JP3964374B2 - 均一系アッセイにおけるアクリジニウム化合物および誘導体の新規用途 - Google Patents

Description

本発明は、均一系アッセイにおけるある種の特有な構造的特徴を有するアクリジニウム化合物の用途に関する。緩和なｐＨにおける発光を保証するのに必要である重要な構造的特徴を本明細書に開示する。

化学発光性のアクリジニウム・エステル（ＡＥ）は、イムノアッセイおよび核酸アッセイで広く用いられてきた極めて有用な標識である。（特許文献１〜７）は、分析物（アナライト）と呼ばれる様々な生物活性分子と複合体を生成する様々な官能基を有する様々な安定アクリジニウム・エステルを開示している。

（特許文献７）は、量子収量が増加した親水性アクリジニウム・エステルを開示している。アクリジニウム・エステル中に独特な構造的特徴を組み込むことにより、あるいはエネルギー移動の原理を用いることにより発光波長を変えることが可能であるアクリジニウム・エステルの設計にも多大な努力が向けられてきた。（特許文献８〜１２）を参照されたい。

アクリジニウム・スルホンアミドは、別の種類の化学発光化合物であり、置換フェノール脱離基が置換スルホンアミドで置き換えられている。不均一系アッセイにおけるこれらのアクリジニウム化合物の合成および用途は、従来技術である（非特許文献１〜３）に記載されている。

機構的には、酸処理が疑似塩基型のアクリジニウム化合物をアクリジニウム・エステルに変換し、そのエステルは、過酸化水素との化学発光反応に関与することが可能である。アルカリの添加は、酸を中和するばかりでなく、過酸化水素のイオン化のために反応媒体のｐＨを上昇させる働きもする。

前述の化学発光を誘発するのに必要な約２未満の強酸性ｐＨおよび約１２超の強塩基性ｐＨを有する比較的強い試薬は、抗体−ハプテン複合物または核酸ハイブリッドなどの結合性複合物の保存には不利である。このことは、シグナル発生が通常アッセイの終了時に行われ、非結合トレーサーおよび／または妨害物質が除去されている不均一系アッセイ方式では問題とならない。

均一系アッセイは、当該物質の測定を一切の分離手順なしに行う分析方法である。均一系アッセイ方式では、タグとして化学発光性アクリジニウム化合物を用いて結合イベントの発生を検出するために、より緩和なｐＨ条件下で発光が起きなければならない。なぜなら、結合性複合物の保存には強いｐＨ条件は不利なためである。さらに、結合および非結合のトレーサーまたは分析物を区別する機構が必要である。なぜなら、均一系アッセイでは一切の分離を行わないためである。これらの制約は、均一系アッセイにおけるアクリジニウム化合物の有用性の障害になっていた。

文献に記載されていると考えられるアクリジニウム化合物を用いる唯一の均一系アッセイは、「ハイブリダイゼーション・プロテクション・アッセイ」である。（非特許文献４）を参照。これらのアッセイでは、アクリジニウム・エステル標識された核酸プローブのアクリジニウム・エステル部分は、標的とハイブリダイズしない場合には加水分解によって選択的に分解される。プローブがその標的とハイブリダイズすると、アクリジニウム・エステルが加水分解から守られ、それによってハイブリダイズしたＤＮＡとハイブリダイ
ズしていないＤＮＡとの区別が可能となる。類似の加水分解速度を有するが異なる時間依存性発光プロファイルを有するアクリジニウム・エステルを用いることにより、核酸を検出するための均一系多重分析物アッセイが考案された。

（非特許文献４）においては、緩和な条件下で発光を可能にするためにアクリジニウム・エステルの構造を変化させてはいない。むしろ、（非特許文献４）のアッセイは、アクリジニウム・エステルで標識された核酸が遊離している場合、あるいは同アクリジニウム・エステル標識核酸の相補的配列とハイブリダイズしている場合のアクリジニウム・エステルの異なる加水分解（分解）速度を巧みに利用している。すなわち、相補配列とハイブリダイズしているか否かという核酸の特性を用いてアクリジニウム・エステルの分解速度を変化させている。

蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）は、生体分子における近接効果を研究するために広く用いられてきたよく知られている現象である。ＦＲＥＴでは、電子的に励起された蛍光ドナー分子は、双極子間カップリングを介してその電子エネルギーを第２の分子、すなわちアクセプター分子に移動する。このエネルギー移動は、ドナーの蛍光クエンチングを引き起こす。アクセプターが蛍光性であれば、その蛍光が観察される。

エネルギー移動の効率は、ドナーおよびアクセプターの蛍光体を隔てる距離の６乗に反比例し、ドナーの蛍光量子収量およびドナーの最大発光波長におけるアクセプターの吸光係数にも直接左右される。距離に依存するため、ＦＲＥＴは、１０ｎｍを超える距離では通常観察されない。

また、化学発光ドナーとしてイソルミノールおよびアクセプターとしてフルオレセインを用いる化学発光エネルギー移動に基づく均一系イムノアッセイも報告されている。（非特許文献５）を参照。プロゲステロンなどの小さな分析物ならびにタンパク質抗原のためのアッセイが、イソルミノール‐フルオレセインのドナー‐アクセプター対を用いて構築されたが、イソルミノールからの化学発光を緩和な条件下で引き起こすことが可能なためであろう。
米国特許第４，７４５，１８１号 米国特許第４，９１８，１９２号 米国特許第５，１１０，９３２号 米国特許第５，２４１，０７０号 米国特許第５，５３８，９０１号 米国特許第５，６６３，０７４号 米国特許第５，６５６，４２６号 米国特許第５，３９５，７５２号 米国特許第５，７０２，８８７号 米国特許第５，８７９，８９４号 米国特許第６，１６５，８００号 米国特許第６，３３５，８０３号 アダムチクら（Ａｄａｍｃｚｙｋ ｅｔ ａｌ．）、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、第５５巻、１０８９９〜１０９１４ページ（１９９９年） マティングリ（Ｍａｔｔｉｎｇｌｙ）、Ｊ．Ｂｉｏｌｕｍｉｎ．Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎ．、第６巻、１０７〜１１４ページ（１９９１年） アダムチクら（Ａｄａｍｃｚｙｋ ｅｔ ａｌ．）、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．、第１１巻、７１４〜７２４ページ（２０００年） ネルソンら（Ｎｅｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第３５巻、８４２９〜８４３８ページ（１９９６年） パテールら（Ｐａｔｅｌ ｅｔ ａｌ．）、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．、第２９／９巻、１６０４〜１６０８ページ（１９８３年） シュレーダーら（Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ ｅｔ ａｌ．）、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、第４８巻、１９３３〜１９３７ページ（１９７６年） ゾマーら（Ｚｏｍｅｒ ｅｔ ａｌ．）、「アクリジニウム・エステル標識化合物の合成、化学発光、および安定性（Synthesis, Chemiluminescence, and Stability of Acridinium Ester Labeled Compounds ）」、Ｐｒａｃｔ．Ｓｐｅｃｔｒｏｃ．（Ｌｕｍｉｎ．Ｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ａｎａｌ．）、第１２巻、５０５〜５１１ページ（１９９１年） シドキら（Ｓｉｄｋｉ ｅｔ ａｌ．）、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、第２６巻、第２号、６９ページ、（１９８８年）

本発明の目的は、強酸処理または強塩基処理を用いずに分析物を検出または定量するための化学発光性アクリジニウム化合物を用いる均一系アッセイを提供することである。

上記問題点を解決するために、請求項１に記載の発明は、強酸または強塩基を添加することなく分析物を検出または定量するための化学発光性アクリジニウム化合物を用いる均一系アッセイであって、前記化学発光性アクリジニウム化合物が、（ｉ）アクリジニウム核上のＣ２位およびＣ７位の少なくともいずれかに電子供与性官能基を有するアクリジニウム・エステル、ならびに（ｉｉ）アクリジニウム・スルホンアミドからなる群から選択されることを要旨とする。
請求項２に記載の発明は、サンプル中の分析物を検出または定量するための均一系アッセイであって、アクリジニウム核上のＣ２位およびＣ７位の少なくともいずれかに電子供与性官能基を有するアクリジニウム・エステル、またはアクリジニウム核上のＣ２位およびＣ７位の少なくともいずれかに電子供与性官能基を有するか、もしくは有していないアクリジニウム・スルホンアミドからなる群から選択される化学発光性アクリジニウム化合物と該分析物との複合体を生成する工程と、未知濃度の該分析物を含有するサンプルに所定量の該複合体を添加する工程と、該分析物に特異的な抗体を添加し、該分析物またはそのアクリジニウム複合体との結合性複合物を生成する工程と、該結合性複合物の溶液をインキュベートする工程と、６〜１０のｐＨ範囲で化学発光誘発試薬を添加することにより、該結合性複合物反応混合物の化学発光を誘発し、発光を引き起こす工程と、ルミノメーターで発光量を測定する工程と、該反応混合物からの発光量を、発光量を既知濃度の該分析物と関連付ける標準用量反応曲線と比較することにより、該分析物の濃度を計算する工程とからなることを要旨とする。

請求項３に記載の発明は、請求項２に記載のアッセイにおいて、アクリジニウム化合物が前記アクリジニウム・エステルであることを要旨とする。
請求項４に記載の発明は、請求項２に記載のアッセイにおいて、アクリジニウム化合物が前記アクリジニウム・スルホンアミドであることを要旨とする。

請求項５に記載の発明は、請求項２に記載のアッセイにおいて、前記化学発光性アクリジニウム化合物が以下の構造、すなわち

（式中、Ｒ_１は、２０個までのヘテロ原子を含むアルキル、アルケニル、アルキニルもしくはアラルキル、またはスルホプロピルもしくはスルホブチル基であり、Ｘは、酸素または窒素であり、Ｙは、２０個までの炭素原子を含む分枝鎖もしくは直鎖のハロゲン化もしくは非ハロゲン化アルキル、または置換アリール、または複素環系であり、Ｘが酸素の場合にＺは省略され、Ｙは下式の多置換アリール部分であり、

（式中、Ｒ_４およびＲ_８は、同一または異なり、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシル（‐ＯＲ）、アルキルチオール（‐ＳＲ）、またはアクリジニウム核とＹ部分間の‐ＣＯＸ‐結合を立体効果および電子効果の少なくともいずれかにより安定化する働きをする置換アミノ基であり、Ｒ_５およびＲ_７は、水素またはＲと同一であり、Ｒ_６は、‐Ｒ_９‐Ｒ_１０であり、Ｒ_９は不必要、または２０個までのヘテロ原子を含む、分枝鎖もしくは直鎖アルキル、置換もしくは無置換のアリールもしくはアラルキルであり、Ｒ_１０は、下式、すなわち

‐ＳＯ_２Ｃｌ、‐Ｎ_３、‐Ｎ_２ ^＋Ｃｌ⁻、ハロゲンもしくはカルボン酸からなる群から選択される、脱離基または脱離基に接続された求電子官能基であり、Ｒ_５およびＲ_６、ならびにＲ_６およびＲ_７は交換可能であり）、Ｘが窒素の場合には、Ｚは‐ＳＯ_２‐Ｙ’であり、Ｙ’はＹと同一の定義であり、両者は同一または異なることが可能であり、Ｗ１およびＷ２は同一または異なり、ＯＲ、ＯＨ、ＳＲ、ＳＨ、ＮＨ_２、ＮＲ’Ｒ”からなる電子供与基であって、Ｒ、Ｒ’およびＲ”は同一または異なることが可能であり、２０個までのヘテロ原子を含むアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、およびアラルキルからなる群から選択され、Ａ−は、前記アクリジニウム核の４級窒素と対をなすために導入される対イオンであり、ＣＨ_３ＳＯ_４ ⁻、ＦＳＯ_３ ⁻、ＣＦ_３ＳＯ_４ ⁻、Ｃ_４Ｆ_９ＳＯ_４ ⁻、ＣＨ_３Ｃ_６Ｈ_４ＳＯ_３ ⁻、ハロゲン、ＣＦ_３ＣＯＯ⁻、ＣＨ_３ＣＯＯ⁻、およびＮＯ_３ ⁻からなる群から選択される）を有することを要旨とする。

請求項６に記載の発明は、請求項２に記載のアッセイにおいて、当該分析物が、ステロイド、治療薬、ビタミン、ホルモンおよびペプチドからなる群から選択される小分子であることを要旨とする。

請求項７に記載の発明は、強酸または強塩基を添加することなく巨大分子分析物を検出または定量するための均一系共鳴エネルギー移動サンドイッチ・アッセイであって、該巨大分子分析物に特異的な抗体と化学発光性アクリジニウム化合物との複合体を生成する工程と、同巨大分子分析物に特異的な第２の抗体とアクセプター分子との複合体を生成する工程と、サンプル中の該巨大分子分析物と複合体との複合物を生成させ、反応混合物を形成する工程と、６〜１０のｐＨ範囲で化学発光誘発試薬を添加することにより、該結合性複合物反応混合物の化学発光を誘発する工程と（励起状態エネルギーは第１の複合体の化学発光性アクリジニウム化合物から第２の複合体のアクセプター分子へ移動され、それによって該アクセプター分子からの発光または光減衰を引き起こす）、ルミノメーターで光の量を測定する工程と、該反応混合物からの発光量を、発光の量を既知濃度の該巨大分子分析物と関連付ける標準用量反応曲線と比較することにより、該巨大分子分析物の濃度を計算する工程とからなり、前記化学発光性アクリジニウム化合物が、（ｉ）アクリジニウム核上のＣ２位およびＣ７位の少なくともいずれかに電子供与性官能基を有するアクリジ
ニウム・エステル、ならびに（ｉｉ）アクリジニウム・スルホンアミドからなる群から選択されることを要旨とする。

請求項８に記載の発明は、請求項７に記載のアッセイにおいて、当該巨大分子分析物が、タンパク質、核酸、オリゴ糖、抗体、抗体フラグメント、細胞、ウイルスおよび合成高分子からなる群から選択されることを要旨とする。

請求項９に記載の発明は、アクリジニウム・エステルのアクリジニウム核上のＣ２位およびＣ７位の少なくともいずれかに電子供与性官能基を付けることにより、アクリジニウム・エステルの疑似塩基の生成を抑制することを要旨とする。

請求項１０に記載の発明は、請求項９に記載の方法において、電子供与性官能基がＯＲ、ＯＨ、ＳＲ、ＳＨ、ＮＨ２、ＮＲ' Ｒ”式中、Ｒ、Ｒ' およびＲ”同一または異なることが可能であり、２０個までのヘテロ原子を含むアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、およびアラルキルからなる群から選択される）からなる群から選択されることを要旨とする。

本発明は、比較的緩和なｐＨ条件下で化学発光を誘発することが可能であるアクリジニウム・エステルおよびアクリジニウム・スルホンアミドを含むある種のアクリジニウム化合物を含む。比較的緩和な条件下で化学発光を誘発することが可能であるこのようなアクリジニウム化合物の有効性は、均一系共鳴エネルギー移動アッセイにおいてこのような化合物を使用することを可能にしている。意外にも、これらのアクリジニウム化合物から誘導されるハプテン・トレーサーが、溶液中に遊離しているかそれぞれの抗体と結合しているかによって発光の効率に著しい差を示すことが発見された。この現象の発見により、臨床的に重要な分析物の均一系アッセイを実現することができた。

本発明のアクリジニウム化合物から誘導されるハプテン・トレーサーは、それらに対応する抗体と結合すると発光の効率に変化を示す。発光の効率とは、アクリジニウム化合物が遊離であるか抗体と結合しているかによってより多くの光またはより少ない光を放射することを意味する。これらの化合物が抗体と結合した場合、アクリジニウム・エステルの場合には発光が増加し、アクリジニウム・スルホンアミドの場合には発光が減少する。したがって、アクリジニウム化合物によって発光が増強されるかまたは減衰されるかのいずれかになる。

これらの効果を利用し、テオフィリン、バルプロエートおよびカルバマゼピンを含む臨床的に重要な分析物の濃度測定または定量または検出のための均一系アッセイを考案した。さらに、本明細書に開示したアクリジニウム化合物は共鳴エネルギー移動（ＲＥＴ）アッセイにも使用することが可能であり、この場合、化学発光反応中にアクリジニウム化合物から生成するアクリドンからの励起状態エネルギーは、スペクトル特性（異なる波長における放射またはクエンチング）がアクリジニウム化合物のスペクトル特性と識別可能であるナフトフルオレセインおよびダブシルなどのアクセプター分子へ分子間で移動される。

アクリジニウム構造および疑似塩基生成
よく知られているように、アクリジニウム化合物は、ほぼすべてのイムノアッセイが行われる水性媒体中ではアクリジニウム型と疑似塩基型との平衡で存在する。疑似塩基型のアクリジニウム化合物は、過酸化水素と反応し得ないため化学発光を生みだし得ない。化学発光性のアクリジニウム型と非化学発光性の疑似塩基型との平衡は、媒体のｐＨに強く影響を受ける。酸性ｐＨはアクリジニウム型の生成を促進し、塩基性ｐＨは疑似塩基型の生成を促進する。下記の平衡反応は、アクリジニウム型から疑似塩基への変換を示す。

Ｒは通常、２０個までのヘテロ原子を含むアルキル、アルケニル、アルキニルもしくはアラルキルまたはスルホプロピルもしくはスルホブチル基であり、Ｌは通常、芳香族アルコールまたはスルホンアミドなどの脱離基である。

不均一系アッセイ方式では、アクリジニウム化合物またはアクリジニウム化合物標識された生物活性分子（トレーサーもしくは複合体と呼ばれる）からの化学発光は、通常、２種類の試薬を順次添加することによって誘発される。最初の過酸化物を含む強酸によるアクリジニウム化合物の処理は、アクリジニウム化合物の疑似塩基型をアクリジニウム型へ変換するのに必要である。続くアルカリ溶液による処理は酸を中和し、過酸化水素のイオン化のために反応媒体のｐＨを上昇させ、発光が起きるのを可能にする。

均一系アッセイ・フォーマットでは、緩和な条件、すなわち約６〜１０、好ましくは約７〜９の緩和なｐＨでアクリジニウム化合物からの発光が起きる。アッセイ媒体に強酸を添加することなくアクリジニウム型を維持することは、化学発光を発生させるための必須条件である。さらに、酸処理工程を省略することにより、酸を中和し化学発光を誘発するために強塩基を添加する必要性も除去される。

意外にも、アクリジニウム核上のＣ２位および／またはＣ７位に電子供与基を有するアクリジニウム・エステルは、緩和なｐＨにおいて無置換のアクリジニウム・エステルよりも疑似塩基を生成しにくいことが発見された。

本発明で使用するのに適している化学発光性アクリジニウム化合物は、下記の構造を有する。

（式中、
Ｒ_１は、２０個までのヘテロ原子を含むアルキル、アルケニル、アルキニルもしくはア
ラルキルまたはスルホプロピルもしくはスルホブチル基であり、
Ｘは、酸素または窒素であり、
Ｙは、２０個までの炭素原子を含む分枝鎖もしくは直鎖のハロゲン化もしくは非ハロゲン化アルキル、または置換アリール、または複素環系であり、
Ｘが酸素の場合にＺは省略され、Ｙは、下式の多置換アリール成分であり、

式中、Ｒ_４およびＲ_８は、同一または異なり、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシル（‐ＯＲ）、アルキルチオール（‐ＳＲ）、またはアクリジニウム核とＹ成分間の‐ＣＯＸ‐結合を立体効果および／または電子効果により安定化する働きをする置換アミノ基であり、
Ｒ_５およびＲ_７は、水素またはＲと同一であり、
Ｒ_６は、‐Ｒ_９‐Ｒ_１０であり、
Ｒ_９は不必要、または２０個までのヘテロ原子を含む、分枝鎖もしくは直鎖アルキル、置換もしくは無置換アリールまたはアラルキルであり、
Ｒ_１０は、下式

ハロゲンまたは‐ＣＯＯＨからなる群から選択される、脱離基または脱離基に接続された電子求引基であり、
Ｒ_５およびＲ_６、ならびにＲ_６およびＲ_７は交換可能であり、
Ｘが窒素の場合には、Ｚは‐ＳＯ_２‐Ｙ’であり、Ｙ’はＹと同一の定義を有し、両者は同一または異なることが可能であり、
Ｗ１およびＷ２は、同一または異なり、ＯＲ、ＯＨ、ＳＲ、ＳＨ、ＮＨ_２、ＮＲ’Ｒ”からなる電子供与基であり、Ｒ、Ｒ’およびＲ”は同一または異なることが可能であり、２０個までのヘテロ原子を含むアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、およびアラルキルからなる群から選択され、
Ａ⁻は、前記アクリジニウム核の４級窒素と対をなすために導入される対イオンであり、ＣＨ_３ＳＯ_４ ⁻、ＦＳＯ_３ ⁻、ＣＦ_３ＳＯ_４ ⁻、Ｃ_４Ｆ_９ＳＯ_４ ⁻、ＣＨ_３Ｃ_６Ｈ_４ＳＯ_３ ⁻、ハロゲン、ＣＦ_３ＣＯＯ⁻、ＣＨ_３ＣＯＯ⁻、およびＮＯ_３ ⁻からなる群から選択される。）
より具体的には、アクリジニウム化合物は、下記構造のアクリジニウム・エステルでありうる。

（式中、Ｒ_１１は下式

と‐ＮＨ‐Ｒ‐ＮＨ_２とＯＨとから選択され、かつＲ１、ＲおよびＡ‐は、前述の通りである。）
あるいは、アクリジニウム化合物は、下記構造のアクリジニウム・エステルであることが可能である。

（式中、Ｒ_１２は、水素、アミノ、ヒドロキシル、ハロゲン、ニトロ、‐ＣＮ、‐ＳＯ_３Ｈ、‐ＳＣＮ、‐ＯＲ、ＮＨＣＯＲ、‐ＣＯＲ、‐ＣＯＯＨ、‐ＣＯＯＲ、または‐ＣＯＮＨＲから選択され、かつＲ_１、Ａ⁻およびＲ_１１は、前述の通りである。）
また、本発明のアクリジニウム化合物は、下記構造のアクリジニウム・スルホンアミドであることも可能である。

（式中、Ｒ_１、Ａ−、ＲおよびＲ_６は、前述の通りである。）
図１にはジメチル・アクリジニウム・エステル（ＤＭＡＥ）のｐＨ滴定を、図２には２，７‐ジメトキシ‐ＤＭＡＥのｐＨ滴定を示し、アクリジニウム発色団の紫外吸収バンドをｐＨの関数としてプロットしてある。この吸収バンドの強度の減少は、アクリジニウム発色団の破壊および疑似塩基の生成を示している。ＤＭＡＥについての図１から、疑似塩基生成がｐＨ４を超えると基本的に完結することは明らかである。図２から、電子に富んだ２，７−ジメトキシ類縁体については疑似塩基生成がｐＨ１１を超える場合にのみ完結することが明らかである。

電子に富んだアクリジニウム化合物からの化学発光を酸で前処理せずに、かつより緩和なｐＨで誘発することが可能であるか否かを判断するため、ｐＨ８．３あるいはｐＨ９のいずれかの炭酸ナトリウム緩衝液に溶かした１％過酸化水素および０．５％塩化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＣ）界面活性剤からなる単一の化学試薬を用いることにより、２，７‐ジメトキシ‐ＤＭＡＥおよび２‐ＣＭＥ‐７‐メトキシ‐ＤＭＡＥを含むいくつかのアクリジニウム化合物ならびに抗ＴＳＨタンパク質複合体からの化学発光を測定した。

結果を表１に要約して示す。列挙したすべての化合物について、改良された誘発剤を用いて放射された光の量を、０．１Ｎ硝酸に溶かした０．５％過酸化水素と、続いてＣＴＡＣ界面活性剤を含有する０．２５Ｎ ＮａＯＨを順次添加した後で通常測定される光に対する割合（％）として表す。この表には、アクリジニウム・スルホンアミドについての結果も含まれている。アクリジニウム・スルホンアミドは、発光の量子効率および加水分解安定性の点でアクリジニウム・エステルに匹敵する。

化学発光は、Ｍａｇｉｃ Ｌｉｔｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（ＭＬＡ１、ベイヤーダイアグノスティックス社（Ｂａｙｅｒ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ））で５秒間測定した。様々な化合物のサンプルは、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ ＢＳＡおよび０．０１％アジ化ナトリウムを含有するｐＨ８の１０ｍＭリン酸塩中で調製した。

表１のデータは、Ｃ２位および／またはＣ７位への電子供与性官能基の配置により、約８〜９のｐＨ範囲において対応するアクリジニウム・エステルからの化学発光反応が起きることが可能になっていることを示している。アクリジニウム分子上のＣ２位およびＣ７位は等価である。すなわち、これらのどちらかの位置に唯一の官能基、例えばメトキシまたはヒドロキシが存在する場合には、Ｃ２位にあると呼ばれるであろう。２個の官能基が存在すれば、第２の対応する位置はＣ７である。アクリジニウム分子は対称であるため、Ｃ２位はＣ７位と同じである。同様にＣ３位はＣ６位と同じである。しかしながら、Ｃ２とＣ３は等価ではない。したがって、Ｃ２の単一メトキシ基は、Ｃ３のメトキシ基と等価ではない。

表１に列挙したアクリジニウム化合物の化学構造は以下の通りである。

すなわち、２‐ヒドロキシ‐ＤＭＡＥおよび２，７‐ジメトキシ‐ＤＭＡＥは、それぞれ電子供与基を有するアクリジニウム・エステルである。２‐ヒドロキシ‐ＤＭＡＥのヒドロキシ基は電子供与基であり、２，７‐ジメトキシ‐ＤＭＡＥの２個のメトキシ基は電子供与基である。さらに、電子に富んだアクリジニウム核が存在しなくても緩和なｐＨでアクリジニウム・スルホンアミドからの化学発光を誘発することが可能である。電子供与基が存在しなくてもアクリジニウム・スルホンアミド（ＮＳＰ‐ＡＳ）で化学発光が可能である理由は不明である。

抗体結合トレーサーのシグナル変調を用いる均一系アッセイ
（ａ）アクリジニウム・エステル
アクリジニウム・エステルである２，７‐ジメトキシ‐ＤＭＡＥを３種類の分析物、バルプロエート、テオフィリンおよびカルバマゼピンと複合体生成させ、一般的には免疫化学的技法によって測定されるトレーサーを生成した。様々なその他の対象分子とアクリジニウム化合物との複合体を作製する工程段階は、有機合成に関わる当業者にはよく知られている。アクリジニウム化合物の複合体は、アクリジニウム化合物と対象の分子からなり、共有結合がこの２つの部分を連結している。対象の分子は、ステロイド、治療薬、ビタミン、ホルモンおよび小さなペプチドなどの小分子、またはタンパク質、核酸、オリゴ糖、抗体、抗体フラグメント、細胞、ウイルスおよび合成高分子などの巨大分子でありうる。タンパク質の例には、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラビジン（ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ、登録商標）、受容体、およびアレルゲンが含まれる。

共有結合は、アミド結合、エステル結合、エーテル結合、２個の炭素原子を連結する結合などであることが可能である。一般に、アクリジニウム化合物と対象の分子との間の共
有結合の生成は、これら２つの部分の相補的な反応性官能基の間の化学反応によって行われる。例えば、アミド結合は、ある分子上のカルボン酸官能基と第２の分子上のアミノ基とから作られる。通常、そのプロセスは、カルボン酸を活性エステルまたは無水物などの反応性の形態へ変換し、続いてアミノ基と反応させるものである。

最初は、これらの分析物に対応する抗体を蛍光体で標識し、アクリジニウム・トレーサーから抗体上の蛍光体への共鳴エネルギー移動を用いる均一系アッセイを行うことが想定された。しかしながら、実験により、３種類のすべての分析物に対する対応するトレーサーへの抗体結合の結果として、数秒間にわたり測定したアクリジニウム・エステルの発光が予想外に増強することが明らかになった。したがって、これらの分析物に対応する抗体を蛍光体で標識する必要は無かった。

アクリジニウム・エステルに関する光増強の大きさは３種類の分析物で異なっていた。このことは、それぞれのハプテンに対するこれら３種類の異なる抗体の親和性および／または微小環境の違いを反映している可能性がある。

アクリジニウム・エステル抗体結合トレーサーからの発光速度が遊離トレーサーに比べてより早いことが、観察された化学発光シグナルの増加に対する１つの可能性のある機構である。イソルミノール‐ビオチン複合体がアビジンと結合した時の化学発光の増強が（非特許文献６）に報告されている。

バルプロエート、テオフィリンおよびカルバマゼピンの３種類の分析物すべてについて、希釈することなく結合反応からの化学発光シグナルを直接測定することが可能であった。したがって、これらの小分子アッセイを行うことは極めて簡単である。小分子分析物を測定するための均一系アッセイを考案し実施することに関係する工程には、小分子分析物と前述のアクリジニウム化合物の複合体を生成すること、および有機溶媒（例えばジメチルホルムアミド）と水または緩衝液との混合物などの適切な溶媒に溶かした複合体の溶液を作成することが含まれる。アクリジニウム化合物は、Ｃ２位および／またはＣ７位に電子供与性官能基を有するアクリジニウム・エステルあるいはＣ２位および／またはＣ７位に電子供与性官能基を有するもしくは有していないアクリジニウム・スルホンアミドである。

この複合体を用いて、アクリジニウム複合体と結合したときに約６〜１０のｐＨで同複合体の化学発光が誘発された場合の該複合体からの発光強度に変化を引き起こす抗体を選択するために、分析物の様々な抗体をスクリーニングする。

この複合体を用い、液体（通常は血清）中の様々な既知濃度の分析物からなる一連の「標準品」を用いて用量反応曲線を作成する。一般に、このことは、一定容積の緩衝液中で一定濃度のアクリジニウム複合体を各標準品に混ぜること、および溶液中で分析物あるいはそのアクリジニウム複合体との複合物を生成することができる限定量の所望の抗体を加えることによって行われる。

次いで、分析物、複合体および抗体を含む溶液を室温において一定時間、通常は約１０〜６０分間インキュベートし、反応混合物を生成する。
次いで、炭酸塩、ホウ酸塩、リン酸塩、およびトリスなどの緩衝液に溶かした過酸化水素の溶液などの化学発光誘発試薬を加えることにより、約６〜１０のｐＨで反応混合物の化学発光を誘発する。次いで、ルミノメーターで化学発光を測定する。次いで、標準品中の分析物の濃度に対して観測された発光をプロットすることにより用量反応曲線を作成する。

次いで、標準溶液と同一条件でサンプルをインキュベートすることにより分析物の未知サンプルの濃度を決定する。標準分析物の化学発光を誘発するのに用いた同一の誘発剤で分析物の未知サンプルの化学発光を誘発し、用量反応曲線からその濃度を決定する。

カルバマゼピン、テオフィリンおよびバルプロエートについての均一系アッセイを、少量（０．２ｍＬ）の緩衝液に溶かした２，７‐ジメトキシ‐ＤＭＡＥトレーサーを用いて行った。ナノモル濃度のトレーサーをヒト血清中でハプテン標準品と混ぜた。限られた量の対応する抗体を添加することにより、結合反応を開始させた。これらの反応は、分析物とトレーサーが限定量の抗体に対して競合するため、真の競合アッセイである。

ハプテンの濃度が増加するにつれて抗体結合トレーサーの濃度が減少し、その結果アクリジニウム・エステルの化学発光シグナルが比例して減少した。
（ｂ）アクリジニウム・スルホンアミド
緩和な条件におけるアクリジニウム・スルホンアミドのハプテン複合体の化学発光誘発は、アクリジニウム・エステルで観察されたこととまったく対照的な特徴を示した。アクリジニウム・エステルの場合、抗体と結合するトレーサーは化学発光の増加をもたらすが、アクリジニウム・スルホンアミドの場合、抗体によるトレーサー結合は化学発光の減少をもたらす。アクリジニウム・スルホンアミド抗体結合トレーサーからの発光速度がより遅いことが、観察された化学発光シグナルの減少に対する可能性のある機構である。アクリジニウム・スルホンアミド由来のトレーサーの相対的発光収量は、複合体を生成したハプテンに依存していた。さらに、化学発光を誘発するのにＣ２位および／またはＣ７位の電子供与性官能基は必要でなかった。

遊離のトレーサーに比べ、抗体結合トレーサーの化学発光を数秒間測定すると、発光の減少を示した。抗体結合バルプロエート、テオフィリンおよびカルバマゼピン・トレーサーは、遊離トレーサーに対し２８％、１２％および５％の相対的発光を示した。発光の速度プロファイルは、抗体と結合した時の化学発光反応速度の低下を示した。この現象を用い、分析物であるバルプロエート、テオフィリンおよびカルバマゼピンの均一系アッセイを考案した。

クエンチングを用いる均一系アッセイ
抗体によるトレーサーへの結合によるシグナル変調の他に、本発明のアクリジニウム化合物を用いる均一系アッセイのための代替構築物には、用量反応曲線を作成するための機構としてシグナル・クエンチングの現象を用いることが必要である。

シグナル・クエンチングは、アクリジニウム化合物からエネルギーを吸収するがそれ自体は放射しないアクセプター分子を用いてアクリジニウム化合物の化学発光を減少させる。アクリドンは、アクリジニウム化合物の過酸化水素との化学反応から電子的に励起された状態で生成される化学種である。通常は光として放射されるアクリドンの電子的励起エネルギーを吸収し、非放射経路を介してそのエネルギーを消失させうる任意の分子が、このクエンチング機能を果たすことが可能である。この目的にはダブシルが一般に使用されている。

抗体‐トレーサー複合物では、抗体とアクリジニウム化合物由来のトレーサーとの空間的接近は、アクリジニウム化合物からの励起状態エネルギーが抗体上の好適なアクセプター分子に伝達されうることを示唆している。この点をさらに検討するため、２‐ＣＭＥ‐７‐メトキシ‐ＤＭＡＥのバルプロエート・トレーサーを調製した。実施例２を参照。

このトレーサーを非標識バルプロエート抗体とインキュベートしても化学発光シグナルに一切の変調は認められなかった。抗体を消光剤（クエンチャー）のダブシルで標識した
場合には、抗体結合トレーサーは発光の低下を示した。したがって、化学発光シグナルの同時に起こる減少を記録することにより、ダブシル標識抗体と結合するトレーサーを測定することが可能であった。

シグナル・クエンチングの原理を用いるアッセイでは、抗体の複合体と消光剤とを用いる以外は、シグナル変調を用いる均一系アッセイとすべて同一の工程である。
クエンチング現象を用い、バルプロエート・アッセイを考案した。２，７‐ジメトキシ‐ＤＭＡＥ‐バルプロエート複合体に関して前に用いたバルプロエート抗体を合成ダブシル誘導体であるダブシル‐ＥＤ‐グルタレート‐ＮＨＳエステルで標識した。このダブシル誘導体は、最初にダブシルクロライドをエチレンジアミンと縮合し、続いてグルタル酸無水物と反応させ、得られたカルボン酸をＮ‐ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルに変換することにより合成した。

標識抗体を用いる均一系アッセイは、ヒツジ血清中のトレーサーおよびバルプロエート標準品を限定量のダブシル標識抗体に対し競合させることによって行った。バルプロエート濃度の増大は、化学発光シグナルの増加をもたらした。

化学発光共鳴エネルギー移動を用いる均一系アッセイ
化学発光共鳴エネルギー移動（ＲＥＴ）イムノアッセイは、２つの結合相手（例えば抗体）を有する分析物からなる複合物の生成に基づいている。Ｆａｂ、レクチン酵素および核酸結合リガンドも同じように用いることが可能であり、その場合、一方は化学発光性ドナー化合物で標識し、もう１つは分析物上の別のエピトープを対象とし、蛍光体アクセプターで標識する。結合すると、分析物はドナーとアクセプターとを結ぶ橋となり、この２つが１０ｎｍ未満の距離である場合には効率的なＲＥＴが可能になる。光放出試薬で化学発光を誘発すると、アクセプターに移動され、最適な波長で測定される光が発生する。

原則として、化学発光共鳴エネルギー移動イムノアッセイで測定される分析物は、同一分子中に少なくとも２個の結合部位を有する巨大分子である。このような巨大分子には、タンパク質、核酸、オリゴ糖、抗体、抗体フラグメント、細胞、ウイルスおよび合成高分子からなる群が含まれる。

タンパク質などの巨大分子分析物を測定するための均一系化学発光共鳴エネルギー移動アッセイの工程段階には、本発明のアクリジニウム化合物を用い、抗体と、アクリジニウム化合物のアクリジニウム核上に位置する官能基との間で共有結合を生成させて抗体と分析物との第１の複合体を作製することが含まれる。アクリジニウム化合物は、Ｃ２位および／またはＣ７位に電子供与性官能基を有するアクリジニウム・エステルあるいはＣ２位および／またはＣ７位に電子供与性官能基を有するもしくは有していないアクリジニウム・スルホンアミドである。

第２の抗体と分析物との第２の複合体を、第１のアクリジニウム‐抗体複合体から電子励起エネルギーを吸収することが可能である「アクセプター」分子を用いて作製する。この第２の抗体は、分析物の異なる領域に結合しなければならないが、アクリジニウム化合物からアクセプターへのエネルギー移動が起こりうるように第１の抗体に十分近接して結合しなければならない。領域間の距離は一般に１０ｎｍ以下である。アクセプター分子は、アクリジニウム化合物から吸収したエネルギーを異なる波長の光で再放出する、あるいはそのエネルギーを熱として放散することが可能である。

第１および第２の複合体を用い、液体（通常は血清）中の様々な既知濃度の分析物からなる一連の「標準品」を用いて用量反応曲線を作成する。一般に、このことは、一定容積の緩衝液中で一定濃度のアクリジニウム複合体を各標準品と混ぜることによって行われる
。分析物、および２種類の複合体を含有する溶液を「反応混合物」と呼び、周囲温度すなわち室温において約１０〜６０分間インキュベートする。

緩衝液に溶かした過酸化水素の溶液などの化学発光誘発試薬を加えることにより、約６〜１０のｐＨ範囲で反応混合物の化学発光を誘発し、ルミノメーターを用いて化学発光を測定する。ルミノメーターは、２つの異なる波長で放射される化学発光シグナルを区別できなければならない。次いで、標準品中の分析物の濃度に対して観測された化学発光をプロットすることにより用量反応曲線を作成する。

標準の分析物反応混合物と同一条件で未知分析物の反応混合物をインキュベートすることにより分析物の未知サンプルの濃度を決定する。標準の用量反応曲線を作成するのに用いたのと同一の誘発剤および同一の条件を用い、未知反応混合物の化学発光を誘発する。次いで、用量反応曲線から未知サンプルの濃度を決定する。

実施例１３に記載の分析物ＨＣＧのための共鳴エネルギー移動アッセイでは、一方の抗体をアクリジニウム・エステルと結合させ、第２の抗体を蛍光化合物ナフトフルオレセインと結合させる。

標識ビオチン：アビジン複合物
ビタミンであるビオチンを測定するための均一系共鳴エネルギー移動アッセイは、ビオチンと、アクリジニウム化合物のアクリジニウム核上に位置する官能基との間で共有結合生成を行い、ビオチンと本発明のアクリジニウム化合物の複合体を作成することによって行うことが可能である。アクリジニウム化合物は、Ｃ２位および／またはＣ７位に電子供与性官能基を有するアクリジニウム・エステルあるいはＣ２位および／またはＣ７位に電子供与性官能基を有するもしくは有していないアクリジニウム・スルホンアミドである。

ビオチンの第２の複合体は、アクリジニウム化合物‐ビオチン複合体から電子励起エネルギーを吸収することが可能である「アクセプター」と呼ばれる分子を用いて作製する。アクセプター分子は、吸収したエネルギーを異なる波長の光で再放出する、あるいはそのエネルギーを熱として放散することが可能である。

上記の複合体を用い、液体（通常は血清）中の様々な既知濃度の分析物からなる一連のビオチン標準品を用いてビオチンの用量反応曲線を作成する。一般に、このことは、一定容積の緩衝液中で一定濃度の２種類のビオチン複合体およびニュートラビジンまたはストレプトアビジンを各ビオチン標準品と混ぜることによって行われる。「反応混合物」と呼ばれる、ビオチン、２種類の複合体およびニュートラビジンまたはストレプトアビジンを含有する溶液を周囲温度において約１０〜６０分間インキュベートする。

緩衝液に溶かした過酸化水素の溶液などの化学発光誘発試薬を加えることにより、約６〜１０のｐＨ範囲で反応混合物の化学発光を誘発し、ルミノメーターを用いて化学発光を測定する。ルミノメーターは、２つの異なる波長で放射される化学発光シグナルを区別できなければならない。標準品中のビオチンの濃度に対して観測された化学発光をプロットすることによりビオチンの用量反応曲線を作成する。

最初に、標準の反応混合物の場合に用いたのと同一条件で未知サンプルの反応混合物をインキュベートすることによりビオチンの未知サンプルの濃度を測定する。次いで、既知の反応混合物と同一の誘発剤および同一の条件でビオチンの未知サンプルの化学発光を誘発する。ビオチンの未知サンプルの濃度は、測定された化学発光に対応する用量反応曲線上の濃度から決定する。

ドナーとしての機能を果たす本発明のアクリジニウム化合物と蛍光アクセプターとを用いるＲＥＴの限界をテストするために好都合なモデルは、低分子量の分子であるビオチンにそれらを接続し、複合体を生成することであった。次いで、得られる複合体を、ビオチンに対して複数の結合部位を有するタンパク質であるアビジンと結合させる。アビジンの大きさは約３０×４０×５０Åであるため、結合した標識ビオチン分子種は極めて近接しており、それによってＲＥＴが可能となるであろう。そこで、ビオチン‐ヘキサエチレングリコール‐２‐ＣＭＥ‐７‐メトキシ‐ＤＭＡＥ（ビオチン‐ＡＥ）およびビオチン‐ジェファミン（ｊｅｆｆａｍｉｎｅ、登録商標）‐ナフトフルオレセイン（ビオチン‐ＮＰＦＬ）を合成した。ＣＭＥはカルボキシメチルエーテルである。実施例１０を参照。実施例１１は、ビオチンを測定するための共鳴エネルギー移動アッセイについて詳細に述べている。実施例１２に記載のビオチン用共鳴エネルギー移動アッセイでは、アクリジニウム・エステルである２‐ＣＭＥ‐７‐メトキシ‐ＤＭＡＥおよび蛍光化合物のナフトフルオレセインをニュートラビジンと併せて使用した。

ＨＣＧのサンドイッチ・アッセイ
これは、共鳴エネルギー移動の原理を用いたＨＣＧについての均一系アッセイである。このアッセイでは、本発明の新規アクリジニウム化合物で標識した抗ＨＣＧ抗体および別の部位を対象とする蛍光体で標識した第２の抗ＨＣＧ抗体は、大分子量の分析物であるＨＣＧと複合物を生成する。いくつかの抗ＨＣＧ抗体を２‐ＣＭＥ‐７‐メトキシ‐ＤＭＡＥまたはナフトフルオレセインで様々な程度まで標識した。抗ＨＣＧ（全体）抗体および抗ＨＣＧ（β）抗体の対は互いに十分近接して結合し、ＲＥＴを生じた。化学発光（４８０ｎｍ）が誘発されると、発光は６５０ｎｍ超において測定される蛍光体の極大値に移動した。５０００ｍＩＵ／ｍＬのＨＣＧにおいて最大でバックグラウンドの約３倍のシグナル増加が観察された。データを表２に示す。

要約すれば、ある種のアクリジニウム化合物の化学発光を緩和なｐＨで誘発することができる。これらのアクリジニウム化合物から誘導されるハプテン・トレーサーは、それぞれの抗体と複合物を形成した場合に発光の増強（アクリジニウム・エステル）または減衰（アクリジニウム・スルホンアミド）を示す。この新規な発見は、テオフィリン、バルプロエートおよびカルバマゼピンなどの臨床的に重要な分析物のための簡単な均一系アッセイの開発を可能にした。さらに、本明細書に記載のアクリジニウム化合物は、共鳴エネルギー移動アッセイで使用することが可能である。

この実施例は、電子に富んだアクリジニウム・エステルである２，７‐ジメトキシ‐ＤＭＡＥの合成およびそのハプテン複合体について記載している。この実施例では、（非特許文献７）に記載の手順を用いて２，７‐ジメトキシアクリジン‐９‐カルボン酸を合成し、４‐カルボキシベンジル‐２，６‐ジメチルフェノールと縮合させた。得られたアクリジンエステルをメチル・トリフレートでＮ‐メチル化した。ベンジル・エステル保護基の除去によりカルボン酸とした。続くバルプロエート、カルバマゼピンおよびテオフィリン複合体の生成は、活性ＮＨＳエステルを介して行った。

（ａ）２，７‐ジメトキシ‐２' ，６' ‐ジメチル‐４' ‐ベンジルオキシカルボニルフェニルアクリジン‐９‐カルボキシレートの合成
無水ピリジン（２５ｍＬ）に溶かした２，７‐ジメトキシアクリジン‐９‐カルボン酸（０．５ｇ、０．１７７ｍｍｏｌ）を窒素雰囲気中氷浴内で冷却し、塩化ｐ‐トルエンスルホニル（０．６７４ｇ、２当量）で処理し、１０分後に４‐カルボキシベンジル‐２，６‐ジメチルフェノール（０．４５３ｇ、１当量）を加えた。反応物を室温まで温めた。１〜２時間後、さらに２当量の塩化ｐ−トルエンスルホニルを０．５当量のフェノールおよびピリジン（１０〜１５ｍＬ）と一緒に加えた。反応物を窒素雰囲気中４８時間室温において撹拌した。次いで、減圧下で溶媒を除去し、残渣をクロロホルム（５０ｍＬ）に溶かした。この溶液を２％重炭酸ナトリウム水溶液と、続いて２％塩化アンモニウム水溶液で洗浄した。次いで、該クロロホルム抽出物を硫酸マグネシウムで脱水し、蒸発乾固させた。５％酢酸エチル、９５％クロロホルムを用いるシリカ上のＴＬＣにより生成物を精製した。Ｒｆ＝０．５。収量＝０．６６３ｇ（７２％）
（ｂ）２，７‐ジメトキシ‐２' ，６' ‐ジメチル‐４' ‐ベンジルオキシカルボニルフェニル‐１０‐メチルアクリジニウム‐９‐カルボキシレートの合成
ジクロロメタン（５ｍｌ）に溶かした上記（ａ）からのアクリジンエステル（０．１５ｇ、０．２９ｍｍｏｌ）を固体重炭酸ナトリウム（６０ｍｇ、０．７１ｍｍｏｌ）およびトリフルオロメタンスルホン酸メチル（０．２ｍＬ、０．８２ｍｍｏｌ）で処理した。反応物を室温で１６時間撹拌し、次いでメタノール（５ｍＬ）を加え、反応物をグラス・ウールで濾過した。Ｃ１８ ４．６ｍｍ×３０ｃｍカラムで１０％→１００％ＭｅＣＮ／水（各々０．０５％トリフルオロ酢酸を含有）の流速１ｍＬ／分の３０分間グラジエントの濾液のＨＰＬＣ分析および２６０ｎｍのＵＶ検出により、２１分に溶出する生成物への９０％を超える変換が示された。濾液を蒸発乾固させ、粗生成物をそのまま次の反応に用いた。

（ｃ）２，７‐ジメトキシ‐２' ，６' ‐ジメチル‐４' ‐カルボキシフェニル‐１０‐メチルアクリジニウム‐９‐カルボキシレート（２，７‐ジメトキシ‐ＤＭＡＥ）の合成
上記（ｂ）からのアクリジニウム・エステル（２５ｍｇ）を３０％ＨＢｒ／ＡｃＯＨ（３ｍＬ）で処理し、反応物を室温で４時間撹拌した。エーテル（〜５０ｍＬ）を添加することにより生成物を沈殿させた。エーテルをデカントし（容器を傾けて流出させることにより除去）、残渣をエーテルで数回すすぎ、回転式蒸発により乾燥した。収量＝１６ｍｇ。前述のグラジエントを用いるＨＰＬＣ分析は、１５分に溶出する生成物を示した。

（ｄ）２，７‐ジメトキシ‐２' ，６' ‐ジメチル‐４‐［Ｎ−スクシンイミジル］オキシカルボニル‐フェニル‐１０‐メチルアクリジニウム‐９‐カルボキシレート（２，７‐ジメトキシ‐ＤＭＡＥ‐ＮＨＳ）の合成
上記（ｃ）からのアクリジニウム・カルボン酸（１６ｍｇ、０．０３ｍｍｏｌ、ブロミド対イオン）を２５％無水ＭｅＣＮ、７５％無水ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（４ｍＬ）に溶かし、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（１７ｍｇ、５当量）およびジシクロヘキシル・カルボジイミド（ＤＣＣ）（３１ｍｇ、５当量）で処理した。反応物を窒素雰囲気中１６時間室温において撹拌した。前述のグラジエントを用いるＨＰＬＣ分析は、〜１６
分に溶出する生成物への完全な変換を示した。２０ｍｍ×３０ｃｍカラムを用いる分取ＨＰＬＣにより生成物を精製した。生成物を含有するＨＰＬＣ分画を凍結乾燥し鮮黄色の粉末を得た。収量＝１２．６ｍｇ。

（ｅ）２，７‐ジメトキシ‐ＤＭＡＥ‐バルプロエートの合成
ＤＭＦ（０．１ｍＬ）に溶かした２，７‐ジメトキシ‐ＤＭＡＥ‐ＮＨＳ（１ｍｇ、１．８４μｍｏｌ）を氷浴中で冷却し、ｐＨ９の１００ｍＭ炭酸ナトリウム（０．１ｍＬ）に溶かした６‐アミノ‐２‐プロピル‐ヘキサン酸［０．６４ｍｇ、２当量、（非特許文献８参照）］で処理した。反応物を室温で撹拌した。１時間後、前述のグラジエントを用いるＨＰＬＣ分析は、出発材料の完全な消失と数分後に溶出する生成物の生成とを示した。７．８ｍｍ×３０ｃｍカラムを用いる分取ＨＰＬＣによりこの生成物を精製した。生成物を含有するＨＰＬＣ分画を凍結乾燥し、黄色の粉末を得た。収量＝〜１ｍｇ；ＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ ＭＳ 実測値６０３．１（計算値６０１．７）。

（ｆ）２，７‐ジメトキシ‐ＤＭＡＥ‐ＨＤの合成
２，７‐ジメトキシ‐ＤＭＡＥ（７ｍｇ、１３．３μｍｏｌ）を無水ＭｅＣＮ／ＤＭＦの混合物（２ｍＬ、１：３）に溶かし、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（９ｍｇ、５当量）およびＤＣＣ（１６ｍｇ、５当量）で処理した。反応物を室温で撹拌し、３時間後、Ｎ‐ヒドロキシスクシンイミドおよびＤＣＣを各５当量加えた。得られた反応物を室温で１６時間撹拌した。次いで、反応混合物をグラス・ウールで濾過し、ｐＨ９の１００ｍＭ炭酸ナトリウム（２ｍＬ）に溶かした１，６‐ヘキサンジアミン（ＨＤ、１８．３ｍｇ、１０当量）で処理した。反応物を室温で撹拌した。２時間後、４．６ｍｍ×３０ｃｍのＣ１８カラムおよび１０％→６０％ＭｅＣＮ／水（各々が０．０５％ＴＦＡを含む）の流速１ｍＬ／分の４０分間グラジエントを用いる濾液のＨＰＬＣ分析ならびに２６０ｎｍのＵＶ検出は、〜２３分に溶出する生成物を示した。２０ｍｍ×３０ｃｍカラムを用いる分取ＨＰＬＣによりこれを精製した。生成物を含有するＨＰＬＣ分画を凍結乾燥して乾固させた。収量＝９．６ｍｇ（９４％）；ＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ ＭＳ 実測値５４５．８（計算値５４４．７）。

（ｇ）２，７‐ジメトキシ‐ＤＭＡＥ‐ＨＤ‐テオフィリンの合成
８‐カルボキシプロピルテオフィリン（５ｍｇ、１８．８μｍｏｌ、シグマ社（Ｓｉｇｍａ））を無水ＤＭＦ（１ｍＬ）に溶かし、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（１１ｍｇ、５当量）およびＤＣＣ（２０ｍｇ、５当量）で処理した。反応物を室温で１６時間撹拌した。次いで、２，７‐ジメトキシ‐ＤＭＡＥ‐ＨＤ（３．３ｍｇ、４．３μｍｏｌ）をメタノール溶液（０．２ｍＬ）として加え、続いてＮ，Ｎ‐ジイソプロピルエチルアミン（３．２μＬ、１８．４μｍｏｌ）を加えた。３時間後、前述の１０％→６０％グラジエントを用いるＨＰＬＣ分析は、〜２８分に溶出する生成物を示した。２０ｍｍ×３０ｃｍカラムを用いる分取ＨＰＬＣによりこの生成物を単離した。生成物を含有するＨＰＬＣ分画を凍結乾燥して乾固させた。収量＝２．７ｍｇ（７６％）；ＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ ＭＳ 実測値７９４．２（計算値７９２．９）。

（ｈ）２，７‐ジメトキシ‐ＤＭＡＥ‐ＨＤ‐ＳＡ‐ＥＤ‐カルバマゼピンの合成
カルバマゼピン‐ＥＤ‐ＳＡは、チバガイギー社（Ｃｉｂａ‐Ｇｅｉｇｙ Ｌｉｍｉｔｅｄ）、現ノバルティス社（Ｎｏｖａｒｔｉｓ Ｉｎｃ．）の中央研究所（Ｃｅｎｔｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｓ）から提供されたカルバマゼピン‐Ｎ‐酸塩化物から２段階で調製した。カルバマゼピン‐Ｎ‐酸塩化物（２ｇ、７．８２８ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン１０ｍｌ溶液を、エチレンジアミン（５．２４ｍｌ、１０当量）のエーテル１００ｍｌ溶液に０℃で滴加した。反応物を室温で１．５時間撹拌させ、次いでキシレンを用いて減圧下蒸発させた。得られた固体をフリット付き漏斗に移しクロロホルムで３回洗浄し、カルバマゼピン‐ＥＤ９５５ｍｇを灰色がかった白色の物質として得た。カルバ
マゼピン‐ＥＤ（９５０ｍｇ、３．４２ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ／クロロホルム混合溶媒（１：１）７０ｍｌに懸濁し、続いて無水コハク酸（５１３ｍｇ、１．５当量）およびトリエチルアミン（１．９ｍｌ、４当量）を加えた。混合物を撹拌しながら１００℃において１時間加熱して均一溶液を得た。これを減圧下に蒸発乾固させた。残渣を水６０ｍｌで処理した。懸濁液を室温で５０分間撹拌して白色の沈殿を生成させた。これを集め、水、次いでクロロホルムで洗浄した。

真空中で乾燥すると、カルバマゼピン‐ＥＤ‐ＳＡ５５２ｍｇが得られた。無水ＤＭＦ（０．５ｍＬ）に溶かしたカルバマゼピン‐ＥＤ‐ＳＡ（５ｍｇ、１３．２μｍｏｌ）をＮ−ヒドロキシスクシンイミド（７．６ｍｇ、５当量）およびＤＣＣ（１３．６ｍｇ、５当量）で処理した。反応物を室温で３〜４時間撹拌し、次いで、活性エステル１．７ｍｇを回収し、ＤＭＦ９００μＬで希釈した。この溶液を、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（２．４μＬ、１３．８μｍｏｌ）と共に２，７−ジメトキシ−ＤＭＡＥ−ＨＤ（２．５ｍｇ、３．２４μｍｏｌ）のメタノール溶液（０．２ｍＬ）で処理した。反応物を室温で１６時間撹拌した。前述の１０％→６０％グラジエントを用いるＨＰＬＣ分析は、〜３４分に溶出する生成物を示した。２０ｍｍ×３０ｃｍカラムを用いる分取ＨＰＬＣによりこの生成物を精製し、生成物を含有するＨＰＬＣ分画を凍結乾燥した。収量＝１．６ｍｇ（５４％）；ＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ ＭＳ 実測値９０７．８（計算値９０６．１）。

（ｉ）２，７‐ジメトキシ‐ＤＭＡＥ‐抗ＴＳＨ複合体の合成
１００ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ８（０．１ｍＬ）およびＰＢＳ ｐＨ８（８０μＬ）の混合物に溶かした抗ＴＳＨモノクローナル抗体（０．５ｍｇ、３．３３ｎｍｏｌ）を、２，７‐ジメトキシ‐ＤＭＡＥ‐ＮＨＳ（３６．２μｇ、２０当量）のＤＭＦ（２０μＬ）溶液で処理した。反応物をコールドボックス中２〜４℃で１６時間撹拌し、次いで、溶離液として水を用いるセファデックスＧ２５ゲル濾過クロマトグラフィにより標識タンパク質を単離した。カラムの空隙容量に溶出する複合体を集め、〜１ｍＬまで濃縮した。この溶液を、１％ＢＳＡおよび０．０５％アジ化ナトリウムを含有するｐＨ７．４のＰＢＳ４ｍｌで希釈し、４℃で保存した。以下の反応式は、２，７‐ジメトキシ‐ＤＭＡＥおよび複合体の合成を表している。

（ａ）２‐ＣＭＥ‐７‐メトキシ‐ＤＭＡＥの合成
２‐ＣＭＥ‐７‐メトキシ‐ＤＭＡＥの合成は、５‐メトキシイサチンおよび４‐ブロモフェノールから行った。４‐ベンジルオキシブロモベンゼンによる５‐メトキシイサチンのナトリウム塩のＮ‐アルキル化と、続く熱アルカリ中の転位により官能基付きのアクリジンカルボン酸が得られ、これを４‐ニトロ‐２，６‐ジメチルフェノールと縮合させ
た。得られたアクリジンエステル中のベンジルエーテルをまず切断し、遊離のヒドロキシル基をブロモ酢酸ベンジルでアルキル化した。アクリジン窒素のメチル・トリフレートによるメチル化と、続くベンジルエステルの遊離酸への変換により合成が完結した。ＮＨＳエステルを経由して、アクリジニウム化合物をバルプロエート複合体に変換した。

（ｂ）４‐ベンジルオキシブロモベンゼンの合成
アセトン（４０ｍＬ）に溶かした４‐ブロモフェノール（２ｇ、０．０１１６ｍｏｌ）を無水炭酸カリウム（１．９１ｇ、１．２当量）および臭化ベンジル（１．４４ｍＬ、１．０５当量）で処理した。反応物を窒素雰囲気中で還流した。５〜６時間の還流後、反応物を室温まで冷却し、等容積の酢酸エチルで希釈した。この溶液を水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで脱水して蒸発乾固させた。白色のフワフワした固体が得られた。収量＝２．３６ｇ（７３％）。

（ｃ）Ｎ‐［４' ‐ベンジルオキシ］フェニル］‐５‐メトキシイサチンの合成
無水ＤＭＦ（５０ｍＬ）に溶かした５‐メトキシイサチン（１．５ｇ、０．８５ｍｍｏｌ）を窒素雰囲気中氷浴内で冷却し、水素化ナトリウム（０．２５ｇ、１．２当量）で処理した。反応物を氷浴中で撹拌し、１５〜２０分後、ヨウ化銅（３．２３ｇ、２当量）と共に４‐ベンジルオキシブロモベンゼン（２．３６ｇ、０．８５ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（３ｍＬ）溶液として加えた。反応物を窒素雰囲気中１３０℃において２４時間、油浴中で加熱した。次いで、反応物を室温まで冷却して濾過し、濾液を蒸発乾固させた。溶離液としてヘキサンに溶かした３５％酢酸エチルを用いるシリカゲル上のフラッシュ・クロマトグラフィによって粗製物を精製した。Ｎ‐アルキル化イサチン誘導体をオレンジ色〜褐色の固体として単離した。収量＝１ｇ（３２％）。

（ｄ）２‐ベンジルオキシ‐７‐メトキシアクリジン‐９‐カルボン酸の合成
上記（ｃ）からのＮ‐アルキル化イサチン（１ｇ）を１０％水酸化カリウム（１００ｍＬ）に懸濁し、窒素雰囲気中で還流した。４時間後、反応物を５〜１０分間冷却し、次いで温かいうちに濾過した。濾液中に黄色の沈殿が分離した。濾液を氷および水で希釈し、次いで、どろどろした黄色の沈殿が析出するまで濃塩酸と氷との混合物で酸性化した。これを〜１５分間放置し、次いで中型多孔性フリット付きガラス漏斗を用いて濾過した。続いて、生成物を乾燥エーテルですすぎ、次いで空気乾燥した。次いで、得られた黄色の粉末を丸底フラスコに移し、無水トルエンに懸濁して蒸発乾固した。収量＝０．７５ｇ（７５％）。

（ｅ）２‐ベンジルオキシ‐７‐メトキシ‐２' ，６' ‐ジメチル‐４' ‐ニトロフェニルアクリジン‐９‐カルボキシレートの合成
無水ピリジン（３０〜４０ｍＬ）に溶かした上記（ｄ）からの２‐ベンジルオキシ‐７‐メトキシアクリジン‐９‐カルボン酸（０．３８、０．１０６ｍｏｌ）を窒素中０℃において塩化ｐ‐トルエンスルホニル（０．４０４ｇ、２当量）で処理した。〜５分後に２，６‐ジメチル‐４‐ニトロフェノール（０．１７７ｇ、１当量）を加え、反応物を室温まで温め、２４時間撹拌した。次いで、減圧下に溶媒を除去し、残渣をクロロホルム（５０ｍＬ）に溶かした。この溶液を３％重炭酸ナトリウム水溶液と、次いで３％塩化アンモニウム水溶液で洗浄した。次いで、クロロホルム抽出液を無水硫酸マグネシウムで脱水し、蒸発乾固させた。７０％ヘキサン、２５％クロロホルム、５％酢酸エチルを用いるシリカ上の分取ＴＬＣにより粗生成物を精製した。収量＝０．２６ｇ（４８％）
（ｆ）２‐ヒドロキシ‐７‐メトキシ‐２' ，６' ‐ジメチル‐４' ‐ニトロフェニルアクリジン‐９‐カルボキシレートの合成
上記（ｅ）からの２‐ベンジルオキシ‐７‐メトキシアクリジンエステル（０．２ｇ）を３０％ＨＢｒ／ＡｃＯＨ（１０ｍＬ）およびジメチルスルフィド（５ｍＬ）の混合物中で室温において４時間撹拌した。次いで、無水エーテルを添加することにより生成物を沈
殿させ、続いて濾過した。鮮黄色の固体が得られた。４．６ｍｍ×３０ｃｍのＣ１８カラムおよび１０％→７０％ＭｅＣＮ／水（各々が０．０５％ＴＦＡを含む）の流速１ｍＬ／分の３０分間グラジエントを用いる濾液のＨＰＬＣ分析ならびに２６０ｎｍのＵＶ検出は、〜２５分に溶出する生成物を示した（出発材料は３４分に溶出する）。収量＝０．２４ｇ。

（ｇ）２‐［ベンジルオキシカルボニル］メチルオキシ‐７‐メトキシ‐２' ，６' ‐ジメチル‐４' ‐ニトロフェニルアクリジン‐９‐カルボキシレートの合成
無水ＤＭＦ（１０ｍＬ）に溶かした上記（ｆ）からの化合物（０．１６３ｇ、０．３８ｍｍｏｌ）を無水炭酸カリウム（６５ｍｇ、１．２当量）と、続いてブロモ酢酸ベンジル（６６．２μＬ、１．１当量）で処理した。反応物を窒素雰囲気中６５℃において油浴中で加熱した。１時間後、前述のグラジエントを用いるＨＰＬＣ分析は、３２分に溶出する生成物への８５％を超える変換を示した。次いで、反応物を室温まで冷却し、減圧下に溶媒を除去した。残渣をクロロホルム（５０ｍＬ）に溶かし、この溶液を３％塩化アンモニウム水溶液および３％重炭酸ナトリウム水溶液で１回洗浄した。次いで、クロロホルム抽出液を無水硫酸マグネシウムで脱水し、蒸発乾固させた。粗生成物（０．３ｇ）をそのまま次の反応に用いた。

（ｈ）２‐［ベンジルオキシカルボニル］メチルオキシ‐７‐メトキシ‐２' ，６' ‐ジメチル‐４' ‐ニトロフェニル‐１０‐メチルアクリジニウム‐９‐カルボキシレートの合成
上記（ｇ）からの粗製アクリジン・エステル（０．３ｇ、０．５３ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（〜５ｍｌ）に溶かし、重炭酸ナトリウム（０．４４ｇ、１０当量）およびトリフルオロメタンスルホン酸メチル（０．６ｍＬ、１０当量）で処理した。反応物を室温で１６時間撹拌した。前述のグラジエントを用いるＨＰＬＣ分析は、２５分に溶出する生成物について完全な変換を示した。反応物をグラス・ウールで濾過し、濾液を蒸発乾固させた。鮮黄色の固体が回収され、これを次の反応に直接使用した。ＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ ＭＳ 実測値５８２．４（計算値５８１．６）。

（ｉ）２‐カルボキシメチルエーテル‐７‐メトキシ‐２' ，６' ‐ジメチル‐４' ‐ニトロフェニル‐メチルアクリジニウム‐９‐カルボキシレート（２‐ＣＭＥ‐７‐メトキシ‐ＤＭＡＥ）の合成
上記（ｈ）からの粗製アクリジニウム・エステルを３０％ＨＢｒ／ＡｃＯＨ（１０ｍＬ）中室温において４〜５時間撹拌した。次いで、無水エーテルを加えて生成物を沈殿させ、濾過により回収した。この沈殿をエーテルで数回すすぎ、次いで空気乾燥した。赤みを帯びた黄色粉末が得られた。前述のグラジエントを用いるＨＰＬＣ分析は、２０分に溶出する生成物への見事な変換を示した。収量＝０．１２８ｇ；ＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ ＭＳ 実測値４９２．２（計算値４９１．５）。

（ｊ）２‐ＣＭＥ‐７‐メトキシ‐ＤＭＡＥ ＮＨＳエステルの合成
ＭｅＣＮ（２ｍＬ）に溶かした２‐ＣＭＥ‐７‐メトキシ‐ＤＭＡＥ（１０ｍｇ、１６．６μｍｏｌ）をＮ‐ヒドロキシスクシンイミド（２．９ｍｇ、１．５当量）およびＤＣＣ（１７ｍｇ、５当量）で処理した。反応物を室温で１〜２時間撹拌すると、ＤＣＵの微細な沈殿が反応物中に生成した。反応物をグラス・ウールで濾過し、溶液を蒸発乾固させた。ＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ ＭＳ 実測値５８９．１（計算値５８８．６）。

（ｋ）２‐ＣＭＥ‐７‐メトキシ‐ＤＭＡＥ‐バルプロエート複合体の合成
氷冷した６‐アミノ‐２‐プロピルヘキサン酸（１３ｍｇ、７５μｍｏｌ）のリン酸ナトリウム緩衝液（０．１０Ｍ、ｐＨ７．４、０．７０ｍｌ）溶液を、氷冷した２‐ＣＭＥ‐７‐メトキシ‐ＤＭＡＥ ＮＨＳエステル（１．０ｍｇ、１．７μｍｏｌ）のＤＭＦ（
０．３０ｍｌ）溶液と混合した。この混合物を室温で一夜撹拌させた。Ｃ‐１８逆相ＨＰＬＣから所望の生成物を単離し、凍結乾燥した。ＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ ＭＳ 実測値６４６．１（計算値６４５．７）。以下の反応式は、２‐ＣＭＥ‐７‐メトキシ‐ＤＭＡＥおよびバルプロエート複合体の合成を表している。

アクリジニウム誘導体のｐＨ滴定
この実施例は、図１および２のデータを得た方法について詳細に述べている。図１および２は、アクリジニウム・エステル上にメトキシ基を置くことによってアクリジニウムから疑似塩基への移行がどの程度影響されるかということをｐＨの関数として図示している。

２，７‐ジメトキシ‐ＤＭＡＥについて例示される典型的なプロトコルは以下の通りである。２，７‐ジメトキシ‐ＤＭＡＥの溶液（ＤＭＦ中０．５ｍｇ／ｍＬ）を調製し、この溶液２０μＬを適当なｐＨの２５ｍＭリン酸緩衝液１００μＬおよびＤＭＦ８０μＬで希釈した。溶液を室温で１．５〜２時間インキュベートさせ、次いでＢｅｃｋｍａｎ ＤＵ７５００型分光光度計を用いて紫外スペクトルを記録した。測定には、０．１ｍＬの石英のミニセルを使用した。各ｐＨについて２２０〜５００ｎｍの全紫外スペクトルを記録した。アクリジニウム発色団の吸収バンドの強度は、様々なアクリジニウム誘導体によって異なった。２，７‐ジメトキシ‐ＤＭＡＥの場合には、このバンドが４１０ｎｍに観察されたが、アクリジニウム誘導体でアクリジニウム核が無置換の場合には、この吸収バンドは通常３６３ｎｍに観察された。

３‐［９‐（｛（３‐カルボキシプロピル）［（４‐メチルフェニル）スルホニル］アミノ｝カルボニル）‐１０‐アクリジニウミル］‐１‐プロパンスルホネート‐バルプロエート複合体（ＮＳＰ‐ＡＳ‐バルプロエート）の合成
ＮＳＰ‐ＡＳ‐ＮＨＳエステル（５ｍｇ、７．３２μｍｏｌ）および６‐アミノ‐２‐プロピルヘキサン酸（５ｍｇ、２８．９μｍｏｌ）を、ＤＭＦおよび０．２Ｍ重炭酸ナトリウムの１：１混合物（０．５ｍＬ）中で混合した。反応物を室温で２時間、次いで４℃で１６時間撹拌した。４．６ｍｍ×３０ｃｍのＣ１８カラムおよび１０％→６０％ＭｅＣＮ／水（各々が０．０５％ＴＦＡを含む）の流速１ｍＬ／分の４０分間グラジエントを用いる濾液のＨＰＬＣ分析ならびに２６０ｎｍのＵＶ検出は、２８分に溶出する生成物を示した。これを分取ＨＰＬＣにより精製し、ＨＰＬＣ分画を凍結乾燥した。収量＝２．２ｍｇ、ＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ ＭＳ 実測値７４０（計算値７３９）。

（ａ）８‐カルボキシプロピルテオフィリンと１，６‐ヘキサンジアミンの複合体（テオフィリン‐ＨＤ）の合成
ＤＭＦ（１．５ｍＬ）に溶かした８−カルボキシプロピルテオフィリン（４０ｍｇ、１５０μｍｏｌ）をＮ‐ヒドロキシスクシンイミド（５０ｍｇ、４３４μｍｏｌ）およびＤＣＣ（５０ｍｇ、２４２μｍｏｌ）で処理した。反応物を室温で１時間撹拌した。この溶液に、１，６‐ヘキサンジアミン（１７５ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）を０．２Ｍ重炭酸ナトリウム（１．５ｍＬ）と一緒に加えた。反応物を室温で１６時間撹拌し、０％→４０％ＭｅＣＮ／水（各々が０．０５％ＴＦＡを含む）の流速１６ｍＬ／分の４０分間グラジエントおよび２６０ｎｍにおけるＵＶ検出を用いる２０ｍｍ×３０ｃｍのＣ１８カラムを用いる分取ＨＰＬＣにより直接精製した。２１．５分に溶出する生成物を回収し、ＨＰＬＣ分画を減圧下で濃縮し、真空下でさらに乾燥した。収量＝５０ｍｇ（９１％）；ＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ ＭＳ 実測値３６５（計算値３６５．５）。

（ｂ）ＮＳＰ‐ＡＳ‐ＨＤ‐テオフィリン複合体の合成
ＮＳＰ‐ＡＳ‐ＮＨＳエステル（１．８ｍｇ、２．８２μｍｏｌ）とテオフィリン‐ＨＤ（１０ｍｇ、２８．２μｍｏｌ）をＤＭＦ（０．３ｍＬ）中で混合した。この溶液に、０．２Ｍ重炭酸ナトリウム（０．３ｍＬ）を加えた。反応物を室温で３時間撹拌した。流速２．３ｍＬ／分で１０％→６０％ＭｅＣＮ／水（各々が０．０５％ＴＦＡを含む）の４
０分間グラジエントおよび２６０ｎｍにおけるＵＶ検出を用いる１０ｍｍ×３０ｃｍのＣ１８カラム上で生成物を精製した。２４分に溶出された生成物を含有するＨＰＬＣ分画を回収し、凍結乾燥した。収量＝１．３ｍｇ（５０％）；ＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ ＭＳ 実測値９３２（計算値９３３）。

（ｃ）ＮＳＰ‐ＡＳ‐ＥＤ‐カルバマゼピン複合体の合成
ＮＳＰ‐ＡＳ‐ＮＨＳエステル（２ｍｇ、２．９３μｍｏｌ）とカルバマゼピン‐ＥＤ（１０ｍｇ、３５．８μｍｏｌ）をＤＭＦ（０．３ｍＬ）中で混合し、０．２Ｍ重炭酸ナトリウム（０．３ｍＬ）を加えた。反応物を室温で３時間撹拌した。テオフィリン複合体について上記に記載したようにして生成物を精製した。３３分に溶出する生成物を回収し、ＨＰＬＣ分画を凍結乾燥した。収量＝１ｍｇ（４０％）；ＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ ＭＳ 実測値８４６（計算値８４６）。

以下の反応式は、ＮＳＰ‐ＡＳ複合体の合成を表している。

（ａ）２，７‐ジメトキシ‐ＤＭＡＥ‐ＨＤ‐ＳＡ‐ＥＤ‐カルバマゼピン複合体を用いる均一系カルバマゼピン・アッセイ
均一系アッセイは、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ＢＳＡおよび０．０１％アジ化ナトリウムを含有する全容積２００μＬの１０ｍＭリン酸塩中で行った。ヒト血清に溶かしたカルバマゼピン標準品（０、４．２４、８．４７、１６．９、３３．９、５０．８、９３．２μＭ）をアッセイ緩衝液で２０倍に希釈した。アッセイにおけるカルバマゼピンの最終濃度は、０、０．２１２、０．４２４、０．８４５、１．６９５、２．５４、４．６６μＭとした。０．０２μＭまたは０．００２μＭのトレーサーでアッセイを行うと類似の結果が得られた。結合反応は、抗カルバマゼピン、マウス・モノクローナル抗体を終濃度０．１μＭとなるように添加して開始させた。室温で１時間後、１００ｍＭ ＮａＨ
ＣＯ_３に溶かした３％過酸化水素＋０．５％塩化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＣ）からなる改良誘発試薬を用い、ＭＬＡ１（Ｍａｇｉｃ Ｌｉｔｅ Ｌｕｍｉｎｉｍｅｔｅｒ、ベイヤーダイアグノスティックス社（Ｂａｙｅｒ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、フィルタなし）で化学発光を直接測定した（２５μＬ）。濃度ゼロのカルバマゼピン標準品と高濃度のカルバマゼピン標準品には、妥当なアッセイ精度（６％未満のＣＶ）で用量反応曲線のシグナルに約５倍の差があった。

４‐パラメータ・ロジスティック（「４ＰＬ」）カーブフィッティング・アルゴリズムを用い、実測された用量反応曲線をシミュレートした。理論的な用量反応曲線は、実測された用量反応曲線とほぼ重なった。アクリジニウム・エステル・トレーサーを用いる均一系カルバマゼピン・アッセイのデータを表３に示し、図３にはグラフとしてプロットした。

（ｂ）ＮＳＰ‐ＡＳ‐ＨＤ‐ＳＡ‐ＥＤ‐カルバマゼピン複合体を用いる均一系カルバマゼピン・アッセイ
均一系アッセイは、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ＢＳＡおよび０．０１％アジ化ナトリウムを含有する全容積３００μＬの１０ｍＭリン酸塩中で行った。ヒト血清に溶かしたカルバマゼピン標準品（０、４．２４、８．４７、１６．９、３３．９、５０．８、９３．２μＭ）をアッセイ緩衝液で１０倍に希釈した。アッセイにおけるカルバマゼピンの終濃度は、０．４２４、０．８４７、１．６９、３．３９、５．０８、９．３２μＭとした。０．２ｎＭのトレーサーでアッセイを行った。結合反応は、抗カルバマゼピン、マウス・モノクローナル抗体を終濃度７０ｎＭとなるように添加して開始させた。室温で３０分後、１００ｍＭ ＮａＨＣＯ_３に溶かした３％過酸化水素＋０．５％アーカード（ａｒｑｕａｄ、登録商標）からなる改良誘発試薬を用い、ＭＬＡ１（Ｍａｇｉｃ Ｌｉｔｅ
Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ、ベイヤーダイアグノスティックス社（Ｂａｙｅｒ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、フィルタなし）で化学発光を直接測定した（２５μＬ）。濃度ゼロのカルバマゼピン標準品と高濃度のカルバマゼピン標準品には、妥当なアッセイ精度（８％未満のＣＶ）で用量反応曲線のシグナルに約１３倍の差があった。アクリジニウム・スルホンアミド・トレーサーを用いる均一系カルバマゼピン・アッセイのデータを表４に示し、図４にはグラフとしてプロットした。

（ａ）２，７‐ジメトキシ‐ＤＭＡＥ‐ＨＤ‐テオフィリン複合体を用いる均一系テオフィリン・アッセイ
均一系テオフィリン・アッセイでは、実施例６に記載のように全容積２００μＬの緩衝液中で反応を行った。ヒト血清に溶かしたテオフィリン標準品（０、６．９４、１３．９、２７．７、５５．５、１１１、２２２μＭ）を、反応では最終テオフィリン濃度が０、０．６９４、１．３９、２．７７、５．５５、１１．１、２２．２μＭとなるように１０倍に希釈した。様々な濃度のトレーサーおよび抗体（抗テオフィリン・マウス・モノクローナル）を検討し、濃度ゼロのテオフィリン標準品と高濃度のテオフィリン標準品の間にシグナルの最大偏差を生み出す各成分の最適濃度を決定した。抗体濃度を０．１μＭとしてトレーサーの濃度を０．００２から０．０２μＭまで変化させることにより、シグナルには最大で２〜３倍の増大が観察された。トレーサー濃度０．００２μＭおよび抗体濃度０．１μＭを用いることにより、実測された用量反応曲線は、すべてのテオフィリン標準品を区別することが可能であった。４ＰＬ法を利用するカーブフィッティングにより、理論的用量反応曲線と実測された用量反応曲線との間に見事な相関が得られ、実測された用量反応曲線から３つのＡＣＳ：１８０用リガンド・コントロール（ベイヤーダイアグノスティックス社（Ｂａｙｅｒ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ））におけるテオフィリンの濃度を計算した。３つのコントロールについて算出されたテオフィリン濃度は、表示濃度よりもいくらか低かった。アクリジニウム・エステル・トレーサーを用いる均一系テオフィリン・アッセイのデータを表５に示し、図５にはグラフとしてプロットした。

（ｂ）ＮＳＰ‐ＡＳ‐ＨＤ‐テオフィリン複合体を用いる均一系テオフィリン・アッセイ
均一系テオフィリン・アッセイでは、実施例６に記載のように全容積３００μＬの緩衝液中で反応を行った。ヒト血清に溶かしたテオフィリン標準品（０、６．９４、１３．９、２７．７、５５．５、１１１、２２２μＭ）を、反応では最終テオフィリン濃度が０、０．６９４、１．３９、２．７７、５．５５、１１．１、２２．２μＭとなるように１０倍に希釈した。約０．２ｎＭのトレーサーでアッセイを行った。結合反応は、抗テオフィリン、マウス・モノクローナル抗体を最終濃度７０ｎＭとなるように添加して開始させた。室温で３０分のインキュベーション後、改良誘発試薬を用い、ＭＬＡ１（フィルタなし）で化学発光を直接測定した（２５μＬ）。濃度ゼロのテオフィリン標準品と高濃度のテオフィリン標準品には、妥当なアッセイ精度（５％未満のＣＶ）で用量反応曲線のシグナルに約５倍の差があった。アクリジニウム・スルホンアミド・トレーサーを用いる均一系テオフィリン・アッセイのデータを表６に示し、図６にはグラフとしてプロットした。

（ａ）２，７‐ジメトキシ‐ＤＭＡＥ‐バルプロエート複合体を用いる均一系バルプロエート・アッセイ
実施例６に記載のように緩衝液１００μＬ中でアッセイを行った。ヒト血清に溶かしたバルプロエート標準品（０、８７．５、１７５、３５０、７００および１４００μＭ）をアッセイ緩衝液で１０倍に希釈した。トレーサー濃度０．２μＭを用い、抗バルプロエート、マウス・モノクローナル抗体の濃度は１μＭとした。抗体を添加することにより反応を開始させ、室温で１時間インキュベートした後、反応物を１００倍に希釈して前述のように測定した。濃度ゼロのバルプロエート標準品と高濃度のバルプロエート標準品には、シグナルに〜１０倍の差があった。この場合もアッセイ精度は良好であり、すべてのバルプロエート標準品はお互いにはっきりと区別することが可能であった。アクリジニウム・エステル・トレーサーを用いる均一系バルプロエート・アッセイのデータを表７に示し、図７にはグラフとしてプロットした。

（ｂ）ＮＳＰ‐ＡＳ‐バルプロエート複合体を用いる均一系バルプロエート・アッセイ
実施例６に記載のように緩衝液３００μＬ中でアッセイを行った。ヒト血清に溶かしたバルプロエート標準品（０、８７．５、１７５、３５０、７００および１４００μＭ）をアッセイ緩衝液で１０倍に希釈し、最終バルプロエート濃度、０、８．７５、１７．５、３５、７０および１４０μＭとした。約０．２ｎＭのトレーサー濃度を用い、抗バルプロエート、マウス・モノクローナル抗体の濃度は７０ｎＭとした。抗体を添加することにより反応を開始させ、室温で３０分のインキュベーション後、改良誘発試薬を用い、ＭＬＡ１（フィルタなし）で化学発光を直接測定した（２５μＬ）。濃度ゼロのバルプロエート標準品と高濃度のバルプロエート標準品には、妥当なアッセイ精度（８％未満のＣＶ）で用量反応曲線のシグナルに約３．４倍の差があった。アクリジニウム・スルホンアミド・トレーサーを用いる均一系バルプロエート・アッセイのデータを表８に示し、図８にはグラフとしてプロットした。

（ａ）ダブシルクロライドとエチレンジアミンの複合体（ダブシル‐ＥＤ）の合成
ダブシルクロライド（２５ｍｇ、０．０７７ｍｏｌ、アルドリッチ社（Ａｌｄｒｉｃｈ））を、ジクロロメタン（２ｍＬ）に溶かしたエチレンジアミン（３６μＬ、７当量）に加えた。１０〜１５分後、ＴＬＣ（ヘキサンに溶かした２５％酢酸エチル）で出発材料は一切認められなかった。反応物を減圧下に濃縮し、残渣をＭｅＣＮに溶かした。４．６ｍｍ×３０ｃｍのＣ１８カラムおよび１０％→１００％ＭｅＣＮ／水（各々が０．０５％ＴＦＡを含有する）の３０分グラジエントを用いるＨＰＬＣ分析は、１３．５分に溶出する単一生成物を示した。生成物を分取ＨＰＬＣにより精製し、ＨＰＬＣ分画を回転式蒸発により少量に濃縮し、次いで凍結乾燥した。収量＝３５ｍｇ（８０％）；ＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ ＭＳ 実測値３４８．３（計算値３４７．４）。

（ｂ）ダブシル‐ＥＤ‐グルタレート‐ＮＨＳエステルの合成
ＭｅＣＮ（３ｍＬ）に溶かしたダブシル‐ＥＤ（１５ｍｇ、２６．１μｍｏｌ）を、Ｎ，Ｎ‐ジイソプロピルエチルアミン（９．２μＬ、２当量）と、続いて無水グルタル酸（９ｍｇ、３当量）で処理した。室温で２時間後、４．６ｍｍ×３０ｃｍのＣ１８カラムおよび流速１ｍＬ／分の１０％→７０％ＭｅＣＮ／水（各々が０．０５％ＴＦＡを含有する）の３０分間グラジエントを用いるＨＰＬＣ分析ならびに２６０ｎｍにおけるＵＶ検出は、１８分に溶出する生成物への完全な変換を示した（出発材料は１６分に溶出する）。この溶液に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（１５ｍｇ、５当量）と、続いてＤＣＣ（２７ｍｇ、５当量）を加えた。反応物を室温で撹拌した。１時間後、ＨＰＬＣ分析は、〜７０％の変換を示した。追加のＤＣＣ（１３．５ｍｇ、２．５当量）を加え、反応をさらに１時間続けた。次いで、グラス・ウールで反応物を濾過し、分取ＨＰＬＣにより生成物を精製した。ＨＰＬＣ分画を凍結乾燥した。収量＝１４．８ｍｇ（８５％）。

（ｃ）抗バルプロエート抗体‐ダブシル複合体の合成
抗バルプロエート・モノクローナル抗体（０．５ｍｇ、ｐＨ７．４のＰＢＳ中の１．１ｍｇ／ｍＬ原液０．４５ｍＬ）を０．１Ｍ重炭酸ナトリウム（０．４５ｍＬ）で希釈した。この溶液を、ダブシル‐ＥＤ‐グルタレート‐ＮＨＳエステルのＤＭＦ溶液（ＤＭＦ中２ｍｇ／ｍＬ）５０μＬで処理した。標識反応を室温で２〜３時間行い、次いで溶離液として１０ｍＭリン酸塩ｐＨ７を用いるセファデックスＧ２５上のゲル濾過クロマトグラフ
ィにより複合体を単離した。ダブシル取り込みの程度をＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ ＭＳにより測定すると、１タンパク質当たり〜９個のダブシルを示した。複合体は４℃で保存した。

（ｄ）ダブシル標識抗バルプロエート抗体および２‐ＣＭＥ‐７‐メトキシ‐ＤＭＡＥ−バルプロエートを用いる均一系バルプロエート・アッセイ
反応は、実施例６に記載のように緩衝液０．２ｍＬ中で行った。ヒツジ血清に溶かしたバルプロエート標準品は、０、６８．５、１７１、３４２．５、６８５、１０２７．５μＭに相当する０、１０、２５、５０、１００および１５０μｇ／ｍＬの濃度で用いた。トレーサーは１．２９ｎＭの濃度で用いた。最後に、ダブシル標識抗体を最終濃度０．４μＭとなるように加えた。反応物を室温で１時間インキュベートし、次いで実施例６に記載のように直接読み取った。クエンチングを用いる均一系バルプロエート・アッセイについて得られた該データを図９にグラフとしてプロットした。

ＣＬ共鳴エネルギー移動のための複合体
（ａ）ナフトフルオレセインのビオチン複合体
ナフトフルオレセインＮＨＳエステル（２．３ｍｇ）のＤＭＦ（０．２５ｍｌ）溶液をビオチン‐ジェファミン（ビオチン・トリエチレングリコール・ジアミンの複合体、１５ｍｇ）のＤＭＦ（０．２５ｍｌ）溶液および炭酸塩緩衝液（０．１０Ｍ、ｐＨ８．５、０．３０ｍｌ）と混合した。この混合物を室温で一夜撹拌した後、真空中で溶媒を除去し、ＨＰＬＣ精製（Ｃ‐１８逆相クロマトグラフィ）のためＣＨ_３ＣＮ／水に残渣を溶解した。ＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ質量分析により単離生成物を同定した。（計算値８３３．２、実測値８３３．５）
（ｂ）アクリジニウム類縁体のビオチン複合体
ビオチン‐ジェファミン（２．０ｍｇ）および２‐ＣＭＥ‐７‐メトキシ‐ＤＭＡＥ ＮＨＳエステル（０．５ｍｇ）を０．５０ｍｌのＤＭＦに溶解し、溶液を室温で３時間撹拌した。真空中で溶媒を除去後、Ｃ‐１８逆相クロマトグラフィから所望の生成物を単離し、ＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ質量分析により確認した。（計算値８４７．３、実測値８４８．２）
（ｃ）抗ＨＣＧ（β）‐ナフトフルオレセインの調製
酢酸塩緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ５．５）に溶かしたマウスのモノクローナルの抗ＨＣＧβ抗体（ベイヤー社（Ｂａｙｅｒ）、＃１０２４４５９０、１０．２ｍｇ／ｍｌ）０．３０ｍｌを、緩衝液交換のためにＧ‐２５カラム（１ｃｍ×１５ｃｍ）を通し、リン酸緩衝液（０．１０Ｍ、ｐＨ８．０）で溶出し、合計２．８ｍｇの抗体を含むタンパク質２．０ｍｌを回収した。回収サンプルのうち３分の１を、ＤＭＦに溶かしたナフトフルオレセイン‐ＮＨＳ（０．１０ｍｌ、１．０ｍｇ／１．５ｍｌ、合計２０当量）と混ぜた。２時間後、反応混合物をセントリコン（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ、登録商標）１０（０．６６ｍｌ、０．６０ｍｇ／ｍｌ）によりＰＢＳ（２０ｍＭ、ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０５％ＮａＮ_３）で洗浄した。生成物のＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦは、１個の抗体に４．５個の色素が取り込まれたことを示した。

（ｄ）抗ＨＣＧ（全体）‐２‐ＣＭＥ‐７‐メトキシ‐ＤＭＡＥの調製
０．１５Ｍリン酸塩‐０．１％ＮａＮ_３、ｐＨ７．４に溶解した３．５ｍｇ／ｍｌの抗ＨＣＧ（全体）０．９０ｍｌをＧ‐２５カラム（１ｃｍ×１５ｃｍ）に通し、リン酸緩衝液（０．１０Ｍ、ｐＨ８．０）で溶出し、回収した分画をあわせてセントリコン（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ、登録商標）１０により２．３ｍｇ／ｍｌで容積０．９０ｍｌまで濃縮した。このサンプルの３分の１を、ＤＭＦに溶解した２‐ＣＭＥ‐７‐メトキシ‐ＤＭＡＥ ＮＨＳエステル（０．０７５ｍｌ、０．５０ｍｇ／０．７０ｍｌ、２０当量）のサンプルとともに２時間インキュベートした。Ｇ‐２５カラムによる精製およびセントリコン１０による濃縮により、ＰＢＳ緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．
０５％ＮａＮ_３）に溶けた生成物０．２１ｍｇ（０．５２ｍｇ／ｍｌ）が得られた。ＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ分析は、抗体に１．３個の標識が結合されたことを示した。

均一系ＣＬ共鳴エネルギー移動反応におけるアビジンおよびビオチン‐ＡＥのビオチン‐ＪｆＮｐＦＬによる滴定
結合反応（３００μＬ）は、表９に示すようにＢＳＡ‐ＰＢＳ（０．１％ＢＳＡ‐１０ｍＭリン酸カリウム‐０．１５Ｍ ＮａＣｌ‐０．０５％アジ化ナトリウム、ｐＨ８）中で構築した。様々な濃度の「ビオチン‐Ｊｆ‐Ｎｐ‐ＦＬ、１００μＬ」と略記したビオチン‐ジェファミン‐ナフトフルオレセインおよび「ビオチン‐ＡＥ、１００μＬ」と略記したビオチン‐ヘキサエチレングリコール‐２‐ＣＭＥ‐７‐メトキシ‐ＤＭＡＥを予め混合し、１μＭのニュートラビジン（ピアス社（Ｐｉｅｒｃｅ））またはストレプトアビジン（１００μＬ、シグマ社（Ｓｉｇｍａ））を添加し混ぜることによって競合的結合反応（反応番号６〜１４）を開始させ、続いて３７℃で３０分間インキュベートした。コントロール反応（反応番号１〜５）は、記載の試薬を用い、ＢＳＡ‐ＰＢＳで３００μＬとした。データを表９に示す。各反応のデータは、表９中の番号付きの列として示し、第１列のデータは反応１を、第２列は反応２を示し、以下同様である。

ＣＬは、赤色感受性ＰＭＴ管（Ｈａｍａｍａｔｓｕ Ｒ２２２８）および２つのフィルタ（コリオン（Ｃｏｒｉｏｎ、登録商標）カットオフ・フィルタ、６５０ｎｍ超を読み取るため）を備えたＭＬＡ１で、１％過酸化物‐０．５％ＣＴＡＣ‐０．１Ｍ重炭酸ナトリウム‐０．０５％アジ化ナトリウム、ｐＨ８．３を３００μＬ単回注入することにより４℃で測定した。記載の５秒当たりの正味のＲＬＵは、アビジンのみによるバックグラウンドの２１００または２３００ＲＬＵを差し引いたカウントである。また、ビオチンＮｐＦＬ単独でもこの低いバックグラウンドが得られたが、それ自体はどちらのアビジンによっても増大しなかった。表９の反応４および５のデータを参照のこと。ニュートラビジン単独ではビオチン‐ＡＥのＣＬが〜４倍に増大し、一方ストレプトアビジン単独では〜３分の１に減少した。表９の反応６および３のデータを参照のこと。ビオチン‐ＪｆＮｐＦＬが加わるとＣＬはさらに用量依存的に増大した。表９の反応７〜１４を反応６と対比して参照されたい。ビオチンＡＥとストレプトアビジンとを識別可能なビオチン‐ＪｆＮｐＦＬの範囲は約２〜３桁で、サンプル１００μＬ中の検出限界は０．００５μＭ未満であった。「ストレプトアビジン複合物におけるビオチン‐ＡＥからビオチン‐ｊｆＮｐＦＬへのＣＬ ＲＥＴ」のプロットを示す図１０を参照されたい。

図１０に示されるように、最適濃度では、ＲＥＴシグナルは、ストレプトアビジンについては最大１１０倍、ニュートラビジンについては最大１０倍増加した。これらの結果は、ＲＥＴ結合性複合物のサイズをビオチン：アビジン複合物のサイズまで小さくすることが可能であれば最大３ｌｏｇのダイナミック・レンジまでのサンドイッチ・アッセイが可能であることを示唆している。

ビオチン‐ＡＥが単独でアビジンと結合することにより、生じた化学発光シグナルに変調が生じた。表９の反応３のデータを反応６のデータと比較されたい。２２，５８５のシグナルは、ニュートラビジンで８１，７１０へ増加し、ストレプトアビジンで８，１１０へ減少した。興味深いことに、ニュートラビジンは化学発光（４８０ｎｍ）を増大させたが、ストレプトアビジンは化学発光を減少させた。したがって、抗体の部位特異的な化学修飾は、結合したＣＬ標識によって生じるシグナルを変調するのに有用である可能性がある。したがって、本実施例においては、結合反応において様々なレベルのビオチン‐ＮｐＦＬがアビジンに対してビオチン‐ＡＥと競合する場合に、化学発光ＲＥＴ（＞６５０ｎｍ）の量もアビジン分子種に左右される。

ビオチン‐ＡＥ、ビオチン‐Ｊｆ‐Ｎｐ‐ＦＬおよびニュートラビジンによるＣＬエネルギー移動を介するビオチンの均一系逐次飽和アッセイ
記載の濃度のビオチン（１００μＬ）および１μＭニュートラビジン１００μＬを混合し、２０℃で１時間インキュベートした（表１０）。次いで、２５ｎＭビオチン−ＡＥおよび２５０ｎＭビオチン‐Ｊｆ‐Ｎｐ‐ＦＬの溶液を加え、混合し、続いて３７℃で３０分間インキュベートした。最後に、上記のようにＭＬＡ１で読み出しを行った。すべてのバックグラウンド対照値は低かった（反応１〜４）。正味ＲＬＵは、ニュートラビジン単独の場合の３２８５ＲＬＵのバックグラウンド値を差し引いたカウントである。ビオチンの初期の結合により、次の段階において結合する標識ビオチンの量が減少し、それにより約２．５μＭ以上のビオチンで用量依存的にＲＥＴをかなり減少させた。

遊離のビオチンを、一定レベルのビオチン‐ＡＥ、ビオチン‐ＮｐＦＬおよびニュートラビジンと競合させた。表１０に示すように、一部の標識複合体の代わりにニュートラビジンと結合したビオチンは、結合しない場合に増強されるはずのエネルギー移動を低下させた。

（ａ）ＣＬ共鳴エネルギー移動を介するＨＣＧの均一系イムノアッセイ
この実施例では、第１の抗体をアクリジニウム・エステル（２‐ＣＭＥ‐７‐メトキシ‐ＤＭＡＥ）で標識し、第２の抗体を蛍光色素（ナフトフルオレセイン）で標識するＨＣＧの均一系アッセイについて詳細に述べる。

競合的結合反応（３００μＬ）は、ＢＳＡ‐ＰＢＳ中で構築した。抗‐ＨＣＧ（全体）（７５０４ＭＲ）‐（２‐ＣＭＥ‐７‐メトキシ‐ＤＭＡＥ）_１．３を、抗ＨＣＧ（β）（１０２４４５９０１）‐（ナフトフルオレセイン）_４．５と予め混合しそれぞれ最終１０．４μｇ／ｍＬ、１２．０μｇ／ｍＬとした。次いで、表２に示す様々な濃度のＨＣＧ標準品（２００μＬ）を、各チューブ当たり１００μＬの前記混合物に加え（各標準品につき４連）、密封し、続いて混合して３７℃の水浴中で１時間インキュベートした。最後に、各標準品について２チューブを、上記のように単一試薬（ｐＨ８．３）を用いてＣＬを開始させて読み取ることにより４℃においてＭＬＡ１で測定した。５分後、単一ＣＬ試
薬による読み取りを用い同一機器で他の２チューブを読み取ると、シグナルは、５０００ｍＩＵ／ｍＬ ＨＣＧにおいて最大となってＨＣＧが０のときのシグナルの２．７倍に増加し、次いで徐々に減少した。

ジメチル・アクリジニウム・エステル（ＤＭＡＥ）のｐＨ滴定を示すグラフ。 ２，７‐ジメトキシ‐ＤＭＡＥのｐＨ滴定を示すグラフ。 アクリジニウム・エステル・トレーサーを用いる均一系カルバマゼピン・アッセイを示すグラフ。 アクリジニウム・スルホンアミド・トレーサーを用いる均一系カルバマゼピン・アッセイを示すグラフ。 アクリジニウム・エステル・トレーサーを用いる均一系テオフィリン・アッセイを示すグラフ。 アクリジニウム・スルホンアミド・トレーサーを用いる均一系テオフィリン・アッセイを示すグラフ。 アクリジニウム・エステル・トレーサーを用いる均一系バルプロエート・アッセイを示すグラフ。 アクリジニウム・スルホンアミド・トレーサーを用いる均一系バルプロエート・アッセイを示すグラフ。 クエンチングを用いる均一系バルプロエート・アッセイを示すグラフ。 ストレプトアビジン複合物におけるビオチン‐ＡＥからビオチン‐ＪｆＮｐＦＬへのＣＬ ＲＥＴを示すグラフ。

Claims (8)

1. 強酸または強塩基を添加することなく分析物を検出または定量するための化学発光性アクリジニウム化合物を用いる均一系アッセイであって、前記化学発光性アクリジニウム化合物が、
   （ｉ）アクリジニウム核上のＣ２位およびＣ７位の少なくともいずれかに電子供与性官能基を有するアクリジニウム・エステル、ならびに
   （ｉｉ）アクリジニウム・スルホンアミド
   からなる群から選択されることを特徴とするアッセイ。
2. サンプル中の分析物を検出または定量するための均一系アッセイであって、
   （ａ）アクリジニウム核上のＣ２位およびＣ７位の少なくともいずれかに電子供与性官能基を有するアクリジニウム・エステル、またはアクリジニウム核上のＣ２位およびＣ７位の少なくともいずれかに電子供与性官能基を有するか、もしくは有していないアクリジニウム・スルホンアミドからなる群から選択される化学発光性アクリジニウム化合物と該分析物との複合体を生成する工程と、
   （ｂ）未知濃度の該分析物を含有するサンプルに所定量の該複合体を添加する工程と、
   （ｃ）該分析物に特異的な抗体を添加し、該分析物またはそのアクリジニウム複合体との結合性複合物を生成する工程と、
   （ｄ）該結合性複合物の溶液をインキュベートする工程と、
   （ｅ）６〜１０のｐＨ範囲で化学発光誘発試薬を添加することにより、該結合性複合物反応混合物の化学発光を誘発し、発光を引き起こす工程と、
   （ｆ）ルミノメーターで発光量を測定する工程と、
   （ｇ）該反応混合物からの発光量を、発光量を既知濃度の該分析物と関連付ける標準用量反応曲線と比較することにより、該分析物の濃度を計算する工程と
   からなるアッセイ。
3. アクリジニウム化合物が前記アクリジニウム・エステルである請求項２に記載のアッセイ。
4. アクリジニウム化合物が前記アクリジニウム・スルホンアミドである請求項２に記載の
   アッセイ。
5. 前記化学発光性アクリジニウム化合物が以下の構造、すなわち
   

   

   （式中、
   Ｒ_１は、２０個までのヘテロ原子を含むアルキル、アルケニル、アルキニルもしくはアラルキル、またはスルホプロピルもしくはスルホブチル基であり、
   Ｘは、酸素または窒素であり、
   Ｙは、２０個までの炭素原子を含む分枝鎖もしくは直鎖のハロゲン化もしくは非ハロゲン化アルキル、または置換アリール、または複素環系であり、
   Ｘが酸素の場合にＺは省略され、Ｙは下式の多置換アリール部分であり、
   

   

   式中、Ｒ_４およびＲ_８は、同一または異なり、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシル（‐ＯＲ）、アルキルチオール（‐ＳＲ）、またはアクリジニウム核とＹ部分間の‐ＣＯＸ‐結合を立体効果および電子効果の少なくともいずれかにより安定化する働きをする置換アミノ基であり、
   Ｒ_５およびＲ_７は、水素またはＲと同一であり、
   Ｒ_６は、‐Ｒ_９‐Ｒ_１０であり、
   Ｒ_９は不必要、または２０個までのヘテロ原子を含む、分枝鎖もしくは直鎖アルキル、置換もしくは無置換のアリールもしくはアラルキルであり、
   Ｒ_１０は、下式、すなわち
   

   

   ‐ＳＯ_２Ｃｌ、‐Ｎ_３、‐Ｎ_２ ^＋Ｃｌ⁻、ハロゲンもしくはカルボン酸からなる群から選択される、脱離基または脱離基に接続された求電子官能基であり、
   Ｒ_５およびＲ_６、ならびにＲ_６およびＲ_７は交換可能であり、
   Ｘが窒素の場合には、Ｚは‐ＳＯ_２‐Ｙ’であり、Ｙ’はＹと同一の定義であり、両者は同一または異なることが可能であり、
   Ｗ１およびＷ２は同一または異なり、ＯＲ、ＯＨ、ＳＲ、ＳＨ、ＮＨ_２、ＮＲ’Ｒ”からなる電子供与基であって、Ｒ、Ｒ’およびＲ”は同一または異なることが可能であり、２０個までのヘテロ原子を含むアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、およびアラルキルからなる群から選択され、
   Ａ⁻は、前記アクリジニウム核の４級窒素と対をなすために導入される対イオンであり、ＣＨ_３ＳＯ_４ ⁻、ＦＳＯ_３ ⁻、ＣＦ_３ＳＯ_４ ⁻、Ｃ_４Ｆ_９ＳＯ_４ ⁻、ＣＨ_３Ｃ_６Ｈ_４ＳＯ_３ ⁻、ハロゲン、ＣＦ_３ＣＯＯ⁻、ＣＨ_３ＣＯＯ⁻、およびＮＯ_３ ⁻からなる群から選択される）
   を有する請求項２に記載のアッセイ。
6. 当該分析物が、ステロイド、治療薬、ビタミン、ホルモンおよびペプチドからなる群から選択される小分子である請求項２に記載のアッセイ。
7. 強酸または強塩基を添加することなく巨大分子分析物を検出または定量するための均一系共鳴エネルギー移動サンドイッチ・アッセイであって、
   （ａ）該巨大分子分析物に特異的な抗体と化学発光性アクリジニウム化合物との複合体を生成する工程と、
   （ｂ）同巨大分子分析物に特異的な第２の抗体とアクセプター分子との複合体を生成する工程と、
   （ｃ）サンプル中の該巨大分子分析物と複合体との複合物を生成させ、反応混合物を形成する工程と、
   （ｄ）６〜１０のｐＨ範囲で化学発光誘発試薬を添加することにより、該結合性複合物反応混合物の化学発光を誘発する工程と（励起状態エネルギーは第１の複合体の化学発光性アクリジニウム化合物から第２の複合体のアクセプター分子へ移動され、それによって該アクセプター分子からの発光または光減衰を引き起こす）、
   （ｅ）ルミノメーターで光の量を測定する工程と、
   （ｆ）該反応混合物からの発光量を、発光の量を既知濃度の該巨大分子分析物と関連付ける標準用量反応曲線と比較することにより、該巨大分子分析物の濃度を計算する工程とからなり、前記化学発光性アクリジニウム化合物が、
   （ｉ）アクリジニウム核上のＣ２位およびＣ７位の少なくともいずれかに電子供与性官能基を有するアクリジニウム・エステル、ならびに
   （ｉｉ）アクリジニウム・スルホンアミド
   からなる群から選択されることを特徴とするアッセイ。
8. 当該巨大分子分析物が、タンパク質、核酸、オリゴ糖、抗体、抗体フラグメント、細胞、ウイルスおよび合成高分子からなる群から選択される請求項７に記載のアッセイ。

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