JP4034011B2 - 化粧料 - Google Patents
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】
この発明は新規な化粧料、特に紫外線照射時に表皮のケラチノサイトから放出され、メラノサイトのメラニン産生を促進させる働きを持つＡＤＦ(adult T cell leukemia derived factor)の産生を抑制させることにより、メラノサイトでのメラニン産生を抑制すると共に、メラノサイトに直接作用してメラニン産生を抑制する物質を共に配合することにより、より効果の高い美白化粧料を提供するものである。 さらに詳しくは、紫外線照射時に表皮のケラチノサイトから放出され、メラノサイトのメラニン産生を促進させる働きを持つＡＤＦ(adult T cell leukemia derived factor)の産生を抑制する物質として、トコフェロール類、アスコルビン酸誘導体、システイン誘導体、カロチン類、ユビキノン類、フラボノイド類およびその配糖体、フラボン類およびその配糖体、イソフラボン類およびその配糖体、フラバノン類およびその配糖体、フラボノール類およびその配糖体、カテキン類およびその配糖体、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドおよびその誘導体、グアバ葉抽出物、ひまわり種子抽出物、茶抽出物、エーデルワイス抽出物の群から1種又は2種以上と、メラノサイトに直接作用してメラニン産生を抑制する効果のあるパッシフローラ属植物、ビオラ属植物、クレマチス属植物、ユーコミア属植物の抽出物の群から1種又は2種以上を配合することにより、効果が高くかつ、安全性に優れた化粧料に関する。
【０００２】
【従来の技術】
私達の肌は、常に外的環境から様々なストレスを受けている。 特に紫外線による皮膚への傷害は大きな問題であり、シミ、シワ、肌荒れなどの大きな原因になっている。 従来、紫外線によるシミ、ソバカス、日焼けの対策としては、メラニン産生に影響を及ぼす酵素であるチロシナーゼを阻害する物質や、培養したメラノサイトに有効成分を添加して、メラノサイトのメラニン産生を抑制する物質を有効成分として配合する化粧料が利用されてきた。 コウジ酸、ハイドロキノン誘導体および、桑白皮、甘草等種々の植物抽出物は、チロシナーゼ阻害作用や、メラノサイトのメラニン産生を抑制することにより美白作用を期待するものである。 これらの物質は直接メラノサイトに働きかけ、その作用によりメラニン産生を抑制することにより美白効果を期待するものであった。
【０００３】
【発明が解決しようとする問題点】
紫外線が肌に照射されると炎症が生じた後、肌の黒化が始まる。 しかし、紫外線が直接メラノサイトに作用してメラニン産生を刺激するのではない。 まず紫外線がケラチノサイトに作用し、ケラチノサイトが各種のサイトカインを放出する。そして、これらのサイトカインがメラノサイトに作用しメラニン産生が亢進することになる。 そのため、メラノサイトのメラニン産生だけを抑制する従来の美白剤では、その効果が充分ではないことが明らかになった。
【０００４】
【問題を解決する手段】
したがって、安全性が高く、かつ美白効果の高い化粧料の開発が望まれていた。
表皮のケラチノサイトは紫外線照射時に、ＡＤＦ(adult T cell leukemia derived factor：成人Ｔ細胞白血病由来因子)と言われる分子量13,000のタンパク質を産生する。 産生されたＡＤＦはメラノサイトに働きかけ、メラノサイトの受容体の数を増やし、メラニン産生を促進させるということが神戸大の市橋等により報告されている。(Pigment Cell Res.1997; 10: 68-73) そこで、ケラチノサイトからのADF産生を抑制することによりメラニン産生を制御する素材を配合すると共に、直接メラノサイトに作用してメラニン産生を抑制する素材を併用することにより、従来の美白化粧料に比べ、効果の高い化粧料を提案するものである。
そこでこれらの観点から、人ケラチノサイトを試験管系で培養し、紫外線照射時に産生されるＡＤＦの産生量の確認を行った。 その結果、ＡＤＦ(adult T cell leukemia derived factor)の産生を抑制する物質として、トコフェロール類、アスコルビン酸誘導体、システイン誘導体、カロチン類、ユビキノン類、フラボノイド類およびその配糖体、フラボン類およびその配糖体、イソフラボン類およびその配糖体、フラバノン類およびその配糖体、フラボノール類およびその配糖体、カテキン類およびその配糖体、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドおよびその誘導体、グアバ葉抽出物、ひまわり種子抽出物、茶抽出物、エーデルワイス抽出物に高い効果が確認された。 また、メラノサイトに直接作用してメラニン産生を抑制する効果のある物質であるパッシフローラ属植物抽出物(特願平10-376084)、ビオラ属植物抽出物(特願平10-376085)、クレマチス属植物抽出物(特開平7-277944)、 ユーコミア属植物抽出物(特顔平10-376086)を共に配合することにより、効果が高くかつ、安全性に優れた化粧料であることを見いだし、本発明の完成にいたった。
【０００５】
すなわち、本発明はＡＤＦ(adult T cell leukemia derived factor)の産生を抑制する物質として、トコフェロール類、アスコルビン酸誘導体、システイン誘導体、カロチン類、ユビキノン類、フラボノイド類およびその配糖体、フラボン類およびその配糖体、イソフラボン類およびその配糖体、フラバノン類およびその配糖体、フラバノール類およびその配糖体、カテキン類およびその配糖体、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドおよびその誘導体、グアバ葉抽出物、ひまわり種子抽出物、茶抽出物、エーデルワイス抽出物の群から選ばれる１種または２種以上の物質と、メラノサイトに直接作用してメラニン産生を抑制する効果のある物質であるパッシフローラ属植物抽出物(特願平10-376084)、 ビオラ属植物抽出物(特願平10-376085)、クレマチス属植物抽出物(特開平7-277944)、 ユーコミア属植物抽出物(特顔平10-376086)の群から選ばれる1種又は2種以上の抽出物を共に含有することを特徴とする化粧料を提供するものである。
【０００６】
本発明に用いられるパッシフローラ属の植物は、例えば、パッション・フラワー（Passiflora Incarnata L.）、クダモノトケイ（Passiflora edulis Sims）、ウォーターレモン（P. ligularis Juss）、トケイソウ（P. caerulea L.）、月葉西番蓮（Passiflora altebilobata Hemsl.）、蛇王藤（P. cochinchinensis Spr.）、杯葉西番蓮（P. cupiformis Mast.）等が挙げられる。
【０００７】
本発明に用いられるビオラ属の植物は、例えば、ワイルドパンジー(Viola tricolor L.ssp.Arvensis Murr.)、ニオイスミレ（Viola odorata L.）、スミレ（Voila mandshurica W. Becker）、コスミレ（V. japonica Langsd.）、ノジスミレ（V. yedoensis Makino）、ニョイスミレ（V. verecunda A. Gray）、ツクシスミレ（V. diffusa Gingins）、シロスミレ（V. patrinii DC.）、エゾノタチツボスミレ（V. acuminata Ledeb.）、ネパールスミレ（V. betonicifolia Smith subsp. Nepalensis W. Becker）、シロバナスミレ（V. patrinii DC ex Gingins）、マルバケスミレ（V. collina Bess.）、フキスミレ（V. diamantiaca Nakai）、タチツボスミレ（V. grypoceras A. Gray）、地草果（V. philippica Cav. Subsp. Malesica W. Becker）、スミレサイシン（V. vaginita Maxim.）、ツボスミレ（V. verecunda A. Gray）等が挙げられる。
【０００８】
本発明に用いられるクレマチス属の植物は、例えば、威霊仙(Clematis chinensis Osbeck.)、テッセン（Clematis florida Thunb.）、カザグルマ（Clematis patens Morr.et Decne）、センニンソウ（Sweet Autumn Clematis）等が挙げられる。
【０００９】
本発明に用いられるユーコミア属の植物は、例えば、杜仲(Eucommia ulmoides Oliv.)、トゲミノマサキ（E.trichocarpus Hayata）、ツリバナ（E.oxyphylla Miq.）等が挙げられる。
【００１０】
本発明に用いられるトコフェロール類は、例えば、α-トコフェロール、β- トコフェロール、γ−トコフェロール、δ−トコフェロールが挙げられこれらはｄ体ｌ体を問わない。
【００１１】
本発明に用いられるアスコルビン酸誘導体は、例えば、アスコルビン酸ステアレート、アスコルビン酸ジパルミテート等の脂肪酸誘導体、アスコルビン酸−３−リン酸マグネシウム等のリン酸エステル、アスコルビン酸グルコシド等の配糖体等が挙げられる。
【００１２】
本発明に用いられるシステイン誘導体は、例えば、システイン塩酸塩等の塩類、N-アセチル−システイン、カルボシステイン、システインの２量体であるシスチン等が挙げられる。
【００１３】
本発明に用いられるユビキノン類は、例えば、コエンザイムＱ６（CoQ6）、コエンザイムＱ7（CoQ7）、コエンザイムＱ8（CoQ8）、コエンザイムＱ9（CoQ9）、コエンザイムＱ10（CoQ10）等が挙げられる。
【００１４】
本発明に用いられるカロチン類には、例えば、カロテン、ルテイン、ビオラキサンチン、スピリロキサンチン、スフェロイデンなどが挙げられ、これらはα体、β体、γ体を問わない。
【００１５】
本発明に用いられるフラボン類は、例えばフラボン及び／又はその配糖体、アピゲニン及び／又はその配糖体、ルテオリン及び／又はその配糖体等が挙げられる。
【００１６】
本発明に用いられるイソフラボン類は、例えば、イソフラボン及び／又はその配糖体等が挙げられる。
【００１７】
本発明に用いられるフラバノン類は、例えば、ナリンゲニン、エリオジクチオール、及びその配糖体であるナリンギン等が挙げられる。
【００１８】
本発明に用いられるカテキン類は、例えば、カテキン、カテキンガラート、ガロカテキン等が挙げられ、これらの異性体も使用できる。
【００１９】
本発明に用いられるフラボノール類は、例えば、ケンフェロール及び／又はその配糖体、クエルセチン及び／又はその配糖体、ミリセチン及び／又はその配糖体等が挙げられる。
【００２０】
本発明に用いられる還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドは、例えば、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド及び／又はその誘導体が挙げられる。
【００２１】
本発明の化粧料に用いるトコフェロール類、アスコルビン酸誘導体、システイン誘導体、カロチン類、ユビキノン類、フラボノイド類およびその配糖体、フラボン類およびその配糖体、イソフラボン類およびその配糖体、フラバノン類およびその配糖体、フラボノール類およびその配糖体、カテキン類およびその配糖体、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドおよびその誘導体の化合物、 バンザクロ（Psidium）属植物抽出物、カメリア（Camellia）属植物抽出物、ヘリアンタス（Helianthus）属植物抽出物、レオントポディウム (Leontopodium)属植物抽出物、パッシフローラ属植物抽出物、ビオラ属植物抽出物、クレマチス属植物抽出物、 ユーコミア属植物抽出物は独自に抽出してもよいし、精製してもよい。
【００２２】
例えば、抽出するにあたっては上記化合物は、種々の適当な有機溶媒を用いてそれぞれの化合物を豊富に含む植物類から低温下及び／又は加温下で抽出された物が使用できる。また、市販の試薬類をそのまま使用できる。
【００２３】
さらに、本発明の化粧料に用いる植物抽出物の調製も特に限定されるものではない。例えば、種々の適当な有機溶媒を用いてそれぞれの化合物を豊富に含む植物類から低温下及び／又は加温下で抽出された物が使用できる。
【００２４】
抽出溶媒としては、特に限定はされないが例えば、水；メチルアルコール、エチルアルコール等の低級１価アルコール；グリセリン、プロピレングリコール、1,3-ブチレングリコール等の液状多価アルコール；アセトン、メチルエチルケトン等のケトン；酢酸エチルなどのアルキルエステル；ベンゼン、ヘキサン等の炭化水素；ジエチルエーテル等のエーテル類；ジクロルメタン、クロロホルム等のハロゲン化アルカン等の１種または２種以上を用いることが出来る。 就中、水、エチルアルコール、1,3-ブチレングリコールの１種または２種以上の混合溶媒が特に好適である。
【００２５】
植物エキスの抽出は、生のままあるいは乾燥した植物体を重量比で１〜1000倍量、特に10〜100倍量の溶媒を用い、０℃以上、特に２０℃〜４０℃で１時間以上、特に３〜７日間行うのが好ましい。抽出部位は、どの部分を用いても良く、また全草を用いることもできる。
【００２６】
以上のような条件で得られる植物抽出液は、抽出された溶液のまま用いても良いが、さらに必要により濾過等の処理をして、濃縮、粉末化したものを適宜使い分けて用いることが出来る。
【００２７】
本発明の化粧料における植物抽出液の配合量は、蒸発乾燥分に換算して一般的に0.0001〜20.0重量%が好ましく、特に0.01〜5.0重量%の範囲が最適である。
含有量が0.0001重量%未満であると充分な効果が発揮されず、20.0重量%以上加えても効果はほぼ一定である。
【００２８】
本発明の化粧料は、上記必須成分のほか、化粧品、医薬部外品、医薬品に用いられる水性成分、油性成分、植物抽出物、動物抽出物、粉末、界面活性剤、油剤、アルコール、PH調整剤、防腐剤、酸化防止剤、増粘剤、色素、香料等を必要に応じて混合して適宜配合することにより調製される。 本発明の化粧料の剤形は特に限定されず、化粧水、乳液、クリーム、パック、パウダー、スプレー、軟膏、分散液、洗浄料等種々の剤形とすることができる。
【００２９】
【実施例】
以下、本発明による有効物質の人ケラチノサイト、およびメラノサイトにかかわる試験、および動物での効果試験の実施例を示す。 さらに、その素材を用いた化粧料への応用処方例等について述べるが、ここに記載された実施例に限定されないのは言うまでもない。
【００３０】
【実施例１】
植物抽出液の調製
バンザクロ（Psidium）属植物抽出物、カメリア（Camellia）属植物抽出物、ヘリアンタス（Helianthus）属植物抽出物、レオントポディウム (Leontopodium)属植物抽出物、パッシフローラ属植物抽出物、ビオラ属植物抽出物、クレマチス属植物抽出物、ユーコミア属植物抽出物は、各種植物体乾燥物それぞれの5gに抽出溶剤100mlを加え、室温でときどき撹拌しながら７日間抽出し、濾過して各抽出液を得た。 これら各抽出液を減圧濃縮し、下記測定方法による人ケラチノサイトによるＡＤＦ産生抑制作用および、メラノサイトによるメラニン産生抑制試験を測定する試料とした。 また、トコフェロール類、アスコルビン酸誘導体、システイン誘導体、カロチン類、ユビキノン類、フラボノイド類およびその配糖体、フラボン類およびその配糖体、イソフラボン類およびその配糖体、フラバノン類およびその配糖体、フラボノール類およびその配糖体、カテキン類およびその配糖体、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドおよびその誘導体の化合物については、市販の試薬を用いた。
【００３１】
【実施例２】
人ケラチノサイトによるＡＤＦ産生抑制作用の測定
（１）試料溶液の調製
前記各種試料を、精製水により１0 mg/ml濃度に溶解したものを試料溶液として調製する。 また、水に不溶の試料は、ポリオキシエチレン(50)硬化ひまし油、エタノール、またはジメチルスルホキシドにより可溶化させ、10mg/ml試料濃度に調製したものを試料溶液とする。
【００３２】
（２）人ケラチノサイトの培養
無菌的に採取した正常人包皮から真皮、皮下組織をできるだけ削除する。 無菌シャーレに、トリプシン/EDTA(0.25%/0.05%)PBS(-)(リン酸緩衝液)を入れ、表皮を上にして室温で１日放置後、ピンセットで表皮と真皮を分離する。 表皮細胞を採集し、遠心チューブにPBS(-)10mlを加え、ピペッテイングにより細胞を分散させ、1000回転、5分間遠心し、上清をすてる。 PBS(-)による細胞の洗浄を３回繰り返す。 集まった細胞をケラチノサイト用無血清培地で分散し、コラーゲンコート（１型）シャーレにまき、37℃、5% CO２インキュベーター中で培養する。
培地 ：ブレットキット ＥＧＭ (改変 MCDB 131 培地)
添加物：牛脳抽出物(BBE) 12μg/ml, h-EGF 0.01μg/ml, ハイドロコーチゾン 1μg/ml, ゲンタマイシン 50mg/ml, アンフォテリシン 50μg/ml
【００３３】
（３）人ケラチノサイトによるＡＤＦ産生量の測定
(a)人ケラチノサイトのＡＤＦ誘導
人ケラチノサイトを直径36mmシャーレにコンフルーエントになるまで細胞を培養する。 これに(1)で調製した試料を添加し、ＣＯ２インキュベーター中で30分間インキュベートする。 培地を除去し、PBS(-)を0.5ml添加し、UV-B 20mJ/cm2を照射し、ＡＤＦを誘導させる。 PBS(-)を除去し、ケラチノサイト用無血清培地2mlを添加し、3時間インキュベートしてＡＤＦの産生を行う。
インキュベート後、トリプシン/EDTA(0.25%/0.05%)PBS(-)1mlで細胞をはがし、3000回転、5分間で細胞を回収する。 回収した細胞に lysis buffer (10% NP-40 2.5ml; 100mM Tris-HCl (PH7.5) 5.0ml; 3M−NaCl, 2.5ml; 200mM フェニルメチルスルフォニルフロライド(PMSF)/ジメチルホルムアミド(DMFA)250μl; 0.111 IU/ml アプロチニン 185μl; 10%アジ化ナトリウム 100μl; 蒸留水で 50ml) 30μl を添加し、良く撹拌して溶解する。 細胞溶解液を3000回転、5分間、続いて15,000回転、5分間遠心し、上澄みを新しいエッペンチューブに取り、タンパク量を測定する。 タンパク量は Bio Rad 社のprotein assay Kit を用いて行った。
【００３４】
(b)タンパク電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
アクリルアミド15%濃度の lower gelおよび、4.5%濃度の stacking gel を作成する。 タンパク量30μgの試料に、それと同量の２倍濃度サンプリングバッファー(0.5M-Tr is-HCl(PH6.8) 2ml; 10%SDS 4ml; β-メルカプトエタノール 1.2ml; グリセロール 2ml； 蒸留水 0.8ml；1% BPB, 適量;)を添加し、100℃、5分間加熱し、ゲルに添加する試料を調製する。 Tris塩 30.3g; グリシン 144.0g; SDS 10.0g; 蒸留水で10Lにしたランニングバッファー中で、30mAで電気泳動を行った。
【００３５】
(c)ウエスタンブロッテイング
電気泳動を行ったゲルと PVDF 膜をトランスファーバッファー(グリシン, 72.25g; Tris-base, 15g; SDS, 3.75g; 蒸留水, 4L)中でセットし、500mAで90分間トランスファーを行った。
トランスファー後、PVDF 膜をブロッキング溶液（10g スキンミルク; 10ml 仔牛血清; 90ml 0.05%Tween20 PBS(-)溶液)に浸し、一晩冷蔵放置する。 その後、ブロッキング溶液を除去し、0.05%Tween20 PBS(-)溶液で洗浄を3回行う。 一次抗体としてADF抗体 (0.35μg/ml)を0.05%Tween20 PBS(-)溶液)で1μl/7mlに希釈し、PVDF膜を一時間処理する。 次に二次抗体として抗マウス抗体 (10μl/6ml 0.05%Tween20 PBS(-)溶液)でPVDF膜を一時間処理する。 その後0.05%Tween20 PBS(-)溶液で5回洗浄後ImmunoStar(和光純薬工業株式会社)で発色し、13,000ダルトンのバンドの濃淡でＡＤＦ量の確認を行った。
【００３６】
【表１】
ケラチノサイトのADF産生抑制作用
【００３７】
表１より、UV-B照射時のADF産生量を4、非照射のADF産生量を０とした場合、表１に示したdl-α-トコフェロールとラウロイルシステインは、それぞれ100ppmと0.1mＭでADF産生量が１となり、ADFの産生を顕著に抑制していた。 また、Ｌ-アスコルビン酸リン酸Mgは100ppm、N-アセチルシステインは1mM、ユビキノンQ9は10μＭ、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドは50μＭ、グアバ葉抽出物、茶抽出物および、ひまわり種子抽出物はそれぞれ100ppmでADF産生量が２となり、ADF産生抑制が認められた。 さらに、ミリセチン、ケンフェロール、クエルセチン、ルチンのフラボノール類、ナリンゲニン、ナリンギン、ヘスペリジンのフラバノン類、フラボンのフラボン類、ゲニステインノイソフラボン類、カテキン、エピガロカテキンガレートのカテキン類については、それぞれ50mＭでまた、エーデルワイス抽出物は200ppmでADF産生量が３となり、ADF産生抑制効果が弱いながらも認められた。
【００３８】
【実施例３】
メラノサイトによるメラニン産生抑制効果の測定
つぎにパッシフローラ属植物抽出物、ビオラ属植物抽出物、クレマチス属植物抽出物、ユーコミア属植物抽出物のメラニン産生抑制効果について、マウスメラノーマ細胞によるメラニン産生抑制試験について述べるが、ここに記載された実施例に限定されないのは言うまでもない。
【００３９】
試料の調製
パッシフローラ属植物抽出物として、パッションフラワー抽出物 1ｍg/ml、又はビオラ属植物抽出物としてワイルドパンジー抽出物 1ｍg/ml、又はクレマチス属植物抽出物として威霊仙抽出物 1ｍg/ml、又はユーコミア属植物抽出物として杜仲抽出物 1ｍg/ml、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油 500ppm、牛胎児血清10%の割合になるようにそれぞれの試料を秤取し、良く溶解した後、ダルベッコMEM培養液に加える。 培養液を超音波処理により透明にした後、除菌濾過をし試料を調製する。
【００４０】
細胞培養
マウスメラノーマ細胞 B-16 株を用いて、実験を行った。 培地にはダルベッコ MEM 培養液に牛胎児血清10%を添加した。 パッションフラワー抽出物、ワイルドパンジー抽出物、威霊仙抽出物、杜仲抽出物は水抽出物、50%エタノール水溶液抽出物、100%エタノール抽出物を培地にそれぞれ100ppmの濃度になるように添加した。 また、美白効果の陽性対照物質としてコウジ酸を用いた。 メラニン量の測定は培養後細胞を2N-NaOHに溶解し、400nmの吸光度を測定した。 また、細胞数は2N-NaOHに溶解した細胞溶解液の一部を Bio-Rad社のプロテインアッセイキットにより600nmの吸光度で測定し、タンパク量に換算した。 メラニン産生量は、単位タンパク量あたりのメラニン量の割合で計算した。
【００４１】
実験結果
表２にマウスメラノーマ B-16 細胞に及ぼすパッションフラワー抽出物、ワイルドパンジー抽出物、威霊仙抽出物、杜仲抽出物のメラニン産生抑制効果を示した。陽性対照であるコウジ酸は、細胞毒性のかからない上限濃度である100ppm添加で22%のメラニン産生抑制度であった。 一方、パッションフラワー抽出物は、細胞毒性がかからない濃度の300ppm添加で水抽出物が53%、50%エタノール水溶液抽出物が46%、100%エタノール抽出物が38%であり、パッションフラワー抽出物に高い美白効果が認められた。ワイルドパンジー抽出物は、細胞毒性がかからない濃度の300ppm添加で水抽出物が38%、50%エタノール水溶液抽出物が35%、100%エタノール抽出物が25%であり、ワイルドパンジー抽出物に高い美白効果が認められた。威霊仙抽出物は、細胞毒性がかからない濃度の100ppm添加で水抽出物が51%、50%エタノール水溶液抽出物が22%、100%エタノール抽出物が15%であり、威霊仙抽出物に高い美白効果が認められた。杜仲抽出物は、細胞毒性がかからない濃度の200ppm添加で水抽出物が46%、50%エタノール水溶液抽出物が33%、100%エタノール抽出物が36%であり、杜仲抽出物に高い美白効果が認められた。
【００４２】
【表２】
メラニン産生抑制効果
【００４３】
【実施例４】
次に本発明の各種成分を配合した化粧料の処方例を示すが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００４４】
製法 a)〜f)までを加熱溶解し、80℃に保つ。g)〜m)までを加熱溶解し、
80℃に保ち、a)〜f)に加えて乳化し、40℃まで撹拌しながら冷却する。
【００４５】
製法 a)〜f)までを加熱溶解し、80℃に保つ。g)〜ｌ)までを加熱溶解し、
80℃に保ち、a)〜f)に加えて乳化し、40℃まで撹拌しながら冷却する。
【００４６】
製法 a)〜f)までを加熱溶解し、80℃に保つ。g)〜l)までを加熱溶解し、
80℃に保ち、a)〜f)に加えて乳化し、40℃まで撹拌しながら冷却する。
【００４７】
製法 a)〜f)までを加熱溶解し、80℃に保つ。g)〜l)までを加熱溶解し、
80℃に保ち、a)〜f)に加えて乳化し、40℃まで撹拌しながら冷却する。
【００４８】
製法 a)〜e)までを加熱溶解し、80℃に保つ。f)〜l)までを加熱溶解し、
80℃に保ち、a)〜e)に加えて乳化し、50℃まで撹拌しながら冷却する。
50℃でm)を添加し、40℃まで冷却する。
【００４９】
製法 a)〜e)までを加熱溶解し、80℃に保つ。f)〜l)までを加熱溶解し、
80℃に保ち、a)〜e)に加えて乳化し、50℃まで撹拌しながら冷却する。
50℃でm)を添加し、40℃まで冷却する。
【００５０】
製法 a)〜e)までを加熱溶解し、80℃に保つ。f)〜l)までを加熱溶解し、
80℃に保ち、a)〜e)に加えて乳化し、50℃まで撹拌しながら冷却する。
50℃でm)を添加し、40℃まで冷却する。
【００５１】
製法 a)〜e)までを加熱溶解し、80℃に保つ。f)〜l)までを加熱溶解し、
80℃に保ち、a)〜e)に加えて乳化し、50℃まで撹拌しながら冷却する。
50℃でm)を添加し、40℃まで冷却する。
【００５２】
製法 a)〜i)までを混合し、均一に溶解する。
【００５３】
製法 a)〜h)までを混合し、均一に溶解する。
【００５４】
製法 a)〜h)までを混合し、均一に溶解する。
【００５５】
製法 a)〜h)までを混合し、均一に溶解する。
【００５６】
製法 a)〜m)までを混合し、よく撹拌、分散させ均一にする。
【００５７】
製法 a)〜l)までを混合し、よく撹拌、分散させ均一にする。
【００５８】
製法 a)〜l)までを混合し、よく撹拌、分散させ均一にする。
【００５９】
製法 a)〜l)までを混合し、よく撹拌、分散させ均一にする。
【００６０】
【実施例４】に示した処方例＜処方例５：乳液１＞の処方例中、dl-α−トコフェロール1.0%、威霊仙水抽出物1.0%をそれぞれ表３の原料に置き換えて添加し、乳液を調製し効果試験に用いた。
例えば、表中18の乳液は、杜仲エキス1.0%、dl-α−トコフェロール1.0%を含む。
【００６１】
【表３】
【００６２】
有効性試験
黒色モルモットの背部に1cm×1cmの面積に紫外線を２MED照射し、照射後に試料を塗布する。これを1日に1回行い、合計3回繰り返し、皮膚に黒化を起こさせる。 その後、1日1回照射部位に試料を塗布し、3週間後に皮膚の黒化度を判定した。判定は、コントロールである無塗布群と比較し、5段階評価にて黒化度を判定した。なお、1匹のモルモット背部には4区画塗布区をとり、一群10匹で試験を行った。有効性の判定はコントロール群と比較してより白かったものが70%以上の場合を◎、40-70%の場合を○、20-40%の場合を△、20%以下の場合を×とした。
表４からも分かるように従来の美白効果が高いといわれるコウジ酸の有効性が20-40%であった。 また、直接メラノサイトに作用してメラニン産生を直接抑制する杜仲エキス、パッションフラワーエキス、ワイルドパンジーエキス、威霊仙エキス単独でも有効性は20-40%であった。 しかし、ADF産生抑制剤とメラニン産生抑制剤を組み合わせたものでは、いずれも有効性が40%以上で高い有効性を示した。
【００６３】
【表４】
【発明の効果】
以上詳述したごとく、本発明化粧料は、紫外線によるシミやくすにに対して優れた美白効果を示すことが分かった。 また、本発明の化粧料は、安全性が高く、安心して使用することができる。
【産業上の利用分野】
この発明は新規な化粧料、特に紫外線照射時に表皮のケラチノサイトから放出され、メラノサイトのメラニン産生を促進させる働きを持つＡＤＦ(adult T cell leukemia derived factor)の産生を抑制させることにより、メラノサイトでのメラニン産生を抑制すると共に、メラノサイトに直接作用してメラニン産生を抑制する物質を共に配合することにより、より効果の高い美白化粧料を提供するものである。 さらに詳しくは、紫外線照射時に表皮のケラチノサイトから放出され、メラノサイトのメラニン産生を促進させる働きを持つＡＤＦ(adult T cell leukemia derived factor)の産生を抑制する物質として、トコフェロール類、アスコルビン酸誘導体、システイン誘導体、カロチン類、ユビキノン類、フラボノイド類およびその配糖体、フラボン類およびその配糖体、イソフラボン類およびその配糖体、フラバノン類およびその配糖体、フラボノール類およびその配糖体、カテキン類およびその配糖体、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドおよびその誘導体、グアバ葉抽出物、ひまわり種子抽出物、茶抽出物、エーデルワイス抽出物の群から1種又は2種以上と、メラノサイトに直接作用してメラニン産生を抑制する効果のあるパッシフローラ属植物、ビオラ属植物、クレマチス属植物、ユーコミア属植物の抽出物の群から1種又は2種以上を配合することにより、効果が高くかつ、安全性に優れた化粧料に関する。
【０００２】
【従来の技術】
私達の肌は、常に外的環境から様々なストレスを受けている。 特に紫外線による皮膚への傷害は大きな問題であり、シミ、シワ、肌荒れなどの大きな原因になっている。 従来、紫外線によるシミ、ソバカス、日焼けの対策としては、メラニン産生に影響を及ぼす酵素であるチロシナーゼを阻害する物質や、培養したメラノサイトに有効成分を添加して、メラノサイトのメラニン産生を抑制する物質を有効成分として配合する化粧料が利用されてきた。 コウジ酸、ハイドロキノン誘導体および、桑白皮、甘草等種々の植物抽出物は、チロシナーゼ阻害作用や、メラノサイトのメラニン産生を抑制することにより美白作用を期待するものである。 これらの物質は直接メラノサイトに働きかけ、その作用によりメラニン産生を抑制することにより美白効果を期待するものであった。
【０００３】
【発明が解決しようとする問題点】
紫外線が肌に照射されると炎症が生じた後、肌の黒化が始まる。 しかし、紫外線が直接メラノサイトに作用してメラニン産生を刺激するのではない。 まず紫外線がケラチノサイトに作用し、ケラチノサイトが各種のサイトカインを放出する。そして、これらのサイトカインがメラノサイトに作用しメラニン産生が亢進することになる。 そのため、メラノサイトのメラニン産生だけを抑制する従来の美白剤では、その効果が充分ではないことが明らかになった。
【０００４】
【問題を解決する手段】
したがって、安全性が高く、かつ美白効果の高い化粧料の開発が望まれていた。
表皮のケラチノサイトは紫外線照射時に、ＡＤＦ(adult T cell leukemia derived factor：成人Ｔ細胞白血病由来因子)と言われる分子量13,000のタンパク質を産生する。 産生されたＡＤＦはメラノサイトに働きかけ、メラノサイトの受容体の数を増やし、メラニン産生を促進させるということが神戸大の市橋等により報告されている。(Pigment Cell Res.1997; 10: 68-73) そこで、ケラチノサイトからのADF産生を抑制することによりメラニン産生を制御する素材を配合すると共に、直接メラノサイトに作用してメラニン産生を抑制する素材を併用することにより、従来の美白化粧料に比べ、効果の高い化粧料を提案するものである。
そこでこれらの観点から、人ケラチノサイトを試験管系で培養し、紫外線照射時に産生されるＡＤＦの産生量の確認を行った。 その結果、ＡＤＦ(adult T cell leukemia derived factor)の産生を抑制する物質として、トコフェロール類、アスコルビン酸誘導体、システイン誘導体、カロチン類、ユビキノン類、フラボノイド類およびその配糖体、フラボン類およびその配糖体、イソフラボン類およびその配糖体、フラバノン類およびその配糖体、フラボノール類およびその配糖体、カテキン類およびその配糖体、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドおよびその誘導体、グアバ葉抽出物、ひまわり種子抽出物、茶抽出物、エーデルワイス抽出物に高い効果が確認された。 また、メラノサイトに直接作用してメラニン産生を抑制する効果のある物質であるパッシフローラ属植物抽出物(特願平10-376084)、ビオラ属植物抽出物(特願平10-376085)、クレマチス属植物抽出物(特開平7-277944)、 ユーコミア属植物抽出物(特顔平10-376086)を共に配合することにより、効果が高くかつ、安全性に優れた化粧料であることを見いだし、本発明の完成にいたった。
【０００５】
すなわち、本発明はＡＤＦ(adult T cell leukemia derived factor)の産生を抑制する物質として、トコフェロール類、アスコルビン酸誘導体、システイン誘導体、カロチン類、ユビキノン類、フラボノイド類およびその配糖体、フラボン類およびその配糖体、イソフラボン類およびその配糖体、フラバノン類およびその配糖体、フラバノール類およびその配糖体、カテキン類およびその配糖体、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドおよびその誘導体、グアバ葉抽出物、ひまわり種子抽出物、茶抽出物、エーデルワイス抽出物の群から選ばれる１種または２種以上の物質と、メラノサイトに直接作用してメラニン産生を抑制する効果のある物質であるパッシフローラ属植物抽出物(特願平10-376084)、 ビオラ属植物抽出物(特願平10-376085)、クレマチス属植物抽出物(特開平7-277944)、 ユーコミア属植物抽出物(特顔平10-376086)の群から選ばれる1種又は2種以上の抽出物を共に含有することを特徴とする化粧料を提供するものである。
【０００６】
本発明に用いられるパッシフローラ属の植物は、例えば、パッション・フラワー（Passiflora Incarnata L.）、クダモノトケイ（Passiflora edulis Sims）、ウォーターレモン（P. ligularis Juss）、トケイソウ（P. caerulea L.）、月葉西番蓮（Passiflora altebilobata Hemsl.）、蛇王藤（P. cochinchinensis Spr.）、杯葉西番蓮（P. cupiformis Mast.）等が挙げられる。
【０００７】
本発明に用いられるビオラ属の植物は、例えば、ワイルドパンジー(Viola tricolor L.ssp.Arvensis Murr.)、ニオイスミレ（Viola odorata L.）、スミレ（Voila mandshurica W. Becker）、コスミレ（V. japonica Langsd.）、ノジスミレ（V. yedoensis Makino）、ニョイスミレ（V. verecunda A. Gray）、ツクシスミレ（V. diffusa Gingins）、シロスミレ（V. patrinii DC.）、エゾノタチツボスミレ（V. acuminata Ledeb.）、ネパールスミレ（V. betonicifolia Smith subsp. Nepalensis W. Becker）、シロバナスミレ（V. patrinii DC ex Gingins）、マルバケスミレ（V. collina Bess.）、フキスミレ（V. diamantiaca Nakai）、タチツボスミレ（V. grypoceras A. Gray）、地草果（V. philippica Cav. Subsp. Malesica W. Becker）、スミレサイシン（V. vaginita Maxim.）、ツボスミレ（V. verecunda A. Gray）等が挙げられる。
【０００８】
本発明に用いられるクレマチス属の植物は、例えば、威霊仙(Clematis chinensis Osbeck.)、テッセン（Clematis florida Thunb.）、カザグルマ（Clematis patens Morr.et Decne）、センニンソウ（Sweet Autumn Clematis）等が挙げられる。
【０００９】
本発明に用いられるユーコミア属の植物は、例えば、杜仲(Eucommia ulmoides Oliv.)、トゲミノマサキ（E.trichocarpus Hayata）、ツリバナ（E.oxyphylla Miq.）等が挙げられる。
【００１０】
本発明に用いられるトコフェロール類は、例えば、α-トコフェロール、β- トコフェロール、γ−トコフェロール、δ−トコフェロールが挙げられこれらはｄ体ｌ体を問わない。
【００１１】
本発明に用いられるアスコルビン酸誘導体は、例えば、アスコルビン酸ステアレート、アスコルビン酸ジパルミテート等の脂肪酸誘導体、アスコルビン酸−３−リン酸マグネシウム等のリン酸エステル、アスコルビン酸グルコシド等の配糖体等が挙げられる。
【００１２】
本発明に用いられるシステイン誘導体は、例えば、システイン塩酸塩等の塩類、N-アセチル−システイン、カルボシステイン、システインの２量体であるシスチン等が挙げられる。
【００１３】
本発明に用いられるユビキノン類は、例えば、コエンザイムＱ６（CoQ6）、コエンザイムＱ7（CoQ7）、コエンザイムＱ8（CoQ8）、コエンザイムＱ9（CoQ9）、コエンザイムＱ10（CoQ10）等が挙げられる。
【００１４】
本発明に用いられるカロチン類には、例えば、カロテン、ルテイン、ビオラキサンチン、スピリロキサンチン、スフェロイデンなどが挙げられ、これらはα体、β体、γ体を問わない。
【００１５】
本発明に用いられるフラボン類は、例えばフラボン及び／又はその配糖体、アピゲニン及び／又はその配糖体、ルテオリン及び／又はその配糖体等が挙げられる。
【００１６】
本発明に用いられるイソフラボン類は、例えば、イソフラボン及び／又はその配糖体等が挙げられる。
【００１７】
本発明に用いられるフラバノン類は、例えば、ナリンゲニン、エリオジクチオール、及びその配糖体であるナリンギン等が挙げられる。
【００１８】
本発明に用いられるカテキン類は、例えば、カテキン、カテキンガラート、ガロカテキン等が挙げられ、これらの異性体も使用できる。
【００１９】
本発明に用いられるフラボノール類は、例えば、ケンフェロール及び／又はその配糖体、クエルセチン及び／又はその配糖体、ミリセチン及び／又はその配糖体等が挙げられる。
【００２０】
本発明に用いられる還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドは、例えば、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド及び／又はその誘導体が挙げられる。
【００２１】
本発明の化粧料に用いるトコフェロール類、アスコルビン酸誘導体、システイン誘導体、カロチン類、ユビキノン類、フラボノイド類およびその配糖体、フラボン類およびその配糖体、イソフラボン類およびその配糖体、フラバノン類およびその配糖体、フラボノール類およびその配糖体、カテキン類およびその配糖体、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドおよびその誘導体の化合物、 バンザクロ（Psidium）属植物抽出物、カメリア（Camellia）属植物抽出物、ヘリアンタス（Helianthus）属植物抽出物、レオントポディウム (Leontopodium)属植物抽出物、パッシフローラ属植物抽出物、ビオラ属植物抽出物、クレマチス属植物抽出物、 ユーコミア属植物抽出物は独自に抽出してもよいし、精製してもよい。
【００２２】
例えば、抽出するにあたっては上記化合物は、種々の適当な有機溶媒を用いてそれぞれの化合物を豊富に含む植物類から低温下及び／又は加温下で抽出された物が使用できる。また、市販の試薬類をそのまま使用できる。
【００２３】
さらに、本発明の化粧料に用いる植物抽出物の調製も特に限定されるものではない。例えば、種々の適当な有機溶媒を用いてそれぞれの化合物を豊富に含む植物類から低温下及び／又は加温下で抽出された物が使用できる。
【００２４】
抽出溶媒としては、特に限定はされないが例えば、水；メチルアルコール、エチルアルコール等の低級１価アルコール；グリセリン、プロピレングリコール、1,3-ブチレングリコール等の液状多価アルコール；アセトン、メチルエチルケトン等のケトン；酢酸エチルなどのアルキルエステル；ベンゼン、ヘキサン等の炭化水素；ジエチルエーテル等のエーテル類；ジクロルメタン、クロロホルム等のハロゲン化アルカン等の１種または２種以上を用いることが出来る。 就中、水、エチルアルコール、1,3-ブチレングリコールの１種または２種以上の混合溶媒が特に好適である。
【００２５】
植物エキスの抽出は、生のままあるいは乾燥した植物体を重量比で１〜1000倍量、特に10〜100倍量の溶媒を用い、０℃以上、特に２０℃〜４０℃で１時間以上、特に３〜７日間行うのが好ましい。抽出部位は、どの部分を用いても良く、また全草を用いることもできる。
【００２６】
以上のような条件で得られる植物抽出液は、抽出された溶液のまま用いても良いが、さらに必要により濾過等の処理をして、濃縮、粉末化したものを適宜使い分けて用いることが出来る。
【００２７】
本発明の化粧料における植物抽出液の配合量は、蒸発乾燥分に換算して一般的に0.0001〜20.0重量%が好ましく、特に0.01〜5.0重量%の範囲が最適である。
含有量が0.0001重量%未満であると充分な効果が発揮されず、20.0重量%以上加えても効果はほぼ一定である。
【００２８】
本発明の化粧料は、上記必須成分のほか、化粧品、医薬部外品、医薬品に用いられる水性成分、油性成分、植物抽出物、動物抽出物、粉末、界面活性剤、油剤、アルコール、PH調整剤、防腐剤、酸化防止剤、増粘剤、色素、香料等を必要に応じて混合して適宜配合することにより調製される。 本発明の化粧料の剤形は特に限定されず、化粧水、乳液、クリーム、パック、パウダー、スプレー、軟膏、分散液、洗浄料等種々の剤形とすることができる。
【００２９】
【実施例】
以下、本発明による有効物質の人ケラチノサイト、およびメラノサイトにかかわる試験、および動物での効果試験の実施例を示す。 さらに、その素材を用いた化粧料への応用処方例等について述べるが、ここに記載された実施例に限定されないのは言うまでもない。
【００３０】
【実施例１】
植物抽出液の調製
バンザクロ（Psidium）属植物抽出物、カメリア（Camellia）属植物抽出物、ヘリアンタス（Helianthus）属植物抽出物、レオントポディウム (Leontopodium)属植物抽出物、パッシフローラ属植物抽出物、ビオラ属植物抽出物、クレマチス属植物抽出物、ユーコミア属植物抽出物は、各種植物体乾燥物それぞれの5gに抽出溶剤100mlを加え、室温でときどき撹拌しながら７日間抽出し、濾過して各抽出液を得た。 これら各抽出液を減圧濃縮し、下記測定方法による人ケラチノサイトによるＡＤＦ産生抑制作用および、メラノサイトによるメラニン産生抑制試験を測定する試料とした。 また、トコフェロール類、アスコルビン酸誘導体、システイン誘導体、カロチン類、ユビキノン類、フラボノイド類およびその配糖体、フラボン類およびその配糖体、イソフラボン類およびその配糖体、フラバノン類およびその配糖体、フラボノール類およびその配糖体、カテキン類およびその配糖体、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドおよびその誘導体の化合物については、市販の試薬を用いた。
【００３１】
【実施例２】
人ケラチノサイトによるＡＤＦ産生抑制作用の測定
（１）試料溶液の調製
前記各種試料を、精製水により１0 mg/ml濃度に溶解したものを試料溶液として調製する。 また、水に不溶の試料は、ポリオキシエチレン(50)硬化ひまし油、エタノール、またはジメチルスルホキシドにより可溶化させ、10mg/ml試料濃度に調製したものを試料溶液とする。
【００３２】
（２）人ケラチノサイトの培養
無菌的に採取した正常人包皮から真皮、皮下組織をできるだけ削除する。 無菌シャーレに、トリプシン/EDTA(0.25%/0.05%)PBS(-)(リン酸緩衝液)を入れ、表皮を上にして室温で１日放置後、ピンセットで表皮と真皮を分離する。 表皮細胞を採集し、遠心チューブにPBS(-)10mlを加え、ピペッテイングにより細胞を分散させ、1000回転、5分間遠心し、上清をすてる。 PBS(-)による細胞の洗浄を３回繰り返す。 集まった細胞をケラチノサイト用無血清培地で分散し、コラーゲンコート（１型）シャーレにまき、37℃、5% CO２インキュベーター中で培養する。
培地 ：ブレットキット ＥＧＭ (改変 MCDB 131 培地)
添加物：牛脳抽出物(BBE) 12μg/ml, h-EGF 0.01μg/ml, ハイドロコーチゾン 1μg/ml, ゲンタマイシン 50mg/ml, アンフォテリシン 50μg/ml
【００３３】
（３）人ケラチノサイトによるＡＤＦ産生量の測定
(a)人ケラチノサイトのＡＤＦ誘導
人ケラチノサイトを直径36mmシャーレにコンフルーエントになるまで細胞を培養する。 これに(1)で調製した試料を添加し、ＣＯ２インキュベーター中で30分間インキュベートする。 培地を除去し、PBS(-)を0.5ml添加し、UV-B 20mJ/cm2を照射し、ＡＤＦを誘導させる。 PBS(-)を除去し、ケラチノサイト用無血清培地2mlを添加し、3時間インキュベートしてＡＤＦの産生を行う。
インキュベート後、トリプシン/EDTA(0.25%/0.05%)PBS(-)1mlで細胞をはがし、3000回転、5分間で細胞を回収する。 回収した細胞に lysis buffer (10% NP-40 2.5ml; 100mM Tris-HCl (PH7.5) 5.0ml; 3M−NaCl, 2.5ml; 200mM フェニルメチルスルフォニルフロライド(PMSF)/ジメチルホルムアミド(DMFA)250μl; 0.111 IU/ml アプロチニン 185μl; 10%アジ化ナトリウム 100μl; 蒸留水で 50ml) 30μl を添加し、良く撹拌して溶解する。 細胞溶解液を3000回転、5分間、続いて15,000回転、5分間遠心し、上澄みを新しいエッペンチューブに取り、タンパク量を測定する。 タンパク量は Bio Rad 社のprotein assay Kit を用いて行った。
【００３４】
(b)タンパク電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
アクリルアミド15%濃度の lower gelおよび、4.5%濃度の stacking gel を作成する。 タンパク量30μgの試料に、それと同量の２倍濃度サンプリングバッファー(0.5M-Tr is-HCl(PH6.8) 2ml; 10%SDS 4ml; β-メルカプトエタノール 1.2ml; グリセロール 2ml； 蒸留水 0.8ml；1% BPB, 適量;)を添加し、100℃、5分間加熱し、ゲルに添加する試料を調製する。 Tris塩 30.3g; グリシン 144.0g; SDS 10.0g; 蒸留水で10Lにしたランニングバッファー中で、30mAで電気泳動を行った。
【００３５】
(c)ウエスタンブロッテイング
電気泳動を行ったゲルと PVDF 膜をトランスファーバッファー(グリシン, 72.25g; Tris-base, 15g; SDS, 3.75g; 蒸留水, 4L)中でセットし、500mAで90分間トランスファーを行った。
トランスファー後、PVDF 膜をブロッキング溶液（10g スキンミルク; 10ml 仔牛血清; 90ml 0.05%Tween20 PBS(-)溶液)に浸し、一晩冷蔵放置する。 その後、ブロッキング溶液を除去し、0.05%Tween20 PBS(-)溶液で洗浄を3回行う。 一次抗体としてADF抗体 (0.35μg/ml)を0.05%Tween20 PBS(-)溶液)で1μl/7mlに希釈し、PVDF膜を一時間処理する。 次に二次抗体として抗マウス抗体 (10μl/6ml 0.05%Tween20 PBS(-)溶液)でPVDF膜を一時間処理する。 その後0.05%Tween20 PBS(-)溶液で5回洗浄後ImmunoStar(和光純薬工業株式会社)で発色し、13,000ダルトンのバンドの濃淡でＡＤＦ量の確認を行った。
【００３６】
【表１】
ケラチノサイトのADF産生抑制作用
表１より、UV-B照射時のADF産生量を4、非照射のADF産生量を０とした場合、表１に示したdl-α-トコフェロールとラウロイルシステインは、それぞれ100ppmと0.1mＭでADF産生量が１となり、ADFの産生を顕著に抑制していた。 また、Ｌ-アスコルビン酸リン酸Mgは100ppm、N-アセチルシステインは1mM、ユビキノンQ9は10μＭ、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドは50μＭ、グアバ葉抽出物、茶抽出物および、ひまわり種子抽出物はそれぞれ100ppmでADF産生量が２となり、ADF産生抑制が認められた。 さらに、ミリセチン、ケンフェロール、クエルセチン、ルチンのフラボノール類、ナリンゲニン、ナリンギン、ヘスペリジンのフラバノン類、フラボンのフラボン類、ゲニステインノイソフラボン類、カテキン、エピガロカテキンガレートのカテキン類については、それぞれ50mＭでまた、エーデルワイス抽出物は200ppmでADF産生量が３となり、ADF産生抑制効果が弱いながらも認められた。
【００３８】
【実施例３】
メラノサイトによるメラニン産生抑制効果の測定
つぎにパッシフローラ属植物抽出物、ビオラ属植物抽出物、クレマチス属植物抽出物、ユーコミア属植物抽出物のメラニン産生抑制効果について、マウスメラノーマ細胞によるメラニン産生抑制試験について述べるが、ここに記載された実施例に限定されないのは言うまでもない。
【００３９】
試料の調製
パッシフローラ属植物抽出物として、パッションフラワー抽出物 1ｍg/ml、又はビオラ属植物抽出物としてワイルドパンジー抽出物 1ｍg/ml、又はクレマチス属植物抽出物として威霊仙抽出物 1ｍg/ml、又はユーコミア属植物抽出物として杜仲抽出物 1ｍg/ml、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油 500ppm、牛胎児血清10%の割合になるようにそれぞれの試料を秤取し、良く溶解した後、ダルベッコMEM培養液に加える。 培養液を超音波処理により透明にした後、除菌濾過をし試料を調製する。
【００４０】
細胞培養
マウスメラノーマ細胞 B-16 株を用いて、実験を行った。 培地にはダルベッコ MEM 培養液に牛胎児血清10%を添加した。 パッションフラワー抽出物、ワイルドパンジー抽出物、威霊仙抽出物、杜仲抽出物は水抽出物、50%エタノール水溶液抽出物、100%エタノール抽出物を培地にそれぞれ100ppmの濃度になるように添加した。 また、美白効果の陽性対照物質としてコウジ酸を用いた。 メラニン量の測定は培養後細胞を2N-NaOHに溶解し、400nmの吸光度を測定した。 また、細胞数は2N-NaOHに溶解した細胞溶解液の一部を Bio-Rad社のプロテインアッセイキットにより600nmの吸光度で測定し、タンパク量に換算した。 メラニン産生量は、単位タンパク量あたりのメラニン量の割合で計算した。
【００４１】
実験結果
表２にマウスメラノーマ B-16 細胞に及ぼすパッションフラワー抽出物、ワイルドパンジー抽出物、威霊仙抽出物、杜仲抽出物のメラニン産生抑制効果を示した。陽性対照であるコウジ酸は、細胞毒性のかからない上限濃度である100ppm添加で22%のメラニン産生抑制度であった。 一方、パッションフラワー抽出物は、細胞毒性がかからない濃度の300ppm添加で水抽出物が53%、50%エタノール水溶液抽出物が46%、100%エタノール抽出物が38%であり、パッションフラワー抽出物に高い美白効果が認められた。ワイルドパンジー抽出物は、細胞毒性がかからない濃度の300ppm添加で水抽出物が38%、50%エタノール水溶液抽出物が35%、100%エタノール抽出物が25%であり、ワイルドパンジー抽出物に高い美白効果が認められた。威霊仙抽出物は、細胞毒性がかからない濃度の100ppm添加で水抽出物が51%、50%エタノール水溶液抽出物が22%、100%エタノール抽出物が15%であり、威霊仙抽出物に高い美白効果が認められた。杜仲抽出物は、細胞毒性がかからない濃度の200ppm添加で水抽出物が46%、50%エタノール水溶液抽出物が33%、100%エタノール抽出物が36%であり、杜仲抽出物に高い美白効果が認められた。
【００４２】
【表２】
メラニン産生抑制効果
【実施例４】
次に本発明の各種成分を配合した化粧料の処方例を示すが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００４４】
80℃に保ち、a)〜f)に加えて乳化し、40℃まで撹拌しながら冷却する。
【００４５】
80℃に保ち、a)〜f)に加えて乳化し、40℃まで撹拌しながら冷却する。
【００４６】
80℃に保ち、a)〜f)に加えて乳化し、40℃まで撹拌しながら冷却する。
【００４７】
80℃に保ち、a)〜f)に加えて乳化し、40℃まで撹拌しながら冷却する。
【００４８】
80℃に保ち、a)〜e)に加えて乳化し、50℃まで撹拌しながら冷却する。
50℃でm)を添加し、40℃まで冷却する。
【００４９】
80℃に保ち、a)〜e)に加えて乳化し、50℃まで撹拌しながら冷却する。
50℃でm)を添加し、40℃まで冷却する。
【００５０】
80℃に保ち、a)〜e)に加えて乳化し、50℃まで撹拌しながら冷却する。
50℃でm)を添加し、40℃まで冷却する。
【００５１】
80℃に保ち、a)〜e)に加えて乳化し、50℃まで撹拌しながら冷却する。
50℃でm)を添加し、40℃まで冷却する。
【００５２】
【００５３】
【００５４】
【００５５】
【００５６】
【００５７】
【００５８】
【００５９】
【００６０】
【実施例４】に示した処方例＜処方例５：乳液１＞の処方例中、dl-α−トコフェロール1.0%、威霊仙水抽出物1.0%をそれぞれ表３の原料に置き換えて添加し、乳液を調製し効果試験に用いた。
例えば、表中18の乳液は、杜仲エキス1.0%、dl-α−トコフェロール1.0%を含む。
【００６１】
【表３】
有効性試験
黒色モルモットの背部に1cm×1cmの面積に紫外線を２MED照射し、照射後に試料を塗布する。これを1日に1回行い、合計3回繰り返し、皮膚に黒化を起こさせる。 その後、1日1回照射部位に試料を塗布し、3週間後に皮膚の黒化度を判定した。判定は、コントロールである無塗布群と比較し、5段階評価にて黒化度を判定した。なお、1匹のモルモット背部には4区画塗布区をとり、一群10匹で試験を行った。有効性の判定はコントロール群と比較してより白かったものが70%以上の場合を◎、40-70%の場合を○、20-40%の場合を△、20%以下の場合を×とした。
表４からも分かるように従来の美白効果が高いといわれるコウジ酸の有効性が20-40%であった。 また、直接メラノサイトに作用してメラニン産生を直接抑制する杜仲エキス、パッションフラワーエキス、ワイルドパンジーエキス、威霊仙エキス単独でも有効性は20-40%であった。 しかし、ADF産生抑制剤とメラニン産生抑制剤を組み合わせたものでは、いずれも有効性が40%以上で高い有効性を示した。
【００６３】
【表４】
以上詳述したごとく、本発明化粧料は、紫外線によるシミやくすにに対して優れた美白効果を示すことが分かった。 また、本発明の化粧料は、安全性が高く、安心して使用することができる。
Claims (2)
- ひまわり (Helianthus annus L.) 種子抽出物、エーデルワイス (Leontopodium alpinum) 抽出物より選ばれる１種又は２種以上を配合することを特徴とするＡＤＦ(adult T cell leukemia derived factor)産生抑制剤。
- 杜仲 (Eucommiaulmoides Oliv.) 、ワイルドパンジー (Viola tricolor L.ssp.ArvensisMurr.) 、パッション・フラワー（ Passiflora Incarnata L. ）、威霊仙 (Clematis chinensis Osbeck.)
抽出物より選ばれる 1 種又は 2 種以上及び、ひまわり (Helianthus annus L.) 種子抽出物、エーデルワイス (Leontopodiumalpinum) 抽出物より選ばれる 1 種又は 2 種以上を配合することを特徴とする美白剤。
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