JP4196603B2 - Ｌ−アルギニンの製造法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、Ｌ−アルギニン生産能を有する微生物及び同微生物を用いたＬ−アルギニンの製造法に関する。Ｌ−アルギニンは、肝機能促進薬、アミノ酸輸液及び総合アミノ酸製剤等の成分として、産業上有用なアミノ酸である。
【０００２】
【従来の技術】
従来、発酵法によるＬ−アルギニンの製造は、コリネ型細菌野生株；サルファ剤、２−チアゾールアラニン又はα−アミノ−β−ヒドロキシ吉草酸等の薬剤に耐性を有するコリネ型細菌；２−チアゾールアラニン耐性に加えて、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−プロリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−メチオニンまたはＬ−トリプトファン要求性を有するコリネ型細菌（特開昭５４−４４０９６号）；ケトマロン酸、フルオロマロン酸又はモノフルオロ酢酸に耐性を有するコリネ型細菌（特開昭５７−１８９８９号）；アルギニノールに耐性を有するコリネ型細菌（特開昭６２−２４０７５号）；または、Ｘ−グアニジン（Ｘは脂肪酸又は脂肪鎖の誘導体）に耐性を有するコリネ型細菌（特開平２−１８６９９５号）等を用いて行われている。
【０００３】
一方、組換えＤＮＡ技術によりＬ−アルギニンの生合成酵素を増強することによって、Ｌ−アルギニンの生産能を増加させる種々の技術が開示されている。例えば、エシェリヒア属に属する微生物由来のアセチルオルニチンデアセチラーゼ、Ｎ−アセチルグルタミン酸−γ−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、Ｎ−アセチルグルタモキナーゼ、及びアルギニノサクシナーゼの遺伝子を含むＤＮＡ断片とベクターＤＮＡとの組換え体ＤＮＡを保有せしめたコリネバクテリウム属又はブレビバクテリウム属に属する微生物（特公平５−２３７５０号）、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ活性が増強されたコリネ型細菌等の微生物（EP 1057 893 A1）、及び、Ｎ−アセチルグルタミン酸シンセターゼ遺伝子(argA)を導入されたエシェリヒア・コリ（特開昭57-5693号参照）を用いてＬ−アルギニンを製造する方法等が開示されている。
【０００４】
また、コリネ型細菌では、いくつかのＬ−アルギニン生合成系酵素の生成が、Ｌ−アルギニンにより抑制されていることが調べられている。さらに、Ｌ−アルギニン生合成系酵素のいくつかは、Ｌ−アルギニンによる抑制を受けるが、Ｌ−アルギニン蓄積量が向上したコリネ型細菌の変異株では、これらの酵素のＬ−アルギニンによる抑制が解除されていることが報告されている（Agric. Biol. Chem., 43(1), 105, 1979）。
【０００５】
一方、エシェリヒア・コリでは、Ｌ−アルギニン生合成系のリプレッサー及びリプレッサーをコードする遺伝子が特定されており（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1987), 84(19), 6697-701）、またリプレッサータンパクと各種Ｌ−アルギニン生合成系遺伝子との結合相互作用についても調べられている（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1987), 84(19), 6697-701、J. Mol. Biol. (1992), 226,
367-386）。
【０００６】
しかしながら、コリネ型細菌では、Ｌ−アルギニン生合成系のリプレッサータンパクは同定されていない。リプレッサータンパク遺伝子（argR）については、遺伝子データベースGenBankに、その塩基配列とそれによってコードされると想定されるアミノ酸配列が登録されているが（AF049897）、これは前記アミノ酸配列と公知のアルギニンリプレッサーとの相同性からargRと命名されたものと考えられる。
【０００７】
ところで、近年、Ｌ−アミノ酸を特異的に微生物の菌体の外部に排出する機能を持つタンパク質および遺伝子が同定され、特にVrlijcらは、コリネバクテリウム属細菌からＬ−リジンの菌体外への排出に関与する遺伝子を同定した（Vrlijc M., Sahm H., Eggeling L. Molecular Microbiology 22:815-826(1996)）。この遺伝子はlysEと名付けられ、同遺伝子をコリネバクテリウム属細菌において増強させることによって、コリネバクテリウム属細菌のＬ−リジン生産能が向上することが報告されている（WO 97/23597）。また、エシェリヒア・コリにおいてアミノ酸排出タンパク質の発現量を上昇させることにより、いくつかのＬ−アミノ酸の生産性を向上させることができることが知られている（特開平2000-189180号）。例えば、yggA遺伝子を多コピーでエシェリヒア・コリに導入することにより、リジン及びアルギニンの生産性が向上することが報告されている（特開2000-189180号）。また、エシェリヒア・コリにおいては、ORF306遺伝子の発現を増強することによって、シスチン、システイン等の生産性が向上することが報告されている(EP885962)。しかし、lysE遺伝子がＬ−リジン以外のアミノ酸を排出する機能を有することは知られていない。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、コリネ型細菌及びエシェリヒア属細菌等の微生物のＬ−アルギニン生産能を向上させ、Ｌ−アルギニンを効率よく製造する方法を提供することを課題とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、Ｌ−アルギニン生産菌に関する研究の過程で、lysE遺伝子の発現を増強することによって、Ｌ−アルギニン生産能を向上させることができることを見い出した。さらに、lysEの増強と、argR遺伝子の破壊又はＬ−アルギニン生合成系酵素の活性の増強とを組み合わせることにより、Ｌ−アルギニン生産能を顕著に向上させることができることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は以下のとおりである。
【００１０】
（１）Ｌ−アルギニン生産能を有し、かつ、ｌｙｓＥ遺伝子の発現が増強されるように改変された微生物。
（２）ｌｙｓＥ遺伝子の発現の増強が、ｌｙｓＥ遺伝子のコピー数を高めること、又は前記細菌細胞内のｌｙｓＥ遺伝子の発現が増強されるように同遺伝子の発現調節配列を改変することによるものである(1)の記載の微生物。
（３）さらに、アルギニンリプレッサーが正常に機能しないように改変されたことを特徴とする(1)又は(2)の微生物。
（４）染色体上のアルギニンリプレッサーをコードする遺伝子が破壊されたことにより、アルギニンリプレッサーが正常に機能しないことを特徴とする(3)の微生物。
（５）さらに、細胞内のＬ−アルギニン生合成系酵素の活性が増強されるように改変された(1)〜(4)のいずれかの微生物。
（６）コリネ型細菌である請求項(1)〜(5)のいずれかの微生物。
（７）エシェリヒア属細菌である請求項(1)〜(5)のいずれかの微生物。
（８）(1)〜(7)のいずれかのコリネ型細菌を培地で培養し、培地中にＬ−アルギニンを生成蓄積せしめ、これを該培地から採取することを特徴とするＬ−アルギニンの製造法。
【００１１】
本発明において、「Ｌ−アルギニン生産能」とは、本発明の微生物を培養したときに、培地中にＬ−アルギニンを蓄積する能力をいう。このＬ−アルギニン生産能は、微生物の野生株の性質として有するものであってもよく、育種によって付与または増強された性質であってもよい。
【００１２】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
＜１＞本発明の微生物
本発明の微生物は、Ｌ−アルギニン生産能を有し、かつ、ｌｙｓＥ遺伝子の発現が増強された微生物である。本発明の微生物は、Ｌ−アルギニン生産能を有する微生物のｌｙｓＥ遺伝子の発現を増強したものであってもよいし、微生物のｌｙｓＥ遺伝子の発現を増強した後に、Ｌ−アルギニン生産能を付与したものであってもよい。
【００１３】
本発明の微生物としては、ｌｙｓＥ遺伝子又はｌｙｓＥ遺伝子ホモログを持つ微生物、具体的にはコリネ型細菌、バチルス属細菌、セラチア属細菌、エシェリヒア属細菌、サッカロマイセス属又はキャンディダ属に属する酵母が挙げられる。これらの中ではコリネ型細菌及びエシェリヒア属細菌が好ましい。
【００１４】
バチルス属細菌としてはバチルス・サブチリスが、セラチア属細菌としてはセラチア・マルセッセンスが、エシェリヒア属細菌としてはエシェリヒア・コリが、サッカロマイセス属酵母としてはサッカロマイセス・セレビシエが、キャンディダ属酵母としてキャンディダ・トロピカリスが挙げられる。
【００１５】
アルギニン生産能を有する微生物としては、5-アザウラシル、6-アザウラシル、2-チオウラシル、5-フルオロウラシル、5-ブロモウラシル、5-アザシトシン、6-アザシトシン等に耐性なバチルス・サブチリス、アルギニンヒドロキサメート、2-チオウラシルに耐性なバチルス・サブチリス、アルギニンヒドロキサメート及び6-アザウラシルに耐性なバチルス・サブチリス（特開昭49-1268191号参照）、
ヒスチジンアナログ又はトリプトファンアナログに耐性なバチルス・サブチリス（特開昭52-114092号参照）、
メチニオン、ヒスチジン、スレオニン、プロリン、イソロイシイン、リジン、アデニン、グアニンまたはウラシル（またはウラシル前駆体）の少なくとも一つに要求性を有するバチルス・サブチリス変異株（特開昭52-99289号参照）、
アルギニンヒドロキサメートに耐性なバチルス・サブチリス（特公昭51-6754号参照）、
コハク酸要求性又は核酸塩基アナログに耐性なセラチア・マルセッセンス（特開昭58-9692号）、
アルギニン分解能を欠損し、アルギニンのアンタゴニスト及びカナバニンに耐性を有し、リジンを要求するセラチア・マルセッセンス（特開昭52-8729号参照）、
argA遺伝子を導入されたエシェリヒア・コリ（特開昭57-5693号参照）、
アルギニン、アルギニンヒドロキサメート、ホモアルギニン、Ｄ−アルギニン、カナバニン耐性、アルギニンヒドロキサメート及び６−アザウラシル耐性のサッカロマイセス・セレビシエ（特開昭53-143288号参照）、及び
カナバニン耐性のキャンディダ・トロピカリス（特開昭53-3586号参照）、が挙げられる。
【００１６】
コリネ型細菌は、従来ブレビバクテリウム属に分類されていたが現在コリネバクテリウム属に統合された細菌を含み（Int. J. Syst. Bacteriol., 41, 255 (1981)）、またコリネバクテリウム属と非常に近縁なブレビバクテリウム属細菌を含む。このようなコリネ型細菌の例として以下のものが挙げられる。
【００１７】
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム
コリネバクテリウム・アセトグルタミカム
コリネバクテリウム・アルカノリティカム
コリネバクテリウム・カルナエ
コリネバクテリウム・グルタミカム
コリネバクテリウム・リリウム（コリネバクテリウム・グルタミカム）
コリネバクテリウム・メラセコーラ
コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス
コリネバクテリウム・ハーキュリス
ブレビバクテリウム・ディバリカタム（コリネバクテリウム・グルタミカム）
ブレビバクテリウム・フラバム（コリネバクテリウム・グルタミカム）
ブレビバクテリウム・インマリオフィラム
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（コリネバクテリウム・グルタミカム）
ブレビバクテリウム・ロゼウム
ブレビバクテリウム・サッカロリティカム
ブレビバクテリウム・チオゲニタリス
ブレビバクテリウム・アルバム
ブレビバクテリウム・セリヌム
ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム
【００１８】
Ｌ−アルギニン生産能を有するコリネ型細菌としては、Ｌ−アルギニン生産能を有するものであれば特に制限されないが、例えば、コリネ型細菌野生株；サルファ剤、２−チアゾールアラニン又はα−アミノ−β−ヒドロキシ吉草酸等の薬剤に耐性を有するコリネ型細菌；２−チアゾールアラニン耐性に加えて、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−プロリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−メチオニンまたはＬ−トリプトファン要求性を有するコリネ型細菌（特開昭５４−４４０９６号）；ケトマロン酸、フルオロマロン酸又はモノフルオロ酢酸に耐性を有するコリネ型細菌（特開昭５７−１８９８９号）；アルギニノールに耐性を有するコリネ型細菌（特開昭６２−２４０７５号）；Ｘ−グアニジン（Ｘは脂肪酸又は脂肪鎖の誘導体）に耐性を有するコリネ型細菌（特開平２−１８６９９５号）等が挙げられる。
【００１９】
具体的には、下記のような菌株を例示することができる。
ブレビバクテリウム・フラバムAJ11169（FERM P-4161）
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ12092（FERM P-7273）
ブレビバクテリウム・フラバムAJ11336（FERM P-4939）
ブレビバクテリウム・フラバムAJ11345（FERM P-4948）
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ12430（FERM BP-2228）
【００２０】
AJ11169は、1977年８月３日付けで独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（〒305-5466 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）にFERM P-4161の受託番号で寄託され、1999年９月２７日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、FERM BP-6892として寄託されている。
【００２１】
AJ12092は、1983年９月２９日付けで独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターにFERM P-7273の受託番号で寄託され、1999年１０月１日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、FERM BP-6906として寄託されている。
【００２２】
AJ11336は、1979年４月２５日付けで独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターにFERM P-4939の受託番号で寄託され、1999年９月２７日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、FERM BP-6893として寄託されている。
【００２３】
AJ11345は、1979年４月２５日付けで独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターにFERM P-4948の受託番号で寄託され、1999年９月２７日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、FERM BP-6894として寄託されている。
【００２４】
AJ12430は、1988年１２月２６日付けで独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターにFERM BP-2228の受託番号で、ブダペスト条約に基いて国際寄託されている。
【００２５】
また、エシェリヒア属細菌としては、ナイトハルトらの著書（Neidhardt,F.C. et.al.,Escherichia coli and Salmonella Typhimurium,American Society for Microbiology,Washington D.C.,1208, table 1）に挙げられるもの、例えばエシェリヒア・コリ等が利用できる。
Ｌ−アルギニン生産能を有するエシェリヒア属細菌としては、エシェリヒア・コリ237株（ロシア特許出願第２０００１１７６７７号）等が挙げられる。
本発明の微生物の第１の形態は、上記のようなＬ−アルギニン生産能を有する微生物において、ｌｙｓＥ遺伝子の発現が増強されるように改変された細菌である。
本発明の微生物の第２の形態は、さらにアルギニンリプレッサーが正常に機能しないように改変された微生物である。
本発明の微生物の第３の形態は、前記第１又は第２の形態の微生物において、さらに細胞内のＬ−アルギニン生合成系酵素の活性が増強されるように改変された微生物である。
以下、各形態について説明する。
【００２６】
（１）ｌｙｓＥ遺伝子の発現が増強された微生物
微生物のｌｙｓＥ遺伝子の発現の増強は、Ｌ−リジン排出系に関与するタンパク質の活性が上昇するように前記タンパク質をコードする遺伝子に変異を導入するか、又は同遺伝子を用いた遺伝子組換え技術を利用することによって、行うことができる。前記遺伝子として具体的には、lysE遺伝子（Vrlijc M., Sahm H., Eggeling L. Molecular Microbiology 22:815-826(1996)、WO 97/23597）が挙げられる。
【００２７】
以下に、lysE遺伝子を例に説明する。
lysE遺伝子によってコードされるタンパク質（LysEタンパク質）の活性が上昇するような変異としては、lysE遺伝子の転写量が増大するようなプロモーター配列の変異、及び、LysEタンパク質の比活性が高くなるようなlysE遺伝子のコード領域内の変異が挙げられる。
【００２８】
また、遺伝子組換え技術を利用してLysE活性を高めるには、例えば、細胞中のlysE遺伝子のコピー数を高めることによって達成される。例えば、lysE遺伝子を含むＤＮＡ断片を、微生物で機能するベクター、好ましくはマルチコピー型のベクターと連結して組換えDNAを作製し、これを微生物に導入して形質転換すればよい。
【００２９】
lysE遺伝子は、コリネ型細菌もしくはエシェリヒア属細菌由来の遺伝子、又は他の生物由来の遺伝子のいずれも使用することができる。このうち、発現の容易さの観点からは、コリネ型細菌又はエシェリヒア属細菌由来の遺伝子が好ましい。
【００３０】
コリネ型細菌のlysE遺伝子は既に配列が明らかにされている（GenBank accession X96471）ので、その塩基配列に基づいて作製したプライマー、例えば配列表配列番号２３および２４に示すプライマーを用いて、コリネ型細菌の染色体DNAを鋳型とするPCR法（PCR：polymerase chain reaction； White,T.J. et al., Trends Genet. 5, 185 (1989)参照）によって、lysE遺伝子を取得することができる。コリネバクテリウム・グルタミカムlysGおよびlysE遺伝子を含むＤＮＡ断片の塩基配列（GenBank accession X96471）を配列番号２５に、LysEのアミノ酸配列を配列番号２６に示す。尚、LysGは、配列番号２５の塩基番号1723〜2352に相当する位置の相補鎖にコードされている。
【００３１】
他の微生物のlysE遺伝子も、その微生物において公知のlysE遺伝子もしくは他種の微生物のlysE遺伝子又はLysEタンパク質の配列情報に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとするＰＣＲ法、又は、前記配列情報に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプローブとするハイブリダイゼーション法によって、微生物の染色体ＤＮＡ又は染色体ＤＮＡライブラリーから、取得することができる。
【００３２】
また、本発明に用いられるlysE遺伝子は、野生型遺伝子には限られず、コードされるLysEタンパク質の機能が損なわれない限り、１若しくは複数の位置での１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加等を含む変異体又は人為的な改変体であってもよい。ここで、「数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、具体的には２から３０個、好ましくは、２から２０個、より好ましくは２から１０個である。また、上記のようなLysEタンパク質と実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号２５の塩基番号１０２５〜１７２３からなる塩基配列又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつLysEと同様の活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。ここで、「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば５０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。
【００３３】
染色体ＤＮＡは、ＤＮＡ供与体である細菌から、例えば、斎藤、三浦の方法（H. Saito and K.Miura, Biochem.B iophys. Acta, 72, 619 (1963)、生物工学実験書、日本生物工学会編、９７〜９８頁、培風館、１９９２年参照）等により調製することができる。
【００３４】
PCR法により増幅されたlysE遺伝子は、エシェリヒア・コリ及び／またはコリネ型細菌等の細胞内において自律複製可能なベクターDNAに接続して組換えDNAを調製し、これをエシェリヒア・コリに導入しておくと、後の操作がしやすくなる。エシェリヒア・コリ細胞内において自律複製可能なベクターとしては、pUC19、pUC18、pHSG299, pHSG399, pHSG398, RSF1010, pBR322, pACYC184, pMW219等が挙げられる。
【００３５】
コリネ型細菌で機能するベクターとは、例えばコリネ型細菌で自律複製できるプラスミドである。具体的に例示すれば、以下のものが挙げられる。
pAM330 特開昭58-67699号公報参照
pHM1519 特開昭58-77895号公報参照
pSFK6 特開2000-262288号公報参照
また、これらのベクターからコリネ型細菌中でプラスミドを自律複製可能にする能力を持つＤＮＡ断片を取り出し、前記エシェリヒア・コリ用のベクターに挿入すると、エシェリヒア・コリ及びコリネ型細菌の両方で自律複製可能ないわゆるシャトルベクターとして使用することができる。
【００３６】
このようなシャトルベクターとしては、以下のものが挙げられる。尚、それぞれのベクターを保持する微生物及び国際寄託機関の受託番号をかっこ内に示した。
これらのベクターは、寄託微生物から次のようにして得られる。対数増殖期に集められた細胞をリゾチーム及びＳＤＳを用いて溶菌し、３００００×ｇで遠心分離して溶解物から得た上澄液にポリエチレングリコールを添加し、セシウムクロライド−エチジウムブロマイド平衡密度勾配遠心分離により分別精製する。
【００３７】
lysE遺伝子とコリネ型細菌で機能するベクターを連結して組換えDNAを調製するには、lysE遺伝子の末端に合うような制限酵素でベクターを切断する。連結はT4DNAリガーゼ等のリガーゼを用いて行うのが普通である。
【００３８】
上記のように調製した組換えDNAを微生物に導入するには、これまでに報告されている形質転換法に従って行えばよい。例えば、エシェリヒア・コリ Ｋ−１２について報告されているような、受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法（Mandel,M.and Higa,A.,J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)）があり、バチルス・ズブチリスについて報告されているような、増殖段階の細胞からコンピテントセルを調製してＤＮＡを導入する方法（ Duncan,C.H.,Wilson,G.A.and Young,F.E., Gene, 1, 153 (1977)）がある。あるいは、バチルス・ズブチリス、放線菌類及び酵母について知られているような、ＤＮＡ受容菌の細胞を、組換えＤＮＡを容易に取り込むプロトプラストまたはスフェロプラストの状態にして組換えＤＮＡをＤＮＡ受容菌に導入する方法（ Chang,S.and Choen,S.N.,Molec. Gen. Genet., 168, 111 (1979);Bibb,M.J.,Ward,J.M.and Hopwood,O.A.,Nature, 274, 398 (1978);Hinnen,A.,Hicks,J.B.and Fink,G.R.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 1929 (1978)）も応用できる。また、コリネ型細菌の形質転換は、電気パルス法（杉本ら、特開平2-207791号公報）によっても行うことができる。
【００３９】
lysE遺伝子のコピー数を高めることは、lysE遺伝子を微生物の染色体DNA上に多コピー存在させることによっても達成できる。微生物の染色体DNA上にlysE遺伝子を多コピーで導入するには、染色体DNA上に多コピー存在する配列を標的に利用して相同組換えにより行う。染色体DNA上に多コピー存在する配列としては、レペティティブDNA、転移因子の端部に存在するインバーテッド・リピートが利用できる。あるいは、特開平2-109985号公報に開示されているように、lysE遺伝子をトランスポゾンに搭載してこれを転移させて染色体DNA上に多コピー導入することも可能である。
【００４０】
lysE遺伝子の発現の増強は、上記の遺伝子増幅による以外に、染色体DNA上またはプラスミド上のlysE遺伝子のプロモーター等の発現調節配列を強力なものに置換することによっても達成される（WO00/18935）。例えば、lacプロモーター、trpプロモーター、trcプロモーター等が強力なプロモーターとして知られている。また、lysE遺伝子のプロモーター領域に塩基置換等を導入し、より強力なものに改変することも可能である。これらのプロモーター置換または改変によりlysE遺伝子の発現が強化される。これら発現調節配列の改変は、lysE遺伝子のコピー数を高めることと組み合わせてもよい。
【００４１】
発現調節配列の置換は、例えば後述の温度感受性プラスミドを用いた遺伝子置換と同様にして行うことができる。例えば、コリネ型酸菌の温度感受性プラスミドとしては、p48K及びpSFKT2（以上、特開2000-262288号公報参照）、pHSC4（フランス特許公開1992年2667875号公報、特開平5-7491号公報参照）等が挙げられる。これらのプラスミドは、コリネ型細菌中で少なくとも25℃では自律複製することができるが、37℃では自律複製できない。後記実施例では、GDH遺伝子のプロモーター配列を置換する際にpSFKT2を用いたが、pSFKT2の代わりにpHSC4を用いて、同様にして遺伝子置換を行うことができる。pHSC4を保持するエシェリヒア・コリAJ12571は、1990年10月11日に独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（〒305-5466 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に受託番号FERM P-11763として寄託され、1991年8月26日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、FERM BP-3524の受託番号で寄託されている。
【００４２】
（２）アルギニンリプレッサーが正常に機能しない微生物
本発明において「アルギニンリプレッサー」とは、Ｌ−アルギニン生合成を抑制する作用を有するタンパク質であり、微生物において同タンパク質をコードする遺伝子の発現量が増加するとＬ−アルギニン生産能が低下し、発現量が低下又は消失するとＬ−アルギニン生産能が向上する。以下、アルギニンリプレッサーをコードする遺伝子をargR遺伝子ともいう。「アルギニンリプレッサーが正常に機能しない」とは、野生株又は非改変株に比べて、アルギニンリプレッサーの活性が低下又は消失していることをいう。
【００４３】
リプレッサーが正常に機能しない微生物は、argR遺伝子が、該遺伝子産物であるアルギニンリプレッサーの活性が低下又は消失するか、又はargR遺伝子の転写が低下または消失するように、改変することによって得られる。このような微生物は、例えば、遺伝子組換え法を用いた相同組換え法（Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory press (1972); Matsuyama, S. and Mizushima, S., J. Bacteriol., 162, 1196(1985)）により、染色体上のargR遺伝子を、正常に機能しないargR遺伝子（以下、「破壊型argR遺伝子」ということがある）で置換することによって行うことができる。
【００４４】
染色体上の配列と相同性を有する配列を持つプラスミド等が菌体内に導入されると、ある頻度で相同性を有する配列の箇所で組換えを起こし、導入されたプラスミド全体が染色体上に組み込まれる。この後さらに染色体上の相同性を有する配列の箇所で組換えを起こすと、再びプラスミドが染色体上から抜け落ちるが、この時組換えを起こす位置により破壊された遺伝子の方が染色体上に固定され、元の正常な遺伝子がプラスミドと一緒に染色体上から抜け落ちることもある。このような菌株を選択することにより、染色体上の正常なargR遺伝子が破壊型argR遺伝子と置換された菌株を取得することができる。
【００４５】
このような相同組換えによる遺伝子破壊技術は既に確立しており、直鎖ＤＮＡを用いる方法、温度感受性プラスミドを用いる方法等が利用できる。また、薬剤耐性等のマーカー遺伝子が内部に挿入されたargR遺伝子を含み、かつ、目的とする微生物細胞内で複製できないプラスミドを用いることによっても、argR遺伝子の破壊を行うことができる。すなわち、前記プラスミドで形質転換され、薬剤耐性を獲得した形質転換体は、染色体ＤＮＡ中にマーカー遺伝子が組み込まれている。このマーカー遺伝子は、その両端のargR遺伝子配列と染色体上のargR遺伝子との相同組換えによって組み込まれる可能性が高いため、効率よく遺伝子破壊株を選択することができる。
【００４６】
遺伝子破壊に用いる破壊型argR遺伝子は、具体的には、制限酵素消化及び再結合によるargR遺伝子の一定領域の欠失、argR遺伝子への他のＤＮＡ断片（マーカー遺伝子等）の挿入、または部位特異的変異法（Kramer, W. and Frits, H. J., Methods in Enzymology, 154, 350 (1987)）や次亜硫酸ナトリウム、ヒドロキシルアミン等の化学薬剤による処理（Shortle, D. and Nathans, D., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 75, 270(1978)）によって、argR遺伝子のコーディング領域またはプロモーター領域等の塩基配列の中に１つまたは複数個の塩基の置換、欠失、挿入、付加または逆位を起こさせることにより、コードされるリプレッサーの活性を低下又は消失させるか、又はargR遺伝子の転写を低下または消失させることにより、取得することができる。これらの態様の中では、制限酵素消化及び再結合によりargR遺伝子の一定領域を欠失させる方法、又はargR遺伝子へ他のＤＮＡ断片を挿入する方法が、確実性及び安定性の点から好ましい。
【００４７】
また、argR遺伝子とその周辺領域を含むプラスミドを鋳型とし、argR遺伝子の末端部又は周辺領域に相当するプライマーを用いてPCR（ポリメラーゼ・チェイン・リアクション）を行い、argR遺伝子の内部又は全体を除く部分を増幅し、得られる増幅産物を環状化することによって、argR遺伝子破壊用プラスミドを作製することができる。後記実施例では、この方法によってargR遺伝子を破壊した。
【００４８】
argR遺伝子は、微生物の染色体ＤＮＡから、既知のargR遺伝子の塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとするＰＣＲ法によって取得することができる。また、微生物の染色体ＤＮＡライブラリーから、既知のargR遺伝子の塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプローブとするハイブリダイゼーション法によって、argR遺伝子を取得することができる。尚、本発明においては、argR遺伝子は破壊型argR遺伝子の作製に用いるため、必ずしも全長を含む必要はなく、遺伝子破壊を起こすのに必要な長さを有していればよい。
【００４９】
argR遺伝子は、目的の微生物のargR遺伝子と相同組換えを起こす程度の相同性を有していれば、由来を特に制限されない。例えば、コリネ型細菌のargR遺伝子として具体的には、配列番号１７に示す塩基配列を有するブレビバクテリウム・フラバムのargR遺伝子、及び、コリネバクテリウム・グルタミカムのargR遺伝子（GenBank accession AF049897）が挙げられる。これらのargR遺伝子は相同性が高く、argR遺伝子を破壊するコリネ型細菌と種又は属が異なるコリネ型細菌又は他の微生物のargR遺伝子であっても、遺伝子破壊に用いることができると考えられる。
【００５０】
本発明において、配列番号１８に示すアミノ酸配列又は同アミノ酸配列と相同性を有するアミノ酸配列とは、配列番号１８に示すアミノ酸配列をコードするargR遺伝子（例えば配列番号１７に示す塩基配列を有するargR遺伝子）と相同組換えを起こす程度の相同性を有するargG遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を意味する。前記相同性は、例えば、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上である。上記のようなargG遺伝子としては、例えば、配列番号１７の塩基番号１８５２〜２３６４からなる塩基配列又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るＤＮＡが挙げられる。ここで、「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば５０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。
【００５１】
PCRに用いるプライマーとしては、argR遺伝子を増幅することができるものであればよく、具体的には配列番号１９及び配列番号２０に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。
【００５２】
また、マーカー遺伝子としては、カナマイシン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子が挙げられる。カナマイシン耐性遺伝子は、ストレプトコッカス・フェカリスのカナマイシン耐性遺伝子を含む公知のプラスミド、例えばpDG783（Anne-Marie Guerout- Fleury et al., Gene, 167, 335-337(1995)）からPCRにより増幅することにより取得することができる。
【００５３】
マーカー遺伝子として薬剤耐性遺伝子を用いる場合は、該遺伝子をプラスミド中のargR遺伝子の適当な部位に挿入し、得られるプラスミドで微生物を形質転換し、薬剤耐性となった形質転換体を選択すれば、argR遺伝子破壊株が得られる。染色体上のargR遺伝子が破壊されたことは、サザンブロッティングやPCR法により、染色体上のargR遺伝子又はマーカー遺伝子を解析することによって、確認することができる。前記カナマイシン耐性遺伝子が染色体ＤＮＡに組み込まれたことの確認は、カナマイシン耐性遺伝子を増幅することができるプライマー（例えば配列番号１及び２に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド）を用いたPCRにより、行うことができる。
【００５４】
（３）Ｌ−アルギニン生合成系酵素活性の増強
Ｌ−アルギニン生合成系酵素活性の増強は、細胞内のＬ−アルギニン生合成系酵素の活性が上昇するように同酵素をコードする遺伝子に変異を導入するか、又は同遺伝子を用いた遺伝子組換え技術を利用することによって、行うことができる。Ｌ−アルギニン生合成系酵素としては、Ｎ−アセチルグルタミルリン酸レダクターゼ（argC）、オルニチンアセチルトランスフェラーゼ（argJ）、Ｎ−アセチルグルタメートキナーゼ（argB）、アセチルオルニチントランスアミナーゼ（argD）、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（argF）、アルギニノコハク酸シンターゼ（argG）、アルギニノコハク酸リアーゼ（argH）から選ばれる１種又は２種以上が挙げられる。これらの酵素名の後のカッコ内は、各酵素をコードする遺伝子名である。
また、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ活性を増強することによっても、Ｌ−アルギニン生産能を上昇させることができる（EP 1057 893 A1）。
【００５５】
遺伝子組換え技術を利用したＬ−アルギニン生合成系酵素活性の増強は、前記LysE活性を高めるのと同様にして、各遺伝子のコピー数を高めること、又は各遺伝子の発現が増強されるようにそれらの遺伝子の発現調節配列を改変することにより、行うことができる。
【００５６】
コリネバクテリウム・グルタミカムの各遺伝子の塩基配列は、GenBankにaccession AF049897として登録されている。これらの遺伝子は、コリネバクテリウム・グルタミカムでは、argC、argJ、argB、argD、argF、argR、argG、argHの順に、染色体ＤＮＡ上に並んでおり、例えば配列番号２７および配列番号２８に示すプライマーを用いて、コリネバクテリウム・グルタミカム又はブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムの染色体ＤＮＡを鋳型とするPCRにより取得することができる。尚、本発明においては、正常なargRを他のＬ−アルギニン生合成系酵素遺伝子とともにコリネ型細菌に導入すると、Ｌ−アルギニン生産性の向上を妨げるので、得られたPCR増幅断片中のargRを破壊又は欠失させておくことが好ましい。これは、例えば、PCR増幅断片を含むプラスミドを鋳型とし、配列番号２９および配列番号３０に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとしてPCRを行うことによって、行うことができる。
【００５７】
本発明においては、Ｌ−アルギニン生合成系酵素活性の増強は、染色体上のargR遺伝子の破壊と組み合わせてもよい。
【００５８】
＜２＞Ｌ−アルギニンの製造法
上記のようにして得られるｌｙｓＥ遺伝子の発現が増強され、かつ、Ｌ−アルギニン生産能を有する微生物を培地で培養し、該培養物中にＬ−アルギニンを生成蓄積せしめ、該培養物からＬ−アルギニンを採取することにより、Ｌ−アルギニンを効率よく製造することができる。
【００５９】
使用する培地は、微生物を用いたアミノ酸の発酵生産に従来より用いられてきた周知の培地を用いてかまわない。つまり、炭素源、窒素源、無機イオン及び必要に応じその他の有機成分を含有する通常の培地である。
【００６０】
炭素源としては、グルコース、シュクロース、ラクトース、ガラクトース、フラクトースやでんぷんの加水分解物などの糖類、グリセロールやソルビトールなどのアルコール類、フマール酸、クエン酸、コハク酸等の有機酸類を用いることができる。
【００６１】
窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガス、アンモニア水等を用いることができる。
【００６２】
有機微量栄養源としては、ビタミンＢ1、Ｌ−ホモセリンなどの要求物質または酵母エキス等を適量含有させることが望ましい。これらの他に、必要に応じて、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、鉄イオン、マンガンイオン等が少量添加される。
【００６３】
培養は好気的条件下で１〜７日間実施するのがよく、培養温度は２４℃〜３７℃、培養中のｐＨは５〜９がよい。尚、ｐＨ調整には無機あるいは有機の酸性あるいはアルカリ性物質、更にアンモニアガス等を使用することができる。発酵液からのＬ−アルギニンの採取は通常イオン交換樹脂法その他の公知の方法を組み合わせることにより実施できる。
【００６４】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
【実施例１】
エシェリヒア・コリとコリネ型細菌のシャトルベクター及び温度感受性ベクターの構築
はじめに、コリネ型細菌にargR遺伝子を導入するためのベクター、及びコリネ型細菌のargR欠失株を作製するための温度感受性ベクターを構築した。
【００６５】
＜１＞ストレプトコッカス・フェカリスの薬剤耐性遺伝子を持つベクターの構築
ストレプトコッカス・フェカリスのカナマイシン耐性遺伝子を、同遺伝子を含む公知のプラスミドからPCRにより増幅した。ストレプトコッカス・フェカリスのカナマイシン耐性遺伝子の塩基配列は既に明らかにされている（Trieu-Cuot,P. and Courvalin,P.:Gene 23（3）, 331-341（1983））。この配列を基に配列番号１および２に示すプライマーを合成し、pDG783（Anne-Marie Guerout- Fleury et al., Gene, 167, 335-337(1995)）を鋳型としてPCRを行ない、カナマイシン耐性遺伝子とそのプロモーターを含むDNA断片を増幅した。
【００６６】
上記DNA断片を宝酒造社製のSUPREC02にて精製した後、制限酵素HindIIIとHincIIで完全分解し平滑末端化した。平滑末端化は宝酒造社製のBlunting Kitにより行なった。このDNA断片と、配列番号３および４に示すプライマーを用いてpHSG399(S.Takeshita et al : Gene 61,63-74(1987)参照)を鋳型としてPCRを行って得られた増幅産物を精製し平滑末端化したDNA断片とを、混合し連結した。連結反応は宝酒造社製 DNA ligation kit ver2にて行なった。連結したDNAを用いて、エシェリヒア・コリJM109のコンピテントセル（宝酒造社製）を形質転換し、IPTG（イソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド）10μg/ml、X-Gal（5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-D−ガラクトシド）40μg/ml及びカナマイシン25μg/mlを含むL培地（バクトトリプトン10g/L、バクトイーストエキストラクト5g/L、NaCl 5g/L、寒天15g/L、pH7.2）に塗布し、一晩培養後、出現した青色のコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換株を得た。
【００６７】
形質転換株からアルカリ法（生物工学実験書、日本生物工学会編、105頁、培風館、1992年）を用いてプラスミドを調製し、制限酵素地図を作成し、図１に示す制限酵素地図と同等であるものをpK1と名付けた。このプラスミドはエシェリヒア・コリ中にて安定に保持され、宿主にカナマイシン耐性を付与する。また、lazZ'遺伝子を含むため、クローニングベクターに適している。
【００６８】
＜２＞シャトルベクターpSFK6の構築
温度感受性複製制御領域の取得の材料として、エシェリシア・コリと、コリネ型細菌の双方の菌体中で自律複製可能なプラスミドベクターを作製した。ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムATCC13869より抽出したプラスミドpAM330(特開昭58-67699号公報参照)を制限酵素HindIIIで完全分解したのち平滑末端化し、これと、上記pK1を制限酵素BsaAIで完全分解したものを、連結した。連結後のDNAを用いてブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムATCC13869を形質転換した。形質転換の方法は、電気パルス法（特開平2-207791号参照）を用いた。形質転換体の選択は、カナマイシン25μg/mlを含むM-CM2Bプレート(ポリペプトン10g/L、酵母エキス10g/L、NaCl 5g/L、ビオチン10μg/L、寒天15g/L、pH7.2)にて行った。二晩培養後、コロニーを釣り上げ単コロニー分離し、形質転換体とした。形質転換体からプラスミドDNAを調製し、制限酵素地図を作成し、図２に示す制限酵素切断地図と同一の制限酵素地図を持つものをpSFK6と命名した。このプラスミドは、エシェリシア・コリとコリネ型細菌中で自律複製でき、宿主にカナマイシン耐性を付与する。
【００６９】
＜３＞温度感受性複製制御領域をもつプラスミドの取得
pSFK6をインビトロでヒドロキシルアミン処理した。ヒドロキシルアミン処理は、公知の方法（G. O. Humpherys et al., Molec. Gen. Genet., 145, 101-108 (1976)等参照）によった。処理後のDNAを回収し、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムATCC13869株を形質転換した。形質転換体は、カナマイシン25μg/mlを含むCM2Bプレート上で低温(25℃)にて選択した。出現した形質転換体を、同様の選択プレートにレプリカし、高温(34℃)にて培養した。高温でカナマイシンを含む選択プレート上で生育できない株１株を取得した。この株から、プラスミドを回収しp48Kと命名した。
【００７０】
＜４＞温度感受性複製制御領域の塩基配列の決定
野生型の複製制御領域を持つプラスミドpSFK6、および温度感受性型の複製制御領域を持つプラスミドp48Kについて、それぞれの複製制御領域部分の塩基配列を決定した。塩基配列は、ABI社のDNA Sequencing Kitを用いてABI社の全自動シーケンサーABI310にて決定した。その結果、野生型複製制御領域と、温度感受性変異型複製制御領域の間には、６個の塩基置換があることが判明した。pSFK6に含まれるコリネ型細菌中で機能する複製制御領域部分（pAM330由来の全配列）の塩基配列を配列番号５に、p48Kに含まれるコリネ型細菌中で機能する温度感受性複製制御領域部分の塩基配列を配列番号７に示す。また、これらの塩基配列中に存在するＯＲＦによってコードされ得るアミノ酸配列を配列番号６及び８に示す。温度感受性複製制御領域では、配列上の1255番目のCがTに、1534番目のCがTに、1866番目のGがAに、2058番目のGがAに、2187番目のCがTに、 3193番目のGがAに変異している。このうちアミノ酸変異を伴うものは1534番目の変異点のみであり、プロリンからセリンへの置換を引き起こす。
【００７１】
＜５＞温度感受性変異を有するシャトルベクターの構築
p48Kが持つ６個の変異を、一点ずつシャトルベクターpSFK6に導入した（図３参照）。変異の導入は、公知の方法（Mikaelian, I., Sergeant, A. Nucleic Acids Res., 20, 376 (1992)）によって行った。具体的方法を以下に示す。3193番目のG→Aの変異を導入するために、配列番号９および１０に示すプライマーの組み合わせと、配列番号１１および１２に示すプライマーの組み合わせを用いて、pAM330を鋳型としてPCRを行なった。得られた増幅産物はそれぞれアガロースゲルで電気泳動後、ゲルから回収することにより精製した。ゲルからのDNA断片の回収は宝酒造社製のEASYTRAP Ver.2にて行なった。精製したDNAを1:1のモル比となるように混合し、これを鋳型として配列番号１３および１４に示すプライマーを用いてPCR反応を行なった。増幅産物は制限酵素MluIで完全分解し、アガロースゲルにて電気泳動後、およそ3.2KbのDNA断片を回収した。pSFK6も同様に制限酵素MluIで完全分解し、アガロースゲルにて電気泳動後、およそ3.8KbのDNA断片を回収した。得られたDNA断片を混合して連結し、エシェリヒア・コリJM109のコンピテントセル（宝酒造社製）を用いて形質転換を行い、カナマイシン25μg/mlを含むL培地に塗布し、一晩培養後、出現したコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換株を得た。形質転換株からアルカリ法を用いてプラスミドを調製し、塩基配列を決定し、配列番号１７に示す配列の1534番目のCがTに変異していることを確認した。このプラスミドをpSFKT2と名付けた（図３）。
【００７２】
【実施例２】
argR遺伝子のクローニングとコリネ型細菌での増幅効果
ブレビバクテリウム・フラバム野生株2247（AJ14067）の染色体DNAを鋳型とし、配列番号１５（配列番号１７の塩基番号1717から1741の配列）および配列番号１６（配列番号１７の塩基番号2386から2362の配列に相補的な配列）に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（プライマー１，２）をプライマーとしてPCRを行った。PCRは、Pyrobest DNA polymerae（宝酒造）を用い、９８℃ １０秒、５８℃ １分、７２℃ ３分を１サイクルとして３０サイクル行った。得られた増幅断片を、実施例１で得たシャトルベクターpSFK6のSmaIサイトに挿入し、コリネ型細菌で自律複製可能なプラスミドpWRを得た。
【００７３】
コリネ型細菌のＬ−アルギニン生産菌でのargR遺伝子の増幅効果を調べるため、pWRをＬ−アルギニン生産菌ブレビバクテリウム・フラバムAJ11345株（FERM BP-6894）に導入した。プラスミドの導入は、電気パルス法（特開平2-207791号）を用いた。形質転換体は、カナマイシン25μg/mlを含むCM2G寒天培地（グルコース5g、NaCl 5g、寒天15gを純水1Lに含む。pH7.2）にてカナマイシン耐性株として選択し、AJ11345/pWRを得た。対照として、AJ11345株にpSFK6を同様にして導入し、形質転換体AJ11345/pSFK6を得た。
【００７４】
上記各菌株を、グルコース0.5g/dl、ポリペプトン 1g/dl、酵母エキス 1g/dl、NaCl 0.5g/dlを含む寒天培地にぬりつけ、31.5℃で20時間培養した。得られた菌体１エーゼを、グルコース4g/dl、硫酸アンモニウム6.5g/dl、KH2PO4 0.1g/dl、MgSO4 0.04g/dl、FeSO4 0.001g/dl、MnSO4 0.001g/dl、ビタミンB1 5μg/dl、ビオチン5μg/dl、大豆加水分解物（N量として45mg/dl）を含む培地に植菌し、フラスコにて31.5℃で50時間振とう培養を行った。各々の培養液中のＬ−アルギニン蓄積量（濃度(g/dl)）を測定した結果を表１に示す。その結果、argR増幅株では、ほとんどＬ−アルギニンを蓄積しなくなった。このことから、argR遺伝子産物がアルギニンリプレッサーとして機能していることが示された。
【００７５】
【表１】
表１
─────────────────────
菌株 L-アルギニン蓄積量（g/dl）
─────────────────────
AJ11345/pSFK6 1.3
AJ11345/pWR 0.2
─────────────────────
【００７６】
pWRにクローニングされた挿入断片の塩基配列を決定した結果を配列番号１７に示す。同塩基配列によってコードされ得るアミノ酸配列を配列番号１８に示す。
【００７７】
【実施例３】
コリネ型細菌のargR破壊株の構築及びアルギニンリプレッサー欠失の効果
＜１＞argR破壊用プラスミドの作製
ブレビバクテリウム・フラバム野生株2247株（AJ14067）の染色体DNAを鋳型とし、配列番号１９（配列番号１７の塩基番号４から28の配列）および配列番号２０（配列番号１７の塩基番号4230から4211の配列に相補的な配列）に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（プライマー３，４）をプライマーとしてPCRを行った。PCRは、Pyrobest DNA polymerae（宝酒造）を用い、９８℃１０秒、５８℃１分、７２℃３分を１サイクルとして３０サイクル行った。得られた増幅断片を、クローニングベクターpHSG399のマルチクローニングサイト内のSmaIサイトに挿入した。
【００７８】
挿入されたDNA断片からアルギニンリプレッサーをコードしていると思われるORF全てを欠失させるために、配列番号２１（配列番号１７の塩基番号2372から2395の配列）および配列番号２２（配列番号１７の塩基番号1851から1827の配列に相補的な配列）に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（プライマー５，６）をプライマーとし、増幅断片が挿入されたpHSG399を鋳型をしてPCRを行った。PCR産物をセルフライゲーションすることにより、pssERを構築した。
【００７９】
次に、pssERを制限酵素SmaIおよびSalIで消化して得た断片と、実施例１で得た温度感受性プラスミドpSFKT2をSmaI、SalIで消化したものを連結することにより、コリネ型細菌で自律複製能が温度感受性になったargR破壊用プラスミドpssERTを得た。
【００８０】
＜２＞相同組換えによるコリネ型細菌のアルギニンリプレッサー欠失株の取得
上記のようにして得たプラスミドpssERTを、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムの野生株2256（ATCC13869）に導入した。プラスミドの導入は電気パルス法（特開平2-207791号）を用いた。本プラスミドは、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム中で自律複製能が温度感受性であるため、本プラスミドが相同組換えによって染色体に組み込まれた株のみが、プラスミド複製の非許容温度である34℃でカナマイシン耐性株として選択できる。argR破壊用プラスミドが染色体に組み込まれた株は、25μg/mlのカナマイシンを含むCM2G培地プレート（ポリペプトン10g、酵母エキス10g、グルコース5g、NaCl 5g、寒天15ｇを純水1Lに含む。pH7.2）にて、カナマイシン耐性株として選択した。この段階では、染色体由来の正常なargR遺伝子と、プラスミド由来のORFが欠失したargG遺伝子とが、プラスミド部分を挟んで染色体上にタンデムに存在する。
【００８１】
次に、組換え株を、再度相同組換えを起こさせ、プラスミド複製の非許容温度34℃でカナマイシン感受性になった株を選択することにより、プラスミド部分とともにargR遺伝子の一方が脱落した株を選択した。これらの株は、染色体上に正常なargR遺伝子が残された株と、破壊型argR遺伝子が残された株とが存在する。これらの中から、破壊型argR遺伝子のみを保持する株を選択した。染色体上のargR遺伝子が破壊型であるかどうかは、34℃でカナマイシン感受性になった株の染色体を調製し、これを鋳型とし、配列番号１９および配列番号２０に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド(プライマー３，４) をプライマーとしてPCRを行い、親株由来の染色体を鋳型にして同様にPCRを行ったものよりも、PCR産物が約600bp短くなることで確認することができる。
【００８２】
上記のようにして選択されたargR破壊株のPCR産物のダイレクトシークエンスを行い、目的どおりargR遺伝子が破壊されていることを確認し、2256ΔR株を得た。
【００８３】
＜３＞argR破壊株によるＬ−アルギニンの生産
2256ΔR株を、グルコース0.5g/dl、ポリペプトン 1g/dl、酵母エキス 1g/dl、NaCl 0.5g/dlを含む寒天培地にぬりつけ、31.5℃で20時間培養した。得られた菌体１エーゼを、グルコース3g/dl、硫酸アンモニウム6.5g/dl、KH２PO4 0.1g/dl、MgSO4 0.04g/dl、FeSO4 0.001g/dl、MnSO4 0.001g/dl、ビタミンB1 300μg/dl、ビオチン200μg/dl、大豆加水分解物（N量として165mg/dl）を含み、NaOHでpH7.0に調整した培地に植菌し、31.5℃で24時間シード培養を行った。
【００８４】
上記シード培養液1mlを、グルコース4g/dl、硫酸アンモニウム6.5g/dl、KH2PO4 0.5g/dl、MgSO4 0.04g/dl、FeSO4 0.001g/dl、MnSO4 0.01g/dl、ビタミンB1 5μg/dl、ビオチン5μg/dl、大豆加水分解物（N量として45mg/dl）を含み、KOHでpHを7.0に調整した培地に植菌し、フラスコにて31.5℃で50時間振とう培養を行った。各菌株の培養液中のＬ−アルギニン蓄積量（濃度(mg/dl)）を測定した結果を表２に示す。その結果、argR破壊株は、親株に比べて著量のＬ−アルギニンを生成した。
【００８５】
【表２】
表２
─────────────────────
菌株 L-アルギニン蓄積量（mg/dl）
─────────────────────
2256 0
2256ΔR 200
─────────────────────
【００８６】
【実施例４】
lysEのコリネ型Arg生産菌における増幅効果
＜１＞lysE遺伝子搭載プラスミドの作製
上記菌株においてlysE遺伝子の増幅効果を確認するため、lysE遺伝子とコリネ型細菌の複製制御領域を有するプラスミドの構築を行なった。
【００８７】
既に取得されているコリネ型細菌で自律複製可能なプラスミドpHM1519(Agric.Biol.Chem.,48,2901-2903(1984))由来の複製制御領域を持つプラスミドpHK4（特開平5‐7491号公報参照）を制限酵素BamHIおよびKpnIで消化して、複製制御領域を含む遺伝子断片を取得した。得られた断片をDNA平滑末端化キット(宝酒造)を用いて平滑末端化した後、KpnIリンカーを用いてpHSG399のKpnIサイトに挿入し、エシェリヒア・コリとコリネ型細菌とのシャトルベクターpKCを得た。
【００８８】
次に、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム野生株2256株の染色体DNAを鋳型とし、配列番号２３（配列番号２５の塩基番号６８１から７０３の配列）および配列番号２４（配列番号２５の塩基番号１８４１から１８６３の配列に相補的な配列）に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとしてPCRを行い、lysE遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。PCRは、DNA PolymeraseとしてTaKaRa Ex Taq（宝酒造）を用い、98℃ 30秒、55℃ 15秒、72℃ 2分を1サイクルとして30サイクル行なった。得られた増幅断片を、TAクローニングベクターpCR2.1（Invitrogen社製）に挿入し、pCRlysEを得た。さらに、この挿入断片を含むように制限酵素BamHIおよびXbaIで遺伝子断片を切り出し、pKCのBamHIおよびXbaI サイトに連結して、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム由来のlysE搭載プラスミドplysEを構築した。この構築の過程を図４に示す。
【００８９】
＜２＞2256株および2256ΔR株におけるlysE遺伝子増幅効果の確認
上記のようにして得られたプラスミドplysEを、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム2256株および2256ΔR株に導入した。プラスミドの導入は電気パルス法（特開平2-207791号）を用いた。形質転換体は、5μg/mlのクロラムフェニコールを含むCM2G培地プレート（ポリペプトン10g、酵母エキス10g、グルコース5g、NaCl 5g、寒天15ｇを純水1Lに含む。pH7.2）にて、クロラムフェニコール耐性株として選択した。これらの形質転換体を、前記と同様にしてフラスコ培養し、Ｌ−アルギニン蓄積量を測定した。結果を表３に示す。
【００９０】
【表３】
表３
──────────────────────────
菌株 L-アルギニン蓄積量（mg/dl）
──────────────────────────
2256 0
2256/plysE 0
2256ΔR 200
2256ΔR/plysE 600
──────────────────────────
【００９１】
【実施例５】
Ｌ−アルギニン生合成系遺伝子との組合せ増幅効果の確認
＜１＞Ｌ−アルギニン生合成系遺伝子搭載plasmidの作製
さらに、上記菌株においてＬ−アルギニン生合成系遺伝子argC,J,B,F,G,Hの増幅効果を確認するため、argCJBDFGH遺伝子とコリネ型細菌の複製制御領域を有するプラスミドの構築を行なった。
【００９２】
pHK4（特開平5-7491号）を制限酵素BamHIおよびKpnIで消化して、コリネ型細菌における複製制御領域を含む遺伝子断片を取得した。得られた断片をDNA平滑末端化キット(宝酒造)を用いて平滑末端化した後、SalIリンカーを用いてpHSG399のSalIサイトに挿入し、エシェリヒア・コリとコリネ型細菌とのシャトルベクターpSAC4を得た。
【００９３】
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム野生株2256株の染色体DNAを鋳型とし、配列番号２７および配列番号２８に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとしてPCRを行い、argCJBDFRGHを含むＤＮＡ断片を増幅した。PCRは、DNA PolymeraseとしてTaKaRa LA Taq（宝酒造）を用い、98℃ 30秒、55℃ 15秒、72℃ 6分を1サイクルとして30サイクル行なった。得られた増幅断片を平滑末端後、pSAC4のSmaIサイトに挿入し、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム由来のargCJBDFRGH搭載プラスミドpargCJBDFRGHを構築した。さらに本プラスミドを鋳型とし、配列番号２９および配列番号３０に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとしてargR遺伝子ORFの外側を増幅するためのPCRを行った。PCRは、DNA PolymeraseとしてTaKaRa LA Taq（宝酒造）を用い、98℃ 20秒、68℃ 15分を1サイクルとして30サイクル行なった後、72℃で10分反応させた。得られた増幅断片を平滑末端後、TaKaRa Ligation Kit ver.2を用いてセルフライゲーションを行うことにより、argR遺伝子を搭載しないプラスミドpargCJBDFGHを構築した。この構築の過程を図５に示す。
【００９４】
＜２＞Ｌ−アルギニン生合成系遺伝子増幅効果の確認
pargCJBDFGHを2256株に導入し、形質転換体2256/pargCJBDFGHを得た。2256株、および2256/pargCJBDFGH株を前記と同様にしてフラスコ培養し、Ｌ−アルギニン蓄積量を測定した。結果を表４に示す。
【００９５】
【表４】
表４
──────────────────────────
菌株 L-アルギニン蓄積量（mg/dl）
──────────────────────────
2256 0
2256/pargCJBDFGH 300
──────────────────────────
【００９６】
＜３＞Ｌ−アルギニン生合成系遺伝子およびlysE遺伝子を組合せて増幅したときの効果の確認
Ｌ−アルギニン生合成系遺伝子およびlysE遺伝子を組合せて増幅したときの効果を確認するため、上述のプラスミドpCRlysEをBamHI消化してlysE遺伝子を含むＤＮＡ断片を切り出し、DNA平滑末端化キット(宝酒造)を用いて平滑末端化した後、XbaIリンカーを用いてプラスミドpargCJBDFGHのXbaIサイトに挿入し、プラスミドpargCJBDFGH-Eを構築した。この構築の過程を図５に示す。本プラスミドを2256株へ導入し、前記と同様にしてフラスコ培養し、Ｌ−アルギニン蓄積量を測定した。結果を表５に示す。
【００９７】
【表５】
表５
──────────────────────────
菌株 L-アルギニン蓄積量（mg/dl）
──────────────────────────
2256 0
2256/pargCJBDFGH 200
2256/plysE 0
2256/pargCJBDFGH-E 400
──────────────────────────
【００９８】
【実施例６】
lysEのエシェリヒア・コリArg生産菌における増幅効果
＜１＞lysE遺伝子搭載プラスミドpRSlysEの構築
公知のプラスミドpRS（特表平3-501682号公報参照）を用いて、lysE発現用プラスミドpRSlysEを構築した（図６）。pRSは、RSF1010の誘導体である広宿主域ベクタープラスミドpAYC32（Chistorerdov, A.Y., Tsygankov, Y.D. Plasmid, 1986, 16, 161-167）に由来するpVIC40プラスミド（WO90/04636国際公開パンフレット、特表平3-501682号公報）より、同プラスミドが持つスレオニンオペロンをコードするDNA領域を削除してベクター部分のみを持つプラスミドである。
【００９９】
まず、pRSより、tacプロモーターを持つプラスミドpRStacを図６に示す方法で構築した。pRSベクターを制限酵素EcoRIおよびPstIで消化し、フェノール・クロロホルム溶液を加えて混合し、反応を停止させた。反応液を遠心分離した後、上層を回収し、エタノール沈殿にてDNAを回収後、0.8%アガロースゲルにて分離し、約8キロベースペア（以下、「kbp」と記載）のDNA断片をEASY TRAP Ver.2（DNA回収キット、宝酒造社製）を用いて回収した。一方、tacプロモーター領域を、pRK223-3プラスミド（発現用ベクター、Pharmacia社製）を鋳型とし、配列番号３１および３２に示すプライマーを用いて、PCRにより増幅した（変性94℃-20秒、アニーリング55℃-30秒、伸長反応72℃-60秒のサイクルを30サイクル行った）。PCR反応にはPyrobest DNA polymerase（宝酒造社製）を使用した。増幅されたtacプロモーターを含むDNA断片をPCRprep（Promega社製）にて精製した後、あらかじプライマー中にデザインしておいた制限酵素サイト、すなわちEcoRIおよびEcoT22Iで消化し、フェノール・クロロホルム溶液を加えて混合し、反応を停止させた。反応液を遠心分離した後、上層を回収し、エタノール沈殿にてDNAを回収した後、0.8%アガロースゲルにて分離し、約0.15kbpのDNA断片をEASY TRAP Ver.2を用いて回収した。
【０１００】
上記のように調製したpRSベクター消化物と、tacプロモーター領域断片を、DNA Ligation Kit Ver.2（宝酒造製）を用いて連結させた。この連結反応溶液でエシェリヒア・コリ（E.coli JM109 competent cells、宝酒造製）を形質転換し、20mg/Lのストレプトマイシンを含むLB寒天培地に塗布し、37℃で一晩保温した。寒天培地上に出現したコロニーを20mg/Lのストレプトマイシンを含むLB液体培地に接種し、37℃で8時間振盪培養した。アルカリ−SDS法にて各培養液からプラスミドDNAを抽出し、制限酵素で消化して構造を確認し、pRStacを得た。pRSベクター上のストレプトマイシン耐性遺伝子の転写方向とtacプロモーターの転写方向が同じ向きになっているものを、pRStacとして選択した。
【０１０１】
上記のようにして得たpRStacを、Sse8387I（宝酒造製）およびSapI（ニューイングランドバイオラボ社製）で消化し、フェノール・クロロホルム溶液を加えて混合し、反応を停止させた。反応液を遠心分離した後、上層を回収し、エタノール沈殿にてDNAを回収後、0.8%アガロースゲルで分離し、約9.0kbpのDAN断片を回収した。
【０１０２】
また、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム２２５６株（ATCC13869）より抽出した染色体を鋳型として、配列番号３３および３４に示すプライマーを用いたPCR法（変性94℃-20秒、アニーリング55℃-30秒、伸長反応72℃-90秒）によりlysE遺伝子断片を増幅した。PCR反応には、Pyrobest DNA polymerase（宝酒造社製）を使用した。得られた断片をPCRprep（Promega社製）にて精製した後、制限酵素Sse8387IおよびSapIで消化した。フェノール・クロロホルム溶液を加えて混合し、反応を停止させた。反応液を遠心分離した後、上層を回収し、エタノール沈殿にてDNAを回収し、0.8%アガロースゲルで回収した。
【０１０３】
上記のように調製したpRStacベクター消化物と、lysE遺伝子領域断片を、DNA Ligation Kit Ver.2（宝酒造製）を用いて連結させた。この連結反応溶液でエシェリヒア・コリ（E.coli JM109 competent cells、宝酒造製）を形質転換し、20mg/Lのストレプトマイシンを含むLB寒天培地に塗布し、37℃で一晩保温した。寒天培地上に出現したコロニーを20mg/Lのストレプトマイシンを含むLB液体培地に接種し、37℃で8時間振盪培養した。アルカリ−SDS法にて各培養液からプラスミドDNAを抽出し、制限酵素での消化および塩基配列の決定により構造を確認して、pRSlysEを得た。pRSlysEは、tacプロモーターの転写方向に対して、lysE遺伝子の転写方向が同じ向きになるように配置されている。
【０１０４】
＜２＞yggA遺伝子搭載プラスミドpGEM5の構築
エシェリヒア・コリK-12株の染色体ＤＮＡの全塩基配列が決定されている（Science, 277, 1453-1474, 1997）。この報告されている塩基配列に基づいて、配列番号３５、３６に示すプライマーを用いて、エシェリヒア・コリMG1655株染色体ＤＮＡを鋳型とするPCRにより、yggA遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。配列番号３５に示すプライマーは、GenBankにaccession No. AE000375で登録されている塩基配列の塩基番号9606〜9626の相補的な配列を有しており、配列番号３６に示すプライマーは、塩基番号8478〜8498の配列を有している。
【０１０５】
エシェリヒア・コリMG1655株の染色体ＤＮＡは、常法により調製した。PCRは、PCR protocols. Current Methods and applications, White, B. A., ed. Humana Press, Totowa, New Jersey, 1993に記載の標準的な条件により実施した。得られたPCR産物は常法により精製し、pGEM-Tベクター（Promega社）にクローニングした。得られたプラスミドは、pGEM5と命名した。
【０１０６】
＜３＞エシェリヒア・コリArg生産菌におけるlysE遺伝子増幅効果の確認
上記のように構築したプラスミドpRSlysE、pGEM5をE. coliのArg生産株である237株に導入した。237株は、エシェリヒア・コリK12 ilvA::Tn5から１−メチル−３−ニトロ−１−ニトロソグアニジンにより誘導された、ピリミジンアナログである６−アザウラシルに耐性な変異株である。同株は、VKPM B-7925の名でAll-Russian Collection for Industrial Microorganisms (VKPM)（1, Dorozhny Proezd., 1, 113545, Moscow, Russia）に寄託されている。形質転換は、定法によって実施した。
【０１０７】
得られた形質転換株についてＬ−アルギニン生産性を確認するため培養評価を行った（３２℃、3日、振盪培養）。用いた培地の組成を以下に示す（単位g/L）。グルコース 60g/L、(NH4)2SO4 35g/L、酵母エキス 5g/L、KH2PO4 2g/L、MgSO4・7H2O 1g/L、CaCO3 25g/L。培地中に蓄積したＬ−アルギニンの量を公知の方法により測定した結果を表６に示す。
【０１０８】
【表６】
表６
──────────────────────────
菌株 L-アルギニン蓄積量（mg/dl）
──────────────────────────
237 450
237/pRSlysE 890
237/pGEM5 600
──────────────────────────
【０１０９】
lysEを増幅したプラスミドpRSlysEの導入によってＬ−アルギニン蓄積量が向上した。また、その向上幅は、従来Ｌ−アルギニン排出因子として報告されていたyggAを増幅するpGEMに比べて、より高いレベルであった。
【０１１０】
（配列表の説明）
配列番号１：ストレプトコッカス・フェカリスのカナマイシン耐性遺伝子増幅用プライマー
配列番号２：ストレプトコッカス・フェカリスのカナマイシン耐性遺伝子増幅用プライマー
配列番号３：pHSG399のベクター部分増幅用プライマー
配列番号４：pHSG399のベクター部分増幅用プライマー
配列番号５：pSFK6の複製制御領域部分の塩基配列
配列番号６：pSFK6中のORFによってコードされ得るアミノ酸配列
配列番号７：p48Kの複製制御領域部分の塩基配列
配列番号８：p48K中のORFによってコードされ得るアミノ酸配列
配列番号９：pSFK6に1534番目のC→Tの変異を導入するための第１回目PCR用プライマー
配列番号10：pSFK6に1534番目のC→Tの変異を導入するための第１回目PCR用プライマー
【０１１１】
配列番号11：pSFK6に1534番目のC→Tの変異を導入するための第１回目PCR用プライマー
配列番号12：pSFK6に1534番目のC→Tの変異を導入するための第１回目PCR用プライマー
配列番号13：pSFK6に1534番目のC→Tの変異を導入するための第２回目PCR用プライマー
配列番号14：pSFK6に1534番目のC→Tの変異を導入するための第２回目PCR用プライマー
配列番号15：argR遺伝子増幅用プライマー
配列番号16：argR遺伝子増幅用プライマー
配列番号17：argR遺伝子を含むＤＮＡ断片の塩基配列
配列番号18：前記ＤＮＡ断片がコードし得るアミノ酸配列
配列番号19：argR遺伝子増幅用プライマー
配列番号20：argR遺伝子増幅用プライマー
【０１１２】
配列番号21：argR遺伝子を含むプラスミドのargR遺伝子ORF以外の部分を増幅するためのプライマー
配列番号22：argR遺伝子を含むプラスミドのargR遺伝子ORF以外の部分を増幅するためのプライマー
配列番号23：lysE遺伝子増幅用プライマー
配列番号24：lysE遺伝子増幅用プライマー
配列番号25：コリネバクテリウム・グルタミカムlysGおよびlysE遺伝子を含むＤＮＡ断片の塩基配列（GenBank X96471）
配列番号26：lysEによってコードされるアミノ酸配列
配列番号27：argCからargH遺伝子を含むDNA断片増幅用プライマー
配列番号28：argCからargH遺伝子を含むDNA断片増幅用プライマー
配列番号29：argRのORFの外側増幅用プライマー
配列番号30：argRのORFの外側増幅用プライマー
【０１１３】
配列番号31：tacプロモーター増幅用プライマー
配列番号32：tacプロモーター増幅用プライマー
配列番号33：lysE遺伝子増幅用プライマー
配列番号34：lysE遺伝子増幅用プライマー
配列番号35：yggA遺伝子増幅用プライマー
配列番号36：yggA遺伝子増幅用プライマー
【０１１４】
【発明の効果】
本発明により、Ｌ−アルギニン生産能を有するコリネ型細菌及びエシェリヒア属細菌等の微生物のＬ−アルギニン生産能を向上させることができる。
【０１１５】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 プラスミドpK1の構築過程を示す図。
【図２】 プラスミドpSFK6の構築過程を示す図。
【図３】 プラスミドpSFKT2の構築過程を示す図。
【図４】 lysE搭載プラスミドplysEの構築の過程を示す図。
【図５】 Ｌ−アルギニン生合成酵素遺伝子を搭載し、argR遺伝子を含まないプラスミドpargCJBDFGH、及びlysE及びＬ−アルギニン生合成酵素遺伝子を搭載したプラスミドpargCJBDFGH-Eの構築の過程を示す図。
【図６】 tacプロモーターを持つプラスミドpRStac、及びpRStacにlysE遺伝子が挿入されたプラスミドpRSlysEの構築を示す図。
【発明の属する技術分野】
本発明は、Ｌ−アルギニン生産能を有する微生物及び同微生物を用いたＬ−アルギニンの製造法に関する。Ｌ−アルギニンは、肝機能促進薬、アミノ酸輸液及び総合アミノ酸製剤等の成分として、産業上有用なアミノ酸である。
【０００２】
【従来の技術】
従来、発酵法によるＬ−アルギニンの製造は、コリネ型細菌野生株；サルファ剤、２−チアゾールアラニン又はα−アミノ−β−ヒドロキシ吉草酸等の薬剤に耐性を有するコリネ型細菌；２−チアゾールアラニン耐性に加えて、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−プロリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−メチオニンまたはＬ−トリプトファン要求性を有するコリネ型細菌（特開昭５４−４４０９６号）；ケトマロン酸、フルオロマロン酸又はモノフルオロ酢酸に耐性を有するコリネ型細菌（特開昭５７−１８９８９号）；アルギニノールに耐性を有するコリネ型細菌（特開昭６２−２４０７５号）；または、Ｘ−グアニジン（Ｘは脂肪酸又は脂肪鎖の誘導体）に耐性を有するコリネ型細菌（特開平２−１８６９９５号）等を用いて行われている。
【０００３】
一方、組換えＤＮＡ技術によりＬ−アルギニンの生合成酵素を増強することによって、Ｌ−アルギニンの生産能を増加させる種々の技術が開示されている。例えば、エシェリヒア属に属する微生物由来のアセチルオルニチンデアセチラーゼ、Ｎ−アセチルグルタミン酸−γ−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、Ｎ−アセチルグルタモキナーゼ、及びアルギニノサクシナーゼの遺伝子を含むＤＮＡ断片とベクターＤＮＡとの組換え体ＤＮＡを保有せしめたコリネバクテリウム属又はブレビバクテリウム属に属する微生物（特公平５−２３７５０号）、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ活性が増強されたコリネ型細菌等の微生物（EP 1057 893 A1）、及び、Ｎ−アセチルグルタミン酸シンセターゼ遺伝子(argA)を導入されたエシェリヒア・コリ（特開昭57-5693号参照）を用いてＬ−アルギニンを製造する方法等が開示されている。
【０００４】
また、コリネ型細菌では、いくつかのＬ−アルギニン生合成系酵素の生成が、Ｌ−アルギニンにより抑制されていることが調べられている。さらに、Ｌ−アルギニン生合成系酵素のいくつかは、Ｌ−アルギニンによる抑制を受けるが、Ｌ−アルギニン蓄積量が向上したコリネ型細菌の変異株では、これらの酵素のＬ−アルギニンによる抑制が解除されていることが報告されている（Agric. Biol. Chem., 43(1), 105, 1979）。
【０００５】
一方、エシェリヒア・コリでは、Ｌ−アルギニン生合成系のリプレッサー及びリプレッサーをコードする遺伝子が特定されており（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1987), 84(19), 6697-701）、またリプレッサータンパクと各種Ｌ−アルギニン生合成系遺伝子との結合相互作用についても調べられている（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1987), 84(19), 6697-701、J. Mol. Biol. (1992), 226,
367-386）。
【０００６】
しかしながら、コリネ型細菌では、Ｌ−アルギニン生合成系のリプレッサータンパクは同定されていない。リプレッサータンパク遺伝子（argR）については、遺伝子データベースGenBankに、その塩基配列とそれによってコードされると想定されるアミノ酸配列が登録されているが（AF049897）、これは前記アミノ酸配列と公知のアルギニンリプレッサーとの相同性からargRと命名されたものと考えられる。
【０００７】
ところで、近年、Ｌ−アミノ酸を特異的に微生物の菌体の外部に排出する機能を持つタンパク質および遺伝子が同定され、特にVrlijcらは、コリネバクテリウム属細菌からＬ−リジンの菌体外への排出に関与する遺伝子を同定した（Vrlijc M., Sahm H., Eggeling L. Molecular Microbiology 22:815-826(1996)）。この遺伝子はlysEと名付けられ、同遺伝子をコリネバクテリウム属細菌において増強させることによって、コリネバクテリウム属細菌のＬ−リジン生産能が向上することが報告されている（WO 97/23597）。また、エシェリヒア・コリにおいてアミノ酸排出タンパク質の発現量を上昇させることにより、いくつかのＬ−アミノ酸の生産性を向上させることができることが知られている（特開平2000-189180号）。例えば、yggA遺伝子を多コピーでエシェリヒア・コリに導入することにより、リジン及びアルギニンの生産性が向上することが報告されている（特開2000-189180号）。また、エシェリヒア・コリにおいては、ORF306遺伝子の発現を増強することによって、シスチン、システイン等の生産性が向上することが報告されている(EP885962)。しかし、lysE遺伝子がＬ−リジン以外のアミノ酸を排出する機能を有することは知られていない。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、コリネ型細菌及びエシェリヒア属細菌等の微生物のＬ−アルギニン生産能を向上させ、Ｌ−アルギニンを効率よく製造する方法を提供することを課題とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、Ｌ−アルギニン生産菌に関する研究の過程で、lysE遺伝子の発現を増強することによって、Ｌ−アルギニン生産能を向上させることができることを見い出した。さらに、lysEの増強と、argR遺伝子の破壊又はＬ−アルギニン生合成系酵素の活性の増強とを組み合わせることにより、Ｌ−アルギニン生産能を顕著に向上させることができることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は以下のとおりである。
【００１０】
（１）Ｌ−アルギニン生産能を有し、かつ、ｌｙｓＥ遺伝子の発現が増強されるように改変された微生物。
（２）ｌｙｓＥ遺伝子の発現の増強が、ｌｙｓＥ遺伝子のコピー数を高めること、又は前記細菌細胞内のｌｙｓＥ遺伝子の発現が増強されるように同遺伝子の発現調節配列を改変することによるものである(1)の記載の微生物。
（３）さらに、アルギニンリプレッサーが正常に機能しないように改変されたことを特徴とする(1)又は(2)の微生物。
（４）染色体上のアルギニンリプレッサーをコードする遺伝子が破壊されたことにより、アルギニンリプレッサーが正常に機能しないことを特徴とする(3)の微生物。
（５）さらに、細胞内のＬ−アルギニン生合成系酵素の活性が増強されるように改変された(1)〜(4)のいずれかの微生物。
（６）コリネ型細菌である請求項(1)〜(5)のいずれかの微生物。
（７）エシェリヒア属細菌である請求項(1)〜(5)のいずれかの微生物。
（８）(1)〜(7)のいずれかのコリネ型細菌を培地で培養し、培地中にＬ−アルギニンを生成蓄積せしめ、これを該培地から採取することを特徴とするＬ−アルギニンの製造法。
【００１１】
本発明において、「Ｌ−アルギニン生産能」とは、本発明の微生物を培養したときに、培地中にＬ−アルギニンを蓄積する能力をいう。このＬ−アルギニン生産能は、微生物の野生株の性質として有するものであってもよく、育種によって付与または増強された性質であってもよい。
【００１２】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
＜１＞本発明の微生物
本発明の微生物は、Ｌ−アルギニン生産能を有し、かつ、ｌｙｓＥ遺伝子の発現が増強された微生物である。本発明の微生物は、Ｌ−アルギニン生産能を有する微生物のｌｙｓＥ遺伝子の発現を増強したものであってもよいし、微生物のｌｙｓＥ遺伝子の発現を増強した後に、Ｌ−アルギニン生産能を付与したものであってもよい。
【００１３】
本発明の微生物としては、ｌｙｓＥ遺伝子又はｌｙｓＥ遺伝子ホモログを持つ微生物、具体的にはコリネ型細菌、バチルス属細菌、セラチア属細菌、エシェリヒア属細菌、サッカロマイセス属又はキャンディダ属に属する酵母が挙げられる。これらの中ではコリネ型細菌及びエシェリヒア属細菌が好ましい。
【００１４】
バチルス属細菌としてはバチルス・サブチリスが、セラチア属細菌としてはセラチア・マルセッセンスが、エシェリヒア属細菌としてはエシェリヒア・コリが、サッカロマイセス属酵母としてはサッカロマイセス・セレビシエが、キャンディダ属酵母としてキャンディダ・トロピカリスが挙げられる。
【００１５】
アルギニン生産能を有する微生物としては、5-アザウラシル、6-アザウラシル、2-チオウラシル、5-フルオロウラシル、5-ブロモウラシル、5-アザシトシン、6-アザシトシン等に耐性なバチルス・サブチリス、アルギニンヒドロキサメート、2-チオウラシルに耐性なバチルス・サブチリス、アルギニンヒドロキサメート及び6-アザウラシルに耐性なバチルス・サブチリス（特開昭49-1268191号参照）、
ヒスチジンアナログ又はトリプトファンアナログに耐性なバチルス・サブチリス（特開昭52-114092号参照）、
メチニオン、ヒスチジン、スレオニン、プロリン、イソロイシイン、リジン、アデニン、グアニンまたはウラシル（またはウラシル前駆体）の少なくとも一つに要求性を有するバチルス・サブチリス変異株（特開昭52-99289号参照）、
アルギニンヒドロキサメートに耐性なバチルス・サブチリス（特公昭51-6754号参照）、
コハク酸要求性又は核酸塩基アナログに耐性なセラチア・マルセッセンス（特開昭58-9692号）、
アルギニン分解能を欠損し、アルギニンのアンタゴニスト及びカナバニンに耐性を有し、リジンを要求するセラチア・マルセッセンス（特開昭52-8729号参照）、
argA遺伝子を導入されたエシェリヒア・コリ（特開昭57-5693号参照）、
アルギニン、アルギニンヒドロキサメート、ホモアルギニン、Ｄ−アルギニン、カナバニン耐性、アルギニンヒドロキサメート及び６−アザウラシル耐性のサッカロマイセス・セレビシエ（特開昭53-143288号参照）、及び
カナバニン耐性のキャンディダ・トロピカリス（特開昭53-3586号参照）、が挙げられる。
【００１６】
コリネ型細菌は、従来ブレビバクテリウム属に分類されていたが現在コリネバクテリウム属に統合された細菌を含み（Int. J. Syst. Bacteriol., 41, 255 (1981)）、またコリネバクテリウム属と非常に近縁なブレビバクテリウム属細菌を含む。このようなコリネ型細菌の例として以下のものが挙げられる。
【００１７】
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム
コリネバクテリウム・アセトグルタミカム
コリネバクテリウム・アルカノリティカム
コリネバクテリウム・カルナエ
コリネバクテリウム・グルタミカム
コリネバクテリウム・リリウム（コリネバクテリウム・グルタミカム）
コリネバクテリウム・メラセコーラ
コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス
コリネバクテリウム・ハーキュリス
ブレビバクテリウム・ディバリカタム（コリネバクテリウム・グルタミカム）
ブレビバクテリウム・フラバム（コリネバクテリウム・グルタミカム）
ブレビバクテリウム・インマリオフィラム
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（コリネバクテリウム・グルタミカム）
ブレビバクテリウム・ロゼウム
ブレビバクテリウム・サッカロリティカム
ブレビバクテリウム・チオゲニタリス
ブレビバクテリウム・アルバム
ブレビバクテリウム・セリヌム
ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム
【００１８】
Ｌ−アルギニン生産能を有するコリネ型細菌としては、Ｌ−アルギニン生産能を有するものであれば特に制限されないが、例えば、コリネ型細菌野生株；サルファ剤、２−チアゾールアラニン又はα−アミノ−β−ヒドロキシ吉草酸等の薬剤に耐性を有するコリネ型細菌；２−チアゾールアラニン耐性に加えて、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−プロリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−メチオニンまたはＬ−トリプトファン要求性を有するコリネ型細菌（特開昭５４−４４０９６号）；ケトマロン酸、フルオロマロン酸又はモノフルオロ酢酸に耐性を有するコリネ型細菌（特開昭５７−１８９８９号）；アルギニノールに耐性を有するコリネ型細菌（特開昭６２−２４０７５号）；Ｘ−グアニジン（Ｘは脂肪酸又は脂肪鎖の誘導体）に耐性を有するコリネ型細菌（特開平２−１８６９９５号）等が挙げられる。
【００１９】
具体的には、下記のような菌株を例示することができる。
ブレビバクテリウム・フラバムAJ11169（FERM P-4161）
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ12092（FERM P-7273）
ブレビバクテリウム・フラバムAJ11336（FERM P-4939）
ブレビバクテリウム・フラバムAJ11345（FERM P-4948）
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ12430（FERM BP-2228）
【００２０】
AJ11169は、1977年８月３日付けで独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（〒305-5466 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）にFERM P-4161の受託番号で寄託され、1999年９月２７日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、FERM BP-6892として寄託されている。
【００２１】
AJ12092は、1983年９月２９日付けで独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターにFERM P-7273の受託番号で寄託され、1999年１０月１日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、FERM BP-6906として寄託されている。
【００２２】
AJ11336は、1979年４月２５日付けで独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターにFERM P-4939の受託番号で寄託され、1999年９月２７日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、FERM BP-6893として寄託されている。
【００２３】
AJ11345は、1979年４月２５日付けで独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターにFERM P-4948の受託番号で寄託され、1999年９月２７日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、FERM BP-6894として寄託されている。
【００２４】
AJ12430は、1988年１２月２６日付けで独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターにFERM BP-2228の受託番号で、ブダペスト条約に基いて国際寄託されている。
【００２５】
また、エシェリヒア属細菌としては、ナイトハルトらの著書（Neidhardt,F.C. et.al.,Escherichia coli and Salmonella Typhimurium,American Society for Microbiology,Washington D.C.,1208, table 1）に挙げられるもの、例えばエシェリヒア・コリ等が利用できる。
Ｌ−アルギニン生産能を有するエシェリヒア属細菌としては、エシェリヒア・コリ237株（ロシア特許出願第２０００１１７６７７号）等が挙げられる。
本発明の微生物の第１の形態は、上記のようなＬ−アルギニン生産能を有する微生物において、ｌｙｓＥ遺伝子の発現が増強されるように改変された細菌である。
本発明の微生物の第２の形態は、さらにアルギニンリプレッサーが正常に機能しないように改変された微生物である。
本発明の微生物の第３の形態は、前記第１又は第２の形態の微生物において、さらに細胞内のＬ−アルギニン生合成系酵素の活性が増強されるように改変された微生物である。
以下、各形態について説明する。
【００２６】
（１）ｌｙｓＥ遺伝子の発現が増強された微生物
微生物のｌｙｓＥ遺伝子の発現の増強は、Ｌ−リジン排出系に関与するタンパク質の活性が上昇するように前記タンパク質をコードする遺伝子に変異を導入するか、又は同遺伝子を用いた遺伝子組換え技術を利用することによって、行うことができる。前記遺伝子として具体的には、lysE遺伝子（Vrlijc M., Sahm H., Eggeling L. Molecular Microbiology 22:815-826(1996)、WO 97/23597）が挙げられる。
【００２７】
以下に、lysE遺伝子を例に説明する。
lysE遺伝子によってコードされるタンパク質（LysEタンパク質）の活性が上昇するような変異としては、lysE遺伝子の転写量が増大するようなプロモーター配列の変異、及び、LysEタンパク質の比活性が高くなるようなlysE遺伝子のコード領域内の変異が挙げられる。
【００２８】
また、遺伝子組換え技術を利用してLysE活性を高めるには、例えば、細胞中のlysE遺伝子のコピー数を高めることによって達成される。例えば、lysE遺伝子を含むＤＮＡ断片を、微生物で機能するベクター、好ましくはマルチコピー型のベクターと連結して組換えDNAを作製し、これを微生物に導入して形質転換すればよい。
【００２９】
lysE遺伝子は、コリネ型細菌もしくはエシェリヒア属細菌由来の遺伝子、又は他の生物由来の遺伝子のいずれも使用することができる。このうち、発現の容易さの観点からは、コリネ型細菌又はエシェリヒア属細菌由来の遺伝子が好ましい。
【００３０】
コリネ型細菌のlysE遺伝子は既に配列が明らかにされている（GenBank accession X96471）ので、その塩基配列に基づいて作製したプライマー、例えば配列表配列番号２３および２４に示すプライマーを用いて、コリネ型細菌の染色体DNAを鋳型とするPCR法（PCR：polymerase chain reaction； White,T.J. et al., Trends Genet. 5, 185 (1989)参照）によって、lysE遺伝子を取得することができる。コリネバクテリウム・グルタミカムlysGおよびlysE遺伝子を含むＤＮＡ断片の塩基配列（GenBank accession X96471）を配列番号２５に、LysEのアミノ酸配列を配列番号２６に示す。尚、LysGは、配列番号２５の塩基番号1723〜2352に相当する位置の相補鎖にコードされている。
【００３１】
他の微生物のlysE遺伝子も、その微生物において公知のlysE遺伝子もしくは他種の微生物のlysE遺伝子又はLysEタンパク質の配列情報に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとするＰＣＲ法、又は、前記配列情報に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプローブとするハイブリダイゼーション法によって、微生物の染色体ＤＮＡ又は染色体ＤＮＡライブラリーから、取得することができる。
【００３２】
また、本発明に用いられるlysE遺伝子は、野生型遺伝子には限られず、コードされるLysEタンパク質の機能が損なわれない限り、１若しくは複数の位置での１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加等を含む変異体又は人為的な改変体であってもよい。ここで、「数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、具体的には２から３０個、好ましくは、２から２０個、より好ましくは２から１０個である。また、上記のようなLysEタンパク質と実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号２５の塩基番号１０２５〜１７２３からなる塩基配列又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつLysEと同様の活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。ここで、「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば５０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。
【００３３】
染色体ＤＮＡは、ＤＮＡ供与体である細菌から、例えば、斎藤、三浦の方法（H. Saito and K.Miura, Biochem.B iophys. Acta, 72, 619 (1963)、生物工学実験書、日本生物工学会編、９７〜９８頁、培風館、１９９２年参照）等により調製することができる。
【００３４】
PCR法により増幅されたlysE遺伝子は、エシェリヒア・コリ及び／またはコリネ型細菌等の細胞内において自律複製可能なベクターDNAに接続して組換えDNAを調製し、これをエシェリヒア・コリに導入しておくと、後の操作がしやすくなる。エシェリヒア・コリ細胞内において自律複製可能なベクターとしては、pUC19、pUC18、pHSG299, pHSG399, pHSG398, RSF1010, pBR322, pACYC184, pMW219等が挙げられる。
【００３５】
コリネ型細菌で機能するベクターとは、例えばコリネ型細菌で自律複製できるプラスミドである。具体的に例示すれば、以下のものが挙げられる。
pAM330 特開昭58-67699号公報参照
pHM1519 特開昭58-77895号公報参照
pSFK6 特開2000-262288号公報参照
また、これらのベクターからコリネ型細菌中でプラスミドを自律複製可能にする能力を持つＤＮＡ断片を取り出し、前記エシェリヒア・コリ用のベクターに挿入すると、エシェリヒア・コリ及びコリネ型細菌の両方で自律複製可能ないわゆるシャトルベクターとして使用することができる。
【００３６】
このようなシャトルベクターとしては、以下のものが挙げられる。尚、それぞれのベクターを保持する微生物及び国際寄託機関の受託番号をかっこ内に示した。
【００３７】
lysE遺伝子とコリネ型細菌で機能するベクターを連結して組換えDNAを調製するには、lysE遺伝子の末端に合うような制限酵素でベクターを切断する。連結はT4DNAリガーゼ等のリガーゼを用いて行うのが普通である。
【００３８】
上記のように調製した組換えDNAを微生物に導入するには、これまでに報告されている形質転換法に従って行えばよい。例えば、エシェリヒア・コリ Ｋ−１２について報告されているような、受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法（Mandel,M.and Higa,A.,J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)）があり、バチルス・ズブチリスについて報告されているような、増殖段階の細胞からコンピテントセルを調製してＤＮＡを導入する方法（ Duncan,C.H.,Wilson,G.A.and Young,F.E., Gene, 1, 153 (1977)）がある。あるいは、バチルス・ズブチリス、放線菌類及び酵母について知られているような、ＤＮＡ受容菌の細胞を、組換えＤＮＡを容易に取り込むプロトプラストまたはスフェロプラストの状態にして組換えＤＮＡをＤＮＡ受容菌に導入する方法（ Chang,S.and Choen,S.N.,Molec. Gen. Genet., 168, 111 (1979);Bibb,M.J.,Ward,J.M.and Hopwood,O.A.,Nature, 274, 398 (1978);Hinnen,A.,Hicks,J.B.and Fink,G.R.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 1929 (1978)）も応用できる。また、コリネ型細菌の形質転換は、電気パルス法（杉本ら、特開平2-207791号公報）によっても行うことができる。
【００３９】
lysE遺伝子のコピー数を高めることは、lysE遺伝子を微生物の染色体DNA上に多コピー存在させることによっても達成できる。微生物の染色体DNA上にlysE遺伝子を多コピーで導入するには、染色体DNA上に多コピー存在する配列を標的に利用して相同組換えにより行う。染色体DNA上に多コピー存在する配列としては、レペティティブDNA、転移因子の端部に存在するインバーテッド・リピートが利用できる。あるいは、特開平2-109985号公報に開示されているように、lysE遺伝子をトランスポゾンに搭載してこれを転移させて染色体DNA上に多コピー導入することも可能である。
【００４０】
lysE遺伝子の発現の増強は、上記の遺伝子増幅による以外に、染色体DNA上またはプラスミド上のlysE遺伝子のプロモーター等の発現調節配列を強力なものに置換することによっても達成される（WO00/18935）。例えば、lacプロモーター、trpプロモーター、trcプロモーター等が強力なプロモーターとして知られている。また、lysE遺伝子のプロモーター領域に塩基置換等を導入し、より強力なものに改変することも可能である。これらのプロモーター置換または改変によりlysE遺伝子の発現が強化される。これら発現調節配列の改変は、lysE遺伝子のコピー数を高めることと組み合わせてもよい。
【００４１】
発現調節配列の置換は、例えば後述の温度感受性プラスミドを用いた遺伝子置換と同様にして行うことができる。例えば、コリネ型酸菌の温度感受性プラスミドとしては、p48K及びpSFKT2（以上、特開2000-262288号公報参照）、pHSC4（フランス特許公開1992年2667875号公報、特開平5-7491号公報参照）等が挙げられる。これらのプラスミドは、コリネ型細菌中で少なくとも25℃では自律複製することができるが、37℃では自律複製できない。後記実施例では、GDH遺伝子のプロモーター配列を置換する際にpSFKT2を用いたが、pSFKT2の代わりにpHSC4を用いて、同様にして遺伝子置換を行うことができる。pHSC4を保持するエシェリヒア・コリAJ12571は、1990年10月11日に独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（〒305-5466 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に受託番号FERM P-11763として寄託され、1991年8月26日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、FERM BP-3524の受託番号で寄託されている。
【００４２】
（２）アルギニンリプレッサーが正常に機能しない微生物
本発明において「アルギニンリプレッサー」とは、Ｌ−アルギニン生合成を抑制する作用を有するタンパク質であり、微生物において同タンパク質をコードする遺伝子の発現量が増加するとＬ−アルギニン生産能が低下し、発現量が低下又は消失するとＬ−アルギニン生産能が向上する。以下、アルギニンリプレッサーをコードする遺伝子をargR遺伝子ともいう。「アルギニンリプレッサーが正常に機能しない」とは、野生株又は非改変株に比べて、アルギニンリプレッサーの活性が低下又は消失していることをいう。
【００４３】
リプレッサーが正常に機能しない微生物は、argR遺伝子が、該遺伝子産物であるアルギニンリプレッサーの活性が低下又は消失するか、又はargR遺伝子の転写が低下または消失するように、改変することによって得られる。このような微生物は、例えば、遺伝子組換え法を用いた相同組換え法（Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory press (1972); Matsuyama, S. and Mizushima, S., J. Bacteriol., 162, 1196(1985)）により、染色体上のargR遺伝子を、正常に機能しないargR遺伝子（以下、「破壊型argR遺伝子」ということがある）で置換することによって行うことができる。
【００４４】
染色体上の配列と相同性を有する配列を持つプラスミド等が菌体内に導入されると、ある頻度で相同性を有する配列の箇所で組換えを起こし、導入されたプラスミド全体が染色体上に組み込まれる。この後さらに染色体上の相同性を有する配列の箇所で組換えを起こすと、再びプラスミドが染色体上から抜け落ちるが、この時組換えを起こす位置により破壊された遺伝子の方が染色体上に固定され、元の正常な遺伝子がプラスミドと一緒に染色体上から抜け落ちることもある。このような菌株を選択することにより、染色体上の正常なargR遺伝子が破壊型argR遺伝子と置換された菌株を取得することができる。
【００４５】
このような相同組換えによる遺伝子破壊技術は既に確立しており、直鎖ＤＮＡを用いる方法、温度感受性プラスミドを用いる方法等が利用できる。また、薬剤耐性等のマーカー遺伝子が内部に挿入されたargR遺伝子を含み、かつ、目的とする微生物細胞内で複製できないプラスミドを用いることによっても、argR遺伝子の破壊を行うことができる。すなわち、前記プラスミドで形質転換され、薬剤耐性を獲得した形質転換体は、染色体ＤＮＡ中にマーカー遺伝子が組み込まれている。このマーカー遺伝子は、その両端のargR遺伝子配列と染色体上のargR遺伝子との相同組換えによって組み込まれる可能性が高いため、効率よく遺伝子破壊株を選択することができる。
【００４６】
遺伝子破壊に用いる破壊型argR遺伝子は、具体的には、制限酵素消化及び再結合によるargR遺伝子の一定領域の欠失、argR遺伝子への他のＤＮＡ断片（マーカー遺伝子等）の挿入、または部位特異的変異法（Kramer, W. and Frits, H. J., Methods in Enzymology, 154, 350 (1987)）や次亜硫酸ナトリウム、ヒドロキシルアミン等の化学薬剤による処理（Shortle, D. and Nathans, D., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 75, 270(1978)）によって、argR遺伝子のコーディング領域またはプロモーター領域等の塩基配列の中に１つまたは複数個の塩基の置換、欠失、挿入、付加または逆位を起こさせることにより、コードされるリプレッサーの活性を低下又は消失させるか、又はargR遺伝子の転写を低下または消失させることにより、取得することができる。これらの態様の中では、制限酵素消化及び再結合によりargR遺伝子の一定領域を欠失させる方法、又はargR遺伝子へ他のＤＮＡ断片を挿入する方法が、確実性及び安定性の点から好ましい。
【００４７】
また、argR遺伝子とその周辺領域を含むプラスミドを鋳型とし、argR遺伝子の末端部又は周辺領域に相当するプライマーを用いてPCR（ポリメラーゼ・チェイン・リアクション）を行い、argR遺伝子の内部又は全体を除く部分を増幅し、得られる増幅産物を環状化することによって、argR遺伝子破壊用プラスミドを作製することができる。後記実施例では、この方法によってargR遺伝子を破壊した。
【００４８】
argR遺伝子は、微生物の染色体ＤＮＡから、既知のargR遺伝子の塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとするＰＣＲ法によって取得することができる。また、微生物の染色体ＤＮＡライブラリーから、既知のargR遺伝子の塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプローブとするハイブリダイゼーション法によって、argR遺伝子を取得することができる。尚、本発明においては、argR遺伝子は破壊型argR遺伝子の作製に用いるため、必ずしも全長を含む必要はなく、遺伝子破壊を起こすのに必要な長さを有していればよい。
【００４９】
argR遺伝子は、目的の微生物のargR遺伝子と相同組換えを起こす程度の相同性を有していれば、由来を特に制限されない。例えば、コリネ型細菌のargR遺伝子として具体的には、配列番号１７に示す塩基配列を有するブレビバクテリウム・フラバムのargR遺伝子、及び、コリネバクテリウム・グルタミカムのargR遺伝子（GenBank accession AF049897）が挙げられる。これらのargR遺伝子は相同性が高く、argR遺伝子を破壊するコリネ型細菌と種又は属が異なるコリネ型細菌又は他の微生物のargR遺伝子であっても、遺伝子破壊に用いることができると考えられる。
【００５０】
本発明において、配列番号１８に示すアミノ酸配列又は同アミノ酸配列と相同性を有するアミノ酸配列とは、配列番号１８に示すアミノ酸配列をコードするargR遺伝子（例えば配列番号１７に示す塩基配列を有するargR遺伝子）と相同組換えを起こす程度の相同性を有するargG遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を意味する。前記相同性は、例えば、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上である。上記のようなargG遺伝子としては、例えば、配列番号１７の塩基番号１８５２〜２３６４からなる塩基配列又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るＤＮＡが挙げられる。ここで、「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば５０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。
【００５１】
PCRに用いるプライマーとしては、argR遺伝子を増幅することができるものであればよく、具体的には配列番号１９及び配列番号２０に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。
【００５２】
また、マーカー遺伝子としては、カナマイシン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子が挙げられる。カナマイシン耐性遺伝子は、ストレプトコッカス・フェカリスのカナマイシン耐性遺伝子を含む公知のプラスミド、例えばpDG783（Anne-Marie Guerout- Fleury et al., Gene, 167, 335-337(1995)）からPCRにより増幅することにより取得することができる。
【００５３】
マーカー遺伝子として薬剤耐性遺伝子を用いる場合は、該遺伝子をプラスミド中のargR遺伝子の適当な部位に挿入し、得られるプラスミドで微生物を形質転換し、薬剤耐性となった形質転換体を選択すれば、argR遺伝子破壊株が得られる。染色体上のargR遺伝子が破壊されたことは、サザンブロッティングやPCR法により、染色体上のargR遺伝子又はマーカー遺伝子を解析することによって、確認することができる。前記カナマイシン耐性遺伝子が染色体ＤＮＡに組み込まれたことの確認は、カナマイシン耐性遺伝子を増幅することができるプライマー（例えば配列番号１及び２に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド）を用いたPCRにより、行うことができる。
【００５４】
（３）Ｌ−アルギニン生合成系酵素活性の増強
Ｌ−アルギニン生合成系酵素活性の増強は、細胞内のＬ−アルギニン生合成系酵素の活性が上昇するように同酵素をコードする遺伝子に変異を導入するか、又は同遺伝子を用いた遺伝子組換え技術を利用することによって、行うことができる。Ｌ−アルギニン生合成系酵素としては、Ｎ−アセチルグルタミルリン酸レダクターゼ（argC）、オルニチンアセチルトランスフェラーゼ（argJ）、Ｎ−アセチルグルタメートキナーゼ（argB）、アセチルオルニチントランスアミナーゼ（argD）、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（argF）、アルギニノコハク酸シンターゼ（argG）、アルギニノコハク酸リアーゼ（argH）から選ばれる１種又は２種以上が挙げられる。これらの酵素名の後のカッコ内は、各酵素をコードする遺伝子名である。
また、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ活性を増強することによっても、Ｌ−アルギニン生産能を上昇させることができる（EP 1057 893 A1）。
【００５５】
遺伝子組換え技術を利用したＬ−アルギニン生合成系酵素活性の増強は、前記LysE活性を高めるのと同様にして、各遺伝子のコピー数を高めること、又は各遺伝子の発現が増強されるようにそれらの遺伝子の発現調節配列を改変することにより、行うことができる。
【００５６】
コリネバクテリウム・グルタミカムの各遺伝子の塩基配列は、GenBankにaccession AF049897として登録されている。これらの遺伝子は、コリネバクテリウム・グルタミカムでは、argC、argJ、argB、argD、argF、argR、argG、argHの順に、染色体ＤＮＡ上に並んでおり、例えば配列番号２７および配列番号２８に示すプライマーを用いて、コリネバクテリウム・グルタミカム又はブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムの染色体ＤＮＡを鋳型とするPCRにより取得することができる。尚、本発明においては、正常なargRを他のＬ−アルギニン生合成系酵素遺伝子とともにコリネ型細菌に導入すると、Ｌ−アルギニン生産性の向上を妨げるので、得られたPCR増幅断片中のargRを破壊又は欠失させておくことが好ましい。これは、例えば、PCR増幅断片を含むプラスミドを鋳型とし、配列番号２９および配列番号３０に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとしてPCRを行うことによって、行うことができる。
【００５７】
本発明においては、Ｌ−アルギニン生合成系酵素活性の増強は、染色体上のargR遺伝子の破壊と組み合わせてもよい。
【００５８】
＜２＞Ｌ−アルギニンの製造法
上記のようにして得られるｌｙｓＥ遺伝子の発現が増強され、かつ、Ｌ−アルギニン生産能を有する微生物を培地で培養し、該培養物中にＬ−アルギニンを生成蓄積せしめ、該培養物からＬ−アルギニンを採取することにより、Ｌ−アルギニンを効率よく製造することができる。
【００５９】
使用する培地は、微生物を用いたアミノ酸の発酵生産に従来より用いられてきた周知の培地を用いてかまわない。つまり、炭素源、窒素源、無機イオン及び必要に応じその他の有機成分を含有する通常の培地である。
【００６０】
炭素源としては、グルコース、シュクロース、ラクトース、ガラクトース、フラクトースやでんぷんの加水分解物などの糖類、グリセロールやソルビトールなどのアルコール類、フマール酸、クエン酸、コハク酸等の有機酸類を用いることができる。
【００６１】
窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガス、アンモニア水等を用いることができる。
【００６２】
有機微量栄養源としては、ビタミンＢ1、Ｌ−ホモセリンなどの要求物質または酵母エキス等を適量含有させることが望ましい。これらの他に、必要に応じて、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、鉄イオン、マンガンイオン等が少量添加される。
【００６３】
培養は好気的条件下で１〜７日間実施するのがよく、培養温度は２４℃〜３７℃、培養中のｐＨは５〜９がよい。尚、ｐＨ調整には無機あるいは有機の酸性あるいはアルカリ性物質、更にアンモニアガス等を使用することができる。発酵液からのＬ−アルギニンの採取は通常イオン交換樹脂法その他の公知の方法を組み合わせることにより実施できる。
【００６４】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
【実施例１】
エシェリヒア・コリとコリネ型細菌のシャトルベクター及び温度感受性ベクターの構築
はじめに、コリネ型細菌にargR遺伝子を導入するためのベクター、及びコリネ型細菌のargR欠失株を作製するための温度感受性ベクターを構築した。
【００６５】
＜１＞ストレプトコッカス・フェカリスの薬剤耐性遺伝子を持つベクターの構築
ストレプトコッカス・フェカリスのカナマイシン耐性遺伝子を、同遺伝子を含む公知のプラスミドからPCRにより増幅した。ストレプトコッカス・フェカリスのカナマイシン耐性遺伝子の塩基配列は既に明らかにされている（Trieu-Cuot,P. and Courvalin,P.:Gene 23（3）, 331-341（1983））。この配列を基に配列番号１および２に示すプライマーを合成し、pDG783（Anne-Marie Guerout- Fleury et al., Gene, 167, 335-337(1995)）を鋳型としてPCRを行ない、カナマイシン耐性遺伝子とそのプロモーターを含むDNA断片を増幅した。
【００６６】
上記DNA断片を宝酒造社製のSUPREC02にて精製した後、制限酵素HindIIIとHincIIで完全分解し平滑末端化した。平滑末端化は宝酒造社製のBlunting Kitにより行なった。このDNA断片と、配列番号３および４に示すプライマーを用いてpHSG399(S.Takeshita et al : Gene 61,63-74(1987)参照)を鋳型としてPCRを行って得られた増幅産物を精製し平滑末端化したDNA断片とを、混合し連結した。連結反応は宝酒造社製 DNA ligation kit ver2にて行なった。連結したDNAを用いて、エシェリヒア・コリJM109のコンピテントセル（宝酒造社製）を形質転換し、IPTG（イソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド）10μg/ml、X-Gal（5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-D−ガラクトシド）40μg/ml及びカナマイシン25μg/mlを含むL培地（バクトトリプトン10g/L、バクトイーストエキストラクト5g/L、NaCl 5g/L、寒天15g/L、pH7.2）に塗布し、一晩培養後、出現した青色のコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換株を得た。
【００６７】
形質転換株からアルカリ法（生物工学実験書、日本生物工学会編、105頁、培風館、1992年）を用いてプラスミドを調製し、制限酵素地図を作成し、図１に示す制限酵素地図と同等であるものをpK1と名付けた。このプラスミドはエシェリヒア・コリ中にて安定に保持され、宿主にカナマイシン耐性を付与する。また、lazZ'遺伝子を含むため、クローニングベクターに適している。
【００６８】
＜２＞シャトルベクターpSFK6の構築
温度感受性複製制御領域の取得の材料として、エシェリシア・コリと、コリネ型細菌の双方の菌体中で自律複製可能なプラスミドベクターを作製した。ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムATCC13869より抽出したプラスミドpAM330(特開昭58-67699号公報参照)を制限酵素HindIIIで完全分解したのち平滑末端化し、これと、上記pK1を制限酵素BsaAIで完全分解したものを、連結した。連結後のDNAを用いてブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムATCC13869を形質転換した。形質転換の方法は、電気パルス法（特開平2-207791号参照）を用いた。形質転換体の選択は、カナマイシン25μg/mlを含むM-CM2Bプレート(ポリペプトン10g/L、酵母エキス10g/L、NaCl 5g/L、ビオチン10μg/L、寒天15g/L、pH7.2)にて行った。二晩培養後、コロニーを釣り上げ単コロニー分離し、形質転換体とした。形質転換体からプラスミドDNAを調製し、制限酵素地図を作成し、図２に示す制限酵素切断地図と同一の制限酵素地図を持つものをpSFK6と命名した。このプラスミドは、エシェリシア・コリとコリネ型細菌中で自律複製でき、宿主にカナマイシン耐性を付与する。
【００６９】
＜３＞温度感受性複製制御領域をもつプラスミドの取得
pSFK6をインビトロでヒドロキシルアミン処理した。ヒドロキシルアミン処理は、公知の方法（G. O. Humpherys et al., Molec. Gen. Genet., 145, 101-108 (1976)等参照）によった。処理後のDNAを回収し、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムATCC13869株を形質転換した。形質転換体は、カナマイシン25μg/mlを含むCM2Bプレート上で低温(25℃)にて選択した。出現した形質転換体を、同様の選択プレートにレプリカし、高温(34℃)にて培養した。高温でカナマイシンを含む選択プレート上で生育できない株１株を取得した。この株から、プラスミドを回収しp48Kと命名した。
【００７０】
＜４＞温度感受性複製制御領域の塩基配列の決定
野生型の複製制御領域を持つプラスミドpSFK6、および温度感受性型の複製制御領域を持つプラスミドp48Kについて、それぞれの複製制御領域部分の塩基配列を決定した。塩基配列は、ABI社のDNA Sequencing Kitを用いてABI社の全自動シーケンサーABI310にて決定した。その結果、野生型複製制御領域と、温度感受性変異型複製制御領域の間には、６個の塩基置換があることが判明した。pSFK6に含まれるコリネ型細菌中で機能する複製制御領域部分（pAM330由来の全配列）の塩基配列を配列番号５に、p48Kに含まれるコリネ型細菌中で機能する温度感受性複製制御領域部分の塩基配列を配列番号７に示す。また、これらの塩基配列中に存在するＯＲＦによってコードされ得るアミノ酸配列を配列番号６及び８に示す。温度感受性複製制御領域では、配列上の1255番目のCがTに、1534番目のCがTに、1866番目のGがAに、2058番目のGがAに、2187番目のCがTに、 3193番目のGがAに変異している。このうちアミノ酸変異を伴うものは1534番目の変異点のみであり、プロリンからセリンへの置換を引き起こす。
【００７１】
＜５＞温度感受性変異を有するシャトルベクターの構築
p48Kが持つ６個の変異を、一点ずつシャトルベクターpSFK6に導入した（図３参照）。変異の導入は、公知の方法（Mikaelian, I., Sergeant, A. Nucleic Acids Res., 20, 376 (1992)）によって行った。具体的方法を以下に示す。3193番目のG→Aの変異を導入するために、配列番号９および１０に示すプライマーの組み合わせと、配列番号１１および１２に示すプライマーの組み合わせを用いて、pAM330を鋳型としてPCRを行なった。得られた増幅産物はそれぞれアガロースゲルで電気泳動後、ゲルから回収することにより精製した。ゲルからのDNA断片の回収は宝酒造社製のEASYTRAP Ver.2にて行なった。精製したDNAを1:1のモル比となるように混合し、これを鋳型として配列番号１３および１４に示すプライマーを用いてPCR反応を行なった。増幅産物は制限酵素MluIで完全分解し、アガロースゲルにて電気泳動後、およそ3.2KbのDNA断片を回収した。pSFK6も同様に制限酵素MluIで完全分解し、アガロースゲルにて電気泳動後、およそ3.8KbのDNA断片を回収した。得られたDNA断片を混合して連結し、エシェリヒア・コリJM109のコンピテントセル（宝酒造社製）を用いて形質転換を行い、カナマイシン25μg/mlを含むL培地に塗布し、一晩培養後、出現したコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換株を得た。形質転換株からアルカリ法を用いてプラスミドを調製し、塩基配列を決定し、配列番号１７に示す配列の1534番目のCがTに変異していることを確認した。このプラスミドをpSFKT2と名付けた（図３）。
【００７２】
【実施例２】
argR遺伝子のクローニングとコリネ型細菌での増幅効果
ブレビバクテリウム・フラバム野生株2247（AJ14067）の染色体DNAを鋳型とし、配列番号１５（配列番号１７の塩基番号1717から1741の配列）および配列番号１６（配列番号１７の塩基番号2386から2362の配列に相補的な配列）に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（プライマー１，２）をプライマーとしてPCRを行った。PCRは、Pyrobest DNA polymerae（宝酒造）を用い、９８℃ １０秒、５８℃ １分、７２℃ ３分を１サイクルとして３０サイクル行った。得られた増幅断片を、実施例１で得たシャトルベクターpSFK6のSmaIサイトに挿入し、コリネ型細菌で自律複製可能なプラスミドpWRを得た。
【００７３】
コリネ型細菌のＬ−アルギニン生産菌でのargR遺伝子の増幅効果を調べるため、pWRをＬ−アルギニン生産菌ブレビバクテリウム・フラバムAJ11345株（FERM BP-6894）に導入した。プラスミドの導入は、電気パルス法（特開平2-207791号）を用いた。形質転換体は、カナマイシン25μg/mlを含むCM2G寒天培地（グルコース5g、NaCl 5g、寒天15gを純水1Lに含む。pH7.2）にてカナマイシン耐性株として選択し、AJ11345/pWRを得た。対照として、AJ11345株にpSFK6を同様にして導入し、形質転換体AJ11345/pSFK6を得た。
【００７４】
上記各菌株を、グルコース0.5g/dl、ポリペプトン 1g/dl、酵母エキス 1g/dl、NaCl 0.5g/dlを含む寒天培地にぬりつけ、31.5℃で20時間培養した。得られた菌体１エーゼを、グルコース4g/dl、硫酸アンモニウム6.5g/dl、KH2PO4 0.1g/dl、MgSO4 0.04g/dl、FeSO4 0.001g/dl、MnSO4 0.001g/dl、ビタミンB1 5μg/dl、ビオチン5μg/dl、大豆加水分解物（N量として45mg/dl）を含む培地に植菌し、フラスコにて31.5℃で50時間振とう培養を行った。各々の培養液中のＬ−アルギニン蓄積量（濃度(g/dl)）を測定した結果を表１に示す。その結果、argR増幅株では、ほとんどＬ−アルギニンを蓄積しなくなった。このことから、argR遺伝子産物がアルギニンリプレッサーとして機能していることが示された。
【００７５】
【表１】
表１
─────────────────────
菌株 L-アルギニン蓄積量（g/dl）
─────────────────────
AJ11345/pSFK6 1.3
AJ11345/pWR 0.2
─────────────────────
【００７６】
pWRにクローニングされた挿入断片の塩基配列を決定した結果を配列番号１７に示す。同塩基配列によってコードされ得るアミノ酸配列を配列番号１８に示す。
【００７７】
【実施例３】
コリネ型細菌のargR破壊株の構築及びアルギニンリプレッサー欠失の効果
＜１＞argR破壊用プラスミドの作製
ブレビバクテリウム・フラバム野生株2247株（AJ14067）の染色体DNAを鋳型とし、配列番号１９（配列番号１７の塩基番号４から28の配列）および配列番号２０（配列番号１７の塩基番号4230から4211の配列に相補的な配列）に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（プライマー３，４）をプライマーとしてPCRを行った。PCRは、Pyrobest DNA polymerae（宝酒造）を用い、９８℃１０秒、５８℃１分、７２℃３分を１サイクルとして３０サイクル行った。得られた増幅断片を、クローニングベクターpHSG399のマルチクローニングサイト内のSmaIサイトに挿入した。
【００７８】
挿入されたDNA断片からアルギニンリプレッサーをコードしていると思われるORF全てを欠失させるために、配列番号２１（配列番号１７の塩基番号2372から2395の配列）および配列番号２２（配列番号１７の塩基番号1851から1827の配列に相補的な配列）に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（プライマー５，６）をプライマーとし、増幅断片が挿入されたpHSG399を鋳型をしてPCRを行った。PCR産物をセルフライゲーションすることにより、pssERを構築した。
【００７９】
次に、pssERを制限酵素SmaIおよびSalIで消化して得た断片と、実施例１で得た温度感受性プラスミドpSFKT2をSmaI、SalIで消化したものを連結することにより、コリネ型細菌で自律複製能が温度感受性になったargR破壊用プラスミドpssERTを得た。
【００８０】
＜２＞相同組換えによるコリネ型細菌のアルギニンリプレッサー欠失株の取得
上記のようにして得たプラスミドpssERTを、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムの野生株2256（ATCC13869）に導入した。プラスミドの導入は電気パルス法（特開平2-207791号）を用いた。本プラスミドは、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム中で自律複製能が温度感受性であるため、本プラスミドが相同組換えによって染色体に組み込まれた株のみが、プラスミド複製の非許容温度である34℃でカナマイシン耐性株として選択できる。argR破壊用プラスミドが染色体に組み込まれた株は、25μg/mlのカナマイシンを含むCM2G培地プレート（ポリペプトン10g、酵母エキス10g、グルコース5g、NaCl 5g、寒天15ｇを純水1Lに含む。pH7.2）にて、カナマイシン耐性株として選択した。この段階では、染色体由来の正常なargR遺伝子と、プラスミド由来のORFが欠失したargG遺伝子とが、プラスミド部分を挟んで染色体上にタンデムに存在する。
【００８１】
次に、組換え株を、再度相同組換えを起こさせ、プラスミド複製の非許容温度34℃でカナマイシン感受性になった株を選択することにより、プラスミド部分とともにargR遺伝子の一方が脱落した株を選択した。これらの株は、染色体上に正常なargR遺伝子が残された株と、破壊型argR遺伝子が残された株とが存在する。これらの中から、破壊型argR遺伝子のみを保持する株を選択した。染色体上のargR遺伝子が破壊型であるかどうかは、34℃でカナマイシン感受性になった株の染色体を調製し、これを鋳型とし、配列番号１９および配列番号２０に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド(プライマー３，４) をプライマーとしてPCRを行い、親株由来の染色体を鋳型にして同様にPCRを行ったものよりも、PCR産物が約600bp短くなることで確認することができる。
【００８２】
上記のようにして選択されたargR破壊株のPCR産物のダイレクトシークエンスを行い、目的どおりargR遺伝子が破壊されていることを確認し、2256ΔR株を得た。
【００８３】
＜３＞argR破壊株によるＬ−アルギニンの生産
2256ΔR株を、グルコース0.5g/dl、ポリペプトン 1g/dl、酵母エキス 1g/dl、NaCl 0.5g/dlを含む寒天培地にぬりつけ、31.5℃で20時間培養した。得られた菌体１エーゼを、グルコース3g/dl、硫酸アンモニウム6.5g/dl、KH２PO4 0.1g/dl、MgSO4 0.04g/dl、FeSO4 0.001g/dl、MnSO4 0.001g/dl、ビタミンB1 300μg/dl、ビオチン200μg/dl、大豆加水分解物（N量として165mg/dl）を含み、NaOHでpH7.0に調整した培地に植菌し、31.5℃で24時間シード培養を行った。
【００８４】
上記シード培養液1mlを、グルコース4g/dl、硫酸アンモニウム6.5g/dl、KH2PO4 0.5g/dl、MgSO4 0.04g/dl、FeSO4 0.001g/dl、MnSO4 0.01g/dl、ビタミンB1 5μg/dl、ビオチン5μg/dl、大豆加水分解物（N量として45mg/dl）を含み、KOHでpHを7.0に調整した培地に植菌し、フラスコにて31.5℃で50時間振とう培養を行った。各菌株の培養液中のＬ−アルギニン蓄積量（濃度(mg/dl)）を測定した結果を表２に示す。その結果、argR破壊株は、親株に比べて著量のＬ−アルギニンを生成した。
【００８５】
【表２】
表２
─────────────────────
菌株 L-アルギニン蓄積量（mg/dl）
─────────────────────
2256 0
2256ΔR 200
─────────────────────
【００８６】
【実施例４】
lysEのコリネ型Arg生産菌における増幅効果
＜１＞lysE遺伝子搭載プラスミドの作製
上記菌株においてlysE遺伝子の増幅効果を確認するため、lysE遺伝子とコリネ型細菌の複製制御領域を有するプラスミドの構築を行なった。
【００８７】
既に取得されているコリネ型細菌で自律複製可能なプラスミドpHM1519(Agric.Biol.Chem.,48,2901-2903(1984))由来の複製制御領域を持つプラスミドpHK4（特開平5‐7491号公報参照）を制限酵素BamHIおよびKpnIで消化して、複製制御領域を含む遺伝子断片を取得した。得られた断片をDNA平滑末端化キット(宝酒造)を用いて平滑末端化した後、KpnIリンカーを用いてpHSG399のKpnIサイトに挿入し、エシェリヒア・コリとコリネ型細菌とのシャトルベクターpKCを得た。
【００８８】
次に、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム野生株2256株の染色体DNAを鋳型とし、配列番号２３（配列番号２５の塩基番号６８１から７０３の配列）および配列番号２４（配列番号２５の塩基番号１８４１から１８６３の配列に相補的な配列）に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとしてPCRを行い、lysE遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。PCRは、DNA PolymeraseとしてTaKaRa Ex Taq（宝酒造）を用い、98℃ 30秒、55℃ 15秒、72℃ 2分を1サイクルとして30サイクル行なった。得られた増幅断片を、TAクローニングベクターpCR2.1（Invitrogen社製）に挿入し、pCRlysEを得た。さらに、この挿入断片を含むように制限酵素BamHIおよびXbaIで遺伝子断片を切り出し、pKCのBamHIおよびXbaI サイトに連結して、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム由来のlysE搭載プラスミドplysEを構築した。この構築の過程を図４に示す。
【００８９】
＜２＞2256株および2256ΔR株におけるlysE遺伝子増幅効果の確認
上記のようにして得られたプラスミドplysEを、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム2256株および2256ΔR株に導入した。プラスミドの導入は電気パルス法（特開平2-207791号）を用いた。形質転換体は、5μg/mlのクロラムフェニコールを含むCM2G培地プレート（ポリペプトン10g、酵母エキス10g、グルコース5g、NaCl 5g、寒天15ｇを純水1Lに含む。pH7.2）にて、クロラムフェニコール耐性株として選択した。これらの形質転換体を、前記と同様にしてフラスコ培養し、Ｌ−アルギニン蓄積量を測定した。結果を表３に示す。
【００９０】
【表３】
表３
──────────────────────────
菌株 L-アルギニン蓄積量（mg/dl）
──────────────────────────
2256 0
2256/plysE 0
2256ΔR 200
2256ΔR/plysE 600
──────────────────────────
【００９１】
【実施例５】
Ｌ−アルギニン生合成系遺伝子との組合せ増幅効果の確認
＜１＞Ｌ−アルギニン生合成系遺伝子搭載plasmidの作製
さらに、上記菌株においてＬ−アルギニン生合成系遺伝子argC,J,B,F,G,Hの増幅効果を確認するため、argCJBDFGH遺伝子とコリネ型細菌の複製制御領域を有するプラスミドの構築を行なった。
【００９２】
pHK4（特開平5-7491号）を制限酵素BamHIおよびKpnIで消化して、コリネ型細菌における複製制御領域を含む遺伝子断片を取得した。得られた断片をDNA平滑末端化キット(宝酒造)を用いて平滑末端化した後、SalIリンカーを用いてpHSG399のSalIサイトに挿入し、エシェリヒア・コリとコリネ型細菌とのシャトルベクターpSAC4を得た。
【００９３】
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム野生株2256株の染色体DNAを鋳型とし、配列番号２７および配列番号２８に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとしてPCRを行い、argCJBDFRGHを含むＤＮＡ断片を増幅した。PCRは、DNA PolymeraseとしてTaKaRa LA Taq（宝酒造）を用い、98℃ 30秒、55℃ 15秒、72℃ 6分を1サイクルとして30サイクル行なった。得られた増幅断片を平滑末端後、pSAC4のSmaIサイトに挿入し、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム由来のargCJBDFRGH搭載プラスミドpargCJBDFRGHを構築した。さらに本プラスミドを鋳型とし、配列番号２９および配列番号３０に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとしてargR遺伝子ORFの外側を増幅するためのPCRを行った。PCRは、DNA PolymeraseとしてTaKaRa LA Taq（宝酒造）を用い、98℃ 20秒、68℃ 15分を1サイクルとして30サイクル行なった後、72℃で10分反応させた。得られた増幅断片を平滑末端後、TaKaRa Ligation Kit ver.2を用いてセルフライゲーションを行うことにより、argR遺伝子を搭載しないプラスミドpargCJBDFGHを構築した。この構築の過程を図５に示す。
【００９４】
＜２＞Ｌ−アルギニン生合成系遺伝子増幅効果の確認
pargCJBDFGHを2256株に導入し、形質転換体2256/pargCJBDFGHを得た。2256株、および2256/pargCJBDFGH株を前記と同様にしてフラスコ培養し、Ｌ−アルギニン蓄積量を測定した。結果を表４に示す。
【００９５】
【表４】
表４
──────────────────────────
菌株 L-アルギニン蓄積量（mg/dl）
──────────────────────────
2256 0
2256/pargCJBDFGH 300
──────────────────────────
【００９６】
＜３＞Ｌ−アルギニン生合成系遺伝子およびlysE遺伝子を組合せて増幅したときの効果の確認
Ｌ−アルギニン生合成系遺伝子およびlysE遺伝子を組合せて増幅したときの効果を確認するため、上述のプラスミドpCRlysEをBamHI消化してlysE遺伝子を含むＤＮＡ断片を切り出し、DNA平滑末端化キット(宝酒造)を用いて平滑末端化した後、XbaIリンカーを用いてプラスミドpargCJBDFGHのXbaIサイトに挿入し、プラスミドpargCJBDFGH-Eを構築した。この構築の過程を図５に示す。本プラスミドを2256株へ導入し、前記と同様にしてフラスコ培養し、Ｌ−アルギニン蓄積量を測定した。結果を表５に示す。
【００９７】
【表５】
表５
──────────────────────────
菌株 L-アルギニン蓄積量（mg/dl）
──────────────────────────
2256 0
2256/pargCJBDFGH 200
2256/plysE 0
2256/pargCJBDFGH-E 400
──────────────────────────
【００９８】
【実施例６】
lysEのエシェリヒア・コリArg生産菌における増幅効果
＜１＞lysE遺伝子搭載プラスミドpRSlysEの構築
公知のプラスミドpRS（特表平3-501682号公報参照）を用いて、lysE発現用プラスミドpRSlysEを構築した（図６）。pRSは、RSF1010の誘導体である広宿主域ベクタープラスミドpAYC32（Chistorerdov, A.Y., Tsygankov, Y.D. Plasmid, 1986, 16, 161-167）に由来するpVIC40プラスミド（WO90/04636国際公開パンフレット、特表平3-501682号公報）より、同プラスミドが持つスレオニンオペロンをコードするDNA領域を削除してベクター部分のみを持つプラスミドである。
【００９９】
まず、pRSより、tacプロモーターを持つプラスミドpRStacを図６に示す方法で構築した。pRSベクターを制限酵素EcoRIおよびPstIで消化し、フェノール・クロロホルム溶液を加えて混合し、反応を停止させた。反応液を遠心分離した後、上層を回収し、エタノール沈殿にてDNAを回収後、0.8%アガロースゲルにて分離し、約8キロベースペア（以下、「kbp」と記載）のDNA断片をEASY TRAP Ver.2（DNA回収キット、宝酒造社製）を用いて回収した。一方、tacプロモーター領域を、pRK223-3プラスミド（発現用ベクター、Pharmacia社製）を鋳型とし、配列番号３１および３２に示すプライマーを用いて、PCRにより増幅した（変性94℃-20秒、アニーリング55℃-30秒、伸長反応72℃-60秒のサイクルを30サイクル行った）。PCR反応にはPyrobest DNA polymerase（宝酒造社製）を使用した。増幅されたtacプロモーターを含むDNA断片をPCRprep（Promega社製）にて精製した後、あらかじプライマー中にデザインしておいた制限酵素サイト、すなわちEcoRIおよびEcoT22Iで消化し、フェノール・クロロホルム溶液を加えて混合し、反応を停止させた。反応液を遠心分離した後、上層を回収し、エタノール沈殿にてDNAを回収した後、0.8%アガロースゲルにて分離し、約0.15kbpのDNA断片をEASY TRAP Ver.2を用いて回収した。
【０１００】
上記のように調製したpRSベクター消化物と、tacプロモーター領域断片を、DNA Ligation Kit Ver.2（宝酒造製）を用いて連結させた。この連結反応溶液でエシェリヒア・コリ（E.coli JM109 competent cells、宝酒造製）を形質転換し、20mg/Lのストレプトマイシンを含むLB寒天培地に塗布し、37℃で一晩保温した。寒天培地上に出現したコロニーを20mg/Lのストレプトマイシンを含むLB液体培地に接種し、37℃で8時間振盪培養した。アルカリ−SDS法にて各培養液からプラスミドDNAを抽出し、制限酵素で消化して構造を確認し、pRStacを得た。pRSベクター上のストレプトマイシン耐性遺伝子の転写方向とtacプロモーターの転写方向が同じ向きになっているものを、pRStacとして選択した。
【０１０１】
上記のようにして得たpRStacを、Sse8387I（宝酒造製）およびSapI（ニューイングランドバイオラボ社製）で消化し、フェノール・クロロホルム溶液を加えて混合し、反応を停止させた。反応液を遠心分離した後、上層を回収し、エタノール沈殿にてDNAを回収後、0.8%アガロースゲルで分離し、約9.0kbpのDAN断片を回収した。
【０１０２】
また、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム２２５６株（ATCC13869）より抽出した染色体を鋳型として、配列番号３３および３４に示すプライマーを用いたPCR法（変性94℃-20秒、アニーリング55℃-30秒、伸長反応72℃-90秒）によりlysE遺伝子断片を増幅した。PCR反応には、Pyrobest DNA polymerase（宝酒造社製）を使用した。得られた断片をPCRprep（Promega社製）にて精製した後、制限酵素Sse8387IおよびSapIで消化した。フェノール・クロロホルム溶液を加えて混合し、反応を停止させた。反応液を遠心分離した後、上層を回収し、エタノール沈殿にてDNAを回収し、0.8%アガロースゲルで回収した。
【０１０３】
上記のように調製したpRStacベクター消化物と、lysE遺伝子領域断片を、DNA Ligation Kit Ver.2（宝酒造製）を用いて連結させた。この連結反応溶液でエシェリヒア・コリ（E.coli JM109 competent cells、宝酒造製）を形質転換し、20mg/Lのストレプトマイシンを含むLB寒天培地に塗布し、37℃で一晩保温した。寒天培地上に出現したコロニーを20mg/Lのストレプトマイシンを含むLB液体培地に接種し、37℃で8時間振盪培養した。アルカリ−SDS法にて各培養液からプラスミドDNAを抽出し、制限酵素での消化および塩基配列の決定により構造を確認して、pRSlysEを得た。pRSlysEは、tacプロモーターの転写方向に対して、lysE遺伝子の転写方向が同じ向きになるように配置されている。
【０１０４】
＜２＞yggA遺伝子搭載プラスミドpGEM5の構築
エシェリヒア・コリK-12株の染色体ＤＮＡの全塩基配列が決定されている（Science, 277, 1453-1474, 1997）。この報告されている塩基配列に基づいて、配列番号３５、３６に示すプライマーを用いて、エシェリヒア・コリMG1655株染色体ＤＮＡを鋳型とするPCRにより、yggA遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。配列番号３５に示すプライマーは、GenBankにaccession No. AE000375で登録されている塩基配列の塩基番号9606〜9626の相補的な配列を有しており、配列番号３６に示すプライマーは、塩基番号8478〜8498の配列を有している。
【０１０５】
エシェリヒア・コリMG1655株の染色体ＤＮＡは、常法により調製した。PCRは、PCR protocols. Current Methods and applications, White, B. A., ed. Humana Press, Totowa, New Jersey, 1993に記載の標準的な条件により実施した。得られたPCR産物は常法により精製し、pGEM-Tベクター（Promega社）にクローニングした。得られたプラスミドは、pGEM5と命名した。
【０１０６】
＜３＞エシェリヒア・コリArg生産菌におけるlysE遺伝子増幅効果の確認
上記のように構築したプラスミドpRSlysE、pGEM5をE. coliのArg生産株である237株に導入した。237株は、エシェリヒア・コリK12 ilvA::Tn5から１−メチル−３−ニトロ−１−ニトロソグアニジンにより誘導された、ピリミジンアナログである６−アザウラシルに耐性な変異株である。同株は、VKPM B-7925の名でAll-Russian Collection for Industrial Microorganisms (VKPM)（1, Dorozhny Proezd., 1, 113545, Moscow, Russia）に寄託されている。形質転換は、定法によって実施した。
【０１０７】
得られた形質転換株についてＬ−アルギニン生産性を確認するため培養評価を行った（３２℃、3日、振盪培養）。用いた培地の組成を以下に示す（単位g/L）。グルコース 60g/L、(NH4)2SO4 35g/L、酵母エキス 5g/L、KH2PO4 2g/L、MgSO4・7H2O 1g/L、CaCO3 25g/L。培地中に蓄積したＬ−アルギニンの量を公知の方法により測定した結果を表６に示す。
【０１０８】
【表６】
表６
──────────────────────────
菌株 L-アルギニン蓄積量（mg/dl）
──────────────────────────
237 450
237/pRSlysE 890
237/pGEM5 600
──────────────────────────
【０１０９】
lysEを増幅したプラスミドpRSlysEの導入によってＬ−アルギニン蓄積量が向上した。また、その向上幅は、従来Ｌ−アルギニン排出因子として報告されていたyggAを増幅するpGEMに比べて、より高いレベルであった。
【０１１０】
（配列表の説明）
配列番号１：ストレプトコッカス・フェカリスのカナマイシン耐性遺伝子増幅用プライマー
配列番号２：ストレプトコッカス・フェカリスのカナマイシン耐性遺伝子増幅用プライマー
配列番号３：pHSG399のベクター部分増幅用プライマー
配列番号４：pHSG399のベクター部分増幅用プライマー
配列番号５：pSFK6の複製制御領域部分の塩基配列
配列番号６：pSFK6中のORFによってコードされ得るアミノ酸配列
配列番号７：p48Kの複製制御領域部分の塩基配列
配列番号８：p48K中のORFによってコードされ得るアミノ酸配列
配列番号９：pSFK6に1534番目のC→Tの変異を導入するための第１回目PCR用プライマー
配列番号10：pSFK6に1534番目のC→Tの変異を導入するための第１回目PCR用プライマー
【０１１１】
配列番号11：pSFK6に1534番目のC→Tの変異を導入するための第１回目PCR用プライマー
配列番号12：pSFK6に1534番目のC→Tの変異を導入するための第１回目PCR用プライマー
配列番号13：pSFK6に1534番目のC→Tの変異を導入するための第２回目PCR用プライマー
配列番号14：pSFK6に1534番目のC→Tの変異を導入するための第２回目PCR用プライマー
配列番号15：argR遺伝子増幅用プライマー
配列番号16：argR遺伝子増幅用プライマー
配列番号17：argR遺伝子を含むＤＮＡ断片の塩基配列
配列番号18：前記ＤＮＡ断片がコードし得るアミノ酸配列
配列番号19：argR遺伝子増幅用プライマー
配列番号20：argR遺伝子増幅用プライマー
【０１１２】
配列番号21：argR遺伝子を含むプラスミドのargR遺伝子ORF以外の部分を増幅するためのプライマー
配列番号22：argR遺伝子を含むプラスミドのargR遺伝子ORF以外の部分を増幅するためのプライマー
配列番号23：lysE遺伝子増幅用プライマー
配列番号24：lysE遺伝子増幅用プライマー
配列番号25：コリネバクテリウム・グルタミカムlysGおよびlysE遺伝子を含むＤＮＡ断片の塩基配列（GenBank X96471）
配列番号26：lysEによってコードされるアミノ酸配列
配列番号27：argCからargH遺伝子を含むDNA断片増幅用プライマー
配列番号28：argCからargH遺伝子を含むDNA断片増幅用プライマー
配列番号29：argRのORFの外側増幅用プライマー
配列番号30：argRのORFの外側増幅用プライマー
【０１１３】
配列番号31：tacプロモーター増幅用プライマー
配列番号32：tacプロモーター増幅用プライマー
配列番号33：lysE遺伝子増幅用プライマー
配列番号34：lysE遺伝子増幅用プライマー
配列番号35：yggA遺伝子増幅用プライマー
配列番号36：yggA遺伝子増幅用プライマー
【０１１４】
【発明の効果】
本発明により、Ｌ−アルギニン生産能を有するコリネ型細菌及びエシェリヒア属細菌等の微生物のＬ−アルギニン生産能を向上させることができる。
【０１１５】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 プラスミドpK1の構築過程を示す図。
【図２】 プラスミドpSFK6の構築過程を示す図。
【図３】 プラスミドpSFKT2の構築過程を示す図。
【図４】 lysE搭載プラスミドplysEの構築の過程を示す図。
【図５】 Ｌ−アルギニン生合成酵素遺伝子を搭載し、argR遺伝子を含まないプラスミドpargCJBDFGH、及びlysE及びＬ−アルギニン生合成酵素遺伝子を搭載したプラスミドpargCJBDFGH-Eの構築の過程を示す図。
【図６】 tacプロモーターを持つプラスミドpRStac、及びpRStacにlysE遺伝子が挿入されたプラスミドpRSlysEの構築を示す図。
Claims (4)
- Ｌ−アルギニン生産能を有し、かつ、ｌｙｓＥ遺伝子の発現が増強されるように改変され、さらに、染色体上のアルギニンリプレッサーをコードする遺伝子が破壊されたことにより、アルギニンリプレッサーが正常に機能しないように改変された、コリネ型細菌である微生物。
- ｌｙｓＥ遺伝子の発現の増強が、ｌｙｓＥ遺伝子のコピー数を高めること、又は前記細菌細胞内のｌｙｓＥ遺伝子の発現が増強されるように同遺伝子の発現調節配列を改変することによるものである請求項１記載の微生物。
- さらに、細胞内のＬ−アルギニン生合成系酵素の活性が増強されるように改変された請求項１又は２に記載の微生物。
- 請求項１〜３のいずれか一項に記載の微生物を培地で培養し、培地中にＬ−アルギニンを生成蓄積せしめ、これを該培地から採取することを特徴とするＬ−アルギニンの製造法。
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