JP3998782B2

JP3998782B2 - Rapid measurement method of microbial count and filtration membrane used for it

Info

Publication number: JP3998782B2
Application number: JP31779297A
Authority: JP
Inventors: 進瀬戸; 佳夫門司
Original assignee: Millipore Corp
Current assignee: EMD Millipore Corp
Priority date: 1997-11-05
Filing date: 1997-11-05
Publication date: 2007-10-31
Anticipated expiration: 2017-11-05
Also published as: JPH11137293A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は食品、製薬、化粧品、電子工業等の分野で使用する水、原料、中間体或いは製品等の中に存在する微生物数を迅速、簡便且つ高感度で測定する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
食品、製薬、化粧品等の分野では周知のように使用する水、原料、中間体或いは製品中の微生物の管理が極めて重要である。又、電子工業でも使用する水の水質管理は重要であって、その中の微生物数は常に把握しておく必要がある。そのため、それらの工業分野においては微生物数測定が必須となっている。
【０００３】
これらの微生物数の測定には、従来より検体中に存在する微生物を寒天平板培地上で培養しコロニーを生成せしめて検出する食品衛生検査指針に基く、いわゆる標準寒天平板法が一般的に用いられている。しかし、この方法は手間がかかる上に判定までに長時間を要し、微生物の有無の判定あるいは微生物数などの検査結果の判定が遅れるため、特に製造あるいは製品出荷の段階で判定待ち時間を要し、時間的経済的に大きなロスとなっている。したがって、より簡便な方法の開発が望まれていた。
【０００４】
この要望に応えて種々の迅速検出方法の提案がなされており、例えば、検体液中の微生物数が充分に多い場合は、少量を小試験管に採取したり、又、微生物数がやや少ない場合はフィルターを用いてろ過捕捉して濃縮した後ろ過膜を取り外し、極く少量の無菌水等にフィルターを浸漬し微生物を懸濁した後、その一部を小試験管に採取し、これに抽出試薬および発光試薬を加えて微生物中のアデノシン三リン酸（以下ＡＴＰと略す）の量をルミノメーターを用いて総光量を測定し、これから微生物数を算出するバイオミルネッセンス法が知られている（特開平２−５７１９７号、特開平２−１６３０９８号等、春田三佐夫他「食品微生物検査の簡易化、自動化、迅速化」第５８頁、サイエンスフォーラム（１９８５）日本）。
【０００５】
しかしながら、これらの方法は、微生物数が少ない検体液の場合（例えば１０³ 〜１０⁴ 個／ｍｌ以下）では抽出されるＡＴＰ量が少なくルミノメーターの測定限界以下のため検出が不可能であり、かかる場合には例えば検体液の微生物をろ過捕捉したろ過膜をその微生物の増殖に適した栄養成分を含む培地で培養を行い、微生物数を検出限界以上に増加させてから総光量を測定し微生物数算出を行わなければならないという高度な技術を必要とする等問題点があり、より一層の改善が求められていた。
【０００６】
この問題を解決するために、本発明者等はＰＣＴ公開ＷＯ９２／１４８３８号において、親水性のろ過膜（親水性ポリテトラフルオロエチレン、親水性ポリビニリデンジフルオライド、親水性ポリカーボネート、親水性ポリスルフォン、親水性ポリアミド等のプラスチック系材料やアセチルセルローズ、ニトロセルローズ又はそれらの混合物等のセルローズ系等の材料からなる例えば孔径約０．１〜１μｍのろ過膜）を格子状の疎水性区画壁（ポリフルオルエチレン、ポリビニリデンジフルオライド、ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリプロピレン等からなる区画壁でその高さはろ過膜面上例えば約０．０１〜０．０５ｍｍ、その巾は例えば約０．１〜２ｍｍの区画壁）で区画して区画壁により完全または実質的に隔離された多数の出来るだけ小面積（例えば２ｍｍ² 以下）の親水性区画を形成してなる、ろ過膜要素を作製し、検体液を大気下にろ過した後該検体液中に含まれている微生物を上記区画内に捕捉し、乾燥を行った後、各区画の堰を越すことなくろ過膜を湿らせる程度の抽出試薬、発光試薬の必要最小限度の量、すなわち、捕捉された微生物からの抽出成分および発光成分が他区画へ拡散流出を防止することなく、且つ区画内で希釈拡散を最小限にする程度の量で、微粒子状のスプレーを行い、得られた標本を高感度の生物発光画像解析システムを適用して処理することにより、微生物数由来の発光点のみを撮像し、当該課題を解決する方法を見出したことを特徴とする検体中の微生物数測定方法を提供した。
【０００７】
この微粒子状のスプレーの方法によれば、微生物から抽出されたＡＴＰ成分（発光成分）のオーバーフローが防止される結果、発光点の発光レベルが高くなり、検出効率が高められ、その結果、微生物の培養をまったく必要としないか、あるいは短時間の培養しか必要としない迅速な微生物数の計数が可能となった。
【０００８】
更に、検体液中に存在する微生物数が少ない場合により簡便に且つ正確に微生物数を検出、計数するためには、発光成分を更に局在化する必要がある。そこで本発明者等は先願発明（特開平５−３２８９９５号、平成４年４月１日出願）において、上記ＷＯ９２／１４８３８号に記載されたろ過膜要素を用いて、微生物数が１０² 個以下／ろ過膜要素、好ましくは５０個以下／ろ過膜要素を含む検体液のろ過を行った後、ろ過膜上に分散捕捉された微生物に対して特にＡＴＰの良抽出剤として沸点が１２０℃以下の揮発性大気下、抽出剤を微粒子状に噴霧した後、大気下、抽出剤を速やかに揮散させ、次いでルシフェリン−ルシフェラーゼ系の発光試薬を高濃度で且つ微粒子状に噴霧する方法により発光反応速度を増加させ結果的に発光点毎の発光量を増加させることができた。
【０００９】
かかる方法を実施することにより、ろ過膜上に捕捉された微生物に対し、極めて少量の抽出剤および発光試薬と微生物が所在する局所付近でＡＴＰ抽出および発光反応が起るため、微生物の存在局所の極近傍で発光するので前述した生物発光画像解析システム装置を用いる発光点の撮像、画像処理、解析がより効果的に行なわれるようになった。
【００１０】
しかしながら、上記のように親水性区画と疎水性隔壁とを有するろ過膜要素を用い、大気下、ＡＴＰ抽出液と発光液とを順に霧状に噴霧（スプレー）する方法、あるいは更に抽出液を揮発性のものにした方法を、食品、製薬、化粧品あるいは電子工業において実際に使用されている純水、原料、中間品あるいは製品から採取された検体液（実液）中に存在する少数個の微生物を検出・計数する場合には、未だ若干の問題が残されている。
【００１１】
例えば食品工業において、中間品あるいは製品であるビールあるいは酒中に含まれる微生物の内、１個当りＡＴＰ含量の大きい酵母の場合は計数上問題は少ないが、酵母に対してＡＴＰ含量が１／１０〜１／１００程度である細菌類を検出し、計数する場合には問題が少なくない。その理由は細菌がろ過捕捉されている分離膜自身からのノイズ発光や、実液中に含まれるノイズ発光が強いため、微生物（細菌）からのみ由来する発光点をバックグラウンド（ノイズ発光）と明確に識別できない場合がある。その場合は実液をろ過した後その微生物の増殖に適した栄養寒天培地あるいは栄養培地を滲み込ませたバット上に置き、２５−６０℃で２−２０時間培養を行って微生物を増殖させた後ろ過膜で捕捉された細菌の捕捉極近傍内でＡＴＰ抽出とこれにつづく発光を行って微生物由来の発光を出来るだけ強くして、ノイズ発光との差を大きくしてから、発光画像解析システムを用いて細菌数の検出・計数を行う必要がある。最近、ノイズ発光を抑制しようとする試みがなされ、例えばBoeringer 社のかかるキット取り扱い説明書によれば、発光試薬に、ＡＴＰ消去剤を加えてバックグラウンドノイズを抑制する方法が提案され、Lumac 社においても同様の提案がなされている。しかしこれらの方法では本来的に検出すべき微生物由来のＡＴＰの発光をも抑制するため、微量の微生物を対象に迅速に計数をすることには適用しがたい。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
以上の背景に基づき、本発明は、ろ過膜上に捕捉した微生物の計数に微生物由来の発光に影響を与えずにノイズを消去し、微生物数のみをより正確且つ簡便に検出乃至計数する方法及びそれに使用するためのろ過膜を提供することを課題とする。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、上記の出願に開示している（ＰＣＴ公開ＷＯ９２／１４８３８号、特開平６−２３７７９３号）ろ過膜要素を前処理する方法即ち、ＡＴＰ分解酵素液に浸漬したろ過膜を使用する方法が、極めて優れていることを見い出し本願発明を想到するに至った。すなわち、本発明はＡＴＰ分解酵素液に浸漬し、乾燥したろ過膜を用いて、微生物を含む液体をろ過してろ過膜に捕捉し、必要に応じ短時間培養し、液状抽出試薬、次いで液状発光試薬を細かい霧状に噴霧して微生物及びその近傍に接触させることにより、ノイズ発光点のない目的とする微生物由来の発光点のみを検出する方法を見い出したものである。
また、必要に応じてＡＴＰ分解酵素溶液を濾過膜の微生物を捕捉する片面のみに噴霧あるいは塗布して乾燥後、上述のごとく液体を濾過する工程に供し、以下同様にして微生物由来の発光点のみを検出しても構わない。
本発明はまた、これらの微生物の迅速測定法に使用するためのろ過膜として上記の優れた特性を発揮するろ過膜自体を提供する。すなわち、本発明のろ過膜は少なくとも微生物を捕捉すべき面のＡＴＰが除去されまたは存在しないろ過膜である。このようなろ過膜は、ＡＴＰ分解酵素を含む溶液に浸漬するか、または少なくとも微生物を捕捉すべき表面にＡＴＰ分解酵素を含む溶液を塗布または噴霧した後、乾燥処置を施することにより得られたものである。
本発明の原理は次の通りである。所定濃度以上のＡＴＰ分解酵素液に浸漬し乾燥したろ過膜を用い、検体中の微生物を吸引ろ過等により付着させ、十分洗浄ろ過して、乾燥する。次いで抽出試薬により発光成分例えばＡＴＰを抽出する。抽出試薬は例えばメタノールあるいはエタノールのような揮発性のものでもよいし、そうでなくてもよい。抽出されたＡＴＰにルシフェリン−ルシフェラーゼからなる発光試薬を噴霧して発光させることにより検出精度が著しく高まる。更に、高精密の発光画像解析システムを用いて微生物数の検出・計数を行なうことにより、微量な発光成分をより正確に検出計数することができる。
本発明を採用することによって、ろ過膜自身からのノイズ発光点を完全には消去出来ず、微生物由来の発光点とは識別できなかった従来法に比べ、検出精度を著しく高められ、その計数値は極めて精度、信頼性が高くなった。
【００１４】
【発明の実施の形態】
以下に本発明をより詳細に説明する。本発明では、親水性区画を格子状の疎水性区画で取り囲んで形成した特殊ろ過膜や、疎水性ろ過膜、例えばＰＶＤＦ（ポリビニリデンフルオライド）、ＰＴＦＥ（ポリテトラフルオルエチレン）、ＰＥ（ポリエチレン）、ＰＣ（ポリカーボネート）、ＰＰ（ポリプロピレン）、ＰＡ（ポリアミド）、ＰＳ（ポリスルホン）等、従来からこの目的に使用されている任意のろ過膜を使用することができる。
次に、ろ過膜を例えば０．１−１０Ｕ（Apyrase 、０．０８５〜８．５ｍｇ protein ／１０ｍｌ、sigma 社製）のＡＴＰ分解酵素液に浸漬し、室温〜３５℃、１０分間以上保温した後、取りだしノイズ発光成分の二次汚染の無いように十分に注意して乾燥して、ろ過に使用する。（乾燥は６０℃、１０〜３０分で加熱乾燥するのが望ましい。）
ろ過時、ろ過膜に捕捉される検体液中の微生物数は検出精度を高めるために１０² 個／膜以下、更には５０個／膜以下が望ましい。
次に、ＡＴＰの液状抽出試薬としては、アルコール類、エーテル類、エステル類、またはメタン、エタン、メチレンもしくはエチレン等のハロゲン誘導体、アセトニトリル、トリエチルアミン等が使用できる。沸点１２０℃以下の抽出剤で噴霧後、揮散しやすいものは特に好適である。もし残留すれば発光酵素の阻害が生じるので注意して除去する必要がある。
次に、液状発光試薬（例えばキッコーマン社、ルシフェールＬＵ）を噴霧して発光させる。
これらの液状試薬は直径２０μｍ以下、好ましくは５〜１０μｍの微粒子のミスト状に噴霧する。
噴霧手段としては、超音波微粒子噴霧器、特に自動式超音波微粒子噴霧器を使用するとよい。
【００１５】
実際の工程では、まず、カップ状ろ過容器等例えば日本ミリポアリミテッド製の「マイクロフィル、ステリフィル（商品名）」等に前記のろ過膜を装着して検体液をろ過し、微生物をろ過膜上に捕捉する。
次にろ過器からろ過膜を取り外し、乾燥後、標本ホルダーにのせ、ろ過膜の上からＡＴＰ抽出試薬を、超音波式噴霧器（松下電器製等）を用いてろ過膜上に噴霧（スプレー）する。更に、ルシフェリン−ルシフェラーゼ発光試薬を上記噴霧器により噴霧添加し、発光せしめる。続いて、発光したろ過膜（以下標本と略す）をカメラ視野内にセットし、生物発光画像解析システム装置（例えばＲＭＤＳ、日本ミリポア（株）製（商品名））を用いて、発光を累積させた後画像処理を行いノイズと見なされる発光を消去し残る発光点を計測して、微生物数を測定する。
【００１６】
ここで用いる生物発光画像解析システムは、従来の測定装置に比べ、微弱な発光であっても高感度に検知し且つ光を著しく強めて処理することができ、しかもデータの処理及び解析も早く簡便であり、さらに本発明の特殊なろ過膜及び試薬の噴霧器を用いるスプレー効果とが相乗して、１個の微生物細胞をも検出できる新規で画期的なもので、極めて優れた微生物測定法を実現するのに寄与している。
【００１７】
システムの概要は図１〜２のように、このシステムは上記の抽出試薬及び発光試薬で処理した後のろ過膜（標本）５を支持するための標本ホルダー９、標本ホルダーの下に置かれた全反射板６、遮光ハウジング８、ろ過膜に出来るだけ接近させて配置され発光を２次元的に検出するテーパーファイバー７、光増幅部及び撮像管からなる超高感度テレビカメラ１０、カメラコントローラー１１、イメージプロセッサ１２、データー解析装置１３、テレビモニター１４から構成されており、特に日本ミリポア（株）製、ＲＭＤＳ（商品名）のテーパーファイバー入力式あるいは同様の測定機能を有するものが好ましい。超高感度テレビカメラとしては冷却型固体撮像素子（ＣＣＤ）を用い、約−３０〜−１２０℃に冷却することにより、カメラ自身からのノイズを抑制して微弱発光を蓄積できるテレビカメラを用いることができる。例えば浜松ホトニクス社製の冷却ＣＣＤデジタルイメージイングシステムがある。別法として、撮像部のテーパーファイバー７及び超高感度テレビカメラ１０を反転させ、その上に標本をセットした標本ホルダーを配置して操作することもできる。標本５とテーパーファイバー７はなるべく接近させてセットするのが望ましい。それによって測定感度が著しく向上され、また従来必要であった走査が不要となる。なお、必要に応じて測定を自動化するため抽出試薬及び発光試薬の噴霧器や標本の搬送装置などを組み合わせてセットすることも出来る。
【００１８】
測定は、発光処理した前記標本（微生物を保持したろ過膜）を保持した標本ホルダー９をテーパーファイバー面に密着させて置き、超高感度テレビカメラ、カメラコントローラー及びイメージプロセッサーを用いて２次元的に光子を３０〜１８０秒間、例えば１２０秒間蓄積し、微生物からの発光を撮像し、データー解析装置により画像処理を行い発光ノイズを消去して微生物由来の強い発光のみを残してテレビモニターに表示する。この処理によって微生物由来以外の発光がノイズとして消去されるので測定された発光点数は微生物数と略一致する。
【００１９】
ここで用いる生物発光画像解析システムは、従来の測定装置に比べ、微弱な発光であっても高感度に検知し且つ光を著しく強めて処理することができ、しかもデータの処理及び解析も早く簡便であり、さらに本発明の特殊なろ過膜及び試薬の噴霧器を用いるスプレー効果とが相乗して、１個の微生物細胞をも検出できる新規で画期的なもので、極めて優れた微生物測定法を実現するのに寄与している。
【００２０】
【作用】
本発明では、ＡＴＰ分解酵素液に浸漬処理したろ過膜を用いて微生物を捕捉し、続いて抽出試薬液（特にＡＴＰ抽出試薬液）及び発光試薬（特にルシフェリン−ルシフェラーゼ試薬）を適当量微粒子の状態で噴霧添加するので、特にろ過膜由来のノイズ成分を消去できて、極めて微量の菌体成分をも容易に高精度に測定することが可能となった。
本発明の方法はろ過膜のＡＴＰ分解酵素処理により、微生物の発光に全く影響なくろ過膜自身からのノイズの発生を防ぎノイズ発光が著しく低下するため、従来法を超える明瞭な発光点が得られ、Ｓ／Ｎ比が増大し、検出が容易になるので、培養が必要でも短時間ですみ、測定が迅速に行える。
【００２１】
【実施例】
実施例１
疎水性の格子を有する親水性のＰＶＤＦ膜（ＲＭＨＶ、４７ｍｍφ、日本ミリポア製）およびポリカーボネート膜（ＨＴＴＰ、４７ｍｍφ、日本ミリポア製）をアピラーゼ液（２Ｕ／ｐＨ７、Ｈｅｐｅｓ緩衝液１０ｍｌ、ｓｉｇｍａ製）に３０℃、３０分浸漬した後、取り出し、クリーンベンチ内で風乾する。ろ過膜をろ過器（ステリフィル、日本ミリポア製）に装着する。１００ｍｌの無菌水を加え吸引ろ過する。ろ過膜を取り外し、風乾して標本ホルダーに載せる。超音波式噴霧器（松下電工製）を用いてＡＴＰ抽出試薬を２０秒間噴霧する。再度、風乾で抽出試薬中のアルコールを十分揮散させてから、その上を中空のプラスチック製カバーで覆い、更に、発光試薬を同超音波式噴霧器で７秒間噴霧して発光させる。直ちに、標本を生物発光画像解析機のカメラ上に置いて２分間フォトカウンティングを行ないテレビモニター上に撮像されるバックグランドの全光子数（４２０×４２０ｐｉｘｅｌ中の光子総数）と発光点数を測定して表１の結果を得た。
【００２２】
【表１】

【００２３】
実施例２
グルコース・ペプトン培地（日本製薬製）５ｍｌを含む中試験管に１白金耳のサッカロミセスセルビシエ（Saccharomyces cerevisiae IFO 0209 ）を接種して３０℃、１夜培養した後、無菌水で約１００ＣＦＵになるように希釈し、その０．２ｍｌを検体液とした。格子付き特殊ろ過膜（ＲＭＨＶ）をアピラーゼ液（ＩＵ／ｐＨ７、Ｈｅｐｅｓ緩衝液１０ｍｌ）に３０℃、１時間浸漬し、風乾し６０℃、３０分加熱した後、ろ過器に装着する。無菌水２０ｍｌを加えた上に、上述の検体液０．２ｍｌを加えてから吸引ろ過した。更に、無菌水２０ｍｌでろ過洗浄した後、ろ過膜を取り外し標本ホルダーにのせ風乾する。中空のプラスチック製カバーでその上を覆い、超音波式噴霧器を用いて抽出試薬を２０秒間噴霧し、５分間以上風乾してから、同噴霧器を用いて発光試薬を７秒間噴霧して発光させる。直ちに標本を測定機のカメラ上において２分間フォトンカウンティングを行ない、テレビモニター上に撮像される発光点を測定して表２の結果を得た。
【００２４】
【表２】

【００２５】
実施例３
ソイビーンカゼインダイジェスト培地（日本製薬製）５ｍｌを含む中試験管に１白金耳のエシェリシエアコリ(Esherichia coli IFO 3301)を接種し、３０℃で１夜培養した後、無菌水で約１００CFU/mlになるように希釈し、その０．２ｍｌを検体液とした。ポリカーボネート膜（ＨＴＴＰ）をアピラーゼ液（２Ｕ／ｐＨ７、Hepes 緩衝液１０ｍｌ）に３０℃、２時間浸漬し、風乾した後、ろ過器に装着する。無菌水で十分洗浄ろ過し、無菌水２０ｍｌを加えた上に、上述の検体液０．２ｍｌを加えてから吸引ろ過した。更に、無菌水２０ｍｌで洗浄ろ過した後、ろ過器からろ過膜を取り外し、ソイビーンカゼインダイジェスト寒天培地上において３０℃、４時間培養した。ろ過膜を取り出し、標本ホルダーに載せ風乾する。中空のプラスチック製カバーでその上を覆い、超音波式噴霧器を用いて抽出試薬を２０秒間噴霧し、５分間以上風乾してから、更に、同噴霧器を用いて高濃度発光試薬（通常の３倍濃度）を７秒間噴霧して発光させる。直ちに、標本を測定器のカメラ上に置いて２分間フォトンカウンティングを行ない、テレビモニター上に撮像される発光点を測定して表３の結果を得た。
【００２６】
【表３】

【００２７】
実施例４
アピラーゼ液（１Ｕ／ｐＨ７、Hepes 緩衝液１０ｍｌ）に３０℃、１時間浸漬し、風乾したポリカーボネート膜（ＨＴＴＰ、４８ｍｍφ、日本ミリポア（株）製）６０℃３０分加熱しろ過器に装着する。缶ビール（３５０ｍｌ）とトマトジュース培地（ Difco製）５ｍｌを含む中試験管に１白金耳のラクトバチルスブレビス(Lactobatillus brevis IFO 3345) を植菌し３０℃、１夜培養して無菌水で約１００CFU/mlになるように希釈した菌液を０．２ｍｌ加えて吸引ろ過する。無菌水２０ｍｌで洗浄ろ過した後、ろ過膜を取り外しトマトジュース寒天培地上に置いて３０℃、１６時間培養した。培養終了後、ろ過膜を取り出し標本ホルダーに載せ風乾する。中空のプラスチック製カバーでその上を覆い、超音波式噴霧器を用いて抽出試薬を２０秒間噴霧し、５分間以上風乾してから、同噴霧器を用いて高濃度発光試薬（常用の３倍濃度）を７秒間噴霧して発光させる。直ちに、標本を測定機のカメラ上に置いて２分間フォトンカウンティングを行ない、テレビモニター上に撮像される発光点を測定して表４の結果を得た。
【００２８】
【表４】

【００２９】
【発明の効果】
本発明によれば次の効果が得られる。
（１）本発明のろ過膜及び方法はろ過膜のＡＴＰ分解酵素処理により、ろ過膜自身からのノイズの発生を防ぐことを可能にする（実施例１）。
（２）本発明のろ過膜及び方法によれば微生物の発光に影響することなく又ノイズ発光が著しく低下するため、従来法を超える明瞭な発光点が得られ、微少量の微生物も検出できる（実施例２、３、４）。
（３）本発明のろ過膜及び方法によればＳ／Ｎ比が増大し、従来法に比べ検出が容易になるので、培養の必要がないが短時間の培養ですみ、測定が即時または迅速に行える（実施例２、３、４）。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の方法に使用できる装置の該略図である。
【図２】図１の部分拡大図である。
【符号の説明】
５試薬で処理した後のろ過膜（標本）
６全反射板
７テーパーファイバー
９ホルダー
１０光増幅部及び撮像管からなる超高感度テレビカメラ
１１カメラコントローラー
１２イメージプロセッサ
１３データー解析装置
１４テレビモニター[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for rapidly, simply and sensitively measuring the number of microorganisms present in water, raw materials, intermediates or products used in the fields of food, pharmaceuticals, cosmetics, electronics industry and the like.
[0002]
[Prior art]
As is well known in the fields of food, pharmaceuticals, cosmetics, etc., it is extremely important to manage the microorganisms in water, raw materials, intermediates or products used. Also, water quality management used in the electronics industry is important, and it is necessary to always know the number of microorganisms in the water. Therefore, measurement of the number of microorganisms is essential in those industrial fields.
[0003]
In order to measure the number of these microorganisms, a so-called standard agar plate method has been generally used based on a food hygiene inspection guideline in which microorganisms present in a specimen are cultured on an agar plate medium and colonies are generated and detected. ing. However, this method is time-consuming and takes a long time to make a determination, and the determination of the presence or absence of microorganisms or the determination of test results such as the number of microorganisms is delayed. However, it is a large loss in terms of time and economy. Therefore, development of a simpler method has been desired.
[0004]
In response to this demand, various rapid detection methods have been proposed. For example, when the number of microorganisms in the sample liquid is sufficiently large, a small amount is collected in a small test tube, or the number of microorganisms is slightly small. Filter and capture using a filter, concentrate, remove the filter membrane, immerse the filter in a very small amount of sterile water to suspend the microorganisms, extract a portion of it into a small test tube and extract it There is known a biomilescence method in which a reagent and a luminescent reagent are added, the amount of adenosine triphosphate (hereinafter abbreviated as ATP) in a microorganism is measured using a luminometer, the total light quantity is measured, and the number of microorganisms is calculated from this. (JP-A-2-57197, JP-A2-163098, etc., Misao Haruta et al., “Simplification, Automation, and Acceleration of Food Microbial Testing”, page 58, Science Forum (1985) Japan).
[0005]
However, in these methods, in the case of a sample solution having a small number of microorganisms (for example, 10 ³ to 10 ⁴ cells / ml or less), the amount of ATP extracted is small and the detection limit is not possible because it is below the measurement limit of the luminometer, In such a case, for example, the filter membrane obtained by filtering and capturing the microorganisms in the sample liquid is cultured in a medium containing nutrient components suitable for the growth of the microorganisms, and the total amount of light is measured after increasing the number of microorganisms beyond the detection limit. There are problems such as the need for advanced technology that the number must be calculated, and further improvement has been demanded.
[0006]
In order to solve this problem, the present inventors disclosed in PCT publication WO 92/14838, hydrophilic filtration membranes (hydrophilic polytetrafluoroethylene, hydrophilic polyvinylidene difluoride, hydrophilic polycarbonate, hydrophilic polysulfone). A hydrophobic partition wall (polyfluid) made of a plastic material such as hydrophilic polyamide, or a cellulose material such as acetylcellulose, nitrocellulose or a mixture thereof having a pore diameter of about 0.1 to 1 μm. A partition wall made of orethylene, polyvinylidene difluoride, polycarbonate, polyethylene, polypropylene, etc., the height of which is about 0.01 to 0.05 mm on the surface of the filtration membrane, for example, and the width is about 0.1 to 2 mm. A large number of products separated by a wall and completely or substantially isolated by the wall Only by forming a hydrophilic compartments of a small area (e.g., 2 mm ² or less), to form a filtration membrane element, the specimen liquid microorganisms contained in the該検body fluid after filtration under atmosphere within said compartment After capture and drying, the extraction reagent and the minimum amount of luminescent reagent that moisten the filter membrane without passing through the weirs of each compartment, that is, the extracted components and luminescent components from the captured microorganisms Spray fine particles in an amount that does not prevent diffusion outflow to other compartments and minimizes dilution diffusion in the compartments, and apply a highly sensitive bioluminescence image analysis system to the obtained specimens. Thus, the present invention provides a method for measuring the number of microorganisms in a specimen, characterized in that only a light emitting point derived from the number of microorganisms is imaged and a method for solving the problem is found.
[0007]
According to this fine particle spray method, the ATP component (luminescent component) extracted from the microorganism is prevented from overflowing, so that the emission level of the luminescent point is increased and the detection efficiency is increased. Rapid counting of the number of microorganisms was possible, requiring no culture at all or only a short time of culture.
[0008]
Furthermore, in order to detect and count the number of microorganisms more easily and accurately when the number of microorganisms present in the sample liquid is small, it is necessary to further localize the luminescent component. Accordingly, the inventors of the prior invention (JP-A-5-328995, filed on April 1, 1992) use the filtration membrane element described in the above-mentioned WO 92/14838 and have a count of 10 ² microorganisms. Below / filter membrane element, preferably 50 or less / After filtering the sample liquid containing the filter membrane element, the boiling point is 120 ° C. or less particularly as a good extractant for ATP against microorganisms dispersed and captured on the filter membrane Luminous reaction rate by spraying the extractant in the form of fine particles in the volatile atmosphere of the gas, then volatilizing the extractant quickly in the atmosphere, and then spraying the luciferin-luciferase luminescent reagent in a high concentration and in the form of fine particles. As a result, it was possible to increase the light emission amount at each light emission point.
[0009]
By carrying out such a method, ATP extraction and luminescence reaction occur in the vicinity of the location where the microorganisms trapped on the filtration membrane are located in an extremely small amount of the extractant, the luminescent reagent, and the microorganisms. Since light is emitted in the vicinity of the light, imaging, image processing, and analysis of the light emission point using the above-described bioluminescence image analysis system apparatus can be performed more effectively.
[0010]
However, as described above, a filtration membrane element having a hydrophilic partition and a hydrophobic partition is used, and in the atmosphere, the ATP extract and the luminescent solution are sprayed in the order of a mist, or further the extract is volatilized. A small number of microorganisms present in the sample liquid (actual liquid) collected from pure water, raw materials, intermediate products or products actually used in the food, pharmaceutical, cosmetics or electronics industries. In the case of detecting / counting, there are still some problems.
[0011]
For example, in the food industry, among microorganisms contained in beer or liquor that are intermediate products or products, yeast having a high ATP content per one has few problems in counting, but the ATP content is 1/10 of yeast. There are many problems when detecting and counting bacteria that are about 1/100. The reason for this is that the emission of noise from the separation membrane itself, in which bacteria are filtered and trapped, and the emission of noise contained in the actual solution are strong, so the emission point derived only from microorganisms (bacteria) is clearly defined as the background (noise emission). May not be identified. In that case, after filtering the actual liquid, it was placed on a nutrient agar medium suitable for the growth of the microorganism or a vat soaked with the nutrient medium, and cultured at 25-60 ° C. for 2-20 hours to grow the microorganism. Emission image analysis system after ATP extraction and subsequent luminescence in the vicinity of the trapped bacteria captured by the post-filtration membrane to increase the luminescence derived from microorganisms as much as possible and increase the difference from noise luminescence It is necessary to detect and count the number of bacteria using Recently, attempts have been made to suppress noise luminescence. For example, according to such a kit instruction manual of Boeringer, a method for suppressing background noise by adding an ATP quencher to a luminescent reagent has been proposed. A similar proposal has been made. However, since these methods also suppress the luminescence of ATP derived from microorganisms that should be originally detected, it is difficult to apply to rapid counting of a small amount of microorganisms.
[0012]
[Problems to be solved by the invention]
Based on the above background, the present invention eliminates noise without affecting the luminescence derived from microorganisms in counting the microorganisms captured on the filtration membrane, and more accurately and simply detects or counts the number of microorganisms. It is an object to provide a filtration membrane for use in it.
[0013]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors disclosed in the above application (PCT Publication WO92 / 14838, JP-A-6-237793) a method of pretreating a filter membrane element, that is, a filter membrane immersed in an ATP-degrading enzyme solution. As a result, the present inventors have found that this method is extremely excellent, and have come up with the present invention. That is, the present invention uses a filtration membrane that is immersed in an ATP-degrading enzyme solution and dried, filters the liquid containing microorganisms, captures it on the filtration membrane, and incubates for a short time if necessary. The inventors have found a method for detecting only a light emission point derived from a target microorganism without a noise light emission point by spraying a reagent in a fine mist and bringing it into contact with the microorganism and its vicinity.
In addition, if necessary, the ATP-degrading enzyme solution is sprayed or applied to only one side of the filtration membrane for capturing microorganisms, dried, and then subjected to the step of filtering the liquid as described above. May be detected.
The present invention also provides a filtration membrane itself exhibiting the above excellent characteristics as a filtration membrane for use in a rapid measurement method for these microorganisms. That is, the filtration membrane of the present invention is a filtration membrane from which ATP on the surface where microorganisms are to be captured is removed or absent. Such a filtration membrane was obtained by immersing in a solution containing an ATP-degrading enzyme, or at least applying or spraying a solution containing an ATP-degrading enzyme on the surface where microorganisms are to be captured, and then applying a drying treatment. Is.
The principle of the present invention is as follows. Using a filter membrane dipped in an ATP-degrading enzyme solution of a predetermined concentration or more and dried, the microorganisms in the specimen are attached by suction filtration or the like, sufficiently washed, filtered, and dried. Next, a luminescent component such as ATP is extracted with an extraction reagent. The extraction reagent may or may not be volatile, for example methanol or ethanol. By spraying the extracted ATP with a luminescent reagent comprising luciferin-luciferase to emit light, detection accuracy is remarkably increased. Furthermore, by detecting and counting the number of microorganisms using a highly precise luminescent image analysis system, it is possible to more accurately detect and count a very small amount of luminescent component.
By adopting the present invention, the noise emission point from the filtration membrane itself cannot be completely erased, and the detection accuracy can be remarkably improved compared to the conventional method that cannot be distinguished from the emission point derived from microorganisms. Has become extremely accurate and reliable.
[0014]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in more detail. In the present invention, a special filtration membrane formed by surrounding a hydrophilic compartment with a lattice-like hydrophobic compartment, or a hydrophobic filtration membrane such as PVDF (polyvinylidene fluoride), PTFE (polytetrafluoroethylene), PE (polyethylene). ), PC (polycarbonate), PP (polypropylene), PA (polyamide), PS (polysulfone), etc., any filtration membrane conventionally used for this purpose can be used.
Next, the filter membrane is immersed in an ATP-degrading enzyme solution of 0.1-10 U (Apyrase, 0.085-8.5 mg protein / 10 ml, manufactured by sigma), for example, and kept at room temperature to 35 ° C. for 10 minutes or more. Take out and dry carefully so that there is no secondary contamination of noise emission components, and use it for filtration. (It is desirable to dry by heating at 60 ° C. for 10 to 30 minutes.)
At the time of filtration, the number of microorganisms in the sample liquid captured by the filtration membrane is desirably 10 ² / membrane or less, more preferably 50 / membrane or less, in order to increase detection accuracy.
Next, as liquid extraction reagents for ATP, alcohols, ethers, esters, halogen derivatives such as methane, ethane, methylene or ethylene, acetonitrile, triethylamine, and the like can be used. Particularly suitable are those that readily evaporate after being sprayed with an extractant having a boiling point of 120 ° C. or lower. If it remains, the luminescent enzyme will be inhibited and must be removed with caution.
Next, a liquid luminescence reagent (for example, Kikkoman Corporation, Lucifer LU) is sprayed to emit light.
These liquid reagents are sprayed in the form of a mist of fine particles having a diameter of 20 μm or less, preferably 5 to 10 μm.
As the spraying means, an ultrasonic fine particle sprayer, particularly an automatic ultrasonic fine particle sprayer may be used.
[0015]
In the actual process, first, the above-mentioned filtration membrane is attached to a cup-shaped filtration container or the like such as “Microfil, Sterifil (trade name)” manufactured by Nihon Millipore Ltd. To capture.
Next, remove the filtration membrane from the filter, dry it, place it on the specimen holder, and spray (spray) the ATP extraction reagent on the filtration membrane using an ultrasonic atomizer (such as Matsushita Electric) from above the filtration membrane. . Further, a luciferin-luciferase luminescence reagent is added by spraying with the above-mentioned nebulizer to cause luminescence. Subsequently, the luminescent filter membrane (hereinafter abbreviated as “specimen”) is set in the camera field of view, and the luminescence is accumulated using a bioluminescence image analysis system device (for example, RMDS, manufactured by Nihon Millipore Corporation (trade name)). After that, image processing is performed to measure the remaining light emission points after eliminating the light emission regarded as noise, and the number of microorganisms is measured.
[0016]
The bioluminescence image analysis system used here can detect even weak light emission with high sensitivity and process light significantly, compared to conventional measurement devices, and it is quick and easy to process and analyze data. Furthermore, in combination with the spray effect using the special filtration membrane of the present invention and the reagent nebulizer, it is a novel and epoch-making one that can detect even one microbial cell. It contributes to realization.
[0017]
The outline of the system is as shown in FIGS. 1 and 2, and this system is placed under a specimen holder 9 for supporting a filtration membrane (specimen) 5 after being treated with the extraction reagent and the luminescent reagent. Ultra-high sensitivity TV camera 10 including a total reflection plate 6, a light shielding housing 8, a taper fiber 7 that is arranged as close as possible to a filtration membrane, and detects light emission two-dimensionally, an optical amplification unit and an imaging tube, a camera controller 11, An image processor 12, a data analysis device 13, and a television monitor 14 are preferable, and those having a taper fiber input type or a similar measurement function of RMDS (trade name) manufactured by Japan Millipore Corporation are preferable. Use a cooled solid-state imaging device (CCD) as an ultra-high sensitivity TV camera, and use a TV camera that can store weak light emission while suppressing noise from the camera itself by cooling to about -30 to -120 ° C. Can do. For example, there is a cooled CCD digital imaging system manufactured by Hamamatsu Photonics. Alternatively, the taper fiber 7 and the ultra-high sensitivity television camera 10 of the imaging unit can be inverted and a sample holder with a sample set thereon can be arranged and operated. It is desirable to set the specimen 5 and the tapered fiber 7 as close as possible. As a result, the measurement sensitivity is remarkably improved, and the conventionally required scanning becomes unnecessary. In addition, in order to automate the measurement as necessary, it is possible to set a combination of an extraction reagent and a luminescent reagent sprayer, a specimen transport device, and the like.
[0018]
In the measurement, the sample holder 9 holding the sample (filter membrane holding microorganisms) subjected to the luminescence treatment is placed in close contact with the tapered fiber surface, and two-dimensionally using an ultra-sensitive TV camera, camera controller and image processor. Photons are accumulated for 30 to 180 seconds, for example, 120 seconds, and light emission from microorganisms is imaged, image processing is performed by a data analysis device, light emission noise is eliminated, and only strong light emission from microorganisms is left and displayed on a television monitor. Since this process eliminates luminescence other than that derived from microorganisms as noise, the measured number of light emission points substantially matches the number of microorganisms.
[0019]
The bioluminescence image analysis system used here can detect even weak light emission with high sensitivity and process light significantly, compared to conventional measurement devices, and it is quick and easy to process and analyze data. Furthermore, in combination with the spray effect using the special filtration membrane of the present invention and the reagent nebulizer, it is a novel and epoch-making one that can detect even one microbial cell. It contributes to realization.
[0020]
[Action]
In the present invention, microorganisms are captured using a filtration membrane immersed in an ATP-degrading enzyme solution, and then an extraction reagent solution (especially an ATP extraction reagent solution) and a luminescent reagent (especially a luciferin-luciferase reagent) in an appropriate amount of fine particle state As a result, the noise component derived from the filtration membrane can be eliminated, and an extremely small amount of the bacterial cell component can be easily and accurately measured.
In the method of the present invention, the ATP-degrading enzyme treatment of the filtration membrane prevents the generation of noise from the filtration membrane itself without any influence on the luminescence of microorganisms, so that the noise emission is remarkably reduced, so that a clear emission point exceeding the conventional method can be obtained. Since the S / N ratio increases and the detection becomes easy, even if culture is necessary, the measurement can be performed quickly in a short time.
[0021]
【Example】
Example 1
Hydrophilic PVDF membrane having a hydrophobic lattice (RMHV, 47 mmφ, manufactured by Nihon Millipore) and polycarbonate membrane (HTTP, 47 mmφ, manufactured by Nihon Millipore) in an apyrase solution (2 U / pH 7, Hepes buffer solution 10 ml, sigma) 30 After dipping at 30 ° C. for 30 minutes, the product is taken out and air-dried in a clean bench. Attach the filter membrane to a filter (Sterifil, manufactured by Nihon Millipore). Add 100 ml of sterile water and filter with suction. Remove the filter membrane, air dry and place it on the specimen holder. ATP extraction reagent is sprayed for 20 seconds using an ultrasonic atomizer (Matsushita Electric Works). Again, the alcohol in the extraction reagent is sufficiently volatilized by air drying, and then the upper part is covered with a hollow plastic cover, and the luminescent reagent is sprayed for 7 seconds with the same ultrasonic sprayer to emit light. Immediately, place the sample on the camera of the bioluminescence image analyzer, perform photocounting for 2 minutes, and measure the total number of photons in the background (total number of photons in 420 × 420 pixels) and the number of emission points captured on the TV monitor. The results in Table 1 were obtained.
[0022]
[Table 1]

[0023]
Example 2
Inoculate 1 medium ear Saccharomyces cerevisiae IFO 0209 into a medium test tube containing 5 ml of glucose / peptone medium (Nippon Pharmaceutical Co., Ltd.) and incubate overnight at 30 ° C. to about 100 CFU in sterile water. Dilution was performed, and 0.2 ml thereof was used as a sample solution. A special filter membrane with a lattice (RMHV) is immersed in an apyrase solution (IU / pH 7, Hepes buffer solution 10 ml) at 30 ° C. for 1 hour, air-dried, heated at 60 ° C. for 30 minutes, and then attached to a filter. 20 ml of sterile water was added, and 0.2 ml of the above-mentioned sample solution was added, followed by suction filtration. Further, after filtration and washing with 20 ml of sterile water, the filtration membrane is removed and placed on a specimen holder and air-dried. The top is covered with a hollow plastic cover, the extraction reagent is sprayed for 20 seconds using an ultrasonic sprayer, air-dried for 5 minutes or more, and then the luminescent reagent is sprayed for 7 seconds using the sprayer to emit light. Immediately, the sample was subjected to photon counting for 2 minutes on the camera of the measuring machine, and the emission points imaged on the television monitor were measured to obtain the results shown in Table 2.
[0024]
[Table 2]

[0025]
Example 3
Inoculate 1 platinum ear Escherichia coli IFO 3301 into a medium test tube containing 5 ml of soy bean casein digest medium (Nippon Pharmaceutical Co., Ltd.) and incubate overnight at 30 ° C to approximately 100 CFU / ml with sterile water The sample solution was 0.2 ml. A polycarbonate membrane (HTTP) is immersed in an apyrase solution (2 U / pH 7, Hepes buffer solution 10 ml) at 30 ° C. for 2 hours, air-dried, and then attached to a filter. After thoroughly washing and filtering with sterile water, 20 ml of sterile water was added, and 0.2 ml of the above-mentioned sample solution was added, followed by suction filtration. Further, after washing and filtering with 20 ml of sterile water, the filtration membrane was removed from the filter and cultured on a soy bean casein digest agar medium at 30 ° C. for 4 hours. Remove the filter membrane, place it on the specimen holder and air dry. Cover the top with a hollow plastic cover, spray the extraction reagent for 20 seconds using an ultrasonic sprayer, air dry for 5 minutes or more, and then use the sprayer to produce a high-concentration luminescent reagent (three times the normal concentration). (Concentration) is sprayed for 7 seconds to emit light. Immediately, the sample was placed on the camera of the measuring device, photon counting was performed for 2 minutes, and the emission point imaged on the television monitor was measured, and the results shown in Table 3 were obtained.
[0026]
[Table 3]

[0027]
Example 4
It is immersed in an apyrase solution (1 U / pH 7, Hepes buffer solution 10 ml) at 30 ° C. for 1 hour, and air-dried polycarbonate membrane (HTTP, 48 mmφ, manufactured by Nihon Millipore) 60 ° C. for 30 minutes and attached to a filter. A medium test tube containing canned beer (350 ml) and tomato juice medium (Difco) 5 ml was inoculated with 1 platinum ear Lactobatillus brevis IFO 3345, cultured at 30 ° C. overnight and about 100 CFU in sterile water. 0.2 ml of the bacterial solution diluted to / ml is added and suction filtered. After washing and filtering with 20 ml of sterile water, the filter membrane was removed and placed on a tomato juice agar medium and cultured at 30 ° C. for 16 hours. After completion of the culture, the filtration membrane is taken out, placed on a specimen holder and air-dried. Cover it with a hollow plastic cover, spray the extraction reagent for 20 seconds using an ultrasonic sprayer, air-dry for 5 minutes or more, and then use the sprayer to make a high-concentration luminescent reagent (normal triple concentration). Is sprayed for 7 seconds to emit light. Immediately, the sample was placed on the camera of the measuring machine, photon counting was performed for 2 minutes, and the emission points imaged on the television monitor were measured to obtain the results shown in Table 4.
[0028]
[Table 4]

[0029]
【The invention's effect】
According to the present invention, the following effects can be obtained.
(1) The filtration membrane and method of the present invention enable the generation of noise from the filtration membrane itself by the ATP-degrading enzyme treatment of the filtration membrane (Example 1).
(2) According to the filtration membrane and method of the present invention, since the emission of noise is significantly reduced without affecting the emission of microorganisms, a clear emission point exceeding the conventional method can be obtained, and a minute amount of microorganisms can be detected ( Examples 2, 3, 4).
(3) According to the filtration membrane and method of the present invention, the S / N ratio is increased, and detection is easier than in the conventional method. (Examples 2, 3, and 4).
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a schematic representation of an apparatus that can be used in the method of the present invention.
FIG. 2 is a partially enlarged view of FIG.
[Explanation of symbols]
5 Filtration membrane (specimen) after treatment with reagents
6 Total Reflector 7 Tapered Fiber 9 Holder 10 Ultra High Sensitivity TV Camera 11 Consisting of Optical Amplification Unit and Imaging Tube Camera Controller 12 Image Processor 13 Data Analysis Device 14 TV Monitor

Claims

At least the surface of the filtration membrane to capture microorganisms is immersed in a solution containing ATP-degrading enzyme , or at least the surface containing microorganisms is coated or sprayed with a solution containing ATP-degrading enzyme, and then subjected to a drying treatment. The specimen is filtered with a filtration membrane, the microorganisms contained in the specimen are captured on the filtration membrane, and a liquid extraction reagent for extracting the luminescence reaction components in the microorganism is sprayed from the specimen, and then the luminescence reagent is removed. atomized spray to emit light in a microorganism vicinity of capturing a, it counts the number of luminescent points using luminometer, a method of measuring microbial count.

The method for measuring the number of microorganisms according to claim 1, wherein the concentration of the ATP-degrading enzyme solution used is 0.1-10 U / 10 ml.

The method for measuring the number of microorganisms according to claim 1 or 2, wherein the luminescent reagent is luciferin-luciferase.

The method for measuring the number of microorganisms according to any one of claims 1 to 3, wherein the luminescence reaction component is adenosine triphosphate.

The number of microorganisms according to any one of claims 1 to 4, wherein the extraction reagent is at least one selected from alcohols, ethers, esters, halogen derivatives such as methane, ethane, methylene or ethylene, acetonitrile, and triethylamine. How to measure.

A hydrophobic membrane selected from the group consisting of polyvinylidene fluoride, polytetrafluoroethylene, polyethylene, polycarbonate, polypropylene, polyamide, polysulfone; and hydrophilic polytetrafluoroethylene, hydrophilic polyvinylidene difluoride, The microorganism according to any one of claims 1 to 5, which is selected from a cellulose-based material such as a hydrophilic plastic selected from hydrophilic polycarbonate, hydrophilic polysulfone, and hydrophilic polyamide, acetylcellulose, nitrocellulose, or a mixture thereof. How to measure numbers.

The method for measuring the number of microorganisms according to any one of claims 1 to 6, wherein the filtration membrane is a hydrophobic filtration membrane subjected to hydrophilic treatment for restoring hydrophobicity after filtration.

The light emission point measuring device has a detection unit, a light shielding housing, a specimen holder for holding the filtration membrane in the housing, and a detection end arranged two-dimensionally in the housing and close to the filtration membrane. A taper fiber input type bioluminescence image analysis system apparatus comprising: a taper fiber having an optical fiber; and an ultra-high sensitivity television camera that amplifies and images light from the fiber. A method for measuring the number of microorganisms.