ｃ（ＣＨ_３）_２、ｎ＝２で表され、Ｃｙ７は一般式１において、Ｘ＝Ｃ（ＣＨ_３）_２、ｎ＝３で表され、Ｃｙ３．５は一般式２おいて、ｎ＝１で表され、Ｃｙ５．５は一般式２おいて、ｎ＝２で表され、Ｃｙ３Ｂは一般式３で表される化学構造を有している。ここで、一般式１〜３においてＲおよびＲ’はヌクレオチドと結合する際に適宜選択されて用いられる官能基である。シアニン蛍光色素は、酵素の取り込み効率のばらつきを抑えることができることから好ましく用いることができる。本発明の塩基配列の分析方法においては、励起、蛍光波長や蛍光シグナルの減衰を考慮すると、特にＣｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５を用いることが好適である。

半導体微粒子とは、III−V族原子やII−IV族原子から構成される半導体であって、量子ドットとも呼ばれる。量子サイズによって光学特性が変わることが知られており、多色蛍光標識物として用いられている。例えばZnSe, CdS, CdSe, CdTe, InAs, InP, PbS, Si等が挙げられるが、これに限定されるものではない。CdSeは、結晶径を変えるだけで青から赤まで任意の可視光の波長を作り出すことができるので、好ましく用いられる。また、ZnSe, CdS, CdSe, CdTe, InAs, InP, PbS, Si等は、ZnS, CdSによりコーティングすると蛍光消光が抑えられることから好ましい。

上記の標識物は、プライマーの塩基伸長反応に影響を与えることがなければ、ｄｄＮＴＰ又はｄＮＴＰのどの位置に結合させてもよい。例えば、アデニン、グアニンの場合はプリン骨格の７位または８位、シトシンはピリミジン骨格の５位または６位、チミンはピリミジン骨格の６位、ウラシルのピリミジン骨格の５位または６位に結合させることができる。標識物の結合方法としては特に制限はなく、例えばＧＥヘルスケアバイオサイエンス（株）の「ＣｙＤｙｅカタログ」（２２頁）に記載されているような一般的な方法で標識体を結合することができる。また、市販されているＣｙ３標識ｄｄＮＴＰ、Ｃｙ５標識ｄｄＮＴＰ（（株）パーキンエルマージャパン）、Ｃｙ３標識ｄＮＴＰ、Ｃｙ５標識ｄＮＴＰ（（株）パーキンエルマージャパン）など、入手可能又は既知の標識物が結合されているｄｄＮＴＰ又はｄＮＴＰを用いることも出来る。

塩基伸長反応にはポリメラーゼを用いるが、好ましくは耐熱性のＤＮＡポリメラーゼを用いる。耐熱性のＤＮＡポリメラーゼを用いることにより、温度サイクルで変性、アニール、塩基伸長の工程を複数回繰り返すことによって、取り込み効率の向上を図ることができる。より好ましくは、ジデオキシヌクレオチドの取り込み効率の高いことから、Thermo Sequenase DNA Polymerase（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス（株））またはSequenase Version 2.0 T7 DNA Polymerase（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス（株））が用いられる。

第３の工程は、第２の工程で得られた標識産物を、該標識産物中に含まれる塩基配列分析用プライマーのタグ配列を介して特異的に捕捉する工程である。

標識産物の捕捉は、塩基配列分析用プライマーにおけるタグ配列と選択的な結合が可能な塩基配列を有するタグ捕捉プローブを用いることで実施できる。図４に一例を示すように、タグ配列と特異的に結合する相補的な塩基配列を有するタグ捕捉プローブを用いて、塩基配列分析用プライマーをタグ配列を介して特異的に捕捉する。このタグ捕捉プローブは、支持体に固定化し、バイオチップとして用いることが可能である。即ち、塩基配列分析用プライマーにおけるタグ配列と選択的な結合が可能な塩基配列を有するタグ捕捉プローブが固定化されたバイオチップを用いることで、簡便に標識産物を捕捉することができる。

本発明においてバイオチップとは、生物の遺伝情報を解析するツールの総称であり、マイクロウェル、マイクロアレイ、DNAチップ等があるがこれに限らない。

本発明のタグ捕捉プローブが固定化されたバイオチップとしては、特に構造に限定はないが、ノイズが低減し、ハイブリダイゼーション効率をあげる効果があることから、例えば、図９に示すようなカバーと支持体を有し、図１０に示すような固定化領域に微細な凹凸構造を有する支持体を用いて、該凹凸構造の凸部上面にタグ捕捉プローブを固定化したバイオチップが好ましい。

支持体の材質としては特に制限はないが、例えば、金、ガラス、セラミックス、シリコンなどの無機材料、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリエチレンテレフタレート、酢酸セルロース、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリジメチルシロキサン、シリコンゴム、ゲルなどのポリマー、ビーズ、繊維、中空糸などを挙げることができる。好ましくは、成形が容易な合成ポリマーであり、ＰＭＭＡが、図１０に示す微細な凹凸構造と組み合わせて好適に用いられる。

支持体の成形としては、ポリマー製の場合、射出成形法、ホットエンボス法などの方法、ガラスやセラミックの場合、サンドブラスト法などの方法を用いることができる。また、シリコンの場合は、半導体プロセスで使用される公知の方法が挙げられる。

支持体の凸部の上面へのタグ捕捉プローブの固定化は、支持体がポリマー製である場合、凸部上面を化学処理し、タグ捕捉プローブと結合可能な官能基、例えばアミノ基、ヒドロキシ基、カルボキシル基、アルデヒド基、エポキシ基などを生成させ、これとプローブＤＮＡとを化学結合させることによって行うことができる。例えば支持体がＰＭＭＡ製である場合は、図７に例示するように、アルカリ性溶液及び／又は酸性溶液によって表面処理することにより支持体表面にカルボキシ基を生成させ、図８に例示するように、３’末端をアミノ化したタグ捕捉プローブをこれと化学反応により縮合させることにより、固定化することができる。また、このような官能基の導入は、例えば該表面をプラズマ処理又は放射線処理（例えばγ線、電子線など）するか、これらの処理の後でさらにグラフト重合処理することによって極性基を導入したり、或いは、ポリカチオン（例えばポリーＬ−リシン、シランカップリング剤など）をコートしたりすることによって行うことができる。

本発明のタグ捕捉プローブが固定化されたバイオチップにおいては、支持体とカバーの間の凹部にはビーズ６を含むことができる（図１０）。ビーズ６が存在することによって、液の効率よい攪拌が可能となり、その結果、反応促進効果がもたらされる。ビーズのサイズは、支持体の凹部に複数個のビーズが自由に動きうるようなサイズであれば該凹部の形状に合わせて適宜選択できるが、例えば直径数十〜数百μｍである。ビーズの材質は特に限定されず、例えば、ガラス、セラミック（例えばイットリア安定化ジルコニア）、ステンレス等の金属、ナイロンやポリスチレンなどのポリマーなどが挙げられる。これらの中でも、化学的に安定であり比重も大きいことからセラミックのビーズが好ましい。

本発明のタグ捕捉プローブが固定化されたバイオチップは、通常、固定化領域（スポット）毎にタグ捕捉プローブをそれぞれ一種類ずつ固定化して作製する。例えば、図５に一例を示すように、一つの支持体に複数種類のタグ捕捉プローブを固定化しておくことにより、一塩基配列の分析と繰り返し塩基配列の分析を同時に行うことが可能である。

本発明のバイオチップ上でタグ捕捉プローブと塩基伸長反応により標識を付加された塩基配列分析用プライマーとをハイブリダイゼーションし、余剰物を洗浄することにより、標識産物をバイオチップ上に特異的に捕捉することができる。この場合のハイブリダイゼーションは、一般にはストリンジェントな条件下で行われる。そのような条件は、限定されないが、例えば３０〜５０℃で、３〜４×ＳＳＣ、０．１〜０．５％ＳＤＳ中で１〜２４時間のハイブリダイゼーション、その後の２×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳを含む溶液による洗浄を含むことができる。ここで、１×ＳＳＣは、１５０ｍＭ塩化ナトリウム及び１５ｍＭクエン酸ナトリウムを含む溶液（ｐＨ７．２）である。

第４の工程は、第３の工程で捕捉した標識産物中に含まれる標識の存在又はシグナル強度を測定することにより、標識の存在又はシグナル強度を指標として特定位置の塩基配列を解析する工程である。

分析したい標的核酸中の特定位置の塩基配列が一塩基である場合には、ｄｄＮＴＰの塩基の種類を、標識の存在の有無を確認して特定することにより、標的核酸中の該特定位置の塩基配列を分析することができる。つまり、特定位置の塩基に相補的なｄｄＮＴＰの標識の存在、即ち相補的なｄｄＮＴＰの標識シグナルが測定されれば、該特定位置に該塩基が存在すると判断することができる。

分析したい標的核酸中の特定位置の塩基配列がマイクロサテライトなどの繰り返し塩基配列である場合には、相互に識別可能な標識を付加したｄＮＴＰのシグナル強度を測定することにより、該特定位置の繰り返し塩基配列における繰り返し回数を検量することができる。例えば、図６に一例を示すように縦軸にシグナル強度、横軸に標的核酸の繰り返し回数をとった検量線を用い、測定して得られた標識を付加したｄＮＴＰのシグナル強度から繰り返し回数を検量することができる。

本発明の塩基配列の分析方法が適用できる標的核酸としては、非天然型核酸とは結合しないものであれば特に制限はなく、天然若しくは人工の任意の塩基配列を有する任意の核酸に適用可能である。ここでいう核酸には、cDNA、ゲノムDNA、合成DNA、mRNA、全RNA、hnRNA、合成RNAを含む全てのDNA又はRNAが含まれる。例えば、薬剤代謝関連遺伝子、遺伝病の原因遺伝子、癌関連遺伝子、その他様々な疾患関連遺伝子又はウイルス由来の核酸など、疾病、治療のマーカーとなり得る核酸は、とりわけ好ましい標的核酸である。

標的核酸の試料には、血液、尿、唾液等の体液が含まれるが、体液以外の任意の試料を使用し得る。試料が固体であれば、酵素処理、界面活性剤又は有機溶媒の添加等の適切な方法で液体に溶解させればよい。

上記の他にも、本発明の方法を適用する標的核酸の試料は、随意に変更することができる。例えば、細胞を株化して大量培養したり、末梢血を多めに取得したりすることで本方法に必要なヒトゲノムDNAを大量に調製することにより、直接ゲノムDNA試料とすることができる。また、少量のゲノムDNAを取得し、例えばＧＥヘルスケアバイオサイエンス（株）の試薬キットGenomiPhiのようなWGA法（Whole Genome Amplification ）で、非特異的にゲノムDNAを増幅した試料を用いてもよい。また、PCR法や、マルチプレックスPCR法、アシンメトリックPCR法のようなプライマーを用いて特定の塩基配列を増幅したものを試料としてもよい。特に、ゲノムDNAなどを用いる場合は、予め分析したい特定位置の塩基配列を含む領域をPCRなどで増幅しておいてもよい。例えば、酵素的に増幅する方法により得られた二本鎖試料の場合は、９５℃まで加熱してから４℃に急冷して１本鎖化したり、塩濃度のきわめて低い溶液中で９５℃まで加熱し断片化したり、超音波で断片化したり、制限酵素で切断したりして、１本鎖化及び／又は断片化操作を加えたものを試料としてもよい。

本発明は、以下の実施例によってさらに具体的に説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されないものとする。

以下の実施例、比較例に用いたＬ型糖のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドは、Applied Biosystems 392 DNA／RNA自動合成機で合成した。

ヌクレオチドは、Ｄ型糖のヌクレオチド（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ）のみ、Ｌ型糖のヌクレオチドのみ、又はＤ型糖のヌクレオチドとＬ型糖のヌクレオチドの組合せを用いた。Ｌ型糖のヌクレオチドは、公知の方法によって合成したもの、又は市販されている、Beta-L-deoxy Adenosine (n-bz) CED phosphoramidite、Beta-L-deoxy Cytidine (n-bz) CED phosphoramidite、Beta-L-deoxy Guanosine (n-ibu) CED phosphoramidite、Beta-L-deoxy Thymidine CED phosphoramidite（ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製）を用いた。

合成したオリゴヌクレオチドの３’末端にアミノリンカーを付加する場合には、GLEN RESEARCH社の３’アミノ化修飾用ガラスビーズ支持体（３’−PT Amino−Modifer C6 CPG）を用い、ＤＮＡシンセサイザーにより行った。

（実施例１）
ヒトＩＬ−６遺伝子の一塩基多型で、転写開始点より−１７４番目に存在する塩基配列（Ｇ／Ｃ）と−２０９番目に存在する塩基配列（Ｃ）を、同時に分析した。

分析は、以下の手順（１）〜（８）に沿って行った。

手順（１）オリゴヌクレオチドの準備
ＩＬ−６遺伝子増幅用プライマーとして、配列番号１に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、また配列番号２に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを合成した。

ＩＬ−６遺伝子の転写開始点より−１７４番目の塩基配列分析用プライマーとして配列番号３に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを、また配列番号３のオリゴヌクレオチドのタグ捕捉プローブとして配列番号４に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを合成した。

ＩＬ−６遺伝子の転写開始点より−２０９番目の塩基を標的核酸の特定位置の塩基として分析するための塩基配列分析用プライマーとして、配列番号５に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを、また配列番号５のオリゴヌクレオチドのタグ捕捉プローブとして配列番号６に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを合成した。

配列番号３及び配列番号５のオリゴヌクレオチドは、５’末端から２７塩基はＬ型ヌクレオチド、２８塩基から３’末端まではD型ヌクレオチドからなり、５’末端から２２塩基はタグ配列である。なお、５’末端から２３〜２７塩基は、スペーサーとしてチミジン残基５塩基を配している。Ｄ型ポリヌクレオチド領域は、特定位置の塩基配列の３’側に隣接する塩基配列を有している。即ち、配列番号３のオリゴヌクレオチドのＤ型ポリヌクレオチド領域はＩＬ−６遺伝子の転写開始点より−１７３〜−１４７番目の塩基配列に相補的な塩基配列であり、同じく配列番号５のオリゴヌクレオチドのＤ型ポリヌクレオチド領域は、ＩＬ−６遺伝子の転写開始点より−２０８〜−１８２番目の塩基配列に相補的な塩基配列である。

配列番号４及び配列番号６のオリゴヌクレオチドは、すべてＬ型ヌクレオチドからなり、それぞれ配列番号３及び５のオリゴヌクレオチドのタグ配列と相補的な塩基配列を有するタグ捕捉プローブで、３’末端にアミノリンカーを有する。

なお、配列番号３及び配列番号５のオリゴヌクレオチドのタグ配列は、Ｄ型とＬ型ヌクレオチドの選択性を明確にするために、以下のような特徴的な塩基配列とした。

即ち、配列番号３のオリゴヌクレオチドのタグ配列は、配列番号５のオリゴヌクレオチドのＤ型ポリヌクレオチド領域の一部と同じ塩基配列を有し、配列番号５のオリゴヌクレオチドのタグ配列は、配列番号３のオリゴヌクレオチドのＤ型ポリヌクレオチド領域の一部と同じ塩基配列を有している。

手順（２）タグ捕捉プローブ固定化用支持体の作製
手順（１）で用意したタグ捕捉プローブを固定化する支持体を以下のようにして作製した。

公知の方法であるＬＩＧＡ（Ｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｉｅ Ｇａｌｖａｎｏｆｏｒｍｕｎｇ Ａｂｆｏｒｍｕｎｇ）プロセスを用いて、射出成形用の型を作製し、射出成型法により後述するような形状を有するＰＭＭＡ製のタグ捕捉プローブ固定化用の支持体を得た。なお、この実施例で用いたＰＭＭＡの平均分子量は５万であり、ＰＭＭＡ中には１重量％の割合で、カーボンブラック（三菱化学製 ＃３０５０Ｂ）を含有させており、支持体は黒色である。この黒色支持体の分光反射率と分光透過率を測定したところ、分光反射率は、可視光領域（波長が４００ｎｍから８００ｎｍ）のいずれの波長でも５％以下であり、また、同範囲の波長で、透過率は０．５％以下であった。分光反射率、分光透過率とも、可視光領域において特定のスペクトルパターン（ピークなど）はなく、スペクトルは一様にフラットであった。なお、分光反射率は、ＪＩＳ Ｚ ８７２２の条件Ｃに適合した照明・受光光学系を搭載した装置（ミノルタカメラ製、ＣＭ−２００２）を用いて、支持体からの正反射光を取り込んだ場合の分光反射率を測定した。

支持体（図９及び図１０の符号１）の形状は、大きさが縦７６ｍｍ、横２６ｍｍ、厚み１ｍｍであり、支持体の中央部分を除き表面は平坦であった。支持体の中央に、縦・横２２ｍｍ、深さ０．１５ｍｍの凹んだ部分が設けてあり、この凹みの中に、直径０．１５ｍｍ、高さ０．１５ｍｍの凸部を１２９６（３６×３６）箇所設けた。凹凸部分の凸部上面の高さ（１２９６箇所の凸部の高さの平均値）と平坦部分との高さの差を測定したところ、３μｍ以下であった。また、１２９６個の凸部上面の高さのばらつき（最も高い凸部上面の高さと最も低い凸部上面との高さの差）、さらには、凸部上面の高さの平均値と平坦部上面の高さの差を測定したところそれぞれ３μｍ以下であった。さらに、凹凸部凸部のピッチ（凸部中央部から隣接した凸部中央部までの距離）は０．５ｍｍであった。

手順（３）タグ捕捉プローブの固定化
手順（２）で得たＰＭＭＡ支持体を１０Ｎの水酸化ナトリウム水溶液に７０℃で１２時間浸漬した。これを、純水、０．１ＮのＨＣｌ水溶液、純水の順で洗浄し、支持体表面にカルボキシル基を生成した。この反応スキームを図７に示す。

配列番号４及び配列番号６で示される塩基配列を有するタグ捕捉プローブ（２２塩基、３’末端アミノ化）を、それぞれ純水に０．３ｎｍｏｌ／μｌの濃度で溶かして、ストックソリューションとした。支持体に点着する際は、ＰＢＳ（ＮａＣｌを８ｇ、Ｎａ_２ＨＰＯ_４・１２Ｈ_２Ｏを２．９ｇ、ＫＣｌを０．２ｇ、ＫＨ_２ＰＯ_４を０．２ｇ純水に溶かし１ｌにメスアップしたものにｐＨ調整用の塩酸を加えたもの、ｐＨ５．５）でプローブＤＮＡの終濃度を０．０３ｎｍｏｌ／μｌとし、かつ、支持体表面のカルボン酸とプローブＤＮＡの末端のアミノ基とを縮合させるため、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）を加え、この終濃度を５０ｍｇ／ｍｌとした。そして、これらの混合溶液をアレイヤー（日本レーザー電子製；Ｇｅｎｅ Ｓｔａｍｐ―ＩＩ）で支持体凸部上面の全てにスポットした。次いで、支持体を密閉したプラスチック容器入れて、３７℃、湿度１００％の条件で２０時間程度インキュベートして、純水で洗浄した。この反応スキームを図８に示す。

手順（４）カバーの作製、及び装着、ビーズの装填
射出成型法により貫通孔（図９及び図１０の符号４）を４つ有するカバー（図９及び図１０の符号２；外周部にオーバーハング構造有り）を作製した。手順（３）で得られたタグ捕捉プローブ（図９及び図１０の符号５）を固定化した支持体にＰＤＭＳを塗布し（図９及び図１０の符号３）、その上に作製したカバー２を装着して４２℃で２時間硬化させ、タグ捕捉プローブを固定化したバイオチップを作製した（図９）。このバイオチップに、カバーの貫通孔４から直径１８０μｍのジルコニアビーズ（図１０の符号６；東ソー（株）製；ＴＺＢ１８０）を２０ｍｇ装填した（図１０）。

手順（５）特定すべき一塩基多型を含む領域のＰＣＲによる増幅
配列番号１に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド及び配列番号２に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用いて、核酸抽出キット「ＱＩＡｍｐ」（キアゲン）で培養細胞（ＨＥＫ２９３ ヒト胎児腎臓由来）より抽出したヒトゲノムＤＮＡ試料からＩＬ−６遺伝子の一部をＰＣＲで増幅した。これらのＤＮＡ試料は、通常の塩基配列決定方法により、予めＩＬ−６遺伝子の転写開始点より−１７４番目の塩基配列はG、同じく−２０９番目の塩基配列はＣであることを確認した。ＰＣＲにはＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡績）を用い、メーカー指定の条件で３５サイクルの増幅反応を実施した。もっとも、このＰＣＲは単に遺伝子の特定領域を増幅することが目的であるため、ＰＣＲの方法や酵素の種類に特段の制限はない。その後、GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス（株））により精製し、余剰のｄＮＴＰｓを除いた。

ここで、ＰＣＲには、常法に従い、３０μＭフォワードプライマー（配列番号１） １μｌ、３０μＭリバースプライマー（配列番号２） １μｌ、１０×ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ ｆｏｒ ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ− １０μｌ、２ｍＭｄＮＴＰｓ１０μｌ、２５ｍＭＭｇＳＯ_４ ４μｌ、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ２ｕｎｉｔｓ、抽出ＤＮＡ溶液 ４５０ｎｇを、純粋で１００μｌにメスアップしたものを用いた。また、PCRは、９４℃・２分、９４℃・３０秒／５５℃・３０秒／６８℃・３０秒を３５サイクル行い、反応後は４℃で保存した。

手順（６）特異的なｄｄＮＴＰの取り込み反応
手順（５）で得られたＰＣＲ産物に、配列番号３と５のオリゴヌクレオチド、Ｃｙ３またはＣｙ５で標識されたｄｄＮＴＰ(Ｃｙ３−ｄｄＮＴＰまたはＣｙ５−ｄｄＮＴＰ)、非標識ｄｄＮＴＰ、ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅなどを加え、ｄｄＮＴＰの取り込みを行った。今回は検出したい塩基種がＧまたはＣであるため、Ｃｙ３−ｄｄＧＴＰ、Ｃｙ５−ｄｄＣＴＰ、ｄｄＴＴＰ（ｄｄＵＴＰでも可）、ｄｄＡＴＰを使用した。また、ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅにはサンガー法に広く使用されている改変型Ｔ７ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ」（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）を使用した。

ここで、ｄｄＮＴＰ取り込み反応には、０．３μＭIＬ−６−１７４塩基配列分析用プライマー（配列番号３）及びＩＬ−６−２０９塩基配列分析用プライマー（配列番号５）各２μｌ、Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ ２μｌ、ＰＣＲ産物（カラム精製後）８００ｎｇ、１０μＭＣｙ３−ｄｄＧＴＰ １μｌ、１０μＭＣｙ５−ｄｄＣＴＰ １μｌ、１０μＭｄｄＴＴＰ １μｌ、１０μＭｄｄＡＴＰ １μｌ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ １．０ｕｎｉｔｅｓを、純粋で２０μｌにメスアップしたものを用いた。また、ｄｄＮＴＰｓ取り込み反応は、９５℃・２分、９５℃・１５秒／６０℃・３０秒を３０サイクル行い、反応後は４℃で保存した。

手順（７）ハイブリダイゼーション
終濃度が、１重量％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、５×ＳＳＣ、０．１重量％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、０．０１重量％サケ精子ＤＮＡの溶液となるようにハイブリダイゼーション用のストック溶液を調製した。

手順（６）の取り込み反応液９．３μｌを９５℃で５分間熱変性し、氷中で急冷した。これに前記のハイブリダイゼーション用ストック液を３０．７μｌ加え、マイクロピペットを用いてハイブリダイゼーション用の溶液４０μｌを貫通孔より注入した。その後、カプトンテープ（アズワン ５−５０１８−０１）で貫通孔を塞ぎ、チャンバー（ＴａＫａＲａ製、Ｔａｋａｒａ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｃｈａｍｂｅｒ ５ Ｎｏ．ＴＸ７１１）にセットした。シェイカー（ＥＹＥＬＡ製、Ｍｕｌｔｉ Ｓｈａｋｅｒ ＭＭＳ）にチャンバーを固定化し、４２℃、１６時間インキュベートした。シェイカーの回転数は２３０ｒｐｍとし、シェイカーの回転面とチャンバーが平衡になるようにした。

インキュベート後、支持体からカバーとＰＤＭＳを脱離後に支持体を洗浄、乾燥した。

手順（８）蛍光強度の測定
ＤＮＡチップ用のスキャナー（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社のＧｅｎｅＰｉｘ ４０００Ｂ）に手順（７）の処理後の支持体をセットし、レーザー出力３３％、フォトマルチプライヤーの電圧設定を５００にした状態で蛍光強度の測定を行った。ここで、蛍光強度とはスポット内の蛍光強度の平均値であり、バックグラウンドノイズとは、プローブＤＮＡを固定化していない凸部の蛍光強度である。

蛍光強度の測定結果を図１１に示す。縦軸はスキャナーで測定した目的のスポットの蛍光強度を、バックグラウンドノイズで割った値（ｓｉｇｎａｌ／ｎｏｉｓｅ）を示した。分析したいタグ捕捉プローブを固定化したスポットのＣｙ３とＣｙ５のｓｉｇｎａｌ／ｎｏｉｓｅを計算し、タグ捕捉プローブ毎に、Ｃｙ３の値を白い棒、Ｃｙ５の値を黒い棒で示した。

図１１より、配列番号４のタグ捕捉プローブからは、Ｃｙ３の蛍光が特異的に検出され、配列番号６のタグ捕捉プローブからはＣｙ５の蛍光が特異的に検出された。これにより、前者がＧ、後者はＣを取り込んだことが判明し、塩基分析が精度良く行われたことが確認できた。

（比較例１）
配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６のオリゴヌクレオチドの代わりに配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９及び配列番号２０のオリゴヌクレオチドを用いた以外は、実施例１の手順（１）〜（８）と同様に行った。

結果を図１２に示す。図の見方は実施例１の図１１と同様である。

配列番号４のタグ捕捉プローブからは、Ｃｙ３とＣｙ５が共に検出され、また配列番号６のタグ捕捉プローブからもＣｙ３とＣｙ５が共に検出され、塩基配列分析を行うことが出来なかった。

配列番号４のタグ捕捉プローブは、配列番号３のタグ配列部分だけではなく、配列番号５のタグ配列以外の領域とも相補的な塩基配列であるため、両者とクロスハイブリを起こしたと考えられる。

また逆に、配列番号６のタグ捕捉プローブは、配列番号５のタグ配列だけではなく、配列番号３のタグ配列以外の領域とも塩基配列としては相補的であるため、両者とクロスハイブリを起こしたと考えられる。

実施例１と比較例１の塩基配列分析用プライマーとタグ捕捉プローブの塩基配列は全く同じであるが、実施例１ではタグ配列とタグ捕捉プローブをＬ型ヌクレオチドで作製しているので、比較例１の様にクロスハイブリ起こすことはなく、塩基配列分析が精度良く行えることが確認できたのに対し、比較例１のようにタグ配列とタグ捕捉プローブをＤ型ヌクレオチドで作製する場合には、クロスハイブリに傾注する必要があることが示された。

（実施例２）
ヒトＩＬ−６遺伝子のＡｎＴｎ解析、転写開始点より−３９６番目付近の塩基配列、即ちＡｎＴｎ配列のＡの数を分析した。実施例１の手順（１）〜（８）のうち、手順（１）、（３）、（５）、（６）で使用したオリゴヌクレオチドを変更し、手順（６）で用いる標識ヌクレオチドを変更した以外は、実施例１と同様に行った。

手順（１）オリゴヌクレオチドの準備
ＩＬ−６遺伝子増幅用プライマーとして、配列番号７に示される配列を有するオリゴヌクレオチド、配列番号８に示される配列を有するオリゴヌクレオチドを合成した。

ＩＬ−６遺伝子の転写開始点より−３９６番目の塩基配列分析用プライマーとして配列番号９に示される配列を有するオリゴヌクレオチドを、配列番号９のオリゴヌクレオチドのタグ捕捉プローブとして配列番号１０に示される配列を有するオリゴヌクレオチドを合成した。

配列番号９のオリゴヌクレオチドは、５’末端から２７塩基はＬ型ヌクレオチド、２８塩基から３’末端まではD型ヌクレオチドからなり、５’末端から２２塩基はタグ配列である。なお、５’末端から２３〜２７塩基は、スペーサーとしてチミジン残基５塩基を配している。

Ｄ型ポリヌクレオチド領域は、特定位置の塩基配列の３’側に隣接する塩基配列を有している。即ち、配列番号９のオリゴヌクレオチドのＤ型ポリヌクレオチド領域はＩＬ−６遺伝子の転写開始点より−３９５〜−３７１番目の塩基配列に相補的な塩基配列である。

また、配列番号９のオリゴヌクレオチドのタグ配列は、配列番号９のオリゴヌクレオチドのＤ型ポリヌクレオチド領域の一部と同じ塩基配列になるようにした。

配列番号１０のオリゴヌクレオチドは、すべてＬ型ヌクレオチドからなり、配列番号９のオリゴヌクレオチドのタグ配列と相補的な塩基配列を有するタグ捕捉プローブで、３’末端にアミノリンカーを有する。

配列番号１０のタグ捕捉プローブを実施例１と同様に支持体に固定化した。

手順（２）タグ捕捉プローブ固定化用支持体の作製、手順（３）タグ捕捉プローブの固定化、手順（４）カバーの作製、及び装着、ビーズの装填は、実施例１と同様に行った。

手順（５）特定すべきＡｎＴｎ配列を含む領域のＰＣＲによる増幅
プライマーとして、配列番号１のオリゴヌクレオチド及び配列番号２のオリゴヌクレオチドの代わりに、配列番号７に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド及び配列番号８に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーに用いたこと以外は、実施例１と同様に行った。

これらのＤＮＡ試料は、通常の塩基配列決定方法により、あらかじめＩＬ−６ＡｎＴｎの塩基配列を確認しており、Ａ８Ｔ１１、即ち、ＩＬ−６遺伝子の転写開始点より−３９６番目の塩基配列はＡである。

手順（６）特異的なｄｄＮＴＰの取り込み反応
手順(５)で得られたＰＣＲ産物に、配列番号９のオリゴヌクレオチド、Ｃｙ３またはＣｙ５で標識したｄｄＮＴＰ(Ｃｙ３−ｄｄＮＴＰまたはＣｙ５−ｄｄＮＴＰ)、非標識ｄｄＮＴＰ、ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅなどを加え、ｄｄＮＴＰの取り込みを行った。今回はＡｎＴｎ配列を決定するので、Ｃｙ３−ｄｄＡＴＰ、Ｃｙ５−ｄｄＵＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰを使用した。また、ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅにはサンガー法に広く使用されている改変型Ｔ７ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ「Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ」（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）を使用した。

ここで、ｄｄＮＴＰ取り込み反応には、０．３μＭ塩基配列分析用プライマー （配列番号９）２μｌ、Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ ２μｌ、ＰＣＲ産物（カラム精製後）８００ｎｇ、１０μＭＣｙ３−ｄｄＡＴＰ １μｌ、１０μＭＣｙ５−ｄｄＵＴＰ １μｌ、１０μＭｄｄＣＴＰ １μｌ、１０μＭｄｄＧＴＰ １μｌ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ １．０ｕｎｉｔｅｓを、純粋で２０μｌにメスアップしたものを用いた。また、ｄｄＮＴＰｓ取り込み反応は、実施例１と同様に行った。

手順（７）ハイブリダイゼーション、（８）蛍光強度の測定については、実施例１と同様に行った。

結果を図１３に示す。図の見方は実施例１の図１１と同様である。

配列番号１０のタグ捕捉プローブからは、Ｃｙ５の光が特異的に検出され、これによりＴを取り込んだことが判明し、塩基分析が精度良く行われたことが確認できた。

（実施例３）
ヒトＨｅｍｅ ｏｘｙｇｅｎａｓｅ−１（ＨＯ−１）のＧＴ繰り返し塩基配列分析、転写開始点より−２７０番目付近に存在するＧＴ繰り返し塩基配列を分析した。実施例１の手順（１）〜（８）のうち、手順（１）、（３）、（５）、（６）で使用したオリゴヌクレオチドを変更し、手順（６）で用いる標識ヌクレオチドを変更した以外は、実施例１と同様に行った。

手順（１）オリゴヌクレオチドの準備
ＨＯ−１遺伝子増幅用プライマーとして、配列番号１１に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、配列番号１２に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを合成した。

ＨＯ−１遺伝子の転写開始点より−２７０番目の塩基配列分析用プライマーとして配列番号１３に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを、配列番号１３のオリゴヌクレオチドのタグ捕捉プローブとして配列番号１４に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを合成した。

さらに、ＨＯ−１遺伝子の転写開始点より−２７０番目の塩基配列分析用プライマーとして配列番号１５に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを、配列番号１５のオリゴヌクレオチドのタグ捕捉プローブとして配列番号１６に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを合成した。

配列番号１３及び配列番号１５のオリゴヌクレオチドは、５’末端から２７塩基はＬ型ヌクレオチド、２８塩基から３’末端まではD型ヌクレオチドからなり、５’末端から２２塩基はタグ配列である。なお、５’末端から２３から２７塩基は、スペーサーとしてチミジン残基５塩基を配している。

Ｄ型ポリヌクレオチド領域は、特定位置の塩基配列の３’側に隣接する塩基配列を有している。即ち、配列番号１３および配列番号１５のオリゴヌクレオチドのＤ型ポリヌクレオチド領域はＨＯ−１遺伝子のＧＴ塩基配列の下流２６塩基に相補的な塩基配列である。

配列番号１４及び配列番号１６のオリゴヌクレオチドは、すべてＬ型ヌクレオチドからなり、それぞれ配列番号１３及び配列番号１５のオリゴヌクレオチドのタグ配列と相補的な塩基配列を有するタグ捕捉プローブで、３’末端にアミノリンカーを有する。

また、配列番号１３のオリゴヌクレオチドに付加したタグ配列は配列番号１３のオリゴヌクレオチドのＤ型ポリヌクレオチド領域の一部と同じ塩基配列で、配列番号１５のオリゴヌクレオチドに付加したタグ配列は配列番号９のオリゴヌクレオチドのタグ配列と全く同じ塩基配列であり、従って、配列番号１６と配列番号１０のオリゴヌクレオチドの塩基配列は完全に同一であるので、配列番号１６のオリゴヌクレオチドはここでは合成していない。

配列番号１４及び配列番号１６のタグ捕捉プローブを実施例１と同様に支持体に固定化した。

手順（２）タグ捕捉プローブ固定化用支持体の作製、手順（３）タグ捕捉プローブの固定化、手順（４）カバーの作製、及び装着、ビーズの装填は実施例１と同様に行った。

手順（５）特定すべきＧＴ塩基配列を含む領域のPCRによる増幅
プライマーとして、配列番号１のオリゴヌクレオチド及び配列番号２のオリゴヌクレオチドの代わりに、配列番号１１に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド及び配列番号１２に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーに用いたことと、ヒトゲノム試料としてＨＥＫ２９３細胞に加えて、ＨＬ−６０（末梢血前骨髄球）も用いたこと以外は、実施例１と同様に行った。

手順（６）特異的なｄＮＴＰ、ｄｄＮＴＰの取り込み反応
手順(５)で準備したＰＣＲ産物に、配列番号１３又は配列番号１５のオリゴヌクレオチド、Ｃｙ３またはＣｙ５標識ｄＮＴＰ(Ｃｙ３−ｄＮＴＰまたはＣｙ５−ｄＮＴＰ)、非標識ｄｄＮＴＰ、ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅなどを加え、ｄＮＴＰ、ｄｄＮＴＰの取り込みを行った。今回はＧＴ塩基配列を分析するので、Ｃｙ３−ｄＡＴＰ、Ｃｙ５−ｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＴＴＰを使用した。また、ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅにはサンガー法に広く使用されている改変型Ｔ７ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ「Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ」（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）を使用した。

ここで、ｄＮＴＰ、ｄｄＮＴＰ取り込み反応には、ＨＥＫ２９３細胞の場合は、０．３μＭＨＯ−１ ＧＴ塩基配列分析用プライマー（配列番号１３）２μｌ、Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ ２μｌ、ＰＣＲ反応液（ＨＥＫ２９３カラム精製後）８００ｎｇ、１０μＭＣｙ３−ｄＡＴＰ １μｌ、１０μＭＣｙ３−ｄＣＴＰ １μｌ、１０μＭｄｄＧＴＰ １μｌ、１０μＭｄｄＴＴＰ １μｌ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ １．０ｕｎｉｔｅｓを、純粋で２０μｌにメスアップしたものを用いた。ＨＬ−６０の場合は、０．３μＭＨＯ−１ ＧＴ塩基配列分析用プライマー（配列番号１５）２μｌ、ＲｅａｃｔｉｏｎＢｕｆｆｅｒ ２μｌ、ＰＣＲ反応液（ＨＬ−６０、カラム精製後）８００ｎｇ、１０μＭＣｙ３−ｄＡＴＰ １μｌ、１０μＭＣｙ３−ｄＣＴＰ １μｌ、１０μＭｄｄＧＴＰ １μｌ、１０μＭｄｄＴＴＰ １μｌ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ １．０ｕｎｉｔｅｓを、純粋で２０μｌにメスアップしたものを用いた。また、ｄＮＴＰ、ｄｄＮＴＰｓ取り込み反応は、実施例１と同様に行った。

手順（７）ハイブリダイゼーションは、手順（６）で行った２種類の取り込み反応液を４．６５μｌずつ使用したこと以外は、実施例１と同様に行った。

手順（８）蛍光強度の測定については、実施例１と同様に行った。

結果を図１４に示す。図の見方は実施例１の図１１と同様である。

配列番号１４のタグ捕捉プローブのＣｙ３、Ｃｙ５のｓｉｇｎａｌ／ｎｏｉｓｅと、配列番号１６のタグ捕捉プローブのｓｉｇｎａｌ／ｎｏｉｓｅを計算し、既知の繰り返し回数を有するサンプルを用いて作製しておいた図６の検量線より繰り返し塩基配列の繰り返し回数を検量すると、ＨＥＫ２９３細胞の場合の繰り返し塩基配列の繰り返し回数は２８回、ＨＬ−６０細胞の場合の繰り返し塩基配列の繰り返し回数は２０回であることが判明した。

塩基配列分析用プライマーの模式図と、該塩基配列分析用プライマーの標的核酸へのハイブリダイゼーションを例示する模式図である。 塩基配列分析用プライマーに、特定位置の一塩基配列に相補的な標識ヌクレオチドを付加する塩基伸長反応を例示する模式図である。 塩基配列分析用プライマーに、特定位置の繰り返し塩基配列に相補的な標識ヌクレオチドを付加する塩基伸長反応を例示する模式図である。 支持体に固定化されたタグ捕捉プローブを用いて、塩基配列分析用プライマーを含む標識産物を特異的に捕捉する工程を例示する模式図である。 支持体に固定化された複数のタグ捕捉プローブを用いて、塩基配列分析用プライマーを含む標識産物を特異的に捕捉する工程を例示する模式図である。 繰り返し塩基配列の繰り返し回数とシグナル強度の関係を示すグラフである。 ＰＭＭＡ支持体の表面処理により支持体表面にカルボキシ基を生成させ化学反応スキームである。 ＰＭＭＡ支持体表面のカルボキシ基とアミノ化プローブＤＮＡとの縮合反応スキームである。 支持体とカバーとを含むタグ捕捉プローブが固定化された本発明のバイオチップのの概略を例示する斜視図及び断面図である。 本発明のタグ捕捉プローブが固定化されたバイオチップの一例の断面図である。 実施例１の蛍光強度の測定結果を示すグラフである。 比較例１の蛍光強度の測定結果を示すグラフである。 実施例２の蛍光強度の測定結果を示すグラフである。 実施例３の蛍光強度の測定結果を示すグラフである。

符号の説明

１ 支持体
２ カバー
３ 接着層（ＰＤＭＳ）
４ 貫通孔
５ 支持体に固定化されたタグ捕捉プローブ
６ ビーズ

Claims (9)

1. 標的核酸中の特定位置の塩基配列を分析する方法であって、
   該特定位置の塩基配列の３’側に隣接する塩基配列に相補的な塩基配列及び天然型核酸とは結合しない塩基配列であるタグ配列を有する塩基配列分析用プライマーを用い、
   該標的核酸と該塩基配列分析用プライマーとをハイブリダイゼーションして、該塩基配列分析用プライマーと該標的核酸との複合体を形成する第１の工程、
   第１の工程で得られた複合体中の塩基配列分析用プライマーに該特定位置の塩基配列に相補的な標識されたヌクレオチドを付加する塩基伸長反応を行って標識産物を得る第２の工程、
   第２の工程で得られた標識産物を該タグ配列を介して特異的に捕捉する第３の工程、
   該標識産物中に含まれる標識の存在又はシグナル強度を測定し、該標識の存在又はシグナル強度を指標として特定位置の塩基配列を解析する第４の工程、
   を含む、塩基配列の分析方法。
2. 前記塩基配列分析用プライマーにおけるタグ配列が、非天然型ヌクレオチドを有する塩基配列である、請求項１に記載の塩基配列の分析方法。
3. 前記非天然型ヌクレオチドが非天然型の糖を有するものである、請求項２に記載の塩基配列の分析方法。
4. 前記非天然型の糖がＬ型リボース又はＬ型デオキシリボースのいずれかである、請求項３に記載の塩基配列の分析方法。
5. 前記の標的核酸中の特定位置の塩基配列が一塩基配列であって、前記第２の工程が、特定位置の塩基配列に相補的な標識されたヌクレオチドとして、該一塩基配列に相補的な標識されたジデオキシヌクレオチドを用いて塩基伸長反応を行って標識産物を得る工程である、請求項１〜４のいずれかに記載の塩基配列の分析方法。
6. 前記の標的核酸中の特定位置の塩基配列がアデニン、グアニン、シトシン及びチミン若しくはウラシルからなる群から選ばれる１乃至３種類の塩基からなる繰り返し塩基配列であって、前記第２の工程が、特定位置の塩基配列に相補的な標識されたヌクレオチドとして、該繰り返し塩基配列に相補的な標識されたデオキシヌクレオチド及び該繰り返し塩基配列に相補的でない非標識のジデオキシヌクレオチドとを用いて塩基伸長反応を行って標識産物を得る工程であって、該デオキシヌクレオチドが互いに異なる標識を有するものである、請求項１〜４のいずれかに記載の塩基配列の分析方法。
7. 前記第２の工程で用いる特定位置の塩基配列に相補的な標識ヌクレオチドの標識物質がシアニン系蛍光色素又は半導体微粒子である、請求項１〜５のいずれかに記載の塩基配列の分析方法。
8. 請求項１〜７のいずれかに記載の塩基配列の分析方法において用いる、該標的核酸中の特定位置の塩基配列の３’側に隣接する塩基配列に相補的な塩基配列及び天然型核酸とは結合しないタグ配列を有する塩基配列分析用プライマー。
9. 請求項８に記載の塩基配列分析用プライマーにおけるタグ配列と選択的な結合が可能な塩基配列を有するタグ捕捉プローブが固定化されたバイオチップ。
   

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