JP4047814B2

JP4047814B2 - 新規カリックス［４］アレーン−ヌクレオシドおよびカリックス［４］アレーン−オリゴヌクレオチドハイブリッド

Info

Publication number: JP4047814B2
Application number: JP2003560028A
Authority: JP
Inventors: キム、ビャン・ヒャン; キム、ス・ジョン
Original assignee: ポステック・ファウンデーション
Priority date: 2002-01-15
Filing date: 2002-06-19
Publication date: 2008-02-13
Anticipated expiration: 2022-06-19
Also published as: EP1397377A1; ATE403662T1; EP1397377A4; US20040157794A1; AU2002311656A1; DE60228081D1; KR100469213B1; WO2003059925A1; EP1397377B1; KR20030061651A; JP2005514462A; US7166718B2

Description

本発明は、カリックス［４］アレーン残基を含むカリックス［４］アレーン−ヌクレオシドハイブリッド（calix[4]arene-nucleoside hybrid）と前記カリックス［４］アレーン−ヌクレオシドハイブリッドを用いてＤＮＡヘアピン構造類似体（DNA hairpin structure mimics）として合成されたカリックス［４］アレーン−オリゴヌクレオチドハイブリッド（calix[4]arene-oligonucleotide hybrid）に関する。

多重官能基（multifunctional groups）の前形成（preorganization）および組合せは生物学的反応力学において非常に重要な役割を担当する（A. R. Fersht, Trends Biochem. Sci. 28, 3111, 1987）。カリックス［４］アレーン(calix[4]arene)は、結合官能基の方向性前形成および低エネルギー要求性形態的変化によって導入物質（guest）結合部位を迅速に組合せることができる能力を有する非常に有望な先導物質（host）として提示されている(T. Harade, J. M. et al., Tetrahedron 49, 5941, 1993; J. Scheerder, et al., Angew. Chem. 108, 1172, 1996; Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 35, 1090, 1996)。したがって、カリックス［４］アレーンは多重機能性酵素モデルのためのビルディング・ブロックとして使用されている（P. Molenveld, et al., J. Am. Chem. Soc. 120, 6726, 1998）。最近は、生物学的活性を有する合成受容体または酵素類似体（mimics）を開発するためにカリックス［４］アレーンが糖（A. Dondoni, et al., Tetrahedron Lett. 42, 3295, 2001）、アミノ酸（L. Frkanec, et al., Chem. Eur. J. 6, 442, 2000）およびペプチド（Y. Hamuro, et al., Angew. Chem. 109, 2797, 1997）と結合されている。しかし、カリックス［４］アレーン残基を含む変形されたオリゴヌクレオチド（modified oligodeoxynucleotide, ODNs）の前例はこれまでない。

そこで、本発明者らは、ＤＮＡヘアピン構造類似体として働けるカリックス［４］アレーン残基を含む変形されたＯＤＮｓの開発を試みた。

したがって、本発明の目的は、生理活性物質との相互作用を通じてオリゴヌクレオチドを認識できるカリックス［４］アレーン−オリゴヌクレオチドハイブリッドの製造に使用できるカリックス［４］アレーン−ヌクレオシドハイブリッドを提供することである。

本発明の一実施態様によって、本発明では一つまたはその以上のアミノ基を有するカリックス［４］アレーンに由来するカリックス［４］アレーン残基にアミド結合を通じて結合している少なくとも一つのヌクレオシドを有するカリックス［４］アレーン−ヌクレオチドハイブリッドが提供される。

また、本発明の他の実施態様によって、カリックス［４］アレーン−ヌクレオシドハイブリッドに由来する残基に結合された二つのヌクレオシド残基の各々に結合した一つまたはその以上のヌクレオチド配列を有するカリックス［４］アレーン−オリゴヌクレオチドハイブリッドが提供される。

本発明の前記および他の目的および特徴は、下記の図面を伴う本発明の詳細な説明によって明白になる。

本発明は、カリックス［４］アレーン残基を含むカリックス［４］アレーン−ヌクレオシドハイブリッドおよび前記カリックス［４］アレーン−ヌクレオシドハイブリッドを主なビルディング・ブロックとして用いて合成され、ＤＮＡヘアピン構造と類似するカリックス［４］アレーン−オリゴヌクレオチドハイブリッドを提供する。

本発明で用いられたカリックス［４］アレーンは下記式９で表される構造を有する。

本発明で使用され得るヌクレオシドとしては、アデノシンおよびチミジンが好ましいが、これらに限定されない。

本発明の好ましい実施態様によれば、ＤＮＡヘアピン構造類似体、たとえば、図２に示す５’−Ａ₁₂−Ｘ−Ｔ₁₂−３’（配列番号１、Ｘは式１のカリックスヌクレオシド１である。）の配列を有するカリックス［４］アレーン−オリゴヌクレオチドハイブリッド（以下、カリックスオリゴヌクレオチド（calixoligonucleotide）と略称する）を製造するための基礎骨格（scaffold）として各々使用され得る下記式１〜４のカリックス［４］アレーン−ヌクレオシドハイブリッド（以下、カリックスヌクレオシド（calixnucleoside）と略称する）１〜４を提供する。

本発明のカリックスヌクレオシドおよびカリックスオリゴヌクレオチドハイブリッドは新規な化合物であって、カリックスオリゴヌクレオチドは様々な構造的長所を有する変形されたオリゴデオキシヌクレオチド（modified oligodeoxynucleotide, ODNs）である：本発明のカリックスオリゴヌクレオチドは一定水準以上の硬度（rigidity）と柔軟性（flexibility）を同時に有する；これらは生体内で安定であり、優れた細胞透過性を有する。また、本発明のカリックスオリゴヌクレオチドは容易に大量生産できる。したがって、本発明のカリックスオリゴヌクレオチドは３重結合形成を通じてＤＮＡまたはＲＮＡを認識できるヘアピン形態のＯＤＮｓとして使用できる（E. T. Kool, Acc. Chem. Res. 31, 502, 1998; S. Wang, et al., Biochemistry 34, 9774, 1995; E. Azhayeva, et al., Nucleic Acid Res. 23, 1170, 1995）。ＯＤＮｓは一本鎖ｍＲＮＡに結合するか（アンチセンス戦略、antisense strategy）または二本鎖ＤＮＡに結合して（アンチゲン戦略、antigene strategy）翻訳と転写を抑制することが報告されている（P. C. Zamecnik, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75, 280, 1978; E. Uhlmann, et al., Chem. Rev. 90, 543, 1990）。このような事実は癌やＡＩＤＳなどの疾患を治療するのに非常に有用である（A. D. Matteucci, et al., Nature 384, 20, 1996; D. H. Barton, et al., Tetrahetron Lett. 30, 4969, 1989)。したがって、本発明のカリックスヌクレオシドおよびカリックスオリゴヌクレオチドハイブリッドはＤＮＡセンサーまたは遺伝子療法（gene therapy）に有用である。

また、本発明は、前記カリックスヌクレオシドおよびカリックスオリゴヌクレオチドハイブリッドの製造方法を提供する。

本発明の好ましい態様では、チミジン誘導体をヌクレオシドとして用いて４つのカリックスヌクレオシドハイブリッドを合成する過程を下記反応式１に詳しく示す。

カリックスヌクレオシドの合成において最も重要な段階は、式７のカリックス[４]アレーンのアミン官能基（amine group）と式６または８のチミジン（thymidine）ヌクレオシドのカルボン酸基（carboxylic acid group）の間でアミド結合（amide bond）を形成することである。

前記反応式１のａ）段階では、式６のチミジン誘導体（D. H. Barton, et al., Tetrahedron Lett. 30, 4969, 1989）の５’−酸官能基（5’-acid functionality）を活性化するために（ＣＯＣｌ）₂、ＥＤＣ（1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride）、ＴＢＣ（2,4,6-trichlorobenzoylchloride）またはＴＢＴＵ（O-benzotriazole-1-yl-N,N,N’,N’-tetramethyluronium tetrafluoroborate）などのような様々なペプチドカップリング試薬（coupling reagents）を用いてもよい。たとえば、ＴＢＴＵの使用は二つの同一なチミジン残基を有する産物（同種−結合産物、homo-coupled product）、すなわち、式３のカリックスヌクレオチドを９５％の収率で生産する。

また、式８のチミジン誘導体（J. Lebreton, et al., Synlett. 137, 1994; J. Y. Kim, et al., Nucleodises, Nucleotide & Nucleic Acids 19, 637, 2000）は前記と類似する方法（段階ｃ）で式７の１，３−ジアミノカリックス［４］アレーン（1,3-diaminocalix[4]arene）（D. M. Rudkevich, et al., J. Org. Chem. 59, 3683, 1994）と反応させて式４の同種−結合カリックスヌクレオシドを得る。

二つの互いに異なるチミジン残基を有する式１および２の異種結合(hetero-coupled)カリックスヌクレオシドは式６のチミジン誘導体（１．２当量）と式７の１，３−ジアミノカリックス［４］アレーンとのカップリングを通じて前記反応式１の段階ｂ）で製造された式５の単一結合（mono-coupled）カリックスヌクレオシドを用いて合成される。式２のカリックスヌクレオシド２は反応式１の段階ｄ）で式８のチミジン誘導体と式５の単一結合カリックスヌクレオシドとのカップリングによって生産される。

反応式１の段階ｅ）では、式１の脱保護された（deprotected）カリックスヌクレオシドがテトラブチルアンモニウムフルオリド（Tetrabutylammonium fluoride）の作用によって式２のカリックスヌクレオシドからＲおよびＲ’を除去して製造される。

式１〜４の本発明のカリックスヌクレオシドの物理学的特性を元素分析（elemental analysis）、質量分析装置（mass spectrometry）、ＩＲ、¹Ｈ−ＮＭＲ、¹³Ｃ−ＮＭＲ、ＵＶ、Ｘ線結晶分析（X-ray crystallography）、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE）および円二色性（circular dichroism, CD）によって分析した。

式４の本発明のカリックスヌクレオシドのＸ線回折等級単一結晶（X-ray diffraction grade single crystals）は前記化合物のＭｅＯＨ溶液を低速溶媒蒸発（slow solvent evaporation）させて形成される。このようなＸ線結晶構造は本発明のカリックスヌクレオシドの固体状構造を確実に示し、二つのチミジン残基がＵ字形構造を形成しながら同じ方向に位置していることを提示する（図１参照）。

本発明のカリックスヌクレオシドを用いてＤＮＡヘアピン構造類似体であるカリックスオリゴヌクレオチドを以下の方法によって容易に合成できる。

まず、式１のカリックスヌクレオシドのＤＭＴｒで保護された２−シアノエチルホスホロアミダイト・ビルディング・ブロック（DMTr protected 2-cyanoethyl phosphoroamidite building block）を製造した後これをパーセプティブ・バイオシステムズ８９０９エクスパダイトＴＭ核酸合成システム（PerSeptive Biosystems 8909 ExpediteTM Nucleic Acid Synthesis System）上で固体相オリゴヌクレオチド合成方法に直接適用する（M. J. Gait, Oligonucleotide Synthesis. A Practical Approach. IRL Press, Oxford, Chapter 4, 1984）。これから配列の中間に式１のカリックスヌクレオシドを含む変形されたＯＤＮ、すなわちＤＮＡヘアピン構造類似体を合成する。このように合成された本発明のカリックスオリゴヌクレオチドはオリゴ１と命名され、５’−Ａ₁₂−Ｘ−Ｔ₁₂−３’（配列番号１；Ｘはカリックスヌクレオシド１である。）の配列を有し、下記構造式１で示される（図２参照）。

前記カリックスオリゴヌクレオチドをＤＭＴｒで切断した結果、図３に示すように、カリックスヌクレオシドにヌクレオチドが連続的に付加されていることを確認した。本発明のカリックスオリゴヌクレオチドはＰＡＧＥと逆相ＨＰＬＣを用いて分離し、フライト（fright）質量分析装置（MALDI-TOF）のマトリックス−補助レーザー脱着／イオン化時間（matrix-assisted laser desorption/ionization time）によってその分子量を８，５３９（ｍ／ｅ）と決定した。

さらに、本発明では他のカリックスオリゴヌクレオチドを合成して精製した：５’−Ｔ₁₂−Ｘ−Ｔ₁₂−３’の配列を有するオリゴ２（配列番号２；Ｘはカリックスヌクレオシド１である。）と５’−ＡＡＡＡＧＡＴＡＴＣＡＡ−Ｘ−ＴＴＧＡＣＡＴＣＴＴＴＴ−３’の配列を有するオリゴ３（配列番号３；Ｘはカリックスヌクレオシド１である）。オリゴ２および３は各々下記構造式２および３で表され、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析装置でこれらの分子量を各々８，４５３および８，５５６（ｍ／ｅ）と決定した。

本発明のカリックスオリゴヌクレオチドのヘアピン構造を立証するために、オリゴ１の熱的変性（thermal denaturation）様相をＵＶ分光器を用いて観察した。図４に示すように、温度に対するλ₂₆₀における吸光度プロットはＳ字形（sigmoidal shape）を示し、中点は二重体のＴｍ値（４０℃）を示す。したがって、オリゴ１が相補的な核酸−塩基（complementary nucleo-bases）（ＡおよびＴ）間の水素結合を通じた二重らせん構造（duplex helix structure）を形成しており、それによりＤＮＡペアピン構造を有することを確認した。本発明のカリックスオリゴヌクレオチドのＣＤスペクトルもまたこれを立証している（図５参照）。前記プロットは２８１ｎｍに中心のある陽性バンドを有し、２４９ｎｍに中心のある陰性バンドを有し、２６０ｎｍ付近でゼロ値を示す。このようなＣＤデータはＢ−形態ＤＮＡ（A. Rodger, et al., Circular Dichroism & Linear Dichroism; Oxford: Oxford University Press, pp. 24-29, 1997）の独特の特性を示し、本発明のカリックスオリゴヌクレオチドがＤＮＡヘアピン構造を有することを示す。

以下、本発明を下記実施例によってさらに詳細に説明する。但し、本発明の内容は下記実施例に限定されない。

実施例１：カリックスヌクレオシドハイブリッドの合成
(段階１)カリックスヌクレオシド３の合成
式７の化合物の量を基準に２．４当量の式６のチミジン誘導体（６５ｍｇ，０．１７６ｍｍｏｌ，Samcheonri Chemical Ltd., D. H. Barton, et al., Tetrahedron Lett. 30:4969, 1989）をＴＢＴＵ（５９ｍｇ，０．１８３ｍｍｏｌ）、ＨＯＢＴ（２６ｍｇ，０．１９４ｍｍｏｌ）、４−メチルモルホリン（２０ｍｇ，０．１８２ｍｍｏｌ）、ＣＨ₂Ｃｌ₂（６ｍｌ）と混合し、室温で３０分間反応させた。活性化されたチミジン誘導体を式７の１，３−ジアミノカリックス［４］アレーン（49mg, 0.079 mmol, Sigma-Aldrich社, D. M. Rudkevich, et al., J. Org. Chem. 59:3683, 1994）と室温で４時間反応させて６９％の収率で式３の同種−結合（homo-coupled）カリックスヌクレオシドを製造した。

(段階２)カリックスヌクレオシド４の合成
式７の化合物の量を基準に２．４当量の式８のチミジン誘導体（652 mg, 1.247 mmol, Samcheonri Chemical Ltd., J. Lebreton, et al., Synlett 137:b, 1994; J. Y. Kim, et al., Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids 19:637, 2000）をＴＢＴＵ（４００ｍｇ，１．２４７ｍｍｏｌ）、ＨＯＢＴ（８４ｍｇ，０．６２４ｍｍｏｌ）、４−メチルモルホリン（１３７μｌ，１．２４７ｍｍｏｌ）、ＣＨ₂Ｃｌ₂（１５ｍｌ）と混合し、室温で３０分間反応させた。活性化されたチミジン誘導体を式７の１，３−ジアミノカリックス［４］アレーン（３１１．４ｍｇ，０．５ｍｍｏｌ）と室温で１時間反応させて４３％の収率で式４の同種結合（homo-coupled）カリックスヌクレオシドを製造した。

（段階３）カリックスヌクレオシド１および２の合成
式７の化合物の量を基準に１．２当量の式６のチミジン誘導体（３４６ｍｇ，０．９３５ｍｍｏｌ）をＴＢＴＵ（４５０ｍｇ，１．４０ｍｍｏｌ）、ＨＯＢＴ（１２６ｍｇ，０．９３５ｍｍｏｌ）、４−メチルモルホリン（５４μｌ，１．４０ｍｍｏｌ）、ＣＨ₂Ｃｌ₂（１５ｍｌ）と混合し、室温で３０分間反応させた。活性化されたチミジン誘導体を１．０当量の式７の１，３−ジアミノカリックス［４］アレーン（６１２ｍｇ，０．９３５ｍｍｏｌ）と１時間反応させて５８％の収率で式５の単一結合（mono-coupled）カリックスヌクレオシドを製造した。式８のチミジン誘導体（１２９ｍｇ，０．２４６ｍｍｏｌ）にＴＢＴＵ（７９ｍｇ，０．２４６ｍｍｏｌ）、ＨＯＢＴ（１７ｍｇ，０．１２３ｍｍｏｌ）、４−メチルモルホリン（２７μｌ，０．２４６ｍｍｏｌ）、ＣＨ₂Ｃｌ₂（１０ｍｌ）を室温で３０分間処理して活性化させた後、前記で合成された式５のカリックスヌクレオシド（１１０ｍｇ，０．１１３ｍｍｏｌ）を添加し、室温で３時間反応させて６４％の収率で式２のカリックスヌクレオシドを製造した。最終的にカリックスヌクレオシド２（１０７．５ｍｇ，０．０７２ｍｍｏｌ）の保護基を室温で１０分間ＴＢＡＦ（７５．２ｍｇ，０．２８８ｍｍｏｌ）およびＴＨＦ（１０ｍｌ）処理によって除去することにより８３％の収率で式１のカリックスヌクレオシドを合成した。

実施例２：カリックスヌクレオシド１〜４の物理学的特性分析
前記実施例１で製造された本発明のカリックスヌクレオシド1〜４の物理学的特性を元素分析（elemental analysis）、質量分析装置（mass spectrometry）、ＩＲ、¹Ｈ−ＮＭＲ、¹³Ｃ−ＮＭＲ、ＵＶ、Ｘ線結晶分析（X-ray crystallography）、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE）および円二色性（circular dichroism, CD）によって以下のように分析した。

カリックスヌクレオシド１
m.p.: > 212.5℃ (decomp);
MS (FAB): m/z: 1127.6 (M+H⁺);
[α]²⁰D=+6.70 (c=0.0094 in CHCl₃);
IR (neat): υ=3309, 3065, 2961, 2931, 2875, 1682, 1465 cm^-1;
¹H NMR (300 MHz, [D₆]Acetone/CDCl₃ 1/1 (v/v)): δ=10.05 (s, 1H), 9.88 (s, 1H), 9.02 (s, 1H), 8.66 (s, 1H), 7.94 (s, 1H), 7.92 (s, 1H), 7.66 (s, 1H), 6.90 (s, 1H), 6.84 (s, 1H), 6.79 (s, 1H), 6.65-6.45 (m, 7H), 6.31 (dd, 1H), 6.01 (dd, 1H), 5.39 (s, 1H), 4.85 (br, 1H), 4.57 (br, 1H), 4.40 (s, 2H), 4.35 (s, 2H), 4.34 (s, 1H), 4.22 (br, 1H), 3.87 (m, 1H), 3.77 (m, 9H), 3.07 (t, J=13.8Hz, 4H), 2.75 (m, 1H), 2.47 (m, 2H), 2.32 (m, 2H), 2.22 (m, 2H), 1.88 (br, 11H), 1.80 (s, 3H), 0.94 (q, J=3.6Hz, 12H);
¹³C NMR (75.5 MHz, [D₆]アセトン/CDCl₃ 1/1 (v/v)): δ=169.9, 168.6, 164.5, 164.2, 156.8, 153.8, 153.5, 151.4, 150.9, 135.6, 135.5, 135.2, 132.5, 132.1, 128.5, 122.4, 120.8, 111.2, 109.7, 88.7, 87.1, 86.7, 85.1, 77.1, 77.0, 75.0, 61.6, 39.5, 38.5, 38.1, 33.9, 31.3, 23.5, 12.6, 10.6, 10.5;
元素分析：C₆₂H₇₄N₆O₁₄, 計算値：C 66.06, H 6.62, N 7.45;
実測値：C 65.75, H 6.97, N 7.73.

カリックスヌクレオシド２
m.p.: 176.4-178.2℃;
MS (FAB): m/z: 1479.3 (M+H⁺);
[α]²³D=+16.8 (c=0.0079 in CH₂Cl₂);
IR(neat): υ=3306, 3066, 2958, 2931, 2958, 1694, 1552, 1468 cm^-1;
¹H NMR (300 MHz, [D₆]アセトン): δ=10.23 (s, 1H), 9.95 (s, 1H), 9.46 (s, 1H), 8.97 (s, 1H), 7.84 (s, 1H), 7.79-7.75 (m, 4H), 7.54 (d, J=1.0Hz, 1H), 7.48-7.37 (m, 8H), 7.28 (d, J=3.6Hz, 2H), 6.40-6.33 (m, 6H), 6.27 (dd, J1=5.3Hz, J2=9.3Hz, 1H), 6.20 (dd, J1=4.9Hz, J2=7.0Hz, 1H), 4.79 (d, J=5.0Hz, 1H), 4.49 (d, J=3.8Hz, 2H), 4.45 (d, J=3.8Hz, 2H), 4.38 (d, J=1.3Hz, 1H), 4.09 (dd, J1=7.7Hz, J2=9.0Hz, 1H), 4.00-3.95 (m, 6H), 3.76 (t, J=7.0Hz, 4H), 3.15 (d, J=8.0Hz, 2H), 3.11 (d, J=6.7Hz, 2H), 3.01 (q, J=7.7Hz, 1H), 2.63-2.48 (m, 2H), 2.42-2.18 (m, 3H), 1.96 (m, 8H), 1.87 (s, 3H), 1.56 (d, J=0.9Hz, 3H), 1.09 (m, 15H), 0.96 (m, 15H), 0.20 (s, 3H), 0.19 (s, 3H);
¹³C NMR(75.5 MHz, [D₆]アセトン): δ=170.0, 168.9, 164.6, 157.0, 155.1, 154.7, 152.4, 151.7, 139.9, 137.6, 137.5, 136.9, 136.8, 136.7, 135.0, 134.9, 134.5, 133.8, 131.2, 129.2, 129.0, 123.3, 121.5, 121.3, 111.8, 111.2, 90.9, 88.7, 86.6, 85.4, 78.1, 78.0, 77.3, 65.8, 40.7, 39.4, 39.0, 36.5, 32.2, 27.9, 26.7, 24.6, 24.3, 20.5, 19.1, 13.0, 12.9, 11.5, 10.9, -4.1, -4.2;
元素分析：C₈₄H₁₀₆N₆O₁₄Si₂, 計算値：C 68.17, H 7.21, N 5.67;
実測値：C 67.79, H 7.53, N 5.85.

カリックスヌクレオシド３
m.p.: 212.3-214.2℃;
MS (FAB): m/z: 1327.3 (M+H⁺);
[α]²⁴D=-9.42 (c=0.0046 in CH₂Cl₂);
IR(neat): υ=3284, 3063, 2957, 2930, 2857, 1682, 1466 cm^-1;
¹H NMR(300 MHz, CDCl₃): δ=9.02 (s, 2H), 8.95 (s, 2H), 7.37 (d, J=2.2Hz, 2H), 7.17 (s, 4H), 6.27 (s, 6H), 6.00 (dd, J1=4.9Hz, J2=9.8Hz, 2H), 4.72 (d, J=4.5Hz, 2H), 4.41 (d, J=4.2Hz, 4H), 4.37 (s, 2H), 3.91 (t, J=7.8Hz, 4H), 3.67 (t, J=6.9Hz, 4H), 3.14 (d, J=4.6Hz, 2H), 3.09 (d, J=4.6Hz, 2H), 2.72 (m, 2H), 2.04 (dd, J1=5.0Hz, J2=12.7Hz, 2H), 1.96-1.80 (m, 14H), 1.04 (t, J=7.3Hz, 6H), 0.92 (s, 18H), 0.88 (t, J=7.5Hz, 6H), 0.18 (s, 6H), 0.15 (s, 6H);
¹³C NMR(75.5 MHz, CDCl₃): δ=167.5, 163.8, 155.6, 154.8, 150.7, 138.9, 137.1, 137.1, 133.5, 133.5, 131.4, 127.8, 122.3, 120.5, 111.9, 110.8, 91.8, 87.8, 77.1, 75.8, 37.4, 31.2, 26.0, 23.6, 23.1, 18.2, 12.6, 10.9, 10.2, -4.5, -4.7;
元素分析：C₇₂H₉₈N₆O₁₄Si₂・3H₂O, 計算値：C 62.58, H 7.58, N 6.08;
実測値：C 62.92, H 7.65, N 5.84.

カリックスヌクレオシド４
m.p.: 222.4-223.7℃;
MS (FAB): m/z: 1630.5 (M⁺);
[α]²⁴D=+9.27 (c=0.0035 in CH₂Cl₂);
IR (neat): υ=3314, 3068, 2960, 2931, 2873, 1688, 1605, 1544, 1468 cm^-1;
¹H NMR(300 MHz, CDCl₃/CD₃OD 15/1 (v/v)): δ=10.5 (br, 2H), 8.46 (br, 2H), 7.59 (s, 2H), 7.41 (s, 2H), 7.34-7.24 (m, 12H), 6.80 (s, 2H), 6.75 (s, 2H), 6.51 (d, J=7.1Hz, 4H), 6.42 (t, J=7.1Hz, 2H), 6.05 (t, J=5.8Hz, 2H), 4.36 (d, J=13.2Hz, 4H), 3.94 (d, J=7.8Hz, 2H), 3.75 (s, 10H), 3.30 (s, 1H), 3.17 (s, 1H), 3.05 (d, J=13.3Hz, 4H), 2.84 (br, 2H), 2.34-2.03 (m, 8H), 1.84 (q, J=7.2Hz, 8H), 1.49 (s, 6H), 1.01 (s, 18H), 0.91 (dd, J1=7.6Hz, J2=16.2Hz, 12H);
¹³C NMR(75.5 MHz, CDCl₃/CD₃OD 15/1 (v/v)): δ=169.2, 164.5, 156.4, 153.7, 150.9, 135.7, 135.7, 135.4, 134.7, 133.3, 132.7, 131.6, 130.1, 130.0, 128.4, 128.1, 128.0, 128.0, 122.1, 120.6, 120.5, 111.2, 85.3, 84.6, 76.9, 64.5, 39.7, 38.2, 35.5, 31.1, 27.0, 23.3, 23.2, 19.5, 12.0, 10.4, 10.3;
元素分析：C₉₆H₁₁₄N₆O₁₄Si₂・2H₂O, 計算値：C 69.12, H 7.13, N 5.04;
実測値：C 69.19, H 7.13, N 4.81.

図１に示すように、Ｘ線結晶構造分析結果から本発明のカリックスヌクレオシドハイブリッドの固体相構造を確認した。

実施例３：ＤＮＡヘアピン構造を有するカリックスオリゴヌクレオチドの合成
（段階１）２−シアノエチルホスホロアミダイト・ビルディング・ブロックの製造
まず、カリックスヌクレオシド１のＤＭＴｒで保護された２−シアノエチルホスホロアミダイト・ビルディング・ブロック（DMTr protected 2-cyanoethyl phosphoroamidite building block）をアグラワルの方法（Agrawal, S. (ed.), Methods in Molecular Biology Protocols foroligonucleotides and analogs; synthesis and properties. Totowa, New Jersey p42, 1993）に従って以下のように製造した。

具体的に、カリックスヌクレオシド１（３２５ｍｇ，０．２８９ｍｍｏｌ）をＤＭＴｒ−Ｃｌ（２２１ｍｇ，０．６５０ｍｍｏｌ）、Ｅｔ₃Ｎ（９１μｌ，０．６５ｍｍｏｌ）、ピリジン１０ｍｌと混合し、室温で６時間反応させてＤＭＴｒで保護されたカリックスヌクレオシド１を得た。ＤＭＴｒで保護されたカリックスヌクレオシド化合物（１２９ｍｇ，０．０９ｍｍｏｌ）をＴＨＦ５ｍｌに溶かした後、これにＤＩＰＥＡ（２２μｌ，０．１４ｍｍｏｌ）を加えた。前記混合物を室温で３０分間攪拌した後、これにクロロ（ジイソプロピルアミノ)−β−シアノエトキシホスフィン（chloro[diisopropylamino]-β-cyanoethoxyphospine, 0.16 mmol）２４．２μｌを添加し、これを１時間反応させてＤＭＴｒで保護された２−シアノエチルホルホロアミダイトビルディングブロックを７４％の収率で製造した。

(段階２)カリックスオリゴヌクレオチドハイブリッドの合成
段階１で製造されたＤＭＴｒで保護された２−シアノエチルホルホロアミダイト・ビルディング・ブロックをパーセプティブ・バイオシステムズ８９０９エクスパダイトTM核酸合成システム（PerSeptive Biosystems 8909 ExpediteTM Nucleic Acid Synthesis System）上で固体相オリゴヌクレオチド合成方法に直接適用した（M. J. Gait, Oligonucleotide Synthesis A Practical Approach. IRL Press, Oxford, Chapter 4, 1984）。ＤＮＡヘアピン構造類似体を製造するために、配列の中間にカリックスヌクレオシド１を含む変形されたＯＤＮを合成した。このようにして合成されたカリックスオリゴヌクレオチドは５’−Ａ₁₂−Ｘ−Ｔ₁₂−３’（配列番号１；Ｘはカリックスヌクレオシド１である。）で記載される配列を有し、以下の構造を有する（図２）。

図３に示すように、ＤＭＴｒ切断結果から前記で合成された本発明のカリックスオリゴヌクレオチドがカリックスヌクレオシドに連続的に付加されたヌクレオチドを有することを確認した。本発明のカリックスオリゴヌクレオチドを２０×２０cm ＰＡＧＥゲルに載せ、２００Ｖで８時間、３００Ｖで２時間連続的に運転した。ゲルを蒸留水７ｍｌに溶解し、３０℃で２００ｒｐｍで１２時間溶出させた。ゲルは漉して除去し、溶出液を蒸留して濃縮させた。これから得られた残滓を蒸留水１ｍｌに溶解し、逆相ＨＰＬＣで精製した（条件：カラムは１０ｍｍ×２５０ｍｍＯＤＳ；ＣＨ₃ＣＮ／０．１Ｍ、ＴＥＡＡ＝９５／５の溶液Ａ；ＣＨ₃ＣＮ／０．１Ｍ，ＴＥＡＡ＝５０／５０の溶液Ｂ；０〜１０、１０〜１０、２０〜１００、２５〜１００、３０〜１０の勾配（溶液Ｂのｍｉｎ％）；３ｍｌ／分の流速；２０〜２４分の保有時間）。精製したカリックスオリゴヌクレオチドの分子量はフライト（fright）質量分析装置（MALDI-TOF MS、基質：3-hydroxypicolic acid, Positive Mode）のマトリックス−補助レーザー脱着／イオン化時間（matrix-assisted laser desorption/ionization time）によって８，５３９（ｍ／ｅ）と決定された。

実施例４：カリックスオリゴヌクレオチドの構造分析
（４−１）熱的変性実験
本発明のカリックスオリゴヌクレオチド（オリゴ１）のヘアピン構造を立証するために、熱的変性（thermal denaturation）実験を行った：カリックスオリゴヌクレオチド（０．３５ＯＤ，１０．５μｇ）を１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝溶液（ｐＨ７．２，［ＮａＣｌ］＝１．０Ｍ）に溶解した後７５℃で５分間加熱し、室温に徐々に冷却した。その後、ＵＶ吸光光度計（UV-2501PC Spectropotometer, Shimazu社）を用いて温度による２６０ｎｍにおける吸光度を測定した。

図４に示すように、温度に対する吸光度をプロッテリングして得た曲線はＳ字形（sigmoidal shape）を示し、中点は二重体のＴｍ値（４０℃）を示した。

（４−２）ＣＤスペクトル分析
ＣＤスペクトル（circular dichroism spectrum）分析をｐＨ７．０、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝溶液、１００ｍＭＮａＣｌ、２０ｍＭＭｇＣｌ₂の条件下で吸光偏光計（Jasco J715 Spectropolarimeter）を用いて行った。

その結果、図５に示すように、これは相補的な核酸−塩基（complementary nucleo-bases）（ＡおよびＴ）の間の水素結合を通じた二重らせん構造（duplex helix structure）の形成およびカリックスオリゴヌクレオチドのＤＮＡヘアピン構造に対する強力な証拠である。さらに、カリックスオリゴヌクレオチドのＣＤスペクトルは２８１ｎｍに中心のある陽性バンドを有し、２４９ｎｍに中心のある陰性バンドを有し、２６０ｎｍ付近でゼロ値を示した。これらの結果はＢ−形態ＤＮＡ（A. Rodger, et al., Circular Dichroism & Linear Dichroism; Oxford: Oxford University Press, pp. 24-29, 1997）の独特の特性を示すものであり、本発明のカリックスオリゴヌクレオチドが実際にＤＮＡヘアピン構造を有することを立証するものである。

図１は、本発明のカリックス［４］アレーン−ヌクレオシド４のＸ線結晶構造分析結果（Chem SD）である。図２は、５’−Ａ₁₂−Ｘ−Ｔ₁₂−３’（Ｘはカリックス［４］アレーン−ヌクレオシド１を意味する）の配列を有する本発明のカリックス［４］アレーン−オリゴヌクレオチドの構造である。図３は、本発明のカリックス［４］アレーン−オリゴヌクレオチドのＤＭＴｒ切断分析結果である。図４は、本発明のカリックス［４］アレーン−オリゴヌクレオチドの熱的変性カーブである。図５は、本発明のカリックス［４］アレーン−オリゴヌクレオチドのＣＤスペクトル分析結果である。

Claims

一つまたはそれ以上のアミノ基で置換されたカリックス［４］アレーンにアミド結合を通じて結合された少なくとも一つ以上のヌクレオシドを有するカリックス［４］アレーン−ヌクレオシドハイブリッド。
前記ヌクレオシドがチミジンであり、カリックス［４］アレーンが二つのアミノ基を有することを特徴とする請求項１記載のカリックス［４］アレーン−ヌクレオシドハイブリッド。
下記式１〜４の化合物からなる群から選ばれることを特徴とする請求項１記載のカリックス［４］アレーン−ヌクレオシドハイブリッド。
請求項１のカリックス［４］アレーン−ヌクレオシドハイブリッドのヌクレオシド残基に各々結合された一つまたはそれ以上のヌクレオチド配列を有するカリックス［４］アレーンオリゴヌクレオチドハイブリッド。
５’−Ａ₁₂−Ｘ−Ｔ₁₂−３’（配列番号１；Ｘは下記式１のカリックス［４］アレーン−ヌクレオシドハイブリッドである。）で記載される配列を有する請求項４記載のカリックス［４］アレーン−オリゴヌクレオチドハイブリッド。
下記構造式１で表されるＤＮＡヘアピン構造を有することを特徴とする請求項５記載のカリックス［４］アレーン−オリゴヌクレオチドハイブリッド。
５’−Ｔ₁₂−Ｘ−Ｔ₁₂−３’（配列番号２；Ｘは下記式１のカリックス［４］アレーン−ヌクレオシドハイブリッドである。）で記載される配列を有する請求項４記載のカリックス［４］アレーン−オリゴヌクレオチドハイブリッド。
下記構造式２で表されるＤＮＡヘアピン構造を有することを特徴とする請求項７記載のカリックス［４］アレーン−オリゴヌクレオチドハイブリッド。
５’−ＡＡＡＡＧＡＴＡＴＣＡＡ−Ｘ−ＴＴＧＡＣＡＴＣＴＴＴＴ−３’（配列番号３；Ｘは下記式１のカリックス［４］アレーン−ヌクレオシドハイブリッドである。）で記載される配列を有する請求項４記載のカリックス［４］アレーン−オリゴヌクレオチドハイブリッド。
下記構造式３で表されるＤＮＡヘアピン構造を有することを特徴とする請求項９記載のカリックス［４］アレーン−オリゴヌクレオチドハイブリッド。
カリックス［４］アレーンのアミン基とヌクレオシドのカルボン酸基の間にアミド結合を形成する段階を含む、請求項１記載のカリックス［４］アレーン−ヌクレオシドハイブリッドの製造方法。
前記ヌクレオシドがチミジンであり、チミジン誘導体の５’−酸または３’−酸基がカップリング試薬（coupling reagents）によって活性化され、１，３−ジアミノカリックス［４］アレーン（1,3-diaminocalix[4]arene）と反応することを特徴とする請求項１１記載の製造方法。
カリックス［４］アレーン−ヌクレオシド誘導体のＴＢＤＭＳＳおよび／またはＴＢＤＰＳ保護基をテトラブチルアンモニウムフルオリド（tetrabutylammonium fluoride）処理によって除去する段階をさらに含むことを特徴とする請求項１１記載の製造方法。
前記ペプチドカップリング試薬が（ＣＯＣｌ）₂、ＥＤＣ、ＴＢＣおよびＴＢＴＵからなる群から選ばれることを特徴とする請求項１２記載の製造方法。
式１のカリックス［４］アレーン−ヌクレオシドのＤＭＴｒで保護された２−シアノエチルホスホロアミダイト・ビルディング・ブロック（DMTr protected 2-cyanoethyl phosphoroamidite building block）を製造した後、これを固体相オリゴヌクレオチド合成方法に適用する段階を含む、請求項４のカリックス［４］アレーン−オリゴヌクレオチドハイブリッドの製造方法。