JP4040110B2 - 膜ベースでの検定のための分析装置 - Google Patents

Description

〔発明の背景〕
本発明の技術分野は、結合性の標的物質（即ち、検体）を含む可能性のある液体サンプル中において、該物質の存在を測定するために使用する分析装置に関する。この目的のために、種々の構成からなる多くの分析装置が使用されてきた。これら装置の多くは、標的物質に特異的に結合できるレセプター（受容体）を固定化した反応膜を用いる。この種の装置を用いる検定においては、典型的には、該反応膜に被検サンプルが塗布される。サンプル中に標的物質が存在すれば、それは固定化されたレセプターに結合するであろう。種々の方法を使用して標的物質がレセプターに結合したかどうかを決定し、サンプル中におけるその存在を示すために、種々の方法が使用される。通常使用される一つの方法は、標的物質に特異的に結合でき且つ検出可能なラベルを結合した抗体を、前記膜に塗布することである。
膜ベースの免疫検定および装置は、極めて単純化された医療診断用途を有している。以前は、固層酵素免疫検定（ELISA）が最も普通のタイプの診断検査であった。これらの検査は、通常は、臨床検査ラボの熟練した技術者によって行われていた。典型的なＥＬＩＳＡでは、比較的長いインキュベーション時間が必要とされる。従って、検査を行うために通常は１時間以上を要していた。更に、ElLISAは、サンプルをバッチで検査するために設計されている。従って、一般に、検査のために十分な数のサンプルが得られるまで、サンプルは検査されない。その結果、患者はサンプルを提供した後、数日を経るまで検査結果を受け取ることができない。膜ベースの免疫検定は、個別的またはバッチで実施できる利点を有している。従って、膜ベースの免疫検定は臨床検査ラボではなく、医院で行うことができる。個別的な検査を行うことができ、通常は１０分で結果が得られる。検査結果を読み取るように設計された特別の器具によって、定量的な結果を提供することもできる。
サンプルが反応膜を通して濃縮されれば、反応-膜タイプの免疫検定における感度（即ち、非常に低レベルの標的物質を検出する能力）を増大することができる。幾つかの装置では、サンプルを引き寄せる吸収材を反応膜の下に有することにより、サンプルは膜の頂部に添加されて前記吸収材へと通過し、その際に反応膜を通してサンプルの濃縮が行われる。吸収材を利用してサンプルを濃縮する膜ベースの免疫検定は、Chu等に付与された米国特許第5,006,464号、Hay-Kaufman等に付与された米国特許第4,818,677号、Valkirs等に付与された米国特許第4,632,901号、およびVonk等に付与された米国特許第5,185,127号に例示されている。
上記の夫々の特許に記載された分析装置の膜および吸収性材料は、頂部部材および底部部材からなるプラスチックハウジング内に収容されており、これらの部材は、前記膜および吸収材をその場所に保持するように、圧縮状態で結合され且つ相互に接触している。十分な圧縮力を使用することは、前記膜を通してのサンプルの流下を容易にする。不充分な圧縮力が存在すると、サンプルは膜を横切って横方向に流れ易く、従って、反応膜の中央部（通常はレセプターが配置される）を通して流れるサンプル量を減少させる。これらタイプの分析装置は、典型的には個別的に組み立てられ、そのことが製造プロセスを複雑且つ高価にする可能性がある。
膜ベースの免疫検定及びその分析装置並びに該分析装置の製造プロセスを更に単純化して、使用を容易にし、容易に入手可能にすることの継続的な要求が存在する。このことは、簡単で、迅速で、感度がよく、特異性があり、保存安定性があり、経済的である診断検査および分析装置が理想とされている開発途上国では特にそうである。
〔発明の概要〕
本発明は、結合性の標的物質を潜在的に含有する液体サンプル中の標的物質を検出するための、免疫検定のような分析検査に用いることができる分析装置を提供する。その最も単純な実施例において、当該分析装置は、開口の周囲のリムを形成する液体不透過性の頂部支持層を具備する。該頂部支持層に隣接して、上面およ下面を有する多孔性の反応膜が存在し、前記反応膜の上面および前記リムがサンプルを受ける凹所を形成する。前記反応膜の上面は、水不溶性の接着剤によって前記頂部支持層の下面に対してシールされ、両者の間には液体不透過性のシールが形成される。前記反応膜の下面に隣接し、且つこれと液体流通する吸収体が配置される。
本発明の分析装置は、更に、前記吸収体の下面に取り付けられた液体不透過性の底部支持層を具備する。
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明による分析装置の分解斜視図であり、該装置の部品の配置を示している。
図２は、本発明による分析装置の頂面図である。
図３は、面３−３に沿った図２の分析装置の複数の層の断面図である。
図４〜図１１は、頂部支持層および反応膜の種々の構成を示す図である。
〔発明の詳細な説明〕
本発明は、結合性の標的物質を含有する可能性の或る液体サンプル中の標的物質を検出するための、単純で製造の容易な分析装置を提供する。水不溶性接着剤を使用して、前記標的物質に結合できるレセプターを表面に有する反応膜および吸収体を、前記水不溶性の頂部支持層に接着する。この水不溶性接着剤の使用は、前記装置を構造的に保持する目的で作用するだけでなく、液体サンプルが前記膜表面を横切って横方向に流れるのを防止する液体不透過性シールを形成し、これにより、前記サンプルは前記膜を貫通して前記吸収材料へと流される。また、前記膜と前記液体不透過性頂部支持層との間のこの種のシールは、前記膜を通して横方向に流れるサンプルの流速を遅くすることにより、標的物質とレセプターとの間の反応時間を増大させて感度の増大をもたらす。
従来技術の分析装置は、圧縮下で結合される適合した上部および下部ハウジングを具備することが多く、これにより前記膜を前記開口と吸収体材料との間に保持する。このタイプの分析装置の例は、米国特許第4,632,901号および米国特許第5,185,127号に与えられている。このような適合したハウジング部材は本発明の実施にも使用できるが、水不溶性接着剤を使用して液体不透過性のシールドを形成することは、適合したハウジング部材の使用を不要にする。もう一つのタイプの分析装置では、適合したハウジング部材は使用しないが、頂部支持層および底部支持層をヒートシールして、開口と吸収体材料との間に反応膜を保持するための十分な圧縮を生じさせる。このタイプの装置の一例は、米国特許第4,818,677号に示されている。このタイプの装置も、本発明を実施するために同様に使用することはできるが、水不溶性接着剤を使用することにより、これを使用することは不要になる。
開口と吸収体材料との間に反応膜を保持するために圧縮を使用しないことの一つの利点は、反応膜の上面が、分析装置を組み立てた後にも比較的平坦なまま残ることである。従って、使用に際し、サンプルを反応膜に適用したときに、該サンプルは、反応膜の全露出表面をより均一に覆い易い。従って、膜に固定された２以上のレセプター領域があれば、略同じ容積のサンプルが夫々のレセプターエリアを通過するであろう。これとは対照的に、開口のリムと反応膜との間に液体不透過性シールを形成するために圧縮を使用することは、反応膜の上面を僅かに凹面、即ちドーム形状にする可能性がある。従って、サンプルを反応膜に加えたときに、それは反応膜の全表面を均一に覆わないかもしれない。これにより、当該装置は、定量的結果を必要とする幾つかの免疫検定にはあまり適さないものなる。
本発明の分析装置は構成が単純で、容易に入手可能な材料を使用して作製することができる。図１を参照すると、分析装置は、開口の周囲のリム（12）を形成する液体不透過性の頂部支持層（10）を具備している。当該装置が組み立てられた後に、反応膜の露出された上面（14）および開口（11）の周囲のリム（12）によってサンプル収容凹所が形成されるように、多孔性の反応膜（13）が頂部支持層の下に配置される。吸収体（15）が、反応膜の下に配置される。当該装置は更に、前記吸収体の下面に接触した上面を備えた液体不透過性の底部支持層（16）を具備する。
頂部支持層（10）は、金属、プラスチックまたはセラミックのような何れの水不溶性材料からも形成することができる。水不溶性にした紙（例えば油紙）も使用できる。可撓性のプラスチックは安価で取り扱い易く、また反応膜（13）および吸収体のための十分な支持を与えるので特に有用である。加えて、可撓性のプラスチックは容易に切断または穿孔して開口（11）を形成できる。適切なプラスチックには、ナイロン、マイラー、アクリルシート、ポリエステルシート、ポリビニルシート等が含まれる。
本発明の最も単純な実施例では、図１、図２、図４ａおよび図５ａに示すように、頂部支持層（10）に一つの円形開口（11）が切除されるが、この開口（11）は適切な他の如何なる形状であってもよい。また、一つの頂部支持層（10）は、複数のサンプル収容凹所を形成するように、２以上の開口（11）を有していてもよい。これにより、一つの分析装置を使用して、一つのサンプル及び／又は複数のサンプル中の複数の検体を検査することが可能になる。従って、開口（11）の形状は、当該分析装置の使用目的に応じて変化させればよいことが理解されるであろう。
多孔性反応膜（13）は、開口（11）を取り囲むリムおよび該反応膜（13）の上面がサンプル収容凹所を形成するように、頂部支持層（10）の下面に対してシールされる。従って、組み立て後の分析装置の一実施例を示す図２を参照すると、反応膜（13）の上面（14）が露出されているので、分析検査を行うときには、検査すべきサンプルおよび検査試薬を直接反応膜に加えることができる。この反応膜（13）は、開口（11）を完全に覆うような大きさである。好ましくは、該反応膜（13）は開口（11）と同じ形状で、該開口（11）の周縁で前記頂部支持体（10）の下面にシールされ得るように、該開口（11）よりも僅かだけ大きいサイズであろう。しかし、反応膜（13）の形状および開口（11）の形状は、図４および図６〜８に示すように異なることができる。
図４〜図１１は、頂部支持層（10）の開口（11）および反応膜（13）の上面（14）の、幾つかの限定された可能な形状を示している。最も単純な実施例では、図４ａおよび図４ｃを参照すると、頂部支持層（10）は円形の開口（11）を有し、反応膜もまた円形である。しかし、図４ｃに示すように、反応膜は開口（11）と同じ形状である必要はない。反応膜（13）の中央の大きい方のドット（22）は、レセプターが固相化される位置を示しており、また、小さい方のドット（23）は対照物質が位置する場所を示している。レセプター領域および対照領域の相対的な形状および大きさは、それらが相互に区別できる限り重要ではない。異なる大きさのレセプタードットおよび対照ドットを使用するのではなく、頂部支持層（10）表面の位置マーカによってこれを行うことも。幾つかの状況においては、反応膜（13）上に対照ドットを有することは必要でないかもしれない。従って、反応膜（13）の全露出表面にレセプターを固相化するのが便利な場合がある。これは、図４ｄに示されており、ここでは内側の円が反応膜（13）の上面における露出部分を表し、内側円の外側の影を付していない領域は、頂部支持層（10）の下面に接着される反応膜（13）の非露出部分を表す。
レセプター及び／又は対照物質を固相化するためのドットは、レセプター及び／又は対照の試薬の液滴を膜表面に加えるだけで形成できるので最も単純な形態であるが、他の形態を使用することもできる。例えば、米国特許第4,916,056号では、レセプターはバーを形成し、陰性対照はレセプターバーに交差するバーを形成しているので、免疫検定が行われた後のマイナス記号は検査サンプル中おける標的物質の不存在を示し、プラス記号はサンプル中における標的物質の存在を示す。図１１ｂは、平行なバーの形状に固相化された複数のレセプターを有するサンプル膜を示している。
上記で述べた通り、図８、図９および図１０に示すように、複数のサンプル収容凹所を形成すれば、同じサンプルの一部を各サンプル収容凹所の中に接種し、夫々の標的物質について別々に検定を行うことにより、一つのサンプルを２以上の標的物質について検定することができる。或いは、２以上のサンプル収容凹所を持った一つの分析装置を使用して、異なったサンプル中における同じ標的物質の存在を検査することができる。図８ｂ、図９ｂおよび図１０ｂに示すように、各開口の下に別々の膜を配置することができる。或いは、図８ｃに示すように、複数のレセプター領域および対照領域をもった一つの反応膜を使用することができる。
幾つかの免疫検定では、１回の検査を行って、一つのサンプル中に存在する複数の検体を試験することができるので、一つのサンプル収容凹所しか必要としない。図５、図６および図１１は、このタイプの免疫検定に使用できる分析装置の実施例を示している。
サンプル収容凹所の容量を増大し、またはサンプルのこぼれを減少するために、サンプル収容凹所のリムの高さを大きくすることができる。これは、頂部支持層（10）を肉厚にすることによって、または図２および図３に示すように、頂部支持層（10）の上面に受け部形成部材（17）を取りつけることによって簡単に行うことができる。この受け部形成部材（17）は、水不溶性の如何なる材料で形成してもよく、頂部支持層（10）の形成に使用した材料と同じであっても異なっていてもよい。それは、頂部支持層（10）の開口（11）と同じ直径および形状の開口を有している。図３を参照すると、この受け部形成部材（17）の開口と頂部支持層（10）の開口が一致して、サンプル収容凹所リム（18）を形成している。
反応膜のために、分析検査に用いられるレセプター試薬を固相化できる如何なる適切な多孔質材料も使用することができる。適切な材料には、ニトロセルロース、ガラス繊維、ポリエステル、硝酸セルロース、ポリエステル、ポリカーボン、ナイロン、および選択されたレセプターに直接または間接的に結合し得る他の天然材料および合成材料が含まれる。通常、この膜はレセプター分子を結合させるために正及び／又は負の電荷を有している。或る膜材料は、ニトロ基の寄与による部分的な負電荷を有する硝酸セルロースのように帯電している。他の材料では、帯電した膜を与えるように前処理してもよい。例えば、ポリエステルは、負または正に帯電した膜を与えるように、カルボキシ基またはアミノ基を誘導することができる。ナイロンは、酸で処理してペプチド結合を開裂させ、正電荷（アミン基に由来する）および負電荷（カルボキシ基に由来する）を与えることができる。
「反応膜」の用語は、分析検査に用いるレセプター試薬が結合される多孔質材料、並びに該反応膜の下面を形成する追加の多孔質材料（存在するならば）を含むことを意図したものである。例えば、好ましい反応膜は、多孔質紙で裏打ちされたニトロセルロースのシートを具備する。また、商業的に入手可能な、多孔質ポリエステルに支持されたニトロセルロースを使用することもできる。紙で裏打ちしたニトロセルロースの代表例は、EYラボラトリーズ社（カリフォルニア州サンマルコ;カタログ番号PNBC15-1、PBNC15-10、PBNC15M-1、PBNC15M-10）から販売されている。この好ましい膜は、ニトロセルロース単独のものよりも実質的に耐久性であり、他の如何なる支持部材も伴わずに用いることができる。これにより、取り扱いおよび装置の組み立てをより容易にすることが可能になる。加えて、紙で裏打ちされたニトロセルロースを反応膜に用いた分析装置は、一定の免疫検定において高い感度を有することが分かった。
当該膜の多孔性は、液体の流速および検定の感度に対して大きな影響を有する。孔サイズが大きいほど、所定の液体の流速は速くなる。流速が増大するにつれて、サンプル中の標的分子と反応膜上に固相化されたレセプターとの間の相互作用に利用可能な時間が減少し、従って検定感度は低下する。加えて、大きな孔サイズはレセプターを固相化するための表面積を小さくするが、これは検定感度の低下に寄与するもう一つのパラメータである。殆どの検定について、前記膜の多孔性は、好ましくは約0.1〜約12ミクロンであり、より好ましくは約0.45〜3ミクロンである。
前記膜の吸い上げ力は検定感度に影響する可能性があり、これは膜材料の厚さおよび性質に依存する。吸い上げ力は、単位時間当たり、標準液の或る距離の移動として測定することができる。多くの場合、比較的低い吸い上げ力を有する膜を選ぶことにより、検定感度を増大させることができる。
図３を参照すると、露出していない反応膜の上面が、水不溶性接着剤（19）を用いて頂部支持層（10）の下面にシールされ、開口（11）周囲の頂部支持層のリム（12）と反応膜（13）の非露出上面（14）との間で液体不透過性シールを形成する。「液体不透過性」の用語は、サンプルおよび後続の試薬をサンプル収容凹所に添加したときに、液体が、反応膜（13）を横切って該膜（13）の非露出表面へと横方向に流れるのではなく、反応膜（13）を貫通して下の吸収体へと流れ易いことを意味する。こうして、この液体不透過性シールは、当該膜（13）を横切る横方向のサンプルの流れを最小限にする。従って、当該膜（13）を貫通させてサンプルを吸収体へと強制的に下向きに流すために、前記膜（13）と吸収体との間に圧縮力を利用する必要性は回避される。分析装置が組み立てられた後、サンプルの下方への流れは、反応膜（13）の中心（レセプターが典型的に固相化されている）を通してサンプルを濃縮するのを補助する。また、こよりによって膜（13）を通過する流速が遅延され、標的物質（サンプル中に存在すれば）がレセプターと接触する時間が増大する。これは、当該分析装置を用いる免疫検定の感度の増大を提供する。
現在知られているものであっても、また後日発見されるものであっても、サンプル収容凹所のリムと反応膜上面の非露出周縁部との間に液体不透過性シールを形成できる限り、如何なる水不溶性接着剤も本発明に使用することができる。取り扱いの容易さの理由から、感圧接着剤が好ましい。表面にコーティングされた感圧接着剤は、永久的な接着性膜表面を形成することができ、これは僅かな圧力下で、他の種々の表面に対して室温で直ちに接着する。家庭用のマスキングテープおよびScotch^TMバンド透明テープは、感圧接着剤で製造される製品の例である。適切な水不溶性感圧接着剤の例には、ポリアクリル酸もしくはポリビニル誘導体、天然もしくは合成ゴム、およびポリシロキサンに基づくものが含まれる。異なる接着剤は費用が異なり、安価な接着剤の方が好ましいこと以外、使用される感圧接着剤の具体的な種類は重要ではない。家庭用マスキングテープまたは外科用テープのような片面接着は、本発明の実施に使用することができる。このテープの非接着面は、頂部支持層の上面を形成し、反応膜は接着面に接着される。片面にコートされた感圧接着剤を有する透明プラスチックのシートもまた使用することができる。
吸収体（15）は、反応膜（13）と液体流通するように、反応膜（13）の下面に隣接して配置される。従って、吸収体（15）の上面は反応膜（13）の下面に直接隣接していてもよい。或いは、中間層が反応膜（13）から吸収体（15）への液体の輸送を可能にするのであれば、反応膜（13）と吸収体（15）との間に中間層が存在してもよい。中間層一例として、反応膜（13）と吸収体（15）との間に多孔質材料を挿入して、反応膜に追加の支持を与えることができる。中間層のもう一つの例として、サンプルを更に反応膜の中心を通すように、開口部を有する液体不透過性の隔膜を使用することができる。このような隔膜は、米国特許第5,006,464号に記載されている。容易な製造および費用の低減が望まれる場合の本発明の実施例では、吸収体の上面は、典型的には反応膜の下面に直接隣接する。
例えば、毛管作用により、多孔性膜を通して液体を引っ張りまたは吸い上げができる従来使用されている何れかの吸収材料を、本発明において用いることができる。有用な公知の材料には、酢酸セルロース繊維、ポリエステル、ポリオレフィン、または他のこのような材料が含まれる。市販の濾紙、または浴室ティッシュもまた使用することができる。当該吸収体は、均一な「吸引」を与えて、サンプルを凹所から反応膜を通して吸収体の中へと流下させることにより、サンプルを集める手段を提供する。従って、吸収体は、サンプルおよび検定を行うときに使用される種々の試薬を保持する貯留器としても作用する。従って、比較的大容量の液体が使用される検定に使用するときは、サンプルおよび試薬が吸収体から反応膜へ逆流する可能性を防止し、またはこれを最小限にするように、該吸収体は高い吸収容量を有するべきである。
反応膜と共に、吸収体の吸い上げ力は重要なパラメータであり得る。吸い上げ時間は、水が吸収紙を通って所定距離（7.5cm）だけ移動するのに要する時間で定義され、紙の基礎重量（坪量）厚さおよび組成に関係している。吸い上げ力は、一つの材料と別の材料とでは大きく異なり得る。従って、当該分析装置の特性ならびにサンプルおよび試薬の流速は、吸収体材料を変えることによって修飾することができる。
吸収体の上面が頂部支持層（10）の下面に結合できるように、吸収体の上面の表面積は、通常は反応膜の表面積よりも大きい。反応膜を頂部支持層（10）に接着するために使用される典型的には同じ水不溶性接着剤が、吸収体を頂部支持層に接着するためにも使用される。この水不溶性接着剤は、吸収体および反応膜上への最小限の圧縮力で構造体を一緒に保持し、従って、既述した圧縮力の影響を回避する。
反応膜を再度参照すると、その多孔性に加えて、その直径および厚さが検定感度に影響し得る。好ましくは、反応膜は頂部支持層（10）の開口（11）よりも僅かだけ大きい表面を有するので、反応膜の非露出表面は8mm未満、好ましくは3mm未満の平均直径を有する。ここで図３を参照すると、非露出領域の直径は、反応膜の露出表面から反応膜の側壁（20）までの距離である。
反応膜の厚さ（即ち、反応膜の上面と下面との間の距離である側壁（20））は、所定の免疫検定に必要な流れ特性に応じて変化させることができる。典型的には、この厚さは約0.05mm〜3.0mmの範囲であり、より普通には約0.1〜約1.0mmであろう。幾つかの免疫検定では、反応膜の厚さが約0.1mm超、好ましくは約0.2mm〜約1.0mmの範囲であるときに、より高い感度を得ることができる。十分な厚さの反応膜を使用すると、頂部支持層（10）の下面、反応膜の側壁、および吸収体の上面によってエアポケット（21）が形成される。反応膜の側壁の直ぐ隣には、添加されたサンプルを膜の中心から引き離す吸収体材料が存在しないので、高い感度が達成されると思われる。従って、エアポケットは、添加されたサンプルが反応膜を下に流れるのを更に容易にする。加えて、より厚い反応膜は、より多くのレセプターを標的物質への結合に利用可能にすることにより、更なる検定感度の増大を提供する。比較的薄い反応膜、例えば、紙で裏打ちされていない0.1mm未満のニトロセルロース膜を有する従来技術の装置は、サンプルを反応膜の中央を通して下方に流すのではなく、反応膜を横切って横方向に流し易い。圧縮下で一緒に保持され、且つ反応膜が下地の吸収体よりも小さい表面積を有する装置では特にそうでる。この場合には、感度を増大するエアポケットが達成されず、吸収材料が反応膜の側壁に接触するので、反応膜を横方向に横切って吸収体材料の中へ流れるサンプルの流れが促進される。
本発明の分析装置は、更に、吸収体の下面に結合された液体不透過性の底部支持層（16）を具備してもよい。この底部支持層は、典型的には頂部支持層と同じ材料で構成されるが、異なっていてもよい。既に述べたように、典型的な従来技術の装置は頂部ハウジング部材および底部ハウジング部材を具備し、これらは、反応膜および吸収体を適切な位置に保持するように圧縮力を使用して嵌合される。本発明の分析装置の反応膜および吸収体は、水不溶性接着剤を使用して頂部支持層に接着されるので、これらを保持するために圧縮を利用する必要はない。従って、嵌合またはシールされた頂部ハウジング部材および底部ハウジング部材を使用する必要はないが、もし望むならば、シールまたは嵌合されたハウジング部材は、本発明の分析装置の頂部および底部支持層として働くことができる。本発明の一実施例において、頂部支持層（10）および底部支持層（16）は一緒に嵌合されず、また相互に接触することもなく、夫々の側部は「開放」されており、吸収体（15）の側部が見える。これは図２に示されており、吸収体（15）は分析装置の側方から肉眼で見ることができる。
当該分析装置の設計は従来技術の装置に比較して比較的単純なので、材料のコストは低く、且つ製造法が容易である。複数の分析装置を同時に製造することができる。例えば、可撓性のプラスチックを使用して頂部支持層を形成するときは、所望の数の装置を形成するのに十分に長いプラスチックのストリップを得ることができる。例えば、５個の支持層を形成するのに十分に長いストリップを得ることができる。次に、このプラスチックに５個の均等に離間した孔が穿設される。既に下面に水不溶性接着剤を有する頂部支持層を購入してもよく、或いは製造プロセス中に接着剤を塗布してもよい。接着剤は、頂部支持層の下面の全体に塗布するのが最も便利であろう。或いは、頂部支持層の開口の周囲、および頂部支持層下面の周縁部の回りに接着剤を塗布し、反応膜および吸収体をこれに接着することができる。
この例の説明を続けると、５個の予め切断された反応膜が、開口を覆って配置される。次いで、吸収性材料のストリップを頂部支持層の露出された下面に接着して、吸収体を形成する。最後に、底部支持層が使用されるときは、底部支持層の形成に使用する材料を、好ましくは水不溶性接着剤を用いて吸収体の下面に接着することになる。最後に、組み立てられたストリップを切断して、５個の分析装置を形成する。
上記製造方の変形として、底部支持層を形成するために使用する材料は、その上に塗布された接着剤を有することができるであろう。次に、吸収体を形成する材料を結合する。別のストリップを製造する。頂部支持層および反応膜を構成する別のストリップを調製する。頂部支持層のための材料は、予め穿設された開口のための孔と、上部支持層材料の下面に塗布された水不溶性接着剤を有している。次いで、開口を覆って反応膜を配置し、接着剤によって頂部支持材料の下面に接着する。吸収材料および底部支持層材料のストリップは、次いで、頂部支持層／反応膜ストリップの下面に結合される。次いで、組み立てられたラミネートを個々の分析装置に切断する。当業者は、当該装置を組み立てることができる多くの異なった方法が存在し得ることを理解するであろう。例えば、ストリップを使用して一列の分析装置を同時に組み立てるのではなく、大きな四辺形の材料を使用して、分析装置を行列状に同時に製造し、その後に個々の装置に切断することができるであろう。
分析装置の単純な設計は、図１２に示すように、組み立てのためのロールを使用することを可能にする。片面に感圧接着剤コーティングされ、且つ予め穿設された孔（サンプル収容凹所用）を有する可撓性の頂部支持層を形成する材料が、一つのロール（101）上にある。次のロール（102）は、予め適切な幅に切断された反応膜のための材料を含んでいる。第三のロール（103）は、吸収体を形成する材料のためのものである。また、第四のロール（104）は、底部支持層を形成する材料のためのものであり、この材料もまた、片面にコーティングされた感圧接着剤を有している。これら種々の部品が、ローラプレス（105）を使用して一緒に組み立てられる。四つの部品が一緒に接合された後、頂部支持層には、ラベル付け装置またはバーコード装置（106）を用いて、当該装置が使用されるべき検査の種類を指示したラベルが施される。接種器（107）は、組み立てられた分析装置の反応膜に適切なレセプターを接種することができる。最後に、切断装置（108）は、個々の分析装置を切り出すことができる。組み立ての最中または切断の後に、図１２には示されていない他の変形または処理を、当該分析装置に生じさせてもよい。例えば、分析装置の反応膜をブロッキング工程のような更なる処理に付してもよい。最後に、種々の品質管理手順が行われた後、使用されるまで当該装置を包装する。
免疫検定の場合、前記レセプターは、尿、血液または唾液のような生物学的サンプル中の標的物質に対して特異的に結合することができる。当業者は、「特異的結合」の用語が、抗原とこれに向けられた抗体のように、共に適合した物質を一緒に結合することを意味することを理解するであろう。また、この点に関する「レセプター」の用語は、液体中に存在し得る標的物質に対して特異的に結合できる、単一の分子を言うことが理解されるであろう。しかし、この用語はまた、前記標的物質の検出を達成するために必要な、十分な数または濃度のレセプター分子を意味し得るものである。標的分子が特定の抗体であるとき、レセプターは該抗体に対して特異的な抗原であろう。従って、ここで使用する「抗原」の用語は、免疫応答を誘導できる何れかの物質を言い、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）抗原、肝炎ウイルス抗原（HCV、HBV、HAV）、トキソプラズモシス・ゴンディ（Toxoplasmosis gondii）、サイトメガロウイルス、ヘリコバクター・ピロリ、風疹などが含まれるが、これらに限定されるものではない。幾つかの場合、標的物質は抗原であり、レセプターは該抗原に特異的に結合する抗体であろう。レセプターは反応膜に直接適用することができ、またその上に固相化することもでき、またはラテックスビーズのような微粒子上にコーティングした後、これを反応膜にトラップさせることができる。反応膜にレセプターを適用するための適切な方法は、当該技術において周知である。
レセプターに加えて、露出された反応膜の画定された領域は対照分子をも含む。例えば、プロテインＡは、免疫検定が適切に行われたかどうかを決定するための適切な対照として使用することができる。対照としてのプロテインＡの使用は、米国特許第5,541,059号に開示されている。他の適切な対照は当該技術において周知である。
上記で述べたように、レセプターおよび対象（使用されるときのみ）は、典型的には、露出された膜表面の限定された領域にのみ適用される。このレセプターは反応膜の中央に接種されるので、反応膜の露出表面の周縁部には、そこに結合されたレセプター分子は存在しない。しかし、幾つかの状況においては、反応膜の全露出表面をレセプターで覆うのが適切であるかもしれない。レセプターが露出した膜表面の限定された領域に接種されるときは、反応膜は、サンプルの標的物質および他の成分が非特異的に反応膜に結合するのを防止するブロック組成物で処理することができる。非特異的結合が問題にならない検査については、ブロッキング工程は不要であろう。また良好な品質の紙で裏打ちされたニトロセルロースを使用すれば、幾つかの検定においてブロッキング工程は不要になる。ブロッキング工程が必要であるとき、普通のブロッキング組成物は、典型的には化学品カタログ（例えば、ペンシルベニア州フィラデルフィアのVWRサイエンティフィックInc社）に開示されているような、ウシ血清アルブミン（BSA）及び／又はタンパク質可溶化洗浄剤を含む。BSAは、通常は約1〜10％の量で使用され、洗浄剤は、通常は約0.1〜約5％の量で使用される。適切な洗浄剤には、ポリオキシエチレンソルビタン誘導体およびポリオキシエチレンエーテルが含まれる。適切なポリオキシエチレンソルビタン誘導体は、ポリオキシエチレン（20）ソルビタンモノラウレート（ICIアメリカ社からTWEEN 20として販売されている）である。適切なポリオキシエチレンエーテルには、ローム＆ハース社がTRIRONの商標で販売しているもの、例えばTRITON X-100が含まれる。
膜ブロッキング処理は、典型的には分析装置が既に組み立てられ、且つレセプターが反応膜に固定化された後に行われる。反応膜の露出表面を覆うのに十分な量のブロッキング組成物が、反応凹所に適用される。反応凹所の直径が１cmであれば、約50μlのブロッキング組成物で十分である。ブロッキング組成物が乾燥した後、分析装置は使用できる状態にある。この分析装置は、使用するまで包装しておくことができる。
本発明の分析装置を使用する免疫検定は、非常に簡単かつ迅速であることができ、また定性的もしくは定量的であり得る。これら分析装置を用いて、当該技術で公知の多くの異なった種類の免疫検定を行うことができる。当該分析装置は、多くの異なる種類の検定に使用するために適合させることができる。例えば、標的物質はホルモン、抗体、抗原、タンパク質などである。可能な標的物質の非包括的リストが、米国特許第5,006,464号に記載されている。免疫検定フォーマットは、検出すべき標的物質に依存するであろう。繰り返すが、これらは当該技術において既に公知である。
特定の標的物質の検出感度を最大にするために、分析装置及び／又は分析方法の種々の要素、例えば、反応膜に使用する材料の多孔性、厚さおよび種類等を変更できることが理解されるであろう。ブロッキング溶液および洗浄溶液、並びに受容体および検出試薬（例えば、酵素、コロイド金、蛍光標識、生体発光標識などの検出マーカーで標識された抗体もしくはプロテインＡ）もまた、検出感度に影響するであろう。当該分析装置は、少しのサンプル操作しか必要とせず、または全く必要としない検定において使用することができ、１分未満で行うことができる。
引用した全ての参照文献は、その全体が本明細書の一部として組み込まれる。以下の例および図面は例示目的ためだけのものであり、如何なる意味においても本発明の範囲を制限するものと解釈されるべきものではない。
例１：分析装置の組み立て
この例は、当該分析装置が容易に入手可能な材料から製造できることを示すものである。片面に感圧接着剤をコーティングしたプラスチックシート（C-LINEプロダクツInc.社製のClear-Adheer^R）を常設店から入手し、１インチ×１インチ四方に切断して、分析装置の頂部支持層を形成した。孔パンチャーを使用して、各正方形の中央に1/3インチの孔を穿設した。これも常設店から入手可能な反応膜材料（例えば通常の家庭用紙タオル、のようなセルロース紙、多孔質ナイロンシート、多孔質酢酸セルロース紙、インク吸い取り紙、または良好な濾過品質をもった他の材料）を、1/4インチ孔パンチャーを使用して1/4インチに切断した。この円形反応膜を前記頂部支持層の接着面に接着して、前記1/3インチの孔を覆った。適切な厚さの吸収性材料を入手し、１インチ×１インチ四方に切断し、前記頂部支持層の接着面に接着して吸収体を形成した。底部支持層を、頂部支持層に使用したのと同じ感圧接着剤コートしたプラスチックから製造し、前記吸収体の下面に接着した。
例２：IgGを検査する分析装置を使用した免疫検定
以下の部品を使用して分析装置を製造し、図１〜図３に示すようにして組み立てた。可撓性であるが剛性の、片面に水不溶性の金津接着剤を有するポリ塩化ビニル（PVC）プラスチック（水道プラスチック小売店）から、3.8cm平方の頂部支持層を切り出した。この頂部支持層の中央に、直径8mmの孔を穿設した。紙で裏打ちされた厚さ略0.8mmのニトロセルロース（EYラボラトリーズ社;カタログ番号#PBNC15-1）から直径11mmの円形の反応膜を切り取り、頂部支持層に接着して前記孔を覆った。3.8cm平方の吸収材料（Whatman社;カタログ番号F429-05）からなる吸収体を、前記頂部支持層の接着剤面に接着した。3.8cm平方の寸法を有し、頂部支持層と同じプラスチック材料および接着剤からなる底部支持層を、吸収体の下面に接着した。頂部支持層と同じプラスチック材料および接着剤からなり、略3.8cm×1.5cmの寸法で、中央に直径8mmの孔を穿設した受け部形成部材を、図２に示すように頂部支持層の頂面に配置した。
ウサギIgGの1mg／ml溶液（EYカタログ番号AP541-1）を、1％ウサギ血清アルブミンを含有する燐酸緩衝食塩水（0.05M、pH7.4）（PBS/BSA希釈剤）の中で調製した。1/2μlの液滴を、反応膜の露出表面の中央にスポットした。反応膜には、重なる処理（例えばブロッキング処理）は行わなかった。このIgG溶液を乾燥させた。プロテインＡ／コロイド金（EYラボラトリーズ社から入手可能、カタログ番号GP-01、GP-01-100またはFC-PRO-5）を0.5％Tween20の中で調製し、50μlを反応膜に添加した。IgGをスポットした個所に赤紫のドットが現れた。反応膜の残部は白のままであった。これは、この分析装置を使用して低濃度のIgGを検出できることを示している。
IgGの溶液を連続希釈して、各希釈液を分析装置の反応膜にスポットすることができる。検定ステップを実行し、可視化できるIgGの最低濃度を決定することによって標準曲線を作成し、上記検定の検出終点を決定することができる。未知量のIgGwo含有するサンプルを上記のようにして検査し、形成された赤紫のドットの強度を標準曲線と比較して、半定量的結果を得ることができる。
例３：IgGを検査する分析装置を用いた免疫検定
例２で説明したようにして分析装置を組み立てた。夫々の装置の反応膜に、0.5μlの1mg/mlのプロテインＡ溶液を接種した。例２で説明したPBS/BSA中における既知濃度の正常ヒト血清の連続希釈液を作製した。各希釈倍率のヒト血清の80μl液滴を反応膜に添加して、完全に吸収させた。例２で説明したプロテインＡ／コロイド金溶液の80μl液滴を反応膜に添加し、完全に吸収させた。蒸留水（120μl）を反応膜に添加して、膜全体から未結合試薬を洗浄した。検定の終了時点において、分析装置の上に赤紫のスポットが見られた。これを使用して1/1000希釈の正常ヒト血清中におけるIgGの存在を検査し、当該分析装置および上記の検定法を使用することにより、IgGが存在し且つ検出可能であることが示された。

Claims (12)

1. 結合性の標的物質を含有する可能性が或る液体サンプル中で、前記標的物質を検出する検査に使用するための分析装置であって、
   上面および下面を有し、且つ、開口周囲のリムを形成する液体不透過性の頂部支持層と、
   上面および下面を有し、且つ、前記頂部支持層に近接した多孔性反応膜と、を有し、前記多孔性反応膜の上面の一部および前記リムはサンプル収容凹所を形成し、前記多孔性反応膜の上面は、水不溶性接着剤によって前記頂部支持層の下面にシールされて両者の間に液体不透過性シールを形成し、
   更に、上面および下面を有し、その上面が前記多孔性反応膜の下面に隣接し且つ前記多孔性反応膜と液体流通する吸収体を具備し、
   更に、上面および下面を有し、且つ、前記吸収体の下面に隣接する液体不透過性の底部支持層を具備し、
   前記液体不透過性シールが、圧縮を伴わずに、前記頂部支持層と前記底部支持層の間に維持され、
   前記頂部支持層および前記底部支持層は一緒に嵌合またはシールされないことを特徴とする分析装置。
2. 前記吸収体の上面が前記多孔性反応膜の周囲を超えて広がっていることを特徴とする請求項１に記載の分析装置。
3. 前記多孔性反応膜が側壁を有しており、前記頂部支持層、前記多孔性反応膜の側壁および前記吸収体の上面によってエアポケットが形成されていることを特徴とする請求項１に記載の分析装置。
4. 前記多孔性反応膜の側壁が０．２〜１．０ｍｍの高さを有することを特徴とする請求項１に記載の分析装置。
5. 前記水不溶性接着剤が感圧接着剤であることを特徴とする請求項１に記載の分析装置。
6. 前記頂部支持層が可撓性プラスチックからなることを特徴とする請求項１に記載の分析装置。
7. 前記頂部支持層の上面に結合された受け部形成部材を更に具備することを特徴とする請求項１に記載の分析装置。
8. 前記多孔性反応膜がニトロセルロースからなることを特徴とする請求項１に記載の分析装置。
9. 前記多孔性反応膜の下面が、前記ニトロセルロースに密着して結合された少なくとも一つの液体不透過性支持材料からなることを特徴とする請求項８に記載の分析装置。
10. 前記液体不透過性支持材料が、紙、ガラス繊維およびポリエステルからなる群から選択されることを特徴とする請求項９に記載の分析装置。
11. 前記多孔性反応膜の上面の露出領域が、その上に固定化され且つ前記結合性標的物質に直接的または間接的に結合できるレセプターを有し、この固定化されたレセプターは前記上面の露出エリアの限定された領域に濃縮されていることを特徴とする請求項１に記載の分析装置。
12. 前記レセプターが抗原または抗体であることを特徴とする請求項１１に記載の分析装置。

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