JP4002577B2 - 粒子の光学的検出および分析 - Google Patents

Description

この発明は、ナノメートル、サブミクロンまたはミクロンの寸法の微粒子の光学的検出および分析に関する。

粒子が、その数、粒度、形状、組成および運動の点について分析され得る多数の原理および技術が存在する。歴史的には、粒子の観察および特徴付けは顕微鏡法の領域にあり、この顕微鏡法の領域では、極めて拡大された粒子の画像が高出力のレンズシステムを用いることによって生成され、目で直接見ることができるかまたは後でオペレータまたは画像分析システムが判読するためにカメラで撮影することができる。

入射する照明との相互作用の点から粒子を特徴付けることのできる多様な顕微鏡システムが存在する。たとえば、粒子は吸収差などの光の特定の波長を選択的に吸収し得るが、その技術は従来の透過顕微鏡法において最も一般的である。入射する照明によって照らされる場合に粒子によって生成される特定の波長を選択的に監視する他の顕微鏡の変形例、たとえば、バックグラウンドの干渉を減ずるのに有用であり、蛍光ラベルを用いることによって特定の構造を識別するのに用いることができる蛍光顕微鏡法などが存在する。さらに他の顕微鏡技術は、粒子が入射光における位相差または干渉顕微鏡法などの位相のずれを引起す方法を利用する。エピ蛍光顕微鏡法などの他の顕微鏡技術は高角度で散乱する光を用いることにより、照らされていないバックグラウンドに対してコントラストの低い粒子を映像化することが可能となる。この技術に類似の他のバージョンが顕微鏡法で用いられるが、そのうち最も一般的なものは暗視野顕微鏡法と称される。この場合、サンプルは多数のアパーチャの源によって照らされ、照明の円錐形の中央部分が検出対物レンズに入るのを光遮蔽体が遮るので、粒子は傾斜角度でのみ照らされる。

照明方法は極めてさまざまであり、或る状況においては、サンプル（典型的には粒子の水性混濁液）が透明な（典型的にはガラスまたはシリカ）光学基板上に配置されてもよく、これは、好適に規定されかつ視準された光ビームによって臨界角と称される或る角度で照らされ、入射光は、液体サンプルが配置される光学素子の面に沿ってこの臨界角で屈折する。エバネッセント波と称されるビームのわずかな部分が短い距離だけ光学基板の上方にあるサンプル相へと伝搬し、このエバネッセント領域に入る粒子がこのうちいくらかを別の非放射場で散乱させるよう作用する。次いで、外部に結合された光（すなわち、エバネッセント場内の粒子によって散乱させられる光）が、目で、または表面に対して通常の角度または高角度で位置している好適な検出器によって遠視野において検出され得る。顕微鏡構成において用いられる場合、この技術はエバネッセント場顕微鏡法と称され、減衰内部全反射の原理に依拠する。

生物学的分子または高分子などのμｍまたはμｍ以下の粒子の懸濁液またはｎｍのスケールの粒子の溶液の光学的分析のための多数の非撮像方法が存在する。このような多くの技術は生物学的分子間の相互作用を監視し、内部領域を規定するために、このような相互作用が大量の溶液相において最小限の干渉の範囲内で他の種から特定的に検出され得、このような分析はしばしば光導波路または光ファイバ構造の界面で実行され、その表面上で、目標の検体に特定の、抗体などの生物学的な捕捉分子が固定化されている。従来の導波路または光ファイバシステムにおいては、表面に関連付けられる、光学構造のエバネッセント場領域において特定の生物学的分子を結合した後で、表面の界面における屈折率の特性に関して用途が変更される。しかしながら、この場は、大量の溶液相にわずかに１００〜２００ｎｍほどしか広がらず、したがって、数が限定された分子の相互作用を含む弱い
相互作用を監視する能力が限定される。このような方法はＤＥ ４３０７０４２（９３０３０５）に開示され、ここでは、単層または多層の受容体分子がエバネッセント導波路センサ装置上に堆積し、このエバネッセント導波路センサ装置は、溶液中のさまざまな化学種および生化学種を検知しかつ定量化することができる。類似の方法が、ＳＥ ８８４０７５（８８１１１０）の優先権を主張するＷＯ ９００５２９５に開示され、ここでは、楔形のプリズムを用いることにより、光学センサ素子の下側から異なる角度で反射する光を撮像しかつ分析して、溶液中における特定の種を定量化することが可能となる。同様に、ＵＳ ２２８２３３（９４０４１５）の優先権を主張するＥＰ６７７７３５は光学的空洞共振器を記載し、ここでは、光が、溶液成分と接触する内部全反射（ＴＩＲ）空洞から反射し、その溶液成分がＴＩＲ空銅内のエバネッセント場と相互作用することにより、溶液中の種を定量化することが可能となる。これらの技術は、検知素子の表面の下側から反射される光の分析に依拠することによって特徴付けられる。

しかしながら、このような数少ない相互作用または結合事象に従う能力は、表面プラズモン共鳴技術を用いることにより１のオーダまたは２のオーダで著しく向上させることができ、この場合、光学導波路構造の表面は導電性金属、典型的には金、銀またはアルミニウムの薄い膜でコーティングされており、表面プラズモンと呼ばれる電磁波が表面プラズモン共鳴角度と呼ばれる特定の角度で金属とガラスとの界面上に入射する光のビームによって誘導され得る。捕捉された高分子を結合した後に、溶液と金属面との間の界面領域の屈折率を変調することにより、ＳＰＲ角度に変化が生じ、これは、直接測定することができるか、または、金属面の下側から反射する光の量を変化させる。このような変化は、ＳＰＲ装置の表面に結合する分子の質量と他の光学的な特性とに直接関連する可能性がある。このような原理に基づいたいくつかのバイオセンサシステムが開示されている。このように、ＳＥ８８４０７４（８８１１１０）の優先権を主張するＷＯ ９００５３０５は、光学器械類のブロックユニットの一方側上に堆積する金属膜の用途について記載し、その多機能な一方側は測定されるべき試薬またはサンプルの溶液と接触し、他方側は、光学器械類のブロックユニット内で、機能面上のリガンドの選択的な結合によって反射率が修正されるような角度で金属面から反射される光学ビームによって照らされる。反射ビームの測定は、センサの機能面に結合する特定種の密度に相関付けられてもよい。

同様に、ＧＢ８８１１５４（８８０５１０）の優先権を主張するＥＰ ３４１９２７は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）センサを含む生物学的または生化学的なテストセンサを記載し、これは、サンプルと抗体との間の表面が共鳴特性に影響を及ぼすよう配置されている。このＳＰＲセンサはガラスと金属との界面上に金属被覆されたスライドガラスを含み、その界面により、表面プラズモンが金属膜において共振するよう誘導される角度に光のビームが方向付けられる。検体の結合の際に生じる共鳴角度の変化は、金属とガラスとの界面から内側に反射した光の強度または角度を測定することによって決定される。このような非撮像反射技術は、反射した光の量または位置の変化を測定することにより、比較的多数の高分子の結合のみを監視する。

上述のエバネッセント技術と同様に、これらの技術は、特定のサンプル成分の結合の際に表面から反射した光の強度または共鳴角度における変化を測定することに依存することによって特徴付けられる。

個々の高分子または超サブミクロンの粒子の存在について、その位置を突止めるか、視覚化するか、検出するかまたは計数するために用いることのできるこのようなＳＰＲ装置の変形例が記載されているが、ここでは、個々のｎｍまたは超サブミクロンのスケールの構造と、エバネッセント表面プラズモン共鳴場との相互作用の光学的な影響により、光が、このような構造から遠視野へと高角度で散乱することとなる。したがって、ＰＣＴ／ＧＢ９８／０１５９１の優先権を主張するＷＯ ９８／５７１４８およびＵＳ ０９／３０
８０４９は、生物学的分子またはウイルスなどのサブミクロンの構造の単一の粒子を検出するための方法および装置を記載し、これは、金属の薄膜でコーティングされ表面プラズモン共鳴角度で入射する光学ビームで照らされる光学的に透明の基板を利用し、金属膜と接触するよう配置されるサンプル内に含まれるサブミクロンの粒子が、従来の光検出システムによって遠視野で検出され得る光を散乱させる。この装置はフローサイトメトリまたは光学顕微鏡の構成で構成されてもよい。

同様に、ＷＯ ９８／２２８０８およびＷＯ ０１４２７６８は、可溶性検体（たとえば、たんぱく質）または微粒子の検体（たとえば、細胞）を検出するための表面プラズモン共鳴装置を説明する。この装置はセンサを受けるよう適合されたセンサブロックを含み、上記センサ、たとえばセンサスライドは、検体を結合することのできる金属被覆されたセンサ面と、センサブロック上のセンサスライドのセンサ面でエバネッセント表面プラズモン共鳴波を生成することのできる光源と、センサ面から内側に反射する光源からの光を検出することのできる第１の検出器と、それに結合される検体から散乱または放射される光を検出することのできる第２の検出器（たとえばビデオカメラ）とを有する。随意には、当該装置はさらに、センサ面に結合される検体から散乱または放射される光の強度を高めるための第２の光源を含み、好ましくは、これは、そこから伝送される光の量を最小限にするような、第１の検出器によって検出される位置に設置される。当該装置において用いるよう適合されたセンサと、当該装置のセンサ面にサンプルをさらすステップを含み、サンプル中の検体を検出する方法とがさらに開示される。

表面プラズモン共鳴現象を利用する上述の両方の場合においては、金属面で表面プラズモンを誘起するために、照明ビームが、下にある光学的に透明な基板と接触する金属膜の下側に入射することが必要であり、次に、関連付けられるエバネッセント場からのエネルギがエバネッセント場内の目標の微粒子によって遠視野に分散される。さらに、金属膜の表面において表面プラズモンを励起するために入射照明が金属膜の下側に当らなければならない角度が極めて狭いので、構成要素の光学素子を注意深く整列させる必要がある。最後に、入射する照明ビームからエバネッセント表面プラズモン場へと金属によって結合されるエネルギの量は、しばしば、極めて小さな粒子、たとえば２００ｎｍ未満の粒子を視覚化することを可能にするために、上記場と相互作用する粒子が十分なエネルギを検出器に散乱させるには不十分である。こうして、ＷＯ０１４２７６８は、この技術による細菌細胞の視覚化の、例示としての記載に限定され、このような粒子は直径が５００ｎｍを超えている。

個々の粒子の画像の生成が必要とされない場合、たとえば、粒子の有無を決定すること、および／またはそれらの粒度、粒度分布、数などを推定することしか必要とされない場合、光散乱現象が優勢である他の原理が用いられてもよい。このような方法は、（典型的にはレーザ源からの）好適に強く集束された光のビームと粒子との相互作用により生成される光学信号の振幅の測定に依拠し、各粒子は光学測定ゾーンを通過し、ここでは、問合せビームが、光電子増倍管、フォトダイオード、ＣＣＤなどの好適な感光装置によって検出されている光学ビームと粒子との相互作用によって生成された信号を伝えるようにされる。

このような機器は粒子検出器または粒子計数器と称され、さまざまな工業的および科学的な応用例において広く用いられる。フローサイトメトリとして公知であるこのような一技術により、実質的に粒子のない液体の流体力学的なシースの急速な流れにサンプルをゆっくりと加えることによりサンプルを希釈することによって、密度の高い懸濁液中の粒子に個々に対処することが可能となり、その出力は、測定量を構成する精密に集束された問合せレーザビームを介して正確に流れるように精密に調整されたノズルによって方向付けられる。散乱した光の強度と、適用できる場合に、好適に集束された高輝度の光学源と粒
子との相互作用によって生成される蛍光波長とを測定することにより、０．２μｍほどの小さな粒子を定量化することができ、それらのサイズおよび吸収差または蛍光特性に関するさまざまな光学パラメータを決定することができる。

しかしながら、或る粒径の上限未満である場合、問合せ光ビームと粒子の相互作用によって生成される信号は、このような光学的な光散乱機器の構成に固有のバックグラウンドから識別するのに不十分である。問合せ光学ビームの強度を高めると、バックグラウンドの強度、ならびに粒子によって生成される信号を単に増大するよう作用する。このような超サブミクロンの粒子の存在を判定するために、通常、電子顕微鏡法などの解像度のより高い非光学的な技術を用いるが、これらは、複雑性と費用とが極めて高いものとなる。

したがって、高価で高出力の危険な光学源を必要とせずに、個々に（たとえば、照明放射の波長の実質的に４分の１未満の粒子などの）極めて小さな粒子の存在を検出することのできる単純でロバストな低コストの光学的粒子検出システムが必要とされるが、これは、共鳴する表面プラズモンに関連付けられるエバネッセント場の散乱の現象には依拠しない。好ましくは、このような装置は既存の光学顕微鏡および粒子検出装置と互換性があり、使用および動作が簡単であり、往々にして複雑なバックグラウンドにおいて組合された特徴を有する粒子の懸濁液についての情報、たとえば粒径、粒度分布、数および他の光学パラメータを提供することができるべきである。

明確にするために、この明細書中に言及されるすべての公報の内容が引用によりこの明細書中に援用される。

発明の概要
この発明は、ウイルス粒子を例とするサブミクロンの微粒子の少量の懸濁液が光学素子の表面上に配置される場合の予想外の発見に少なくとも部分的に基づいており、この光学素子は、たとえば、光学的に透明の（典型的にはガラスまたはシリカ）の基板を含み、その表面の一部分は金属の薄い（たとえば１０’ｓ ｎｍ）膜でコーティングされており、その金属はたとえば、少なくとも部分的に光学的に不透明なクロム、銀または金であり、このため、光学的に透明な基板のさらなる隣接領域が金属膜によって覆われないままにされ、非金属でコーティングされたその領域は、その上に、またはそれに極めて近接して入射するようにされる光のビームによって照らされるが、光のビームは、金属膜でコーティングされた領域に近い（が、典型的には一致しない）（たとえば５ミリ以内、好ましくは１ｍｍ以内、より好ましくは０．５ｍｍ以内の）点で、そして、光学ビームが隣接する金属膜に実質的に平行でそのわずかに上方にあるサンプルを通って屈折により伝搬されるような角度で照らされ、金属膜の上方にあるサンプルを通過するビームの経路内の個々のサブミクロンの粒子が、十分な量の光を散乱させることにより、従来の顕微鏡の対物レンズ／レンズの組合せを介して、目で、または遠視野における像平面において非放射性の金属被覆面の平面に対して標準の角度もしくは高角度で配置される好適な光検出器、たとえば光子増倍管、ソリッドステートのフォトダイオード、ＣＣＤカメラもしくは他の感光装置によって、個々に識別可能となることが判明した。こうして個々に検出することのできる粒子の寸法は、それらが上述のような従来の光透過性、暗視野位相コントラスト、エバネッセント場または表面プラズモン共鳴の顕微鏡技術によって検出され得なかったような寸法である。

サンプルは、典型的には、但し必ずしもそうである必要はないが、粒子の懸濁液または他の分散液から成る液体を含むだろう。粒子は固体であり得るか、またはおそらく液体（
たとえば乳濁液中の極細な小滴）であり得る。液体のサンプルは、通常、但し必ずしもそうである必要はないが、水溶液であるだろう。

一般的に言えば、この発明は、サンプル中の個々のサブミクロンの粒子の検出および／または分析のための装置を提供し、当該装置は、その１つの表面のうち少なくとも一部分が光学的に不透明な金属を含む膜でコーティングされている基板と、光学ビームが金属膜の表面の上方で、しかし実質的にはこれに平行に近接して伝搬させられるように、光学ビームが基板の上で、または基板に極めて近接して、基板のうち金属膜でコーティングされた領域に隣接するかまたはその付近にあるが、それとは一致しない点に入射するように、好適な源からの集束ビームの放射で上記基板を照らすための手段と、金属膜の平面に対して標準の角度または高角度で遠視野に位置する好適な検出器の配置により、光学ビームとの粒子の相互作用によって、粒子により個々に散乱させられるかまたは粒子から出るようにされる光学放射を検出する手段とを含む。

この発明の装置で使用するのに一般的に好適な構成要素が、なかでも、ＵＳ ６，２８０，９６０に開示される。

当業者であれば、好ましくは、この基板自体が、電磁放射のビームに対して全体的または実質的に透明であり、不透明なコーティングが、表面がそのようにコーティングされている基板の部分を実質的または全体的に不透明にするのに十分であることを理解するだろう。

典型的には、電磁放射のビームは、不透明なコーティングで部分的にコーティングされている面とは反対側の基板の表面上に入射するようにされ、次いで、そのビームが、所望の経路に沿ってサンプルを通り、基板による屈折によって伝搬されるので、このような実施例においては、基板が電磁放射に対して全体的または実質的に透明であり、基板の表面の少なくとも一部分が不透明なコーティングで覆われていないことが要件となる。

しかしながら、他の実施例では、電磁放射のビームは、たとえば、基板のうちのコーティングされた表面に直接に平行な基板に極めて近接するかまたはそれに対してわずかに「かすめる」角度でビームを伝えることによって、最初に基板を通過させずにサンプルの上に直接入射してもよく、または別の実施例においては、電磁放射が、基板の上面からの反射によってサンプルを通過するようにされる（すなわち、ビームが、不透明なコーティングで少なくとも部分的に覆われているのと同じ基板の側上に入射する）ことが少なくとも予想される。これらの実施例においては、基板が全体的または部分的に透明である必要はなく、基板表面のうち少なくとも一部分がコーティングされないままである必要はない。

電磁放射は、典型的には、１×１０^-8〜１×１０^-5ｎｍの範囲（すなわち、遠紫外線から深赤外線の範囲）の波長を有するだろう。好都合なことには、電磁放射は人の目に見える（すなわち、約３〜８×１０^-7ｎｍの範囲の）波長の光であるだろう。電子放射は、好都合には、可視光の集束ビームであり得、装置は、有利には、好適なレンズまたは他の集束手段を含むだろう。好適な電子放射源はレーザである。

典型的には、基板はガラスまたはシリカを含み、人の目に見える波長で光学的に透明であるだろう。

いくつかの実施例においては、不透明なコーティングが反射する場合にはそれが好ましい。発明者は、これまでに、不透明な金属コーティングが特に好適であることを発見した。不透明なコーティングの厚さは、好ましくは５００ｎｍ未満、より好ましくは２５０ｎｍ未満、最も好ましくは１００ｎｍ未満である。

電磁放射のビームの端は、そのｌ／ｅのポイントで規定されるが、好ましくは、基板のうちのコーティングされた表面を上回る２μｍ未満、より好ましくは１μｍ未満、最も好ましくは５００ｎｍ未満を伝搬するようにされる。さらに、ビームは、好ましくは、基板のうちのコーティングされた表面に実質的に平行に、すなわち、５°未満、好ましくは２°未満、より好ましくは１°未満、最も好ましくは０．５°未満である表面の平面に対する角度で伝搬させられ、「わずかな角度」という用語は、この明細書の目的に従って解釈
されるべきである。

この発明はまた、対応する方法を提供する。

この発明に従った好ましい実施例においては、（たとえば、粒子の特徴、たとえば粒度、粒度分布、数の密度、形状または他の光学特徴、たとえば蛍光、偏光、位相変調特性などを決定する目的で）透明な液体または気体の媒体において懸濁された（照明のために用いられている光の波長と相対的に）小さな粒子についての個々の光学的検出および／または特徴付けのための方法および装置が提供される。懸濁した粒子を含むサンプルは光学的に透明な（たとえばガラスまたはシリカ）基板を含む光学素子の表面上に配置され、その表面のうちの一部分は、少なくとも部分的に光学的に不透明な金属、たとえばクロム、銀または銀の薄い（１０’ｓ ｎｍ）膜でコーティングされており、このため、光学的に透明な基板の表面のさらなる隣接領域は金属膜でコーティングされないままにされ、非金属でコーティングされたその表面領域は、その上に入射するようにされる光のビームによって照らされるが、隣接する金属膜コーティングに近接する（が、典型的には一致しない）点で、そして、金属膜の面と実質的に平行であるかまたはそれに対してわずかな角度にあり、金属膜のわずかに上方にあるサンプルを通って光学ビームが屈折により伝搬させられるような角度で照らされ、このため、金属膜の上方にあるサンプルを通過する光学ビームの経路内におけるサブミクロンの個々の粒子が、十分な量の光を散乱させることにより、従来の顕微鏡の対物レンズ／レンズの組合せを介して、目で、または、遠視野における像平面において、コーティングされた表面の平面に対して標準の角度もしくは高角度で配置される好適な光検出器、たとえば光子増倍管、ソリッドステートのフォトダイオード、ＣＣＤカメラもしくは他の感光装置によって、個々に識別可能となることが判明した。こうして個々に検出することのできる粒子の大きさは、従来の光透過性、暗視野、位相コントラスト、エバネッセント場または表面プラズモン共鳴の顕微鏡技術によって検出され得なかったような大きさである。

有利には、光学ビームによって描かれる経路の下方にある不透明な膜の存在は、その中にある粒子の可視性を高めるよう作用し、このような粒子は、或る大きさ未満である場合、不十分な光を分散させて、金属膜がないときに見えるようにされる。したがって、基板の表面のうち少なくとも一部分上にある光学的に不透明（または実質的に不透明）な膜の存在はこの発明の本質的な特徴であると考えられる。

粒子によって放射される蛍光または粒子から分散される光は、目で、または、測定領域における各粒子から生じる光の点として好適な検出器によって見られるが、その各々からの信号の振幅は、粒子のさまざまな光学的特性を示し、さらにその存在、サイズ、運動、数、密度、蛍光などを示すことができ、そのすべてのパラメータは、所望の場合、好適な信号処理または画像分析器械類によって定量化され得る。

この発明に従うと、顕微鏡の光学部品および器械類を用いることにより、従来の光学顕微鏡技術では検出することができないほど小さな粒子を個々に検出することが可能となるが、これは、粒子成分に関連付けられる特定のパラメータ、偏光修正特性、位相変調特性または光学的な分析方法によって通常対処可能である他のいずれかのパラメータを測定するのための（固有であろうと、蛍光ラベルの追加によるものであろうと）粒子の存在、粒度、粒度分布、密度、数、蛍光属性を決定することを目的としている。

この発明の方法および関連する装置が、たとえばサイズクラスの関数として粒子の数を決定することを目的とした粒子計数装置の場合などに非顕微鏡の応用例に関連して用いられる可能性のある特定の場合においては、粒子の懸濁液は光学素子の表面の上を流れるようにされ得、このため、粒子の懸濁液は、粒子の存在または数の濃度または粒度分布を統
計的に正確に推定するために、測定量内に含まれる粒子を過度に少なくするように希釈され、量が増加した粒子含有媒体は検出領域の上を流れるようにされ得、これにより、正確に検出および分析することのできる粒子の数が増え得る。このようなより大量の粒子の計数および分析のために、この発明の方法が、フローサイトメータとして公知の機器を例とする光学的粒子測定および分析システムにおいて用いられてもよく、この場合、粒子の懸濁液は、流体力学的なシースとして公知であり高速で移動する実質的に粒子のない流体の流れへと、ノズルを介して、粒子を運ぶサンプルを導入することにより光学測定領域を通過するようにされ、このため、粒子を運ぶサンプルは、粒子が個々に光学測定領域を通過する程度にまで希釈され、粒子を運ぶサンプルの流れる方向が、光学測定領域と最適に整列するよう精密に調整され得る。１つの種類のフローサイトメータは、ＪＯＯＳ（jet-on-an-open-surface）構成として公知であるものを用い、この場合、サンプルを運ぶ流体力学的なシースの流れが、平坦で光学的に透明な表面の上に流れ、このため、サンプルの流れの部分が、問合せ光学ビームの胴部のくびれた部分においてより正確に配置されるようにノズルの位置および流れの速度を調整することによって精密に調整され得る。この発明に従うと、この明細書中に記載される金属被覆された光学面を用いることにより、有利には、上述の金属膜の存在によって与えられる可視性を高めることで、光学的に検出可能なより小さな粒子をこのようなシステムにおいて視覚化することが可能となる。

したがって、この発明のプロセスを用いて、粒子成分に関連付けられる特定のパラメータ、偏光修正特性、位相変調特性または光学的な分析方法によって通常対処可能である他のいずれかのパラメータを測定するのための（固有であろうと、蛍光ラベルの追加によるものであろうと）粒子の存在、粒度、粒度分布、密度、数、蛍光属性を決定することができるが、これは、従来の顕微鏡、フローサイトメータまたは他の光学的な粒子測定機器などの大量のレンズ構成を組込んだ光学系によって個々に検出できないほど小さい粒子についてこのような分析を実行するのに特に有用である。

この点に関して、この発明は、ｍＷの出力をもつソリッドステートのレーザ装置などの中程度の出力をもつ光学源を用いることにより、溶液または懸濁液中のラベル付けされないウイルスなどのサブミクロンの粒子を、個々に直接視覚化しかつ計数することを可能にする。

この発明は、表面付近における粒子に関連した事象の検出に対する感度によって、サブミクロンの粒子と表面コーティングおよび機能層との相互作用を適切な時期に個々に監視しかつ分析することをさらに可能にする。このような事象は、ウイルスと細胞との間の外被感染事象を調査する目的で細胞表面に示される特性を実質的に再現するよう特定的に設計された光学素子上のコーティングと別個のウイルス粒子との相互作用を含み得る。

同様に、この発明に従うと、細胞膜または壁のサブミクロンの領域と表面を有するその領域との接着は、化学的または生化学的に修正されるか、またはそうでない場合、従来の光学顕微鏡技術によって与えられる解像度および感度を上回る解像度および感度で監視され得る。有利には、このような事象は、電子顕微鏡法によるこのような相互作用の視覚化に必要な凍結乾燥された状態とは異なる水性の環境において、実時間で監視され得る。

この発明のプロセスによって個々に見ることのできる粒子の種類の範囲はまた、多様で広範囲にわたる。この明細書中に記載される光学素子を用いると、サブミクロンの粒子からの検出可能な光学信号の生成を助けるその能力により、プロセスにおける汚染レベル、または汚染のないことが望ましい産業用流体または液体における汚染レベルの推定と、生物学、環境、生物工学、食料および臨床サンプル、たとえば血液および尿ならびに他の体液、浄化媒体、医薬製剤、食料など、におけるウイルス粒子および他のサブミクロンの生物学的実体の検出とにこの発明のプロセスを適用することが可能となる。量子ドットと称
されるような蛍光ラベルとして作用するよう設計された超サブミクロンの粒子は、検出および分析に同様に適している。溶液中の他の粒子または流体相中の懸濁する他の粒子は、この発明に従って個々に検出され得、計数され得、かつ特徴付けられ得るが、粒子のない流体中の有機的または無機的な汚染粒子、気体中の煙または他の燃焼生成物の粒子、油中の汚染物質、極微な乳濁液（水中の油または油中の水）の小滴、リポソームおよびベシクル、ミセル、マイコプラズマなどの下位の微視的な細胞、自然由来もしくは産業由来のコロイドまたはいずれかの懸濁液、コロイド液もしくは調合剤を含み、この場合、光が散乱する中央部が存在するが、小さすぎるので従来の光学器械類では分析できない。当然、この発明のプロセスにより、上に入射してくる放射を分散させるかまたは修正することができ、かつ好適な検出器によってバックグラウンドから識別することのできるいずれかの粒子を個々に検出しかつ分析することが可能となることが理解されるだろう。

必要な場合にバックグラウンドから識別することが可能な好適な光学増幅器または蛍光ラベルでラベル付けすることにより、従来の光学ベースの、粒子を特徴付ける器械類を用いても個々に検出し得なかった個々の高分子および高分子構成の分析に対してこの発明のプロセスが適用可能であることがさらに理解されるだろう。同様に、この発明は、検出可能な粒子が細胞もしくは細胞成分、バイオフィルム、ポリマー層などのより大きな超分子構造の一部分である状況において適用可能であり得る。

この明細書中に記載される好適な光学源で照らされる、部分的に金属被覆された光学素子の使用は、低コストの気体、ダイオードまたはソリッドステートのレーザなどの、容易に入手可能で適度な出力を有する光源が、従来の検出光学部品および電子感光装置とともに用いられて、通常、電子顕微鏡などの極めて高性能で複雑な技術でしか個々に視覚化し得ない粒子を検出し得るという点で特に有利である。

この発明は、サンプルが溶液中に存在する事例に限定されないことに留意されたい。しかしながら、それらが存在する場合、溶媒は水またはさらには液体である必要がないが、溶液は、粒子が分析の目的で周囲の環境から光学的に区別され得る物理化学に公知のいかなる形態をもとり得る。さらに、検出されて個々に視覚化されるべき微粒子が電場または音場などの他の物理的な力によって作用されて、たとえば、物理的な運動またはサンプル中の他の成分からの分離を引起すような状況に対してこの発明のプロセスが適用可能であることが明らかとなるはずである。

上述の方法および装置の実施例に加えて、この発明は、他のさまざまな構成で、他のさまざまな目的のために用いることができる。したがって、この発明をＪＯＯＳタイプのフローサイトメトリの構成に組込むことに加えて、この発明は、極小粒子と光場との相互作用を測定する他のいかなる光学的な検出装置にも組込まれ得る。たとえば、この発明は、走査プローブの先端によって表面を効率的な高解像度で走査しかつ撮像するのを助けるために、表面を視覚化し、その表面上における所望の特徴または興味深い特徴を捜し出す手段として、走査型近接場顕微鏡などの走査型プローブ顕微鏡に組込まれてもよい。

同様に、この発明を用いることにより、こうして視覚化された粒子の動的なブラウン運動を監視および分析することができ、そこから得られた情報が、数変動分光法および蛍光相関分光法またはポイントトラッキング画像分析機器などの好適な分析技術によって用いられて、粒度、粒度分布、数、密度、および粒子同士の相互作用の性質および力学、または、存在するのであれば機能層と粒子との相互作用などの粒子の特徴の範囲が導き出され得る。

同様に、この発明を用いて、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）装置などの他の分析技術の性能を高め、当該他の分析技術からより多くの情報を得ることにより、分析されている所
与のいずれかのサンプル中の微粒子に対してＳＰＲ装置の表面を同時に分析することが可能となる。

この明細書中に記載される光学素子の表面に存在するかまたはその表面付近に存在する光場と相互作用する小さな微粒子が、光泳動として公知の現象であり光自体から得られる物理的な推進力にさらされる可能性があることにも留意されたい。粒子の物理的な運動を修正するこの能力、たとえば、光だけの圧力によって或る位置に粒子を有効に閉じ込める能力を用いると、この発明に従った粒子の分析および操作に役立つ。

この発明から結果として得られる特定の利益は、蛍光体または光散乱ラベルを用いて必ずしも光学的に増幅される必要がなく、かつ、従来の顕微鏡器械類によって検出し得ない５〜５００ｎｍの直径範囲のウイルスまたは他の粒子などの超顕微鏡的粒子を直接かつ個々に視覚化する能力を含む。分析の解像度は、サイズおよび光学特性の点で多様であり得る粒子の個体群を粒子ごとに特徴付けして分析し、所望の場合、上記粒子の空間分布を決定するための、この発明によって提供される能力によって大いに改善される。さらに、粒子から出る信号のデジタルまたは光学的相関などの高度な分析技術によって液体中に懸濁した粒子の動的挙動を監視する能力は、他の技術では得られないかもしれないサブミクロンが粒子のもつ他の物理的な特性および特徴を決定するのに有用である。装置を組み立てることのできる物理的な構成要素は複雑でも高価でもなく、素人のユーザが用いることもできる。装置は、解像度および性能を高めるために、一連の既存の光学分析器械類および器械類の設計にレトロスペクティブに適合されやすい。

ここで、この発明が、例示のために添付の図面を特に参照して、より詳細に記載される。

例
図１を参照すると、この発明に従った装置は機器要素１００を含み、この機器要素１００は、典型的にはガラスもしくはシリカのプリズムまたは平坦部である光学的に透明な基板１を有し、その部分上に金属の薄膜２が堆積され、この金属の薄膜２は、たとえば、任意の好適なスパッタリング、気相、電気化学的手段または他の析出手段によって堆積される、典型的には３０〜８０ｎｍの深さの金、銀、アルミニウムまたはクロムである。光学基板は金属膜２によって部分的にしかコーティングされず、その表面のうちの一部分３はコーティングされないままである。好適な視準、強度、偏光および波長または波長領域の光ビーム４は、光学素子上に入射するようにレンズ５によって焦点を合わせられ、このため、ビームは、金属膜２で覆われていないが金属被覆された領域に隣接する領域３における光学素子の表面に当り、当該ビームは、粒子７の懸濁液を含む液体のサンプル６が光学素子１００の表面上に配置される場合、当該ビームが、金属膜に対して実質的に平行でありそのわずかに上方にあるサンプルを通って屈折によって伝搬させられる角度で当る。ビーム内に存在するこれらの粒子７は、個々に作用して光を散乱させ、この光は、好適に整列し集束したレンズ配置８、たとえば顕微鏡の対物レンズによって遠視野で検出することができ、これは、その後、目で観察されるか、または感光装置および好適な信号処理または画像分析器械類を用いて分析されるべき液浸レンズおよび関連するレンズであり得る。代替的には、粒子は、たとえばフローセルの構造における好適な光学的に透明な平面の窓を介して、または顕微鏡のカバーガラスもしくは同等物を介して見ることができるかもしれない。

当然、粒子７によって散乱した光の単純な観察に加えて、金属膜２に近接して伝搬する際にビーム４で粒子が照らされることによって得られる他の光学的な結果が観察されかつ分析され得ることが理解されるだろう。したがって、粒子の個体群７が、本質的に蛍光性
である粒子または選択された蛍光ラベルを用いることによって具体的にラベル付けされている粒子で全体的または部分的に構成される場合、それらの粒子は、ビーム４によって照らされる金属コーティングされた基板２の領域に極めて近接して入ってくると蛍光発光するが、画像が好適な蛍光フィルタアセンブリ９によって最初にフィルタされる場合にレンズアセンブリ８を介して具体的に観察され得る。

いくつかの異なる蛍光フィルタを用いることにより、複数の波長を別個に分析することが可能となり、観察中の多様に染色された粒子の懸濁液について得ることのできる情報を拡張し得ることがさらに理解されるだろう。

図２には、ＪＯＯＳタイプのフローサイトメトリの構成において用いるための代替的な装置が示される。図１に示される光学素子は、粒子を運ぶサンプルの流れがその表面にわたって流れるのを可能にするように装着され得る。ノズル１４から流れ出し、管１６によって流体力学的なシースの流体に導入される粒子１５の流れを含む流体１３の流体力学的に集束した流れ（「流体力学的なシース」）が、光学ビームが光学素子１００の金属被覆された領域にわたって伝搬する領域を通される場合、ノズル１４を微細に調整することによってこの領域に極めて近接して流れるように方向付けられる粒子は、光を散乱させるか、または蛍光発光するよう誘導され、その光学放射は、蛍光フィルタアセンブリ１８を含むレンズシステム１７を用いることにより、必要であれば、好適な感光装置および関連する信号処理電子機器によって検出され、これらの装置および機器は、典型的には、高速で毎秒数百または数千の粒子を個々に連続して分析できるペースで、別個の粒子によって生成される光学信号を測定することが可能である。レンズアセンブリ１７は、さまざまな角度の散乱した光のうち１つ以上が粒子から出てくる散乱した放射または蛍光から選択され得るように設計および構築することができる。

図３には、粒子と機能面との相互作用を検出するための代替的な構成が示され、この代替的な構成は、機能層３０でコーティングされた図１の機器要素１００を含み、この機能層３０は、自然な細胞膜または壁面によって示される特性を実質的に再現する高分子材料または生物学的材料を含み得、液体サンプル３２中の、たとえば感染性のウイルス粒子であり得る粒子３１の相互作用から、粒子と機能面との間の結合事象の挙動、速度および数についての情報を得ることができる。代替的には、機能層は化学的または生化学的に変更を加えられた層を含んでいてもよく、その上に、抗体または他の選択性リガンド結合構造などの化学的または生物学的な分子成分が付着しており、これらは、その存在および数または他の特性がサンプル３２において設定されるのに必要とされる目標の分子または微粒子構造３１に対する特定の親和性を示す。

上述の他の実施例と同様に、粒子３１によって散乱した光の変化を簡単に観察することに加えて、光学ビームによって照らされる金属／ガラスの界面の領域に極めて近接して粒子が入ってくることによって得られる他の光学的な結果が観察および分析され得ることが、当然、明らかである。したがって、粒子の個体群３１が、本質的に蛍光性である粒子、または選択された蛍光ラベルを用いることによって具体的にラベル付けされている粒子で全体的または部分的に構成される場合、それらの粒子は、光学ビームによって照らされる金属／ガラスの界面の領域に極めて近接して入ってくると蛍光発光するが、画像が好適な蛍光フィルタによって最初にフィルタされる場合にレンズおよび検出アセンブリを介して具体的に観察され得る。同様に、粒子による入射ビームの偏光の回転が、この発明において測定され得る。

いくつかの異なる蛍光フィルタを用いることにより、複数の波長を別個に分析することが可能となり、観察中の多様に染色された粒子の懸濁液について得ることのできる情報を拡張し得ることがさらに理解されるだろう。

好ましい実施例では、光学素子はシリカ石英の平面の基板であり、その上に、約５０〜８０ｍｍの厚さの層のクロムがスパッタリング法によって堆積している。この光学素子は、たとえば４０ｍＷの適度な出力と、たとえば４８８ｎｍの好適な波長とを有するレーザビームによって好適な入射角で照らされる。（アデノウイルスなどの）臨床的または生物工学的に重要であるラベル付けされていない屈折性ウイルス粒子の個体群を含むリン酸塩緩衝生理食塩水中で希釈された臨床由来または生物学由来のサンプルなどの生物学的なサンプルの滴が光学素子の表面上に配置され、光学素子の金属被覆された領域に極めて近接したサンプルを通って伝搬する光学ビーム内でウイルス粒子がブラウン運動中に移動するときに当該ウイルス粒子が散乱させる光が、４０倍の液浸対物レンズの付いた従来の顕微鏡の下方において目で観察される。ウイルスの画像は、当然、以後の観察および分析のために好適な器械類によって記録するフィルムまたはビデオに取り込まれ得る。サンプル中のウイルス粒子の存在および数の密度は、それらウイルス粒子が散乱させる光（このサイズの領域において散乱し、それらのサイズの強い関数、たとえば半径、である光）の強度から決定され得るか、または、任意の所与の照明強度に対するサンプル中の単位体積当りの粒径に関連付けられる強度をもつ光の点の数を計数することから決定され得る。

この発明はさまざまな例示のために記載されているが、特許請求の範囲から逸脱することなくさまざまな変更を加えることが可能であることが理解されるべきである。

水性液体中に懸濁したウイルスなどのサブミクロンの粒子を検出するための、この発明に従った装置を示す図である。 フローサイトメトリの構成における応用例のためのこの発明の一用途を示す図である。 光学素子に堆積した機能層と粒子との相互作用を調べるための装置の用途を示す図である。

Claims (29)

1. サブミクロンの粒子の光学的検出および／または分析のための方法であって、
   ｉ． 光学ビームのうち少なくとも一部分が、金属膜の表面の上方で、しかし実質的にはこれに平行に近接して伝搬させられるように、集束された光学ビームが、基板の上で、または基板に極めて近接して、基板のうち金属膜でコーティングされた領域に隣接するかまたはその付近にあるが、それとは一致しない点に入射するように、その基板のうちの１つの表面のうち少なくとも一部分が光学的に不透明な金属を含む膜でコーティングされている基板を、好適な源からの集束ビームの放射で照らすステップと、
   ii． 粒子が、金属膜の上方で、しかしこれに近接して伝搬する光学ビームによって照らされる領域に入るように、サブミクロンの寸法の粒子または粒子の個体群を含むサンプルを基板の表面上に配置するステップと、
   iii． 金属膜の平面に対して標準の角度または高角度で遠視野に位置する好適なレンズおよび検出器の配置により、光学ビームとの粒子の相互作用によって粒子により個々に散乱させられるか、または粒子から出るようにされる光学放射を検出するステップとを含む、方法。
2. 基板が、全体的または実質的に光学的に透明な材料を含むか、または全体的または実質的に光学的に透明な材料から形成され、そのうちの１つの表面の一部分が、全体的または実質的に光学的に不透明な金属の膜でコーティングされ、表面の隣接部分がコーティングされないままである、請求項１に記載の方法。
3. 集束ビームの放射は、基板上において、金属膜でコーティングされた領域に隣接するかまたはその付近にある表面のうちコーティングされていない部分上におけるある一点に入射する、請求項２に記載の方法。
4. 集束された光学ビームは基板のうちの１つの表面上に入射し、基板を通過中に屈折させられ、前記表面のうち金属膜でコーティングされた部分に隣接するかまたはその付近にある反対側の表面にわずかな角度で出てくる、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
5. 前記粒子は、それらの数の密度、粒度、粒度分布、形状または運動の点において分析される、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
6. 前記粒子は、それらが発するか、または照明放射とのそれら粒子の相互作用のために発するようにされる強度および／または蛍光の波長または他の非散乱の放射の点において分析される、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
7. 前記粒子は、それらの偏光または位相変調特性の点において分析される、請求項１から６のいずれかに記載の方法。
8. 前記粒子は、光学ビームによって個々に照らされる体積に入るようにされる、請求項１から７のいずれかに記載の方法。
9. 複数の粒子は光学ビームに同時に存在し、複数の粒子の各々からの光学信号は、前記粒子を個々に特徴付けることができるように区別され得る、請求項１から８のいずれかに記載の方法。
10. サンプル中の粒子が蛍光分子でラベル付けされることにより、これらの粒子を他の粒子および／またはバックグラウンドのノイズから識別することが可能となる、請求項１から９のいずれかに記載の方法。
11. サンプルと接触すべき基板の表面のうち少なくとも一部分は、１つ以上の分子種で誘導される、請求項１から１０のいずれかに記載の方法。
12. １つ以上の分子種は、特にサンプルにおける粒子に結合する、請求項１１に記載の方法。
13. １つ以上の分子種は、それらの分子の構造特徴の機能として、特定の分子タイプを結合する抗体などの生物学的捕捉分子を含む、請求項１１または１２に記載の方法。
14. 動的なブラウン運動またはサンプル中の粒子間の相互作用に関連付けられる挙動は、数変動分光法、蛍光相関分光法などの好適な分析技術によって、または特定の信号源の追跡運動のための画像分析方法によって検出および分析され得る、請求項１から１０のいずれかに記載の方法。
15. 検出可能な粒子は、より大きな超高分子構造の一部である、請求項１から１４のいずれかに記載の方法。
16. 前記超高分子構造は、細胞もしくは細胞成分、バイオフィルム、ポリマー層または他の構造である、請求項１５に記載の方法。
17. 請求項１から１６のいずれかに記載の方法を実行するための装置であって、その１つの表面のうち少なくとも一部分が光学的に不透明な金属を含む膜でコーティングされている基板と、光学ビームが金属膜の表面の上方で、しかし実質的にはこれに平行に近接して伝搬させられるように、光学ビームが基板の上で、または基板に極めて近接して、基板のうち金属膜でコーティングされた領域に隣接するかまたはその付近にあるが、それとは一致しない点に入射するように、好適な源からの集束ビームの放射で前記基板を照らすための手段と、金属膜の平面に対して標準の角度または高角度で遠視野に位置する好適な検出器の配置により、光学ビームとの粒子の相互作用によって、粒子により個々に散乱させられるかまたは粒子から出るようにされる光学放射を検出する手段とを含む、装置。
18. 源はレーザである、請求項１７に記載の装置。
19. 基板が、粒子検出以外の目的で設計されかつ構築されたより大きなアセンブリの一部である、請求項１７または１８のいずれかに記載の装置。
20. 従来の顕微鏡構成に組込むための、請求項１７、１８または１９のいずれかに記載の装置。
21. フローサイトメータ機器構成に組込むための、請求項１７、１８または１９のいずれかに記載の装置。
22. 光ファイバの形で構成される、請求項１７、１８または１９のいずれかに記載の装置。
23. オンラインアプリケーションのために用いられるよう設計された形に構成される、請求項１７、１８または１９のいずれかに記載の装置。
24. 基板は、全体的または実質的に光学的に透明な材料を含むか、または全体的または実質的に光学的に透明な材料から形成され、そのうちの１つの表面の一部分が、全体的または実質的に光学的に不透明な金属の膜でコーティングされ、表面の隣接部分がコーティングされないままである、請求項１７から２３のいずれかに記載の装置。
25. 集束ビームの放射は、基板上において、金属膜でコーティングされた領域に隣接するかまたはその付近にある表面のうちコーティングされていない部分上におけるある一点に入射する、請求項２４に記載の装置。
26. 集束された光学ビームは基板のうちの１つの表面上に入射し、基板を通過中に屈折させられ、前記表面のうち金属膜でコーティングされた部分に近接するかまたはその付近にある反対側の表面にわずかな角度で出てくる、請求項１７から２５のいずれかに記載の装置。
27. 実質的に上記に説明され、添付の図面に関連している、装置。
28. 実質的に上記に説明され、添付の図面に関連している、方法。
29. 請求項１７から２６のいずれかに記載の装置を含む、顕微鏡またはフローサイトメータ。

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