JP4308521B2 - Ｄ−セリンの製造法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
技術分野
本発明は、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)ＤＨ５α株の有するＬ−セリンデアミナーゼ活性より高いＬ−セリンデアミナーゼ活性を有するように改変された微生物の細胞、該細胞の培養物またはそれらの処理物を、ＤＬ−セリンを含有する媒体中、ＤＬ−セリンに接触させてＬ−セリンを分解させ、残存するＤ−セリンを該媒体中から採取することを特徴とするＤ−セリンの製造法および該製造法に係る微生物に関する。Ｄ−セリンはＤ−サイクロセリン等の有用医薬品の合成中間体として有用な化合物である。
【０００２】
【従来の技術】
背景技術
Ｄ−セリンに関しては、以下の製造法が知られている。
(i) ＤＬ−ヒドロキシメチルヒダントインを微生物によってＮ−カルバミル−Ｄ−セリンとした後、加水分解してＤ−セリンを得る方法(特開昭61-152291)。
(ii) ＤＬ−セリンを含有する培地中でキャンディダ属、トルロプシス属、クリプトコッカス属、サッカロマイコプシス属、ハンゼヌラ属、エッシェリヒア属、クレブシェラ属、プロビデンシア属、ミクロバクテリウム属、またはセラチア属に属しＬ−セリンを資化しＤ−セリンを実質的に資化しない微生物を培養し、培養液中からＤ−セリンを単離する方法(特開昭64-2594)。
(iii) チロシナーゼ活性を有する微生物をＤＬ−セリンとフェノールを含有する反応液に作用させ、Ｌ−セリンをＬ−チロシンに変換し、残存したＤ−セリンを採取する方法(特開平5-91895)。
【０００３】
これらの製造法はいずれも工業的なＤ−セリンの製法として用いるには難点がある。即ち、(i)の方法では、ＤＬ−ヒドロキシメチルヒダントインからのＮ−カルバミル−Ｄ−セリンの収率が40%と低い上、触媒用に多量の菌体を必要とする点、(ii)の方法では、反応終了後もＬ−セリンが残存しており、結局ＤＬ−セリンの分割を要する点、(iii)の方法では、基質濃度が1%と低い上、有害なフェノールを反応に必要とする点、などがこれら製造法の工業的利用を難しくしている。
【０００４】
エシェリヒア・コリが、Ｌ−セリンをアンモニアとピルビン酸と水に分解するＬ−セリンデアミナーゼ活性を有していることは知られている〔J. Bacteriol., 171, 5095-5102 (1989)、Eur. J. Biochem., 212, 777-784 (1993)〕。しかし、エシェリヒア・コリより抽出された該酵素は反応時に鉄や還元剤の添加など複雑な条件を必要とすることが報告されており〔J. Bacteriol., 162, 1270-1275 (1985)〕、該精製酵素をＤ−セリン製造に用いることは実用的ではない。
【０００５】
またエシェリヒア・コリはＤ−セリンを分解するＤ−セリンデアミナーゼ活性も有していることが知られている〔J. Bacteriol., 121, 1092-1101 (1975)〕。したがって、エシェリヒア・コリを用いて、Ｌ−セリンデアミナーゼにより、ＤＬ−セリンから生産されたＤ−セリンは、該Ｄ−セリンデアミナーゼにより分解されてしまい、生産効率が低下することがあった。
【０００６】
以上、従来公知の方法においては、ＤＬ−セリンからＤ−セリンを効率よく生産する方法は確立されていない。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
発明の開示
本発明の目的は、工業的に有利なＤ−セリンの製造法を提供することにある。
本発明者は、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)ＤＨ５α株に比べて高いＬ−セリンデアミナーゼ活性を有するように改変されたエシェリヒア・コリからＬ−セリンデアミナーゼの抽出または精製を行うことなく、該菌体または菌体処理物をＤＬ−セリンに接触させることによって、意外にもＤ−セリンをほとんど減じることなく迅速にＬ−セリンを検出限界以下にまで分解消去でき、Ｄ−セリンを工業的に製造できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明は以下（１）〜(１２)に関する。
（１） エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)ＤＨ５α株の有するＬ−セリンデアミナーゼ活性より高いＬ−セリンデアミナーゼ活性を有するように改変された微生物の細胞、該細胞の培養物またはそれらの処理物を、ＤＬ−セリンを含有する媒体中、ＤＬ−セリンに接触させてＬ−セリンを分解させ、残存するＤ−セリンを該媒体中から採取することを特徴とするＤ−セリンの製造法。
（２） エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)ＤＨ５α株の有するＬ−セリンデアミナーゼ活性より高いＬ−セリンデアミナーゼ活性を有するように改変された微生物を、ＤＬ−セリンを含有する培地に培養し、Ｌ−セリンを分解させ、該培養物より残存するＤ−セリンを採取することを特徴とするＤ−セリンの製造法。
【０００９】
（３） 改変された微生物が、Ｌ−セリンデアミナーゼ活性を有する微生物を変異処理して得られる変異微生物である上記（１）または（２）のＤ−セリンの製造法。
（４） 改変された微生物が、Ｌ−セリンデアミナーゼ遺伝子を微生物に組み込んで得られる形質転換体である上記（１）または（２）のＤ−セリンの製造法。
（５） 改変された微生物のＬ−セリンデアミナーゼ活性が、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)ＤＨ５α株の有するＬ−セリンデアミナーゼ活性に比べて２倍以上である上記（１）〜（４）いずれか１つのＤ−セリンの製造法。
【００１０】
（６）改変された微生物のＬ−セリンデアミナーゼ活性が、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)ＤＨ５α株の有するＬ−セリンデアミナーゼ活性に比べて５倍以上である上記（１）〜（４）いずれか１つのＤ−セリンの製造法。
（７） Ｌ−セリンデアミナーゼ遺伝子が、エシェリヒア・コリ由来のsdaA遺伝子またはsdaB遺伝子である上記（４）のＤ−セリンの製造法。
（８） 改変された微生物が、エシェリヒア・コリに属する微生物である上記（１）〜（７）いずれか１つのＤ−セリンの製造法。
【００１１】
（９） 改変された微生物が、Escherichia coli DH5α/pHIB、Escherichia coli NM522/pHIA1、Escherichia coli MM294/pHIA1（FERM BP-7309）、Escherichia coli MM294/pHIA2（FERM BP-7310）、Escherichia coli MM294/pHIB（FERM BP-7311）およびEscherichia coli ME5386/pHIA2からなる群から選ばれる微生物である上記（１）〜（８）いずれか１つのＤ−セリンの製造法。
（１０） 改変された微生物が、Ｄ−セリンデアミナーゼ活性の低い、もしくは活性を有しない微生物である上記（１）〜（９）いずれか１つのＤ−セリンの製造法。
（１１） エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）に属し、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)ＤＨ５α株の有するＬ−セリンデアミナーゼ活性より高いＬ−セリンデアミナーゼ活性を有するように改変された微生物。
（１２） 微生物が、Escherichia coli DH5α/pHIB、Escherichia coli NM522/pHIA1、Escherichia coli MM294/pHIA1（FERM BP-7309）、Escherichia coli MM294/pHIA2（FERM BP-7310）、Escherichia coli MM294/pHIB（FERM BP-7311）およびEscherichia coli ME5386/pHIA2からなる群から選ばれる微生物である上記（１１）の微生物。
【００１２】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
１．エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)ＤＨ５α株に比べて高いＬ−セリンデアミナーゼ活性を有するように改変された微生物の取得
本発明で用いる、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)ＤＨ５α株（東洋紡社製、以下すべておなじ）に比べて高いＬ−セリンデアミナーゼ活性を有するように改変された微生物（以下、改変された微生物と略す）は以下に述べる方法で取得することができる。
【００１３】
改変される微生物（以下、親株という）はＬ−セリンデアミナーゼ活性を有する微生物であっても、Ｌ−セリンデアミナーゼ活性を有していない微生物であってもいずれでもよい。
【００１４】
親株が、Ｌ−セリンデアミナーゼ活性を有している場合は、以下に述べる（１）または（２）記載の方法により、改変された微生物を得ることができる。
該親株がＬ−セリンデアミナーゼ活性を有していない場合には、以下に述べる（２）記載の方法により、改変された微生物を得ることができる。
なお、本発明の製造法では、高収率でＤ−セリンを製造することができるので、Ｄ−セリンデアミナーゼによるＤ−セリンの分解があったとしても、なお、高収率でＤ−セリンを製造することができる。
したがって、親株のＤ−セリンデアミナーゼ活性はあってもなくてもいずれでもよい。
【００１５】
（１）変異処理法による取得
改変された微生物は、親株に変異処理を行い、突然変異を生じさせることにより得られる微生物（以下、変異微生物と略す）より得ることができる。
変異処理法は、通常用いられる方法であればいずれの方法でもよい。例えば、変異処理剤を用いる方法、紫外線照射法などがあげられる。
変異処理剤を用いる方法としては、例えば、N-メチル-N'-ニトロ-N-ニトロソグアニジン(NTG)を用いる方法（微生物実験マニュアル、131頁、1986年、講談社サイエンティフィック社）が好ましく用いられる。
変異処理された微生物を下記に述べる方法で培養し、Ｌ−セリンデアミナーゼ活性がエシェリヒア・コリ(Escherichia coli)ＤＨ５α株より向上した微生物を選択することにより、改変された微生物を得ることができる。
【００１６】
Ｌ−セリンデアミナーゼ活性は少なくともエシェリヒア・コリ(Escherichia coli)ＤＨ５α株の有するＬ−セリンデアミナーゼ活性より向上していればよく、好ましくは２倍以上、さらに好ましくは５倍以上向上していることが望ましい。
Ｌ−セリンデアミナーゼ活性の測定は、Meth. Enzymol., 17B, 346(1971)、Meth. Enzymol., 17B, 351 (1971)等に記載されている方法に準じて行うことができる。また、簡便法として、下記に述べる方法をあげることができる。
【００１７】
すなわち、改変された微生物をＤＬ−セリンと接触させた後に、反応液中に残存するＬ−セリンの量を測定し、単位時間あたりに減少したＬ−セリンの量を算出することで測定することができる。
例えば、反応開始から反応中のある時間までのＬ−セリンの減少量すなわち分解量を測定し、得られた分解量の値を反応時間で割ることにより、単位時間当たりのＬ−セリンの分解量を算定し、得られた値をＬ−セリンデアミナーゼ活性とすることができる。
【００１８】
具体的には、得られた変異微生物を３０℃で１日間培養して得られる培養液を遠心分離して菌体を取得する。培地は、該変異微生物を培養できる培地であればいずれの培地も用いることができる。該菌体を50mmol/Lのリン酸バッファー（pH7.5）に懸濁し、遠心分離して得られる菌体（湿菌体重量約２ｇ）を反応に用いる。
ＤＬ−セリンを50g/L含むリン酸バッファー（pH7.5）に得られた菌体を懸濁し、37℃で10時間〜22時間反応を行う。反応終了後、Ｄ−セリンおよびＬ−セリンの濃度をHPLCにより定量し、バッファー中の含量を算定する。
【００１９】
（２）遺伝子組換えによる方法
以下に述べる方法で、Ｌ−セリンデアミナーゼ遺伝子を取得し、該遺伝子を宿主細胞に組み込むことにより、改変された微生物を得ることができる。
（ａ） Ｌ−セリンデアミナーゼ遺伝子の取得
公知のエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）のＬ−セリンデアミナーゼ遺伝子配列〔J. Bacteriol., 171, 5095-5102 (1989)、Eur. J. Biochem., 212, 777-784 (1993)〕をもとに、Ｌ−セリンデアミナーゼ遺伝子をクローニングすることができる。以下に、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）のＬ−セリンデアミナーゼ遺伝子sdaA、sdaBの取得法を例に説明するが、Ｌ−セリンデアミナーゼ遺伝子の取得源は、Ｌ−セリンデアミナーゼ活性を有する微生物であればエシェリヒア・コリに限定されない。
【００２０】
例えば、以下の方法により取得することができる。
エシェリヒア・コリ、例えばEscherichia coli W3110株をエシェリヒア・コリの培養に適した培地、例えばLB培地〔バクトトリプトン(Difco社製) 10g、酵母エキス(Difco社製) 5g、NaCl 5gを水1リットルに含みpH7.2に調整した培地〕を用い、常法に従って培養する。培養後、培養物より遠心分離により菌体を取得する。
取得した菌体より公知の方法〔例えば、Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)、以下、モレキュラー・クローニング 第３版という〕に従い染色体ＤＮＡを単離する。
【００２１】
J. Bacteriol., 171, 5095-5102 (1989)またはEur. J. Biochem., 212, 777-784 (1993)に記載されたＬ−セリンデアミナーゼ遺伝子の塩基配列情報を利用し、sdaA遺伝子またはsdaB遺伝子に対応する塩基配列を含有するセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーをＤＮＡ合成機を用いて合成する。
得られたセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーおよび染色体ＤＮＡを用いてPCR法にてＤＮＡ断片を増幅する。該増幅ＤＮＡ断片をプラスミドに導入可能とするために、センスプライマーおよびアンチセンスプライマーの5'末端には適切な制限酵素サイト、例えばBamHI等の制限酵素サイトを付加させることが好ましい。
【００２２】
該センスプライマーとアンチセンスプライマーの組み合わせとしては、例えば、配列番号１および２記載の塩基配列を有する２種類のプライマーの組み合わせと配列番号１および３記載の塩基配列を有する２種類のプライマーの組み合わせ(sdaA用)、配列番号４および５記載の塩基配列を有する２種類のプライマーの組み合わせ (sdaB用)等をあげることができる。
染色体ＤＮＡを鋳型として、これらプライマー、TaKaRa LA-PCR TM Kit Ver.2 (宝酒造社製)またはExpand TM High-Fidelity PCR System(Boehringer Mannheim社製)を用い、DNA THermal Cycler(Perkin Elmer Japan社製)でPCRを行う。
【００２３】
PCRの条件として、上記プライマーが２ｋｂ以下のＤＮＡ断片の場合には９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒〜１分間、７２℃で２分間からなる反応工程を１サイクルとして、２ｋｂを超えるＤＮＡ断片の場合には９８℃で２０秒間、６８℃で３分間からなる反応工程を１サイクルとして、いずれも３０サイクル行った後、７２℃で７分間反応させる条件をあげることができる。
PCRにより増幅されたＤＮＡ断片とエシェリヒア・コリで増幅可能なベクターとを、制限酵素を用い、上記プライマーで付与した制限酵素サイトと同じサイトで切断後、アガロースゲル電気泳動、シュークロース密度勾配超遠心分離等を行いＤＮＡ断片を回収する。
【００２４】
回収したＤＮＡ断片を用い、常法、例えば、モレキュラー・クローニング 第２ 版、Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38, John Wiley & Sons (1987-1997)：以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー サプルメントと略す、DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University Press (1995)等に記載された方法により、あるいは市販のキット、例えばSuperScript Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning（Life Techcologies社製）やZAP-cDNA Synthesis Kit〔Stratagene社製〕を用いクローニングベクターを作製し、作製したクローニングベクターを用い、エシェリヒア・コリ、例えばEscherichia coli DH5α株（東洋紡社製）を形質転換する。
【００２５】
エシェリヒア・コリを形質転換するためのクローニングベクターとしては、エシェリヒア・コリK12株中で自律複製できるものであれば、ファージベクター、プラスミドベクター等いずれでも使用できる。エシェリヒア・コリ用の発現ベクターをクローニングベクターとして用いてもよい。具体的には、ZAP Express〔Stratagene社、Strategies, 5, 58 (1992)〕、pBluescript II SK(+)〔Nucleic Acids Research, 17, 9494 (1989)〕、Lambda ZAP II（Stratagene社製）、λgt10、λgt11〔DNA Cloning, A Practical Approach, 1, 49 (1985)〕、λTriplEx（Clontech社製）、λExCell（Pharmacia社製）、pT7T318U（Pharmacia社製）、pcD2〔Mol. Cell. Biol., 3, 280 (1983) 〕、pMW218（和光純薬工業社製）、pUC118、pSTV28（宝酒造社製）、pEG400〔J. Bacteriol., 172, 2392 (1990)〕、pHMV1520（MoBiTec社製）、pQE-30（QIAGEN社製）等をあげることができる。
【００２６】
得られた形質転換株より、目的とする遺伝子を含有するプラスミドを常法、例えば、モレキュラー・クローニング 第３版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー サプルメント、DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University Press (1995)等に記載された方法により取得することができる。
上記方法によりＬ−セリンデアミナーゼ活性を有する蛋白質をコードする遺伝子を含むプラスミドを取得することができる。該プラスミドとして、例えば、実施例に示すpHIA1、pHIA2、pHIBをあげることができる。
【００２７】
同様な方法で、ゲノムのＤＮＡ塩基配列が公知な生物からＬ−セリンデアミナーゼ遺伝子を取得することができる。また、ゲノムのＤＮＡ塩基配列が知られていない生物であっても、適当なベクターを用いてエシェリヒア・コリを宿主として染色体ＤＮＡライブラリーを作成し、このライブラリーの各株についてＬ−セリンデアミナーゼ活性を調べることによって、Ｌ−セリンデアミナーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを含むプラスミドを取得することができる。
【００２８】
（ｂ）Ｌ−セリンデアミナーゼ遺伝子の発現方法
上記のようにして得られたＬ−セリンデアミナーゼをコードするＤＮＡを宿主細胞中で発現させるためには、まず、目的とするＬ−セリンデアミナーゼをコードするＤＮＡを、制限酵素類あるいはＤＮＡ分解酵素類で切断して、コード領域を含む適当な長さのＤＮＡ断片とした後に、該ＤＮＡ断片を発現ベクター中のプロモーターの下流に挿入し、次いで該ＤＮＡを挿入した発現ベクターを、発現ベクターに適合した宿主細胞中に導入する。
宿主細胞としては、原核生物、酵母、動物細胞、昆虫細胞等、目的とする遺伝子を発現できるものは全て用いることができる。
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組込みが可能で、上記目的とするＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。
【００２９】
細菌、放線菌等の原核生物を宿主細胞として用いる場合は、上記ＤＮＡを発現させるための発現ベクターは該原核生物中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、上記ＤＮＡおよび転写終結配列より構成された組換えベクターであることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
【００３０】
発現ベクターとしては、例えば、pBTrp2、pBTac1、pBTac2（いずれもBoehringer Mannheim社製）、pKK233-2（Pharmacia社製）、pSE280（Invitrogen社製）、pGEMEX-1（Promega社製）、pQE-8（QIAGEN社製）、pQE-30（QIAGEN社製）、pKYP10（特開昭58-110600）、pKYP200〔Agric. Biol. Chem., 48, 669 (1984)〕、pLSA1〔Agric. Biol. Chem., 53, 277 (1989)〕、pGEL1〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4306 (1985)〕、pBluescriptII SK+、pBluescriptII SK(-)（Stratagene社製）、pTrS30(FERM BP-5407)、pTrS32(FERM BP-5408)、pGEX（Pharmacia社製）、pET-3（Novagen社製）、pTerm2(USP4686191、USP4939094、USP5160735)、pSupex、pUB110、pTP5、pC194、pUC18〔Gene, 33, 103 (1985)〕、pUC19〔Gene, 33, 103 (1985)〕、pSTV28(宝酒造社製)、pSTV29（宝酒造社製）、pUC118（宝酒造社製）、pPA1（特開昭63-233798）、pEG400〔J. Bacteriol., 172, 2392(1990)〕、pQE-30（QIAGEN社製）、PHY300(宝酒社製),pHW1520（MoBiTec社製）等を例示することができる。
【００３１】
プロモーターとしては、宿主細胞中で発現できるものであればいかなるものでもよい。例えば、trpプロモーター（Ｐtrp）、lacプロモーター（Ｐlac）、PLプロモーター、PRプロモーター、PSEプロモーター等の、エシェリヒア・コリやファージ等に由来するプロモーター、SPO1プロモーター、SPO2プロモーター、penPプロモーター等をあげることができる。またＰtrpを２つ直列させたプロモーター（Ｐtrpｘ２）、tacプロモーター、letIプロモーター、lacT7プロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。さらにバチルス属細菌中で発現させるためのxylAプロモーターやコリネバクテリウム属細菌中で発現させるためのP54-1プロモーターなども用いることができる。
【００３２】
リボソーム結合配列としては、宿主細胞中で発現できるものであればいかなるものでもよいが、シャイン−ダルガノ（Shine-Dalgarno）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６〜１８塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。
転写・翻訳を効率的に行なうため、Ｌ−セリンデアミナーゼ活性を有する蛋白質のＮ末端またはその一部を欠失した蛋白質と発現ベクターのコードする蛋白質のＮ末端部分を融合させた蛋白質を発現させてもよい。
目的とする蛋白質の発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、好適には構造遺伝子直下に転写終結配列を配置することが望ましい。
【００３３】
宿主細胞としては、エッシェリヒア（Escherichia）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属、バチルス（Bacillus）属、ミクロバクテリウム（Microbacterium）属、セラチア（Serratia）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、アグロバクテリウム（Agrobacterium）属、アリシクロバチルス（Alicyclobacillus）属、アナバエナ（Anabaena）属、アナシスティス（Anacystis）属、アースロバクター（Arthrobacter）属、アゾバクター（Azobacter）属、クロマチウム（Chromatium）属、エルウイニア（Erwinia）属、メチロバクテリウム（Methylobacterium）属、ホルミディウム（Phormidium）属、ロドバクター（Rhodobacter）属、ロドシュードモナス（Rhodopseudomonas）属、ロドスピリルム（Rhodospirillum）属、セネデスムス（Scenedesmus）属、ストレプトミセス（Streptomyces）属、シネココッカス（Synnechococcus）属、ザイモモナス（Zymomonas）属等に属する微生物をあげることができる。
【００３４】
例えば、Escherichia coli、Bacillus subtilis、Brevibacterium immariophilum、Brevibacterium saccharolyticum、Brevibacterium flavum、Brevibacterium lactofermentum、Corynebacterium glutamicum、Corynebacterium acetoacidophilum、Microbacterium ammoniaphilum、Serratia marcescens、Agrobacterium rhizogenes、Arthrobacter aurescens、Arthrobacter nicotianae、Arthrobacter sulfureus、Arthrobacter ureafaciens、Erwinia carotovora、Erwinia herbicola、Methylobacterium extorquens、Phormidium sp.、Rhodobacter sphaeroides、Rhodospirillum rubrum、Streptomyces aureofaciens 、Streptomyces griseus、Zymomonas mobilis等をあげることができる。
【００３５】
さらに具体的には、Escherichia coli XL1-Blue（Stratagene社製）、Escherichia coli XL2-Blue（Stratagene社製）、Escherichia coli DH1（モレキュラークローニング 第２版、p505）、Escherichia coli DH5α（東洋紡社製）、Escherichia coli MC1000[Mol. Biol.,138,179-207 (1980)]、Escherichia coli W1485(ATCC12435)、Escherichia coli JM109（Stratagene社製）、Escherichia coli HB101(東洋紡社製)、Escherichia coli W3110(ATCC14948)、Escherichia coli NM522（Stratagene社製）、Bacillus subtilis ATCC33712、Bacillus sp. FERM BP-6030、Brevibacterium immariophilum ATCC14068、Brevibacterium saccharolyticum ATCC14066、Brevibacterium flavum ATCC14067、Brevibacterium lactofermentum ATCC13869、Corynebacterium glutamicum ATCC13032、Corynebacterium glutamicum ATCC14297、Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870、Microbacterium ammoniaphilum ATCC15354、Serratia marcescens ATCC13880、Agrobacterium rhizogenes ATCC11325、Arthrobacter aurescens ATCC13344、Arthrobacter nicotianae ATCC15236、Arthrobacter sulfureus ATCC19098、Arthrobacter ureafaciens ATCC7562、Erwinia carotovora ATCC15390、Erwinia herbicola ATCC21434、Methylobacterium extorquens DSM1337、Phormidium sp. ATCC29409、Rhodobacter sphaeroides ATCC21286、Rhodospirillum rubrum ATCC11170、Streptomyces aureofaciens ATCC10762 、Streptomyces griseus ATCC10137、Zymomonas mobilis ATCC10988等をあげることができる。
【００３６】
Ｄ−セリンデアミナーゼ活性の低い微生物またはＤ−セリンデアミナーゼ活性の欠損した微生物としては、たとえばEscherichia coli ME5386株（国立遺伝研から入手可能）があげられる。
【００３７】
組換えベクターの宿主細胞への導入方法としては、宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができる。例えば、カルシウムイオンを用いる方法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)〕、プロトプラスト法（特開昭63-248394）、エレクトロポレーション法またはGene, 17, 107 (1982)やMolecular & General Genetics, 168, 111 (1979)に記載の方法等をあげることができる。
【００３８】
酵母を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、YEp13（ATCC37115）、YEp24（ATCC37051）、YCp50（ATCC37419）、pHS19、pHS15等を例示することができる。
プロモーターとしては、酵母中で発現できるものであればいかなるものでもよく、例えば、PHO5プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーター、gal 1プロモーター、gal 10プロモーター、ヒートショック蛋白質プロモーター、MFα1プロモーター、CUP1プロモーター等のプロモーターをあげることができる。
【００３９】
宿主細胞としては、サッカロミセス（Saccharomyces）属、シゾサッカロミセス（Schizosaccharomyces）属、クリュイベロミセス（Kluyveromyces）属、トリコスポロン（Trichosporon）属、シュワニオミセス（Schwanniomyces）属、ピヒア（Pichia）属、キャンディダ（Candida）属等に属する微生物、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、クリュイベロミセス・ラクチス（Kluyveromyces lactis）、トリコスポロン・プルランス（Trichosporon pullulans）、シュワニオミセス・アルビウス（Schwanniomyces alluvius）、キャンディダ・ユーティリス（Candida utilis）等をあげることができる。
【００４０】
組換えベクターの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法〔Methods in Enzymol., 194, 182 (1990)、スフェロプラスト法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978)〕、酢酸リチウム法〔J. Bacteriol., 153, 163(1983)〕、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978)に記載の方法等をあげることができる。
【００４１】
動物細胞を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、pcDNAI、pcDM8（フナコシ社製）、pAGE107〔特開平3-22979；Cytotechnology, 3, 133, (1990)〕、pAS3-3（特開平2-227075）、pCDM8〔Nature, 329, 840, (1987)〕、pcDNAI/Amp（Invitrogen社製）、pREP4（Invitrogen社製）、pAGE103〔J. Biochem., 101, 1307 (1987)〕、pAGE210等を例示することができる。
【００４２】
プロモーターとしては、動物細胞中で発現できるものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス（ヒトＣＭＶ）のＩＥ（immediate early）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター等をあげることができる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
宿主細胞としては、ナマルバ細胞、HBT5637（特開昭63-000299）、COS1細胞、COS7細胞、CHO細胞等をあげることができる。
【００４３】
動物細胞への組換えベクターの導入法としては、動物細胞にＤＮＡを導入できる方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポーレーション法〔Cytotechnology, 3, 133 (1990)〕、リン酸カルシウム法（特開平2-227075）、リポフェクション法〔Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84, 7413 (1987)〕、Virology, 52, 456 (1973)に記載の方法等を用いることができる。形質転換体の取得および培養は、特開平2-227075号公報あるいは特開平2-257891号公報に記載されている方法に準じて行なうことができる。
【００４４】
昆虫細胞を宿主細胞として用いる場合には、例えばBaculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, W. H. Freeman and Company, New York (1992)、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー サプルメント、Bio/Technology, 6, 47 (1988)等に記載された方法によって、蛋白質を発現することができる。即ち、組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、蛋白質を発現させることができる。
【００４５】
該方法において用いられる遺伝子導入ベクターとしては、例えば、pVL1392、pVL1393、pBlueBacIII（ともにInvitrogen社製）等をあげることができる。
バキュロウイルスとしては、例えば、夜盗蛾科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus)等を用いることができる。
昆虫細胞としては、Spodoptera frugiperdaの卵巣細胞であるSf9、Sf 21〔Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, W. H. Freeman and Company, New York (1992)〕、Trichoplusia niの卵巣細胞であるHigh5（Invitrogen社製）等を用いることができる。
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への上記組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法（特開平2-227075）、リポフェクション法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)〕等をあげることができる。
【００４６】
遺伝子の発現方法としては、直接発現以外に、モレキュラー・クローニング 第２版に記載されている方法等に準じて、分泌生産、融合蛋白質発現等を行うことができる。
酵母、動物細胞または昆虫細胞により発現させた場合には、糖あるいは糖鎖が付加された蛋白質を得ることができる。
【００４７】
２．改変された微生物の培養
上記１で得られる本発明の改変された微生物を培地に培養する方法は、宿主細胞の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。本発明の改変された微生物がエシェリヒア・コリ等の原核微生物、酵母菌等の真核微生物である場合、これら微生物を培養する培地は、該微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれでもよい。
【００４８】
炭素源としては、それぞれの改変された微生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノールなどのアルコール類が用いられる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、等の各種無機酸や有機酸のアンモニウム塩、その他含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕、大豆粕加水分解物、各種発酵菌体およびその消化物等が用いられる。
【００４９】
無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が用いられる。
培養は、振盪培養または深部通気攪拌培養などの好気的条件下で行う。培養温度は15〜50℃がよく、培養時間は、通常16時間〜7日間である。培養中ｐＨは、3.0〜9.0に保持する。ｐＨの調整は、無機あるいは有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニアなどを用いて行う。
【００５０】
また培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、lacプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル-β-Ｄ-チオガラクトピラノシド(IPTG)等を、trpプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸(IAA)等を、xylAプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養する時にはキシロースを、それぞれ培地に添加してもよい。
【００５１】
本発明の改変された微生物が動物細胞である場合、該改変された動物細胞を培養する培地としては、一般に使用されているRPMI1640培地〔The Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967)〕、EagleのMEM培地〔Science, 122, 501 (1952)〕、DMEM培地〔Virology, 8, 396 (1959)〕、199培地〔Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73, 1(1950)〕またはこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等が用いられる。
培養は、通常pH6〜8、30〜40℃、5% CO2存在下等の条件下で1〜7日間行う。
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００５２】
本発明の改変された微生物が昆虫細胞である場合、該改変された昆虫細胞を培養する培地としては、一般に使用されているTNM-FH培地〔PharMingen社製〕、Sf-900 II SFM培地（GIBCO BRL社製）、ExCell400、ExCell405〔いずれもJRH Biosciences社製〕、Grace's Insect Medium〔Grace, T.C.C., Nature, 195, 788 (1962)〕等を用いることができる。
培養は、通常pH6〜7、25〜30℃等の条件下で、1〜5日間行う。
また、培養中必要に応じて、ゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００５３】
３．Ｄ−セリンの製造
ＤＬ−セリンを含有する媒体中、改変された微生物をＤＬ−セリンに接触させてＬ−セリンを分解させ、残存したＤ−セリンを該媒体中から採取することによりＤ−セリンを製造することができる。
形質転換体および変異微生物におけるＬ−セリンデアミナーゼ活性増強の程度は、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)ＤＨ５α株に比較して増強されている必要があり、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)ＤＨ５α株の有するＬ−セリンデアミナーゼ活性より強ければよいが、好ましくは２倍以上、さらに好ましくは５倍以上であることが望ましい。
【００５４】
また、Ｄ−セリンデアミナーゼ活性の低い、または該活性を有しない株を用いることにより、Ｄ−セリンの製造の効率を上げることができる。
L-セリンデアミナーゼ活性の測定は上記１．（１）で述べたとおりである。
これらの微生物を用いたＤ−セリンの製造は、以下の方法で行うことができる。
すなわち、上記方法で得られる改変された微生物の細胞、該細胞の培養物またはそれらの処理物（以下、酵素源という）を、媒体中でＤＬ−セリンに接触させる。
【００５５】
細胞または該細胞の処理物としては、細胞の乾燥物、凍結乾燥物、界面活性剤処理物、酵素処理物、超音波破砕物、機械的摩砕物、溶媒処理物などの細胞処理物、培養物の濃縮物、乾燥物などの培養処理物、細胞の蛋白質分画物、細胞および細胞処理物の固定化物、あるいは細胞より得られる精製酵素等があげられる。
改変された微生物とＤＬ−セリンとの接触は、該改変された微生物を培養する培地にあらかじめＤＬ−セリンを添加する方法を用いてもよいし、培養中にＤＬ−セリンを添加する方法を用いてもよい。また、該改変された微生物を培養して得られた酵素源を、ＤＬ−セリンを含有する媒体に添加してもよい。
【００５６】
改変された微生物を培養する培地中にＤＬ−セリンを添加する場合、ＤＬ−セリンは培地1mlあたり1〜300mg、好ましくは30〜100mgを培養の開始時または途中に添加する。培養は上記（２）で述べた条件下で行うことができる。
改変された微生物より得られる酵素源とＤＬ−セリンを媒体中で接触させる場合は、該酵素源の量は、当該酵素源の比活性等により異なる。例えば、酵素源として該改変された微生物の細胞を用いる場合は、ＤＬ−セリン1mgあたり湿菌体として5〜1000ｍｇ、好ましくは10〜400ｍｇ添加する。
【００５７】
接触反応は20〜50℃で行なうことが好ましく、特に25℃〜37℃で行なうことが好ましい。反応時間は用いる酵素源の量および比活性等により異なるが、通常２〜150時間、好ましくは5〜60時間である。
媒体としては、水もしくは水性媒体、有機溶媒または水もしくは水性媒体と有機溶媒の混合液が用いられる。水性媒体としては、例えばリン酸緩衝液、HEPES（N-2-ヒドロキシエチルピペラジン-N-エタンスルホン酸）緩衝液、トリス［トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン］塩酸緩衝液等の緩衝液が用いられる。有機溶媒としては反応を阻害しないものであればいずれでもよく、例えば、アセトン、酢酸エチル、ジメチルスルホキシド、キシレン、メチルアルコール、エチルアルコール、ブタノール等が用いられる。
【００５８】
ＤＬ−セリンを媒体中に添加する場合、ＤＬ−セリンを溶解することのできる水もしくは水性媒体、有機溶媒、または水もしくは水性媒体と有機溶媒の混合液にＤＬ−セリンを溶解し、媒体中に添加してもよいし、粉末または細粒状のまま添加してもよい。
反応媒体からのＤ−セリンの採取は、通常の有機合成化学で用いられる方法、例えば、有機溶媒による抽出、結晶化、薄層クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等により行うことができる。
【００５９】
本発明により得られるＤ−セリンの確認または定量方法は、Ｄ−セリンを確認または定量できる方法であればいずれの方法も用いることができるが、例えば、13C-NMRスペクトル、1H-NMRスペクトル、マススペクトル、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)等の方法により行うことができる。
以下に本発明の実施例を示すが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００６０】
【実施例】
発明を実施するための最良の形態
実施例１
１）Ｌ−セリンデアミナーゼ遺伝子の取得
Escherichia coli W3110株（ATCC14948）を１白金耳、10ｍLのLB培地に植菌し、30℃で一晩培養した。培養後、得られた培養液より遠心分離（3,000rpm、10分間）により菌体を取得した。該菌体より、常法（モレキュラー・クローニング 第２版に記載の方法）に従い染色体ＤＮＡを単離精製した。
【００６１】
Ｌ−セリンデアミナーゼをコードする遺伝子であるsdaA〔J. Bacteriol., 171, 5095-5102 (1989)〕の有する塩基配列情報をもとにセンスプライマーとアンチセンスプライマーの組み合わせである配列番号１および２記載の塩基配列を有する２種類のプライマー、配列番号１および３記載の塩基配列を有する２種類のプライマー、およびsdaAと同様にＬ−セリンデアミナーゼをコードする遺伝子であるsdaB〔Eur. J. Biochem., 212, 777-784 (1993)〕の有する塩基配列情報をもとに配列番号４および５記載の塩基配列を有する２種類のプライマーをそれぞれＤＮＡ合成機を用いて合成した。
【００６２】
染色体ＤＮＡを鋳型として、これらプライマー、pfu polymerase cloned(Stratagene社製)およびpfu polymerase 10 X Reaction Buffer (standard buffer)を用い、DNA Thermal Cycler(Perkin Elmer Japan社製)でPCRを行った。
PCRは94℃で30秒間、55℃で30秒〜1分間、72℃で2分間からなる反応工程を1サイクルとして、30サイクル行った後、72℃で7分間反応させる条件で行った。PCRで増幅されたＤＮＡ断片は、いずれも制限酵素HindIIIと制限酵素BamHIで処理した。処理後これらの制限酵素処理ＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動にかけ、各制限酵素で処理されたＤＮＡ断片を取得した。
【００６３】
２）組換え体ＤＮＡの製造
アンピシリン耐性遺伝子とTrpプロモータを有するベクタープラスミドpTrS30 (FERM BP-5407より常法により抽出)を制限酵素HindIIIおよびBamHIで消化後、アガロースゲル電気泳動を行い、HindIII‐BamHI処理pTrS30断片を取得した。
上記で取得されたHindIII‐BamHI処理ＤＮＡ断片とHindIII‐BamHI処理pTrS30断片を混合した後、ライゲーション反応を行うことにより組換え体ＤＮＡを取得した。
【００６４】
該組換え体ＤＮＡを用い、Escherichia coli DH5α株（東洋紡社製）を常法に従って形質転換後、該形質転換体を、アンピシリン100μg/mLを含むLB寒天培地[バクトトリプトン(Difco社製) 10g、酵母エキス(Difco社製) 5g、NaCl 5gを水1リットルに含み、pH7.2に調整され、寒天を1.5%になるように添加された培地]に塗布し、30℃で１日間培養した。
該培地上で生育した形質転換体のコロニー数個ずつを、アンピシリン100μg／ｍLを含むLB培地10mLで30℃で１日間培養した。
【００６５】
得られた培養液を遠心分離することにより菌体を取得した。該菌体より常法に従ってプラスミドを単離した。
HindIII‐BamHI処理ＤＮＡ断片（配列番号１および２記載の塩基配列を有する２種類のプライマーの組み合わせでPCR増幅して得られたＤＮＡ断片）とHindIII‐BamHI処理ｐTrS30断片とを連結して得られたプラスミドをｐHIA1、HindIII‐BamHI処理ＤＮＡ断片（配列番号１および３記載の塩基配列を有する２種類のプライマーの組み合わせでPCR増幅して得られたＤＮＡ断片）とHindIII‐BamHI処理ｐTrS30断片とを連結して得られたプラスミドをｐHIA2、HindIII‐BamHI処理ＤＮＡ断片（配列番号４および５記載の塩基配列を有する２種類のプライマーの組み合わせでPCR増幅して得られたＤＮＡ断片）とHindIII‐BamHI処理ｐTrS30断片とを連結して得られたプラスミドをｐHIB1とそれぞれ命名した。
【００６６】
３）形質転換体の製造
このようにして得られたプラスミドを常法に従ってEscherichia coli NM522(Stratagene社製)、Escherichia coli MM294(ATCC33625)およびＤ−セリンデアミナーゼ活性を欠損したEscherichia coli ME5386株(国立遺伝研より入手)に導入した。
これらの菌株のうち、pHIA1を保有するEscherichia coli MM294/pHIA1、pHIA2を保有するEscherichia coli MM294/pHIA2、およびpHIBを保有するEscherichia coli MM294/pHIBは、ブタペスト条約に基づき、それぞれFERM BP-7309、FERM BP-7310、FERM BP-7311として独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター：日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（旧：工業技術院生命工学工業技術研究所：日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号）に平成１２年９月２８日付けで寄託されている。
【００６７】
実施例２ Ｌ−セリンデアミナーゼの発現およびＤ−セリンの製造
上記のようにして得られた形質転換体およびＬ−セリンデアミナーゼ遺伝子を含まないプラスミドpTrS30を有するEscherichia coli DH5α/pTrS30株を、アンピシリン100μg/mLを含むLB培地100ｍLで30℃、1日間培養した。得られた培養液を遠心分離して菌体を取得し、これを50mmol/Lのリン酸バッファー（pH7.5）に再び懸濁し、遠心分離して得られる菌体（湿菌体重量約2g）を反応に用いた。
ＤＬ−セリンを50g/L含むリン酸バッファー（pH7.5）に上記の菌体を懸濁し、37℃で10時間〜22時間反応を行った。
【００６８】
反応開始時、反応中および反応終了後に反応液中のＤ−セリンおよびＬ−セリンの濃度をHPLCにより定量した。
HPLCの条件は以下のとおりである。
カラム：CRAWNPAK CR(+) （Daicel Chemical Industries, Ltd.）
移動層：過塩素酸水溶液(pH 1.0)
流速：0.2mL/分
カラム温度：2℃
【００６９】
検出はオルトフタルアルデヒド(OPA)を用いたポストカラム誘導体化法〔J. Chromatogr., 33, 353-355 (1973)〕を用いた。
第１表に結果を示した。
【００７０】
【表１】
【００７１】
反応開始後10、11または12時間目の反応液中のＬ−セリン濃度を求め、反応開始時の反応液中のＬ−セリン濃度との差をＬ−セリンの総分解量として示した。
Ｌ−セリンの総分解量を反応開始からの時間（10、11または12時間）で割った値をＬ−セリンデアミナーゼ活性として、Escherichia coli DH5α/pTrS30株のＬ−セリンデアミナーゼ活性を1.0とした場合の各菌株の活性を相対活性として示した。
【００７２】
第１表から明らかなように、Escherichia coli ME5386/pHIA2株について反応開始後12時間目、Escherichia coli DH5α/pHIB株およびEscherichia coli NM522/pHIA1株について反応開始後21時間目、Escherichia coli NM294/pHIA2株について反応開始後22時間目のＬ−セリン濃度およびＤ−セリン濃度を測定したところ、反応液中のＬ−セリン残量はゼロであり、Ｄ−セリンのみが残存していた。
【００７３】
【発明の効果】
産業上の利用可能性
本発明により、ＤＬ−セリンから、Ｄ−サイクロセリン等の有用医薬品の合成中間体等として有用なＤ−セリンを効率よく生産することができる。
【００７４】
【配列表フリーテキスト】
配列番号１：合成ＤＮＡ
配列番号２：合成ＤＮＡ
配列番号３：合成ＤＮＡ
配列番号４：合成ＤＮＡ
配列番号５：合成ＤＮＡ
【００７５】
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> KYOWA HAKKO KOGYO CO., LTD
<120> A process for producing D-serine
<130> 11349WO1
<140>
<141>
<150> JP 00/334751
<151> 2000-11-01
<160> 5
<170> PatentIn Ver. 2.0
<210> 1
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: synthetic DNA
<400> 1
ccatcgataa gcttatgatt agtctattcg acatgtttaa gg 42
<210> 2
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: synthetic DNA
<400> 2
cgcggatcct ggggaatatt acagcagac 29
<210> 3
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: synthetic DNA
<400> 3
cgcggatcca gaagtattag tcacactgga c 31
<210> 4
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: synthetic DNA
<400> 4
cccaagctta tgattagcgt attcgatatt ttc 33
<210> 5
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: synthetic DNA
<400> 5
cgggatccat gagaaatcgg gaagaggc 28
【発明の属する技術分野】
技術分野
本発明は、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)ＤＨ５α株の有するＬ−セリンデアミナーゼ活性より高いＬ−セリンデアミナーゼ活性を有するように改変された微生物の細胞、該細胞の培養物またはそれらの処理物を、ＤＬ−セリンを含有する媒体中、ＤＬ−セリンに接触させてＬ−セリンを分解させ、残存するＤ−セリンを該媒体中から採取することを特徴とするＤ−セリンの製造法および該製造法に係る微生物に関する。Ｄ−セリンはＤ−サイクロセリン等の有用医薬品の合成中間体として有用な化合物である。
【０００２】
【従来の技術】
背景技術
Ｄ−セリンに関しては、以下の製造法が知られている。
(i) ＤＬ−ヒドロキシメチルヒダントインを微生物によってＮ−カルバミル−Ｄ−セリンとした後、加水分解してＤ−セリンを得る方法(特開昭61-152291)。
(ii) ＤＬ−セリンを含有する培地中でキャンディダ属、トルロプシス属、クリプトコッカス属、サッカロマイコプシス属、ハンゼヌラ属、エッシェリヒア属、クレブシェラ属、プロビデンシア属、ミクロバクテリウム属、またはセラチア属に属しＬ−セリンを資化しＤ−セリンを実質的に資化しない微生物を培養し、培養液中からＤ−セリンを単離する方法(特開昭64-2594)。
(iii) チロシナーゼ活性を有する微生物をＤＬ−セリンとフェノールを含有する反応液に作用させ、Ｌ−セリンをＬ−チロシンに変換し、残存したＤ−セリンを採取する方法(特開平5-91895)。
【０００３】
これらの製造法はいずれも工業的なＤ−セリンの製法として用いるには難点がある。即ち、(i)の方法では、ＤＬ−ヒドロキシメチルヒダントインからのＮ−カルバミル−Ｄ−セリンの収率が40%と低い上、触媒用に多量の菌体を必要とする点、(ii)の方法では、反応終了後もＬ−セリンが残存しており、結局ＤＬ−セリンの分割を要する点、(iii)の方法では、基質濃度が1%と低い上、有害なフェノールを反応に必要とする点、などがこれら製造法の工業的利用を難しくしている。
【０００４】
エシェリヒア・コリが、Ｌ−セリンをアンモニアとピルビン酸と水に分解するＬ−セリンデアミナーゼ活性を有していることは知られている〔J. Bacteriol., 171, 5095-5102 (1989)、Eur. J. Biochem., 212, 777-784 (1993)〕。しかし、エシェリヒア・コリより抽出された該酵素は反応時に鉄や還元剤の添加など複雑な条件を必要とすることが報告されており〔J. Bacteriol., 162, 1270-1275 (1985)〕、該精製酵素をＤ−セリン製造に用いることは実用的ではない。
【０００５】
またエシェリヒア・コリはＤ−セリンを分解するＤ−セリンデアミナーゼ活性も有していることが知られている〔J. Bacteriol., 121, 1092-1101 (1975)〕。したがって、エシェリヒア・コリを用いて、Ｌ−セリンデアミナーゼにより、ＤＬ−セリンから生産されたＤ−セリンは、該Ｄ−セリンデアミナーゼにより分解されてしまい、生産効率が低下することがあった。
【０００６】
以上、従来公知の方法においては、ＤＬ−セリンからＤ−セリンを効率よく生産する方法は確立されていない。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
発明の開示
本発明の目的は、工業的に有利なＤ−セリンの製造法を提供することにある。
本発明者は、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)ＤＨ５α株に比べて高いＬ−セリンデアミナーゼ活性を有するように改変されたエシェリヒア・コリからＬ−セリンデアミナーゼの抽出または精製を行うことなく、該菌体または菌体処理物をＤＬ−セリンに接触させることによって、意外にもＤ−セリンをほとんど減じることなく迅速にＬ−セリンを検出限界以下にまで分解消去でき、Ｄ−セリンを工業的に製造できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明は以下（１）〜(１２)に関する。
（１） エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)ＤＨ５α株の有するＬ−セリンデアミナーゼ活性より高いＬ−セリンデアミナーゼ活性を有するように改変された微生物の細胞、該細胞の培養物またはそれらの処理物を、ＤＬ−セリンを含有する媒体中、ＤＬ−セリンに接触させてＬ−セリンを分解させ、残存するＤ−セリンを該媒体中から採取することを特徴とするＤ−セリンの製造法。
（２） エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)ＤＨ５α株の有するＬ−セリンデアミナーゼ活性より高いＬ−セリンデアミナーゼ活性を有するように改変された微生物を、ＤＬ−セリンを含有する培地に培養し、Ｌ−セリンを分解させ、該培養物より残存するＤ−セリンを採取することを特徴とするＤ−セリンの製造法。
【０００９】
（３） 改変された微生物が、Ｌ−セリンデアミナーゼ活性を有する微生物を変異処理して得られる変異微生物である上記（１）または（２）のＤ−セリンの製造法。
（４） 改変された微生物が、Ｌ−セリンデアミナーゼ遺伝子を微生物に組み込んで得られる形質転換体である上記（１）または（２）のＤ−セリンの製造法。
（５） 改変された微生物のＬ−セリンデアミナーゼ活性が、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)ＤＨ５α株の有するＬ−セリンデアミナーゼ活性に比べて２倍以上である上記（１）〜（４）いずれか１つのＤ−セリンの製造法。
【００１０】
（６）改変された微生物のＬ−セリンデアミナーゼ活性が、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)ＤＨ５α株の有するＬ−セリンデアミナーゼ活性に比べて５倍以上である上記（１）〜（４）いずれか１つのＤ−セリンの製造法。
（７） Ｌ−セリンデアミナーゼ遺伝子が、エシェリヒア・コリ由来のsdaA遺伝子またはsdaB遺伝子である上記（４）のＤ−セリンの製造法。
（８） 改変された微生物が、エシェリヒア・コリに属する微生物である上記（１）〜（７）いずれか１つのＤ−セリンの製造法。
【００１１】
（９） 改変された微生物が、Escherichia coli DH5α/pHIB、Escherichia coli NM522/pHIA1、Escherichia coli MM294/pHIA1（FERM BP-7309）、Escherichia coli MM294/pHIA2（FERM BP-7310）、Escherichia coli MM294/pHIB（FERM BP-7311）およびEscherichia coli ME5386/pHIA2からなる群から選ばれる微生物である上記（１）〜（８）いずれか１つのＤ−セリンの製造法。
（１０） 改変された微生物が、Ｄ−セリンデアミナーゼ活性の低い、もしくは活性を有しない微生物である上記（１）〜（９）いずれか１つのＤ−セリンの製造法。
（１１） エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）に属し、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)ＤＨ５α株の有するＬ−セリンデアミナーゼ活性より高いＬ−セリンデアミナーゼ活性を有するように改変された微生物。
（１２） 微生物が、Escherichia coli DH5α/pHIB、Escherichia coli NM522/pHIA1、Escherichia coli MM294/pHIA1（FERM BP-7309）、Escherichia coli MM294/pHIA2（FERM BP-7310）、Escherichia coli MM294/pHIB（FERM BP-7311）およびEscherichia coli ME5386/pHIA2からなる群から選ばれる微生物である上記（１１）の微生物。
【００１２】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
１．エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)ＤＨ５α株に比べて高いＬ−セリンデアミナーゼ活性を有するように改変された微生物の取得
本発明で用いる、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)ＤＨ５α株（東洋紡社製、以下すべておなじ）に比べて高いＬ−セリンデアミナーゼ活性を有するように改変された微生物（以下、改変された微生物と略す）は以下に述べる方法で取得することができる。
【００１３】
改変される微生物（以下、親株という）はＬ−セリンデアミナーゼ活性を有する微生物であっても、Ｌ−セリンデアミナーゼ活性を有していない微生物であってもいずれでもよい。
【００１４】
親株が、Ｌ−セリンデアミナーゼ活性を有している場合は、以下に述べる（１）または（２）記載の方法により、改変された微生物を得ることができる。
該親株がＬ−セリンデアミナーゼ活性を有していない場合には、以下に述べる（２）記載の方法により、改変された微生物を得ることができる。
なお、本発明の製造法では、高収率でＤ−セリンを製造することができるので、Ｄ−セリンデアミナーゼによるＤ−セリンの分解があったとしても、なお、高収率でＤ−セリンを製造することができる。
したがって、親株のＤ−セリンデアミナーゼ活性はあってもなくてもいずれでもよい。
【００１５】
（１）変異処理法による取得
改変された微生物は、親株に変異処理を行い、突然変異を生じさせることにより得られる微生物（以下、変異微生物と略す）より得ることができる。
変異処理法は、通常用いられる方法であればいずれの方法でもよい。例えば、変異処理剤を用いる方法、紫外線照射法などがあげられる。
変異処理剤を用いる方法としては、例えば、N-メチル-N'-ニトロ-N-ニトロソグアニジン(NTG)を用いる方法（微生物実験マニュアル、131頁、1986年、講談社サイエンティフィック社）が好ましく用いられる。
変異処理された微生物を下記に述べる方法で培養し、Ｌ−セリンデアミナーゼ活性がエシェリヒア・コリ(Escherichia coli)ＤＨ５α株より向上した微生物を選択することにより、改変された微生物を得ることができる。
【００１６】
Ｌ−セリンデアミナーゼ活性は少なくともエシェリヒア・コリ(Escherichia coli)ＤＨ５α株の有するＬ−セリンデアミナーゼ活性より向上していればよく、好ましくは２倍以上、さらに好ましくは５倍以上向上していることが望ましい。
Ｌ−セリンデアミナーゼ活性の測定は、Meth. Enzymol., 17B, 346(1971)、Meth. Enzymol., 17B, 351 (1971)等に記載されている方法に準じて行うことができる。また、簡便法として、下記に述べる方法をあげることができる。
【００１７】
すなわち、改変された微生物をＤＬ−セリンと接触させた後に、反応液中に残存するＬ−セリンの量を測定し、単位時間あたりに減少したＬ−セリンの量を算出することで測定することができる。
例えば、反応開始から反応中のある時間までのＬ−セリンの減少量すなわち分解量を測定し、得られた分解量の値を反応時間で割ることにより、単位時間当たりのＬ−セリンの分解量を算定し、得られた値をＬ−セリンデアミナーゼ活性とすることができる。
【００１８】
具体的には、得られた変異微生物を３０℃で１日間培養して得られる培養液を遠心分離して菌体を取得する。培地は、該変異微生物を培養できる培地であればいずれの培地も用いることができる。該菌体を50mmol/Lのリン酸バッファー（pH7.5）に懸濁し、遠心分離して得られる菌体（湿菌体重量約２ｇ）を反応に用いる。
ＤＬ−セリンを50g/L含むリン酸バッファー（pH7.5）に得られた菌体を懸濁し、37℃で10時間〜22時間反応を行う。反応終了後、Ｄ−セリンおよびＬ−セリンの濃度をHPLCにより定量し、バッファー中の含量を算定する。
【００１９】
（２）遺伝子組換えによる方法
以下に述べる方法で、Ｌ−セリンデアミナーゼ遺伝子を取得し、該遺伝子を宿主細胞に組み込むことにより、改変された微生物を得ることができる。
（ａ） Ｌ−セリンデアミナーゼ遺伝子の取得
公知のエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）のＬ−セリンデアミナーゼ遺伝子配列〔J. Bacteriol., 171, 5095-5102 (1989)、Eur. J. Biochem., 212, 777-784 (1993)〕をもとに、Ｌ−セリンデアミナーゼ遺伝子をクローニングすることができる。以下に、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）のＬ−セリンデアミナーゼ遺伝子sdaA、sdaBの取得法を例に説明するが、Ｌ−セリンデアミナーゼ遺伝子の取得源は、Ｌ−セリンデアミナーゼ活性を有する微生物であればエシェリヒア・コリに限定されない。
【００２０】
例えば、以下の方法により取得することができる。
エシェリヒア・コリ、例えばEscherichia coli W3110株をエシェリヒア・コリの培養に適した培地、例えばLB培地〔バクトトリプトン(Difco社製) 10g、酵母エキス(Difco社製) 5g、NaCl 5gを水1リットルに含みpH7.2に調整した培地〕を用い、常法に従って培養する。培養後、培養物より遠心分離により菌体を取得する。
取得した菌体より公知の方法〔例えば、Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)、以下、モレキュラー・クローニング 第３版という〕に従い染色体ＤＮＡを単離する。
【００２１】
J. Bacteriol., 171, 5095-5102 (1989)またはEur. J. Biochem., 212, 777-784 (1993)に記載されたＬ−セリンデアミナーゼ遺伝子の塩基配列情報を利用し、sdaA遺伝子またはsdaB遺伝子に対応する塩基配列を含有するセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーをＤＮＡ合成機を用いて合成する。
得られたセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーおよび染色体ＤＮＡを用いてPCR法にてＤＮＡ断片を増幅する。該増幅ＤＮＡ断片をプラスミドに導入可能とするために、センスプライマーおよびアンチセンスプライマーの5'末端には適切な制限酵素サイト、例えばBamHI等の制限酵素サイトを付加させることが好ましい。
【００２２】
該センスプライマーとアンチセンスプライマーの組み合わせとしては、例えば、配列番号１および２記載の塩基配列を有する２種類のプライマーの組み合わせと配列番号１および３記載の塩基配列を有する２種類のプライマーの組み合わせ(sdaA用)、配列番号４および５記載の塩基配列を有する２種類のプライマーの組み合わせ (sdaB用)等をあげることができる。
染色体ＤＮＡを鋳型として、これらプライマー、TaKaRa LA-PCR TM Kit Ver.2 (宝酒造社製)またはExpand TM High-Fidelity PCR System(Boehringer Mannheim社製)を用い、DNA THermal Cycler(Perkin Elmer Japan社製)でPCRを行う。
【００２３】
PCRの条件として、上記プライマーが２ｋｂ以下のＤＮＡ断片の場合には９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒〜１分間、７２℃で２分間からなる反応工程を１サイクルとして、２ｋｂを超えるＤＮＡ断片の場合には９８℃で２０秒間、６８℃で３分間からなる反応工程を１サイクルとして、いずれも３０サイクル行った後、７２℃で７分間反応させる条件をあげることができる。
PCRにより増幅されたＤＮＡ断片とエシェリヒア・コリで増幅可能なベクターとを、制限酵素を用い、上記プライマーで付与した制限酵素サイトと同じサイトで切断後、アガロースゲル電気泳動、シュークロース密度勾配超遠心分離等を行いＤＮＡ断片を回収する。
【００２４】
回収したＤＮＡ断片を用い、常法、例えば、モレキュラー・クローニング 第２ 版、Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38, John Wiley & Sons (1987-1997)：以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー サプルメントと略す、DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University Press (1995)等に記載された方法により、あるいは市販のキット、例えばSuperScript Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning（Life Techcologies社製）やZAP-cDNA Synthesis Kit〔Stratagene社製〕を用いクローニングベクターを作製し、作製したクローニングベクターを用い、エシェリヒア・コリ、例えばEscherichia coli DH5α株（東洋紡社製）を形質転換する。
【００２５】
エシェリヒア・コリを形質転換するためのクローニングベクターとしては、エシェリヒア・コリK12株中で自律複製できるものであれば、ファージベクター、プラスミドベクター等いずれでも使用できる。エシェリヒア・コリ用の発現ベクターをクローニングベクターとして用いてもよい。具体的には、ZAP Express〔Stratagene社、Strategies, 5, 58 (1992)〕、pBluescript II SK(+)〔Nucleic Acids Research, 17, 9494 (1989)〕、Lambda ZAP II（Stratagene社製）、λgt10、λgt11〔DNA Cloning, A Practical Approach, 1, 49 (1985)〕、λTriplEx（Clontech社製）、λExCell（Pharmacia社製）、pT7T318U（Pharmacia社製）、pcD2〔Mol. Cell. Biol., 3, 280 (1983) 〕、pMW218（和光純薬工業社製）、pUC118、pSTV28（宝酒造社製）、pEG400〔J. Bacteriol., 172, 2392 (1990)〕、pHMV1520（MoBiTec社製）、pQE-30（QIAGEN社製）等をあげることができる。
【００２６】
得られた形質転換株より、目的とする遺伝子を含有するプラスミドを常法、例えば、モレキュラー・クローニング 第３版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー サプルメント、DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University Press (1995)等に記載された方法により取得することができる。
上記方法によりＬ−セリンデアミナーゼ活性を有する蛋白質をコードする遺伝子を含むプラスミドを取得することができる。該プラスミドとして、例えば、実施例に示すpHIA1、pHIA2、pHIBをあげることができる。
【００２７】
同様な方法で、ゲノムのＤＮＡ塩基配列が公知な生物からＬ−セリンデアミナーゼ遺伝子を取得することができる。また、ゲノムのＤＮＡ塩基配列が知られていない生物であっても、適当なベクターを用いてエシェリヒア・コリを宿主として染色体ＤＮＡライブラリーを作成し、このライブラリーの各株についてＬ−セリンデアミナーゼ活性を調べることによって、Ｌ−セリンデアミナーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを含むプラスミドを取得することができる。
【００２８】
（ｂ）Ｌ−セリンデアミナーゼ遺伝子の発現方法
上記のようにして得られたＬ−セリンデアミナーゼをコードするＤＮＡを宿主細胞中で発現させるためには、まず、目的とするＬ−セリンデアミナーゼをコードするＤＮＡを、制限酵素類あるいはＤＮＡ分解酵素類で切断して、コード領域を含む適当な長さのＤＮＡ断片とした後に、該ＤＮＡ断片を発現ベクター中のプロモーターの下流に挿入し、次いで該ＤＮＡを挿入した発現ベクターを、発現ベクターに適合した宿主細胞中に導入する。
宿主細胞としては、原核生物、酵母、動物細胞、昆虫細胞等、目的とする遺伝子を発現できるものは全て用いることができる。
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組込みが可能で、上記目的とするＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。
【００２９】
細菌、放線菌等の原核生物を宿主細胞として用いる場合は、上記ＤＮＡを発現させるための発現ベクターは該原核生物中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、上記ＤＮＡおよび転写終結配列より構成された組換えベクターであることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
【００３０】
発現ベクターとしては、例えば、pBTrp2、pBTac1、pBTac2（いずれもBoehringer Mannheim社製）、pKK233-2（Pharmacia社製）、pSE280（Invitrogen社製）、pGEMEX-1（Promega社製）、pQE-8（QIAGEN社製）、pQE-30（QIAGEN社製）、pKYP10（特開昭58-110600）、pKYP200〔Agric. Biol. Chem., 48, 669 (1984)〕、pLSA1〔Agric. Biol. Chem., 53, 277 (1989)〕、pGEL1〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4306 (1985)〕、pBluescriptII SK+、pBluescriptII SK(-)（Stratagene社製）、pTrS30(FERM BP-5407)、pTrS32(FERM BP-5408)、pGEX（Pharmacia社製）、pET-3（Novagen社製）、pTerm2(USP4686191、USP4939094、USP5160735)、pSupex、pUB110、pTP5、pC194、pUC18〔Gene, 33, 103 (1985)〕、pUC19〔Gene, 33, 103 (1985)〕、pSTV28(宝酒造社製)、pSTV29（宝酒造社製）、pUC118（宝酒造社製）、pPA1（特開昭63-233798）、pEG400〔J. Bacteriol., 172, 2392(1990)〕、pQE-30（QIAGEN社製）、PHY300(宝酒社製),pHW1520（MoBiTec社製）等を例示することができる。
【００３１】
プロモーターとしては、宿主細胞中で発現できるものであればいかなるものでもよい。例えば、trpプロモーター（Ｐtrp）、lacプロモーター（Ｐlac）、PLプロモーター、PRプロモーター、PSEプロモーター等の、エシェリヒア・コリやファージ等に由来するプロモーター、SPO1プロモーター、SPO2プロモーター、penPプロモーター等をあげることができる。またＰtrpを２つ直列させたプロモーター（Ｐtrpｘ２）、tacプロモーター、letIプロモーター、lacT7プロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。さらにバチルス属細菌中で発現させるためのxylAプロモーターやコリネバクテリウム属細菌中で発現させるためのP54-1プロモーターなども用いることができる。
【００３２】
リボソーム結合配列としては、宿主細胞中で発現できるものであればいかなるものでもよいが、シャイン−ダルガノ（Shine-Dalgarno）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６〜１８塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。
転写・翻訳を効率的に行なうため、Ｌ−セリンデアミナーゼ活性を有する蛋白質のＮ末端またはその一部を欠失した蛋白質と発現ベクターのコードする蛋白質のＮ末端部分を融合させた蛋白質を発現させてもよい。
目的とする蛋白質の発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、好適には構造遺伝子直下に転写終結配列を配置することが望ましい。
【００３３】
宿主細胞としては、エッシェリヒア（Escherichia）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属、バチルス（Bacillus）属、ミクロバクテリウム（Microbacterium）属、セラチア（Serratia）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、アグロバクテリウム（Agrobacterium）属、アリシクロバチルス（Alicyclobacillus）属、アナバエナ（Anabaena）属、アナシスティス（Anacystis）属、アースロバクター（Arthrobacter）属、アゾバクター（Azobacter）属、クロマチウム（Chromatium）属、エルウイニア（Erwinia）属、メチロバクテリウム（Methylobacterium）属、ホルミディウム（Phormidium）属、ロドバクター（Rhodobacter）属、ロドシュードモナス（Rhodopseudomonas）属、ロドスピリルム（Rhodospirillum）属、セネデスムス（Scenedesmus）属、ストレプトミセス（Streptomyces）属、シネココッカス（Synnechococcus）属、ザイモモナス（Zymomonas）属等に属する微生物をあげることができる。
【００３４】
例えば、Escherichia coli、Bacillus subtilis、Brevibacterium immariophilum、Brevibacterium saccharolyticum、Brevibacterium flavum、Brevibacterium lactofermentum、Corynebacterium glutamicum、Corynebacterium acetoacidophilum、Microbacterium ammoniaphilum、Serratia marcescens、Agrobacterium rhizogenes、Arthrobacter aurescens、Arthrobacter nicotianae、Arthrobacter sulfureus、Arthrobacter ureafaciens、Erwinia carotovora、Erwinia herbicola、Methylobacterium extorquens、Phormidium sp.、Rhodobacter sphaeroides、Rhodospirillum rubrum、Streptomyces aureofaciens 、Streptomyces griseus、Zymomonas mobilis等をあげることができる。
【００３５】
さらに具体的には、Escherichia coli XL1-Blue（Stratagene社製）、Escherichia coli XL2-Blue（Stratagene社製）、Escherichia coli DH1（モレキュラークローニング 第２版、p505）、Escherichia coli DH5α（東洋紡社製）、Escherichia coli MC1000[Mol. Biol.,138,179-207 (1980)]、Escherichia coli W1485(ATCC12435)、Escherichia coli JM109（Stratagene社製）、Escherichia coli HB101(東洋紡社製)、Escherichia coli W3110(ATCC14948)、Escherichia coli NM522（Stratagene社製）、Bacillus subtilis ATCC33712、Bacillus sp. FERM BP-6030、Brevibacterium immariophilum ATCC14068、Brevibacterium saccharolyticum ATCC14066、Brevibacterium flavum ATCC14067、Brevibacterium lactofermentum ATCC13869、Corynebacterium glutamicum ATCC13032、Corynebacterium glutamicum ATCC14297、Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870、Microbacterium ammoniaphilum ATCC15354、Serratia marcescens ATCC13880、Agrobacterium rhizogenes ATCC11325、Arthrobacter aurescens ATCC13344、Arthrobacter nicotianae ATCC15236、Arthrobacter sulfureus ATCC19098、Arthrobacter ureafaciens ATCC7562、Erwinia carotovora ATCC15390、Erwinia herbicola ATCC21434、Methylobacterium extorquens DSM1337、Phormidium sp. ATCC29409、Rhodobacter sphaeroides ATCC21286、Rhodospirillum rubrum ATCC11170、Streptomyces aureofaciens ATCC10762 、Streptomyces griseus ATCC10137、Zymomonas mobilis ATCC10988等をあげることができる。
【００３６】
Ｄ−セリンデアミナーゼ活性の低い微生物またはＤ−セリンデアミナーゼ活性の欠損した微生物としては、たとえばEscherichia coli ME5386株（国立遺伝研から入手可能）があげられる。
【００３７】
組換えベクターの宿主細胞への導入方法としては、宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができる。例えば、カルシウムイオンを用いる方法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)〕、プロトプラスト法（特開昭63-248394）、エレクトロポレーション法またはGene, 17, 107 (1982)やMolecular & General Genetics, 168, 111 (1979)に記載の方法等をあげることができる。
【００３８】
酵母を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、YEp13（ATCC37115）、YEp24（ATCC37051）、YCp50（ATCC37419）、pHS19、pHS15等を例示することができる。
プロモーターとしては、酵母中で発現できるものであればいかなるものでもよく、例えば、PHO5プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーター、gal 1プロモーター、gal 10プロモーター、ヒートショック蛋白質プロモーター、MFα1プロモーター、CUP1プロモーター等のプロモーターをあげることができる。
【００３９】
宿主細胞としては、サッカロミセス（Saccharomyces）属、シゾサッカロミセス（Schizosaccharomyces）属、クリュイベロミセス（Kluyveromyces）属、トリコスポロン（Trichosporon）属、シュワニオミセス（Schwanniomyces）属、ピヒア（Pichia）属、キャンディダ（Candida）属等に属する微生物、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、クリュイベロミセス・ラクチス（Kluyveromyces lactis）、トリコスポロン・プルランス（Trichosporon pullulans）、シュワニオミセス・アルビウス（Schwanniomyces alluvius）、キャンディダ・ユーティリス（Candida utilis）等をあげることができる。
【００４０】
組換えベクターの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法〔Methods in Enzymol., 194, 182 (1990)、スフェロプラスト法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978)〕、酢酸リチウム法〔J. Bacteriol., 153, 163(1983)〕、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978)に記載の方法等をあげることができる。
【００４１】
動物細胞を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、pcDNAI、pcDM8（フナコシ社製）、pAGE107〔特開平3-22979；Cytotechnology, 3, 133, (1990)〕、pAS3-3（特開平2-227075）、pCDM8〔Nature, 329, 840, (1987)〕、pcDNAI/Amp（Invitrogen社製）、pREP4（Invitrogen社製）、pAGE103〔J. Biochem., 101, 1307 (1987)〕、pAGE210等を例示することができる。
【００４２】
プロモーターとしては、動物細胞中で発現できるものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス（ヒトＣＭＶ）のＩＥ（immediate early）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター等をあげることができる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
宿主細胞としては、ナマルバ細胞、HBT5637（特開昭63-000299）、COS1細胞、COS7細胞、CHO細胞等をあげることができる。
【００４３】
動物細胞への組換えベクターの導入法としては、動物細胞にＤＮＡを導入できる方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポーレーション法〔Cytotechnology, 3, 133 (1990)〕、リン酸カルシウム法（特開平2-227075）、リポフェクション法〔Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84, 7413 (1987)〕、Virology, 52, 456 (1973)に記載の方法等を用いることができる。形質転換体の取得および培養は、特開平2-227075号公報あるいは特開平2-257891号公報に記載されている方法に準じて行なうことができる。
【００４４】
昆虫細胞を宿主細胞として用いる場合には、例えばBaculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, W. H. Freeman and Company, New York (1992)、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー サプルメント、Bio/Technology, 6, 47 (1988)等に記載された方法によって、蛋白質を発現することができる。即ち、組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、蛋白質を発現させることができる。
【００４５】
該方法において用いられる遺伝子導入ベクターとしては、例えば、pVL1392、pVL1393、pBlueBacIII（ともにInvitrogen社製）等をあげることができる。
バキュロウイルスとしては、例えば、夜盗蛾科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus)等を用いることができる。
昆虫細胞としては、Spodoptera frugiperdaの卵巣細胞であるSf9、Sf 21〔Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, W. H. Freeman and Company, New York (1992)〕、Trichoplusia niの卵巣細胞であるHigh5（Invitrogen社製）等を用いることができる。
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への上記組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法（特開平2-227075）、リポフェクション法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)〕等をあげることができる。
【００４６】
遺伝子の発現方法としては、直接発現以外に、モレキュラー・クローニング 第２版に記載されている方法等に準じて、分泌生産、融合蛋白質発現等を行うことができる。
酵母、動物細胞または昆虫細胞により発現させた場合には、糖あるいは糖鎖が付加された蛋白質を得ることができる。
【００４７】
２．改変された微生物の培養
上記１で得られる本発明の改変された微生物を培地に培養する方法は、宿主細胞の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。本発明の改変された微生物がエシェリヒア・コリ等の原核微生物、酵母菌等の真核微生物である場合、これら微生物を培養する培地は、該微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれでもよい。
【００４８】
炭素源としては、それぞれの改変された微生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノールなどのアルコール類が用いられる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、等の各種無機酸や有機酸のアンモニウム塩、その他含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕、大豆粕加水分解物、各種発酵菌体およびその消化物等が用いられる。
【００４９】
無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が用いられる。
培養は、振盪培養または深部通気攪拌培養などの好気的条件下で行う。培養温度は15〜50℃がよく、培養時間は、通常16時間〜7日間である。培養中ｐＨは、3.0〜9.0に保持する。ｐＨの調整は、無機あるいは有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニアなどを用いて行う。
【００５０】
また培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、lacプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル-β-Ｄ-チオガラクトピラノシド(IPTG)等を、trpプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸(IAA)等を、xylAプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養する時にはキシロースを、それぞれ培地に添加してもよい。
【００５１】
本発明の改変された微生物が動物細胞である場合、該改変された動物細胞を培養する培地としては、一般に使用されているRPMI1640培地〔The Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967)〕、EagleのMEM培地〔Science, 122, 501 (1952)〕、DMEM培地〔Virology, 8, 396 (1959)〕、199培地〔Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73, 1(1950)〕またはこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等が用いられる。
培養は、通常pH6〜8、30〜40℃、5% CO2存在下等の条件下で1〜7日間行う。
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００５２】
本発明の改変された微生物が昆虫細胞である場合、該改変された昆虫細胞を培養する培地としては、一般に使用されているTNM-FH培地〔PharMingen社製〕、Sf-900 II SFM培地（GIBCO BRL社製）、ExCell400、ExCell405〔いずれもJRH Biosciences社製〕、Grace's Insect Medium〔Grace, T.C.C., Nature, 195, 788 (1962)〕等を用いることができる。
培養は、通常pH6〜7、25〜30℃等の条件下で、1〜5日間行う。
また、培養中必要に応じて、ゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００５３】
３．Ｄ−セリンの製造
ＤＬ−セリンを含有する媒体中、改変された微生物をＤＬ−セリンに接触させてＬ−セリンを分解させ、残存したＤ−セリンを該媒体中から採取することによりＤ−セリンを製造することができる。
形質転換体および変異微生物におけるＬ−セリンデアミナーゼ活性増強の程度は、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)ＤＨ５α株に比較して増強されている必要があり、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)ＤＨ５α株の有するＬ−セリンデアミナーゼ活性より強ければよいが、好ましくは２倍以上、さらに好ましくは５倍以上であることが望ましい。
【００５４】
また、Ｄ−セリンデアミナーゼ活性の低い、または該活性を有しない株を用いることにより、Ｄ−セリンの製造の効率を上げることができる。
L-セリンデアミナーゼ活性の測定は上記１．（１）で述べたとおりである。
これらの微生物を用いたＤ−セリンの製造は、以下の方法で行うことができる。
すなわち、上記方法で得られる改変された微生物の細胞、該細胞の培養物またはそれらの処理物（以下、酵素源という）を、媒体中でＤＬ−セリンに接触させる。
【００５５】
細胞または該細胞の処理物としては、細胞の乾燥物、凍結乾燥物、界面活性剤処理物、酵素処理物、超音波破砕物、機械的摩砕物、溶媒処理物などの細胞処理物、培養物の濃縮物、乾燥物などの培養処理物、細胞の蛋白質分画物、細胞および細胞処理物の固定化物、あるいは細胞より得られる精製酵素等があげられる。
改変された微生物とＤＬ−セリンとの接触は、該改変された微生物を培養する培地にあらかじめＤＬ−セリンを添加する方法を用いてもよいし、培養中にＤＬ−セリンを添加する方法を用いてもよい。また、該改変された微生物を培養して得られた酵素源を、ＤＬ−セリンを含有する媒体に添加してもよい。
【００５６】
改変された微生物を培養する培地中にＤＬ−セリンを添加する場合、ＤＬ−セリンは培地1mlあたり1〜300mg、好ましくは30〜100mgを培養の開始時または途中に添加する。培養は上記（２）で述べた条件下で行うことができる。
改変された微生物より得られる酵素源とＤＬ−セリンを媒体中で接触させる場合は、該酵素源の量は、当該酵素源の比活性等により異なる。例えば、酵素源として該改変された微生物の細胞を用いる場合は、ＤＬ−セリン1mgあたり湿菌体として5〜1000ｍｇ、好ましくは10〜400ｍｇ添加する。
【００５７】
接触反応は20〜50℃で行なうことが好ましく、特に25℃〜37℃で行なうことが好ましい。反応時間は用いる酵素源の量および比活性等により異なるが、通常２〜150時間、好ましくは5〜60時間である。
媒体としては、水もしくは水性媒体、有機溶媒または水もしくは水性媒体と有機溶媒の混合液が用いられる。水性媒体としては、例えばリン酸緩衝液、HEPES（N-2-ヒドロキシエチルピペラジン-N-エタンスルホン酸）緩衝液、トリス［トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン］塩酸緩衝液等の緩衝液が用いられる。有機溶媒としては反応を阻害しないものであればいずれでもよく、例えば、アセトン、酢酸エチル、ジメチルスルホキシド、キシレン、メチルアルコール、エチルアルコール、ブタノール等が用いられる。
【００５８】
ＤＬ−セリンを媒体中に添加する場合、ＤＬ−セリンを溶解することのできる水もしくは水性媒体、有機溶媒、または水もしくは水性媒体と有機溶媒の混合液にＤＬ−セリンを溶解し、媒体中に添加してもよいし、粉末または細粒状のまま添加してもよい。
反応媒体からのＤ−セリンの採取は、通常の有機合成化学で用いられる方法、例えば、有機溶媒による抽出、結晶化、薄層クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等により行うことができる。
【００５９】
本発明により得られるＤ−セリンの確認または定量方法は、Ｄ−セリンを確認または定量できる方法であればいずれの方法も用いることができるが、例えば、13C-NMRスペクトル、1H-NMRスペクトル、マススペクトル、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)等の方法により行うことができる。
以下に本発明の実施例を示すが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００６０】
【実施例】
発明を実施するための最良の形態
実施例１
１）Ｌ−セリンデアミナーゼ遺伝子の取得
Escherichia coli W3110株（ATCC14948）を１白金耳、10ｍLのLB培地に植菌し、30℃で一晩培養した。培養後、得られた培養液より遠心分離（3,000rpm、10分間）により菌体を取得した。該菌体より、常法（モレキュラー・クローニング 第２版に記載の方法）に従い染色体ＤＮＡを単離精製した。
【００６１】
Ｌ−セリンデアミナーゼをコードする遺伝子であるsdaA〔J. Bacteriol., 171, 5095-5102 (1989)〕の有する塩基配列情報をもとにセンスプライマーとアンチセンスプライマーの組み合わせである配列番号１および２記載の塩基配列を有する２種類のプライマー、配列番号１および３記載の塩基配列を有する２種類のプライマー、およびsdaAと同様にＬ−セリンデアミナーゼをコードする遺伝子であるsdaB〔Eur. J. Biochem., 212, 777-784 (1993)〕の有する塩基配列情報をもとに配列番号４および５記載の塩基配列を有する２種類のプライマーをそれぞれＤＮＡ合成機を用いて合成した。
【００６２】
染色体ＤＮＡを鋳型として、これらプライマー、pfu polymerase cloned(Stratagene社製)およびpfu polymerase 10 X Reaction Buffer (standard buffer)を用い、DNA Thermal Cycler(Perkin Elmer Japan社製)でPCRを行った。
PCRは94℃で30秒間、55℃で30秒〜1分間、72℃で2分間からなる反応工程を1サイクルとして、30サイクル行った後、72℃で7分間反応させる条件で行った。PCRで増幅されたＤＮＡ断片は、いずれも制限酵素HindIIIと制限酵素BamHIで処理した。処理後これらの制限酵素処理ＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動にかけ、各制限酵素で処理されたＤＮＡ断片を取得した。
【００６３】
２）組換え体ＤＮＡの製造
アンピシリン耐性遺伝子とTrpプロモータを有するベクタープラスミドpTrS30 (FERM BP-5407より常法により抽出)を制限酵素HindIIIおよびBamHIで消化後、アガロースゲル電気泳動を行い、HindIII‐BamHI処理pTrS30断片を取得した。
上記で取得されたHindIII‐BamHI処理ＤＮＡ断片とHindIII‐BamHI処理pTrS30断片を混合した後、ライゲーション反応を行うことにより組換え体ＤＮＡを取得した。
【００６４】
該組換え体ＤＮＡを用い、Escherichia coli DH5α株（東洋紡社製）を常法に従って形質転換後、該形質転換体を、アンピシリン100μg/mLを含むLB寒天培地[バクトトリプトン(Difco社製) 10g、酵母エキス(Difco社製) 5g、NaCl 5gを水1リットルに含み、pH7.2に調整され、寒天を1.5%になるように添加された培地]に塗布し、30℃で１日間培養した。
該培地上で生育した形質転換体のコロニー数個ずつを、アンピシリン100μg／ｍLを含むLB培地10mLで30℃で１日間培養した。
【００６５】
得られた培養液を遠心分離することにより菌体を取得した。該菌体より常法に従ってプラスミドを単離した。
HindIII‐BamHI処理ＤＮＡ断片（配列番号１および２記載の塩基配列を有する２種類のプライマーの組み合わせでPCR増幅して得られたＤＮＡ断片）とHindIII‐BamHI処理ｐTrS30断片とを連結して得られたプラスミドをｐHIA1、HindIII‐BamHI処理ＤＮＡ断片（配列番号１および３記載の塩基配列を有する２種類のプライマーの組み合わせでPCR増幅して得られたＤＮＡ断片）とHindIII‐BamHI処理ｐTrS30断片とを連結して得られたプラスミドをｐHIA2、HindIII‐BamHI処理ＤＮＡ断片（配列番号４および５記載の塩基配列を有する２種類のプライマーの組み合わせでPCR増幅して得られたＤＮＡ断片）とHindIII‐BamHI処理ｐTrS30断片とを連結して得られたプラスミドをｐHIB1とそれぞれ命名した。
【００６６】
３）形質転換体の製造
このようにして得られたプラスミドを常法に従ってEscherichia coli NM522(Stratagene社製)、Escherichia coli MM294(ATCC33625)およびＤ−セリンデアミナーゼ活性を欠損したEscherichia coli ME5386株(国立遺伝研より入手)に導入した。
これらの菌株のうち、pHIA1を保有するEscherichia coli MM294/pHIA1、pHIA2を保有するEscherichia coli MM294/pHIA2、およびpHIBを保有するEscherichia coli MM294/pHIBは、ブタペスト条約に基づき、それぞれFERM BP-7309、FERM BP-7310、FERM BP-7311として独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター：日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（旧：工業技術院生命工学工業技術研究所：日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号）に平成１２年９月２８日付けで寄託されている。
【００６７】
実施例２ Ｌ−セリンデアミナーゼの発現およびＤ−セリンの製造
上記のようにして得られた形質転換体およびＬ−セリンデアミナーゼ遺伝子を含まないプラスミドpTrS30を有するEscherichia coli DH5α/pTrS30株を、アンピシリン100μg/mLを含むLB培地100ｍLで30℃、1日間培養した。得られた培養液を遠心分離して菌体を取得し、これを50mmol/Lのリン酸バッファー（pH7.5）に再び懸濁し、遠心分離して得られる菌体（湿菌体重量約2g）を反応に用いた。
ＤＬ−セリンを50g/L含むリン酸バッファー（pH7.5）に上記の菌体を懸濁し、37℃で10時間〜22時間反応を行った。
【００６８】
反応開始時、反応中および反応終了後に反応液中のＤ−セリンおよびＬ−セリンの濃度をHPLCにより定量した。
HPLCの条件は以下のとおりである。
カラム：CRAWNPAK CR(+) （Daicel Chemical Industries, Ltd.）
移動層：過塩素酸水溶液(pH 1.0)
流速：0.2mL/分
カラム温度：2℃
【００６９】
検出はオルトフタルアルデヒド(OPA)を用いたポストカラム誘導体化法〔J. Chromatogr., 33, 353-355 (1973)〕を用いた。
第１表に結果を示した。
【００７０】
【表１】
反応開始後10、11または12時間目の反応液中のＬ−セリン濃度を求め、反応開始時の反応液中のＬ−セリン濃度との差をＬ−セリンの総分解量として示した。
Ｌ−セリンの総分解量を反応開始からの時間（10、11または12時間）で割った値をＬ−セリンデアミナーゼ活性として、Escherichia coli DH5α/pTrS30株のＬ−セリンデアミナーゼ活性を1.0とした場合の各菌株の活性を相対活性として示した。
【００７２】
第１表から明らかなように、Escherichia coli ME5386/pHIA2株について反応開始後12時間目、Escherichia coli DH5α/pHIB株およびEscherichia coli NM522/pHIA1株について反応開始後21時間目、Escherichia coli NM294/pHIA2株について反応開始後22時間目のＬ−セリン濃度およびＤ−セリン濃度を測定したところ、反応液中のＬ−セリン残量はゼロであり、Ｄ−セリンのみが残存していた。
【００７３】
【発明の効果】
産業上の利用可能性
本発明により、ＤＬ−セリンから、Ｄ−サイクロセリン等の有用医薬品の合成中間体等として有用なＤ−セリンを効率よく生産することができる。
【００７４】
【配列表フリーテキスト】
配列番号１：合成ＤＮＡ
配列番号２：合成ＤＮＡ
配列番号３：合成ＤＮＡ
配列番号４：合成ＤＮＡ
配列番号５：合成ＤＮＡ
【００７５】
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> KYOWA HAKKO KOGYO CO., LTD
<120> A process for producing D-serine
<130> 11349WO1
<140>
<141>
<150> JP 00/334751
<151> 2000-11-01
<160> 5
<170> PatentIn Ver. 2.0
<210> 1
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: synthetic DNA
<400> 1
ccatcgataa gcttatgatt agtctattcg acatgtttaa gg 42
<210> 2
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: synthetic DNA
<400> 2
cgcggatcct ggggaatatt acagcagac 29
<210> 3
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: synthetic DNA
<400> 3
cgcggatcca gaagtattag tcacactgga c 31
<210> 4
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: synthetic DNA
<400> 4
cccaagctta tgattagcgt attcgatatt ttc 33
<210> 5
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: synthetic DNA
<400> 5
cgggatccat gagaaatcgg gaagaggc 28
Claims (9)
- エシェリヒア・コリ(Escherichiacoli)に属する微生物にＬ−セリンデアミナーゼ遺伝子を組み込んで得られる形質転換体の細胞、該細胞の培養物またはそれらの処理物を、ＤＬ−セリンを含有する媒体中、ＤＬ−セリンに接触させてＬ−セリンを分解させ、残存するＤ−セリンを該媒体中から採取することを特徴とするＤ−セリンの製造法。
- Ｌ−セリンデアミナーゼ遺伝子が、エシェリヒア・コリ由来のsdaA遺伝子またはsdaB遺伝子である請求項１記載のＤ−セリンの製造法。
- 形質転換体が、Escherichia coli MM294/pHIA1（FERM BP-7309）、Escherichia coli MM294/pHIA2（FERM BP-7310）およびEscherichia coli MM294/pHIB（FERM BP-7311）からなる群から選ばれる微生物である請求項１又は２に記載のＤ−セリンの製造法。
- 形質転換体が、Ｄ−セリンデアミナーゼ活性の低い、もしくは活性を有しない微生物である請求項１〜３いずれか１項に記載のＤ−セリンの製造法。
- エシェリヒア・コリ(Escherichiacoli)に属する微生物にＬ−セリンデアミナーゼ遺伝子を組み込んで得られる形質転換体を、ＤＬ−セリンを含有する培地に培養し、Ｌ−セリンを分解させ、該培養物より残存するＤ−セリンを採取することを特徴とするＤ−セリンの製造法。
- Ｌ−セリンデアミナーゼ遺伝子が、エシェリヒア・コリ由来のsdaA遺伝子またはsdaB遺伝子である請求項５記載のＤ−セリンの製造法。
- 形質転換体が、Escherichia coli MM294/pHIA1（FERM BP-7309）、Escherichia coli MM294/pHIA2（FERM BP-7310）およびEscherichia coli MM294/pHIB（FERM BP-7311）からなる群から選ばれる微生物である請求項５または６記載のＤ−セリンの製造法。
- 形質転換体が、Ｄ−セリンデアミナーゼ活性の低い、もしくは活性を有しない微生物である請求項５〜７いずれか１項に記載のＤ−セリンの製造法。
- Escherichia coli MM294/pHIA1（FERM BP-7309）、Escherichia coli MM294/pHIA2（FERM BP-7310）およびEscherichia coli MM294/pHIB（FERM BP-7311）からなる群から選ばれる微生物。
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