JP3921552B2 - Ｒｎａウイルス感染性クローンおよびそれから誘導されるワクチンと診断アッセイ法 - Google Patents

Description

本発明はＲＮＡウイルスおよびＲＮＡウイルスから得られる感染性クローンの領域に関する。さらに、本発明はかかるＲＮＡウイルスの感染性クローンを用い、修飾することにより得られるワクチンと診断アッセイ法に関する。
組換えＤＮＡ技術は、ＤＮＡレベルでの核酸修飾を目的とした非常に多様で強力な生物学技法であり、分子レベルでゲノムを分析、修飾することを可能とする。この観点において、ウイルスはそのゲノムが小さなサイズであるが故に、特にそのような巧妙な取り扱いで分析することができる。しかし、組換えＤＮＡ技術は非レトロウイルス型のＲＮＡウイルスに直接適用できる訳ではない。その理由はこれらのウイルスがその複製に際してＤＮＡ中間段階を包含しないからである。かかるウイルスにとっては、組換えＤＮＡ技術をそのゲノムに適用して修飾ウイルスを生成させる前に、感染性クローン（例えば、ＤＮＡコピーとして、またはin vitroて転写したＲＮＡコピーとして、またはそのいずれかの誘導体として）を開発する必要がある。感染性クローンはウイルスの全長（ゲノム長）ｃＤＮＡ（ここではＲＮＡのＤＮＡコピーにつき広い意味で用い、ｍＲＮＡのＤＮＡコピーについての厳密な意味ではない）の構築を経て誘導することができる。それについての研究では感染性転写物を全長ｃＤＮＡでトランスフェクションした細胞中in vivoで合成するが、感染性転写物は完全なウイルスゲノムからなるin vitroで結合した部分長のｃＤＮＡフラグメントからin vitroで転写することによっても得ることができる。すべての場合において、転写されたＲＮＡはｃＤＮＡに導入されたすべての修飾をもち、このように修飾したウイルスをさらに継代するのに使用することができる。
感染性ｃＤＮＡクローンおよび感染性in vitro転写物は大量のプラス鎖ＲＮＡウイルス（総説としては、ボイヤーおよびヘンニー（Boyer and Haenni）、Viology１９８、４１５〜４２６参照）について１２kbまでのまたは僅かに大きいゲノムと共に産生されている。ペスチウイルス（Pestivirus）のウイルスゲノム長はこれまで最も長いプラス鎖ウイルスＲＮＡゲノムと思われており、このものから感染性クローン（ムーアマン（Moormann）ら、J.Vir. ７０：７６３〜７７０）が調製されている。ゲノム長と関係する問題はバクテリアにおいて長い安定なｃＤＮＡクローンを得て維持することの困難さにあるのみならず、ウイルスの複製に関連する正常に関与するウイルス・タンパクの介助なしに宿主細胞中で複製が遂行される最初のＲＮＡ転写物の感染性にもある。感染を成功裏に達成するためには、ウイルス転写物がウイルス・コード化タンパクと、特にウイルス・レプリカーゼと、また、翻訳機構などの宿主細胞成分と相互に作用しなければならない。従って、ウイルス転写物の構造はビリオンＲＮＡの構造にできる限り近似していなければならない。さらなる問題は、ゲノムの３'側から転写されるサブゲノム・メッセンジャーＲＮＡのメカニズムを経て複製するこれらプラス鎖ＲＮＡウイルスについて、また、ゲノムの一部のみである数種の構造タンパクからなる、裸のキャプシドまたは中空殻粒子などの、複製に際し欠陥のある干渉性粒子を生成するこれらプラス鎖ＲＮＡウイルスについて見出すことができる。不完全ウイルスＲＮＡフラグメントの存在または、例えば、転写されるウイルスＲＮＡと、または複写中間物のＲＮＡと相互作用するかあるいはそれを妨害し、その構造を損なうマトリックスもしくはヌクレオキャプシド・タンパクの存在が全長ＲＮＡ鎖の合成を阻止し、その結果、ゲノム長のＲＮＡを含む感染性ウイルスの生成を阻止する。
ブタ生殖呼吸器症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ、ゲノム長さ１５．２kb）とも呼ばれるレーリスタット（Lelystad）ウイルス（ＬＶ）はアルテリウイルス科（Arteriviridae）の一つであり、この科はまた、ウマの動脈炎ウイルス（ＥＡＶ、ゲノム長さ１２．７kb）、乳酸脱水素酵素−上昇ウイルス（ＬＤＶ，ゲノム長さ、少なくとも１４．２kb）、およびサル出血熱ウイルス（ＳＨＦＶ，ゲノム長さ、約１５kb）（ミューレンベルフ（Muelenberg）ら、１９９３ａ；プラゲマンおよびメーニッヒ（Plagemann and Moennig）、１９９３）を含む。
最近、国際ウイルス分類委員会はこの科をコロナウイルス科（Coronaviridae）（ゲノム長さ、２８〜３０kb）およびトロウイルス科（Toroviridae）（ゲノム長さ、２６〜２８kb）と共に新しい目、ニドウイルス目（Nidovirales）に入れることを決定した。このニドウイルス目はエンベロープＲＮＡウイルスを代表し、プラス鎖ＲＮＡゲノムを含み、複製に際し、サブゲノムＲＮＡの３'ネストセットを合成する。コロナウイルスとアルテリウイルスのサブゲノムＲＮＡはウイルスゲノムの５’末端から誘導されるリーダー配列を含む（スパーン（Spaan）ら、１９８８；プラゲマンおよびメーニッヒ（Plagemann and Moennig）、１９９３）。トロウイルスのサブゲノムＲＮＡはリーダー配列を欠いている（スニーデルおよびホルジネック（Snijder and Horzinek）、１９９３）。ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをコード化するＯＲＦ1aおよび1bはゲノムＲＮＡから発現されるが、構造タンパクをコード化するニドウイルス目のゲノム３'末端のより小さいＯＲＦはサブゲノムｍＲＮＡから発現される。
ＰＲＲＳＶ（レーリスタット（Lelystad）ウイルス）は１９９１年ウエンスボート（Wensvoort）ら（１９９１）により最初に単離されたが、今ではブタ生殖呼吸器症候群ウイルス（ＰＲＲＳ）として知られる新しい疾患の原因物質であることが判明した。この疾患の主徴候はブタの呼吸器障害とメスブタの流産である。１９８７年に米国で、１９９１年にヨーロッパで最初に観察されたように、主要な発生は減少しているいるが、このウイルスは今なお米国、ヨーロッパおよびアジアで家畜の群れに経済的損失をもたらしている。ＰＲＲＳＶは肺胞マクロファージ中で優先的に増殖する（ウエンスボート（Wensvoort）ら、１９９１）。２〜３の細胞株、例えば、ＣＬ２６２１およびサル腎臓細胞株ＭＡ−１０４からクローン化される他の細胞株（ベンフィールド（Benfield）ら、１９９２；コリンズ（Collins）ら、１９９２；キム（Kim）ら、１９９３）もまた当該ウイルスに感受性である。いくつかの周知のＰＲＲＳＶ株は以下の受け入れ番号で知られている。CNCM I-1102、I-1140、I-1387、I-1388、ECACC V93070108、またはATCC VR2332、VR2385、VR2386、VR2429、VR2474、およびVR2402。ＰＲＲＳＶのゲノムは完全にまたは部分的に配列決定されており（コンゼルマン（Conzelmann）ら、１９９３；ミューレンベルフ（Muelenberg）ら、１９９３ａ；マーソウ（Murthaugh）ら、１９９５）、コード化しているが、その他にも、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＯＲＦ 1aおよび1b）、６種の構造タンパクがあり、その４種の包膜糖タンパクはGP₂（ORF2）、GP₃（ORF3）、GP₄（ORF4）およびGP₅（ORF5）であり、他は非グリコシル化膜タンパクＭ（ORF6）およびヌクレオキャプシドタンパクＮ（ORF7）である（ミューレンベルフ（Muelenberg）ら、１９９５、１９９６；バン・ニューシュタット（van Nieuwstadt）ら、１９９６）。ＰＲＲＳＶのＥＰおよびＵＳ株の免疫学的特性化とヌクレオチド配列決定により、構造ウイルスタンパク中に位置するＰＲＲＳＶの株内でのマイナーな抗原性の差異を確認している（ネルソン（Nelson）ら、１９９３；ウエンスボート（Wensvoort）ら、１９９２；マーソウ（Murthaugh）ら、１９９５）。
ブタは口鼻経路でＰＲＲＳＶを感染させることができる。肺に入ったウイルスは肺胞のマクロファージにより取り込まれ、これらの細胞内でＰＲＲＳＶの複製が９時間以内に完結する。ＰＲＲＳＶは１２時間以内に肺から肺リンパ節に移行し、次いで、末梢のリンパ節、骨髄および脾臓に３日以内に移動する。これらの部位では、ほんの２〜３の細胞がウイルス抗原に陽性に着色する。このウイルスは少なくとも２１日間、時にはより長く血中に存在する。７日後、ＰＲＲＳＶに対する抗体が血中に見出される。ＰＲＲＳ感染ブタ中にウイルスと抗体が組み合わさって存在することは、ウイルス感染が低レベルであっても、また抗体が存在するにもかかわらず、長時間生存し得ることを示している。少なくとも７週間、肺の肺胞細胞の個体群は正常ＳＰＦの肺と異なっている。
ＰＲＲＳＶは口鼻経路を介してブタに感染させるためにその包膜を必要とし、従って、ブタの正常な免疫応答はとりわけ１以上の包膜タンパクに対しての中和抗体産生を必然的に伴う。かかる抗体はウイルスを非感染性とする。しかし、ウイルスも肺胞マクロファージ中で一旦は裸のキャプシドを産生する。該キャプシドはＭおよび/またはＮタンパクにより包膜されたＲＮＡで構築され、場合により部分的にある種の糖タンパクを含んでいる。これら不完全なウイルス粒子または（部分的に）裸のキャプシドが細胞内または細胞外に存在することは電子顕微鏡に証明することができる。ある場合には、核酸内容物をもたない裸のキャプシドが見つかることもある。裸のキャプシドは血流に乗り全身に拡散し、脾臓、リンパ節および骨髄でマクロファージにより血中から取り込まれる。これらの裸ではあるが感染力のあるウイルスキャプシドは、ブタが産生した抗体により中和されることがなく、従って、抗体の存在下でもウイルス感染の存続することが説明される。感染した骨髄細胞からのマクロファージの子孫はこの様式で身体の新たな部位へウイルス感染を拡大していく。すべての骨髄マクロファージ系統細胞が感染している訳ではないので、末梢部位の限られた少数のマクロファージのみが感染され、ウイルスを産生する。ＯＲＦ７タンパクのみからなるＰＲＲＳＶキャプシドは、例えば、マクロファージをキメラ仮性狂犬病（pseudorabies）ＯＲＦ７ベクター・ウイルスで感染することにより他のウイルスタンパク不存在下で形成させることができる。ＰＲＶウイルスはＰＲＲＳＶのＯＲＦ７遺伝情報を含むように巧みに操作された。感染１８時間後、感染細胞の細胞質はＰＲＲＳウイルス・ヌクレオキャプシドのサイズをもつ大量の小さな空の球形構造物を含んでいる。
本発明は感染性クローンをここに提供するが、該クローンはこれまでにも感染性クローンを得ているプラス鎖ＲＮＡウイルスの、その最大ゲノムの長さをはるかに超えるゲノム長を有するウイルスから誘導する。本出願の実験の部では１５．２kbのゲノム長を有するＰＲＲＳＶに基づき、それから誘導される感染性クローンの産生につき記載するが、かかるクローンは今や約１５kbのゲノム長を有するＬＤＶおよびＳＨＦＶから、また、そのゲノムの僅かに小さいＥＡＶから、また、コロナウイルス科またはトロウイルス科などの、より大きいゲノム長を有するウイルスから得ることができる。
本発明はまた感染性クローンを産生する方法を提供する。該方法は、不完全ウイルスＲＮＡフラグメントの存在、あるいは例えば、転写されるＲＮＡ転写物と、または複写中間物のＲＮＡと相互作用するかあるいはそれを妨害し、その構造を損なうマトリックスもしくはヌクレオ・キャプシド・タンパクの存在と関連して、ウイルスＲＮＡ鎖合成に際して遭遇する問題を回避することにより感染性クローンを産生する。該方法は全長ＲＮＡ鎖合成を不要とし、従って、感染性ウイルスの産生を不要とする。本発明は宿主細胞をトランスフェクションすることにより感染性クローンを産生する方法を提供する。該方法は、野生型ウイルスでの感染には本質的に非感受性である宿主細胞を当該ウイルスに基づく組換え核酸でトランスフェクションし、次いで、該ウイルスに感受性の細胞に移行させるか、該細胞と共培養することにより当該宿主細胞から感受性子孫ウイルスを回収することからなる。本質的に感受性ではない細胞とは、当該研究ウイルスの複製に常時用いる細胞と比較して、当該研究ウイルスにほんの僅かに感受性であるか、全く感受性ではないものであるが、他のウイルス株には完全に感受性であってもよい。本発明は野生型ウイルスでの感染に非感受性の宿主細胞をトランスフェクションすることにより感染性クローンを産生する方法を提供する。この場合には、ＲＮＡフラグメントと、ウイルスＲＮＡ鎖合成に干渉するマトリックスまたはヌクレオチドキャプシドタンパクとからなる裸のキャプシドまたは不完全ウイルス粒子の産生を避けることからなる。感染性ウイルスはこのようにトランスフェクションした宿主細胞から、該ウイルスに感受性の細胞に移行することにより回収する。実験の部で、どのようにこの方法でＰＲＲＳＶの感染性クローンを得るかを記載するが、この方法はまた、他のプラス鎖ＲＮＡウイルスにも適用することができる。
本発明はまた、組換えＤＮＡ技術のさらなる応用により修飾した感受性クローンを産生させる可能性を提供する。かかる修飾は単回または複数回の変異、置換、欠失もしくは挿入またはその組み合せであり、技術上既知の組換えＤＮＡ技法により達成することができる。このように、本発明は修飾したＲＮＡウイルスを提供し、該ウイルスはＲＮＡウイルスの研究およびワクチン調製に使用することができる。
本発明はまた、例えば、ＰＲＲＳＶなどのアルテリウイルス科（Arteriviridae）からの感染性クローンを提供するものであり、該感染性クローンは該クローンが基本となるウイルスを原因とする疾患に対し単回用途ワクチンとして使用することができる。例えば、ＰＲＲＳＶに基づく感染性クローンは今やＰＲＲＳＶの発病マーカーまたは血清学的マーカーを研究するのに用いることができる。ＰＲＲＳＶの既知血清学的マーカーは、例えば、ＯＲＦ２ないし７によりコード化したＰＲＲＳＶの構造タンパクのいずれかに位置しているが、ＯＲＦ1aおよび1bによりコード化したタンパクにも見出すことができる。発病マーカーはＰＲＲＳＶの非構造タンパクをコード化するＯＲＦ1aおよび1bに存在するが、ＯＲＦ２ないし７によりコード化した構造タンパクのいずれにも見出すことができる。これらのマーカーに関して感染性クローンのゲノムを修飾することにより、その親株に比べて悪性ではないか、または弱いＰＲＲＳＶ、および/またはワクチン投与したブタと野生型ウイルスで感染したブタとの間の血清学的分化を可能とするために血清学的マーカーを欠失させる、あるいは導入することにより修飾したＰＲＲＳＶを得ることが可能である。かかる修飾は、例えば、ＰＲＲＳＶ感染性クローンにより提供されるが、そこでは、ＯＲＦ７ Ｎタンパクをコード化する核酸配列がATCC VR2332またはLDVのＯＲＦ７タンパクと置き換わっている。
本発明はまた、例えば、ＰＲＲＳＶなどのアルテリウイルス科（Arteriviridae）から誘導される感染性クローンをも提供し、このものは多様な抗原の送達システムまたはウイルス・ベクター・ワクチンとして用いることができる。かかるクローンにおいては、研究対象ウイルスの配列に対応しない異種核酸配列が挿入される。かかる異種核酸配列は、例えば、選び抜いた抗原をコード化する配列から誘導することができる。この抗原は病原に対し免疫性を誘導するタンパクまたはペプチドである。該ウイルスは骨髄のマクロファージおよびマクロファージ系統細胞に感染し、その孫細胞を介して抗原含有ウイルスを分布するので、このウイルス・ベクターワクチンは免疫系に中心的な細胞に感染し、さらに進んだ工程で抗原を呈示することができる。該ベクターワクチンウイルスは樹枝状マクロファージまたはカッパー（Kuppfer）細胞または他の免疫系細胞などの抗原呈示細胞に感染し、（不完全）エンベロープ・ウイルス粒子として、あるいは裸のキャプシド粒子としてこれを実施することができる。裸のキャプシドまたは不完全ウイルス粒子での感染は持続する感染を確実にするので、免疫学的増幅効果は抗原を選択した病原に対し寿命の長い免疫性をもたらすだろう（低レベルでの刺激が継続する故に）。我々は他の病原性生物または物質のエピトープに情報を組み込むことにより、抗原キャリヤーとして該ウイルスを使用することができる。外来エピトープ情報を担持するかかるベクターワクチンウイルスのいくつかは、一度に混合し、投与してもよい。この方法は１つの病原の数種の異なる抗原に対しての活発な免疫、あるいは数種の異なる病原に対しての活発な免疫を可能とする。
本発明はまた、例えば、ＰＲＲＳＶなどのアルテリウイルス科（Arteriviridae）から誘導される感染性クローンをも提供し、該クローンは二重目的のワクチンとして使用することができる。例えば、ＰＲＲＳＶに基づく感染性クローンはＰＲＲＳＶともう一種の病原に対し防御するワクチンを構築するために使用することができるが、その場合、ベクターワクチンの開発を、ＰＲＲＳＶに対し向けられた単一目的ワクチンの開発を目指す開発と単に組み合せることにより実施する。特定の二重目的ワクチンはブタの呼吸器疾患を防御する目的で開発されているが、そこではブタに感染することの知られた種々の他の呼吸器病原のいずれかから誘導した抗原をＰＲＲＳＶワクチンに挿入している。
本発明はまたワクチンを提供するが、それは単一目的の、二重目的の、あるいはベクターのワクチンであり、当該ワクチンが環境に流出し得ないという意味で安全である。当該ワクチンの安全性（非流出性）は包膜した感染性ウイルスを生産するのに必要なこれらウイルスタンパクの情報を欠失させることによって確実なものとすることができる。このウイルスは当該タンパクを構成的に発現する細胞株中で増殖しなければならない。この相補性細胞株でのウイルス複製は完全な包膜を有し、ブタのマクロファージに感染することができる。１回の複製サイクルの後、包膜タンパクの情報を欠く孫ウイルスは、最早、エンベロープウイルスのように他の細胞に感染することができない。体内でのマクロファージ感染は裸のキャプシドまたは不完全ウイルス粒子としてもなお可能である。
本発明はまた、ウイルス抗原およびタンパクをも提供するが、これらは本発明により修飾したＲＮＡウイルスで感染させた細胞培養物から取得することができる。かかる抗原は、ＥＬＩＳＡまたは当業者既知の他のタイプの診断アッセイなど、診断アッセイ法に使用することができる。かかるアッセイ法は一次診断のための単独型試験として、または本発明により修飾したＲＮＡウイルスに基づき、識別ワクチンもしくはマーカーワクチンを接種した動物群に適用する随伴試験として使用することができる。
実験の部
in vitroで感染性ＲＮＡを転写し得るｃＤＮＡクローンの生産はプラス鎖ＲＮＡウイルスの分子遺伝子分析用の本質的な手段となっている。この技術はプラス鎖ＲＮＡウイルスに適用可能であり、そのＲＮＡゲノムはｍＲＮＡとして機能し、適切な宿主細胞に導入したとき、完全な感染サイクルを始動する。多くのウイルスについて感染性クローンが記載されており、遺伝子の発現、複製、ウイルスタンパクの機能およびＲＮＡウイルスの組換えに関する研究を容易なものとしている（総説についてはボイヤーおよびヘンニー（Boyer and Haenni）１９９４年参照）。さらに、これらのクローンは新しいウイルスベクターおよびワクチンの開発のために考慮することができる。感染性ｃＤＮＡクローンについてはアルテリウイルスに関しこれまで記載されたことはない。我々はＰＲＲＳＶの感染性クローン産生およびキメラＰＲＲＳＶウイルス産生におけるその最初の応用につきここに報告する。
材料と方法
細胞およびウイルス
ＰＲＲＳＶ（またはＬＶ）のター・ハーン（Ter Huurne）株（ＣＮＣＭに寄託、パリ、受け入れ番号Ｉ−１１０２）は１９９１年に単離し（ウエンスボート（Wensvoort）ら、１９９１）、一次肺胞マクロファージ中またはＣＬ２６２１細胞中で増殖した。ター・ハーン（ＴＨ）株の６次継代物をこの研究に使用した。また、この株の誘導体、LV4.2.1をＣＬ２６２１細胞上に適合させ、系列継代により増殖した。肺胞マクロファージはＲＰＭＩ１６４０増殖培地（フロー）に維持し、一方、ＣＬ２６２１細胞はハンクス（Hanks）の最小必須栄養培地（ギブコーＢＲＬ/ライフ・デクノロジー）に維持した。ＢＨＫ−２１細胞はダルベッコ（Dulbecco）の最小必須栄養培地に維持した。トランスフェクションの実験のために、ＢＨＫ−２１細胞はグラスゴー（Glasgow）最小必須栄養培地（ギブコーＢＲＬ/ライフ・デクノロジー）中に、リルジェストロームおよびガロフ

（１９９３年）の方法に従い増殖させた。
ウイルスＲＮＡの単離
すでに記載されているように（ミューレンベルフ（Muelenberg）ら、１９９３ａ）、感染多重度１でＰＲＲＳＶにより感染、２４時間後の肺胞マクロファージまたはＣＬ２６２１細胞から細胞内ＲＮＡを単離した。ビリオン・ゲノムＲＮＡを単離するために、ビリオンをバン・ニューシュタット（van Nieuwstadt）ら（１９９６）の記載どおりに、スクロース勾配により精製し、ＴＮＥ（０．０１Ｍトリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．２、０．１Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ）に再懸濁した。プロティナーゼＫバッファー（１００ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．２、２５ｍＭ ＥＤＴＡ、３００ｍＭ ＮａＣｌ、２％（w/v）ＳＤＳ）１mlおよびプロティナーゼＫ（ベーリンガー・マンハイム）０．４ｍｇを精製ＰＲＲＳＶビリオン（１０⁸ＴＣＩＤ₅₀）１mlに加えた。この反応混合物を３７℃で３０分間培養した。ＲＮＡをフェノール/クロロホルム（１：１）で１度抽出し、エタノールで沈殿した。該ＲＮＡをエタノール中−２０℃で保存した。このＲＮＡ沈殿物の１／１０を逆転写（ＲＴ）反応に用いた。
ＰＲＲＳＶゲノムの５’および３’末端クローニング
ＰＲＲＳＶのウイルス・ゲノム５’末端を改良一本鎖連結反応により一本鎖ｃＤＮＡとする手法によりクローニングした（ＳＬＩＣ、エドワード（Edwards）ら、１９９１）。上記のように調製したビリオンＲＮＡの１／１０をプライマー１１Ｕ１１３（５’TACAGGTGCCTGATCCAAGA ３’）とのＲＴ反応に用いたが、該プライマーはゲノムのヌクレオチド１２３２〜１２５１に相補的である。該ＲＴ反応は既に記載のように（ミューレンベルフ（Muelenberg）ら、１９９３b）最終容量２０μｌで実施した。次いで、６Ｍ ＮａＯＨ ２μｌをＲＴ反応物に加え、ＲＮＡを３７℃で３０分間水解した。一本鎖ｃＤＮＡをベーリンガー・マンハイムの高純度ＰＣＲ産物精製キットを用いて精製した。精製したｃＤＮＡをエタノールで沈殿し、ＴＥに再懸濁し、連結反応して固定プライマーＡＬＧ３（５’CACGAATTCACTATCGATTCTGGATCCTTC ３’）とした。このプライマーはEcoRI、ClaIおよびBamHI部位を含み、その３’末端は自己結合を防ぐためにアミノ保護基で修飾されている。一本鎖ｃＤＮＡ産物を、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１０μg/ml ＢＳＡ、２５％ＰＥＧ、１．０ｍＭヘキサミン塩化コバルト、４０μＭ ＡＴＰ、および０．５μｌ（１０Ｕ）Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ（ニューイングランド・バイオラボ）中、４pmol ＡＬＧ３に結合した。結合反応物の１／３をＰＣＲの鋳型として用い、プライマーとしてＬＶ６９（５’AGGTCGTCGACGGGCCCCGTGATCGGGTACC ３’）およびＡＬＧ４（５’GAAGGATCCAGAATCGATAG ３’）を用いた。プライマーＬＶ６９はヌクレオチド５９４〜６１５に相補的であり、ＡＬＧ４は固定プライマーＡＬＧ３に相補的である。ＰＣＲの条件はミューレンベルフ（Muelenberg）ら（１９９３b）の記載どおりであり、得られた産物はEcoRIおよびSalIで消化し、ｐＧＥＭ−４Ｚにクローニングした。同様の方策を用いてＬＶゲノムの５’末端を細胞内ＬＶ ＲＮＡからクローニングした。これらの実験のために、ＬＶを感染させたＣＬ２６２１細胞から単離した総細胞ＲＮＡ１０μｇを使用した。５’ｃＮＤＡクローンの配列を決定し、公開されたＰＲＲＳＶ配列ミューレンベルフ（Muelenberg）ら、１９９３a）に比べて１０個分のヌクレオチドが伸長した１クローンｐＡＢＶ３８７をさらなる実験に使用した。
長鎖ポリ（Ａ）尾部を含む３’末端ｃＤＮＡクローンはプライマーＬＶ７６（５’TCTAGGAATTCTAGACGATCG(T)₄₀ ３’）でＬＶ ＲＮＡを逆転写することにより構築されたが、該ＬＶ７６はEcoRI、XbaIおよびPvuI部位を含んでいる。逆転写反応に続き、プライマーＬＶ７５（５’TCATAGGAATTCTAGACGATCGT ３’）、および３９Ｕ７０Ｒ（５’GGAGTGGTTAACCTCGTCAA ３’）によりＰＣＲを実施した。なお、ＬＶ７５はポリ（Ｔ）延伸部を除きＬＶ７６と同一であり、３９Ｕ７０Ｒはセンスプライマーであって、ＬＶゲノムのヌクレオチド１４５６６〜１４５８５に相当し、Hpa I部位を含んでいる。得られるＰＣＲ産物をHpa IおよびEcoRIで消化し、同じ酵素で限定したｃＤＮＡクローンｐＡＢＶ３９にクローニングした（図１）。４５Ａ（ｐＡＢＶ３８２）と１０９Ａ（ｐＡＢＶ３９２）のポリ（Ａ）伸長部および正しいゲノムｃＤＮＡ配列を含む２つのｃＤＮＡクローンは、オリゴヌクレオチド配列決定により評価されるごとく、全長ゲノムｃＤＮＡクローンを構築するのに使用した。
配列分析
オリゴヌクレオチドの配列はアプライド・バイオシステムズのＰＲＩＳＭ^TM迅速反応ダイ・デオキシ^TMターミネーター・サイクル配列決定キットおよび自動シークエンサーにより決定した。
ＰＲＲＳＶの全長ゲノムｃＤＮＡクローンの構築
ＬＶのゲノム・ヌクレオチド配列を決定するために以前に生成したｃＤＮＡクローン（ミューレンベルフ（Muelenberg）ら、１９９３a）を図１に示した常套の制限部位で共に結合した。プラスミドｐＡＢＶ２５４をｐＡＢＶクローン２５、１１、１２および１００から構築し、前の研究に用いた（デン・ブーン（denBoon）ら、１９９６）。標準クローニング手法はサムブルーク（Sambrook）ら（１９８９）の方法に従い実施した。これにより高コピー数のプラスミドｐＧＥＭ−４ＺをＬＶのｃＤＮＡに重なり合って含む３種のプラスミドを得た。プラスミドｐＡＢＶ３３１およびｐＡＢＶ３６９はＬＶゲノムのヌクレオチド５〜６０１５からなる。ヌクレオチドの相違はその領域で配列決定した６種の独立したｃＤＮＡクローンの一組中に１：１の割合で３４６２位に見出された。このヌクレオチドの相違はＯＲＦ１Ａの１０８４位のアミノ酸置換に至った（Proに代わってLeu）。我々はこのアミノ酸が感染性に及ぼす影響について予測し得なかったので、Leuコード化ｃＤＮＡフラグメントをEcoRV（ヌクレオチド３４０３）およびSacII（ヌクレオチド３６０５）部位で交換することによりｐＡＢＶ３３１にクローニングし、その結果、ｐＡＢＶ３６９とした。プラスミドｐＡＢＶ３８４はＬＶゲノムのヌクレオチド５１６８〜９８２５からなる。プラスミドｐＡＢＶ２０およびｐＡＢＶ５と重なり合う適切なｃＤＮＡクローンが未だ入手できず、また、最終的にｐＡＢＶ３３１およびｐＡＢＶ３６９のｃＤＮＡ配列に融合し得ないので、２種類の新しいｃＤＮＡフラグメントをＲＴ−ＰＣＲにより産生した。ヌクレオチド５１６９〜５１８６に相当するセンス・プライマーＬＶ５９（５’TCGGAATCTAGATCTCACGTGGTGCAGCTGCTG ３’）およびヌクレオチド６０７８〜６０９７に相補的なアンチセンス・プライマー６１Ｕ３０３（５’CATCAACACCTGTGCAGACC ３’）を１回のＰＣＲに使用した。センス・プライマー６１Ｕ５２６Ｒ（５’TTCCTTCTCTGGCGCATGAT３’）はヌクレオチド５９３６〜５９５５に位置し、ＬＶ６０（５’GTACTGGTACCGGATCCGTGAGGATGTTGC ３’）はヌクレオチド６７２７〜６７４５に相補的でもあり、もう一つのＰＣＲに使用した。これら２つのＰＣＲフラグメントはＬＶ５９に包含されたXba I部位を用い、ｐＡＢＶ２０の内部Apo I部位（ヌクレオチド６００６）およびＬＶ６０にも包含させたヌクレオチド６７４０のBamHI部位に共に結合させた。新たなｃＤＮＡフラグメントを完全に配列決定したが、公開された配列と異なるアミノ酸となるような変異は含んでいなかった（ミューレンベルフ（Muelenberg）ら、１９９３a）。プラスミドｐＡＢＶ３６８はＰＲＲＳＶのヌクレオチド８２７４〜１３７２０を含んでいる。ｐＧＥＭ−４ＺのｃＤＮＡフラグメントをさらに結合させると不安定なクローンとなるので、ｐＡＢＶ３３１／３６９、ＰＡＢＶ３８４およびｐＡＢＶ３６８の挿入物をｐＯＫ１２の５’および３’ｃＤＮＡフラグメントに結合させた（ビエラおよびメッシング（Viera and Messing）ら、１９９１）。プラスミド・ベクターｐＯＫ１２はｐＧＥＭ−４Ｚよりコピー数が少ないので、大型の外来ｃＤＮＡ配列のクローニングにより適していると期待される。プラスミドを大腸菌株ＤＨ５ａに形質転換し、カナマイシン１５μg/mlの存在下３２℃で増殖させ、コピー数をできるだけ低くした。先ず、ｐＡＢＶ３８２（（Ａ）₄₅）とｐＡＢＶ３９２（（Ａ）₁₀₉）のｃＤＮＡフラグメントをEcoRIで消化、この部位をクレノウ（Klenow）ポリメラーゼ（ファルマシア）で平滑断端に改変し、次いで、BamHIで消化、切除した。これらのフラグメントをBamHIおよびFsp Iで消化したpOK１２にクローン化し、後者の部位は平滑段端に改変し、ｐＡＢＶ３９４およびｐＡＢＶ３９５とした。この方法でｐＯＫ１２に存在するＴ７ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターを除去した。次いで、ｐＡＢＶ３６８とｐＡＢＶ３８４のｃＤＮＡフラグメントを、フランキングまたはベクター配列中のBcl I部位（ヌクレオチド１３３９４）、Sca I部位（ヌクレオチド８６５７）およびBamHIとBgl II部位を用いて３’末端ｃＤＮＡクローンに結合させた。このようにしてプラスミドｐＡＢＶ４０１およびｐＡＢＶ４０２とした（図１）。
ＬＶゲノムの５’末端に直接融合したＴ７ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターを含む５’ｃＤＮＡクローンはプライマーＬＶ８３（５’GAATTCACTAGTTAATACGACTCACTATAGATGATGTGTAGGGTATTCC３’）およびＬＶ６９を用いｐＡＢＶ３８７からＰＣＲにより増幅した。ＬＶ８３は５’側から３’への順でEcoRIとSpe I部、T7 ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーター配列、転写開始用の単一のＧ、およびＬＶゲノムのヌクレオチド１〜１９から構成される。ＰＣＲフラグメントをｐＯＫ12のEcoRIとSal I部位にクローニングし、ｐＡＢＶ３９６とした。ｐＡＢＶ３９６の正しい配列をオリゴヌクレオチド配列決定法により評価した。次いで、ｐＡＢＶ３３１およびｐＡＢＶ３６９のＬＶ ｃＤＮＡフラグメントをApa IおよびBamHIで切除し、ｐＡＢＶ３９６に結合し、Apa IおよびBamHIで消化した。最終的に、得られる５’ｃＤＮＡフラグメントを、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ・プロモターの上流ＳｐｅＩ部位とウイルスゲノムの５１６８位のユニークPml I部位を用い、ｐＡＢＶ４０１およびｐＡＢＶ４０２にクローニングした。この方法により、親株に類似のウイルスに対応するものとして、また、外来読み取り枠を含むキメラウイルスに対応するものとして、ゲノム長ｃＤＮＡクローンを得た。
PacIおよび/またはSwaI部位を含む変異ウイルスの産生
ＯＲＦ７遺伝子の直ぐ下流のゲノム長ｃＤＮＡクローンにユニークPac I部位を導入するために、ヌクレオチド１４９８７および１４９８８のＴおよびＡ両方を、センスプライマーＬＶ１０８（５’GGAGTGGTTAACCTCGTCAAGTATGGCCGGTAAAAACCAGAGCC ３’）とアンチセンスプライマーＬＶ１１２（５’CCATTCACCTGACTGTTTAATTAACTTGCACCCTGA ３’）およびセンスプライマーＬＶ１１１（５’TCAGGGTGCAAGTTAATTAAACAGTCAGGTGAATGG ３’）とＬＶ７５を用いるＰＣＲによりＡと置換えた。
同様に、ユニークSwa I部位は、プライマーＬＶ１０８とＬＶ１１０（５’CCTGA CTGTCAATTTAAATTGCACCCTGAC ３’）およびプライマーＬＶ１０９（５’GTCAGGGTGCAATTTAAATTGACAGTCAGG ３’）とＬＶ１１１を用いるＰＣＲにより１４９８０位のＧをＴに、１４９８５位のＴをＡに代えることにより創製した。ＰＣＲフラグメントを、創製したPac IとSwa I部位およびフランキングHpa IとXba I部位を用いてｐＡＢＶ３９５に結合し、それぞれｐＡＢＶ４２７およびｐＡＢＶ４２６とした。このフラグメントは、次いで、同じユニークHpa IとXba I部位を用いてｐＡＢＶ４１４に挿入し、ｐＡＢＶ４３７およびｐＡＢＶ４４２とした（図４参照）。ｐＡＢＶ４３７およびｐＡＢＶ４４２の転写物から回収したウイルスのマーカー変異を検出するために、感染ブタ肺胞マクロファージの上清からＲＮＡを単離した。このＲＮＡを逆転写ＰＣＲに用い、プライマーＬＶ７６、ＬＶ７５および３９Ｕ７０Ｒによりフラグメントを約０．６kb（入手可能な長さのヌクレオチド１４５７６〜ポリＡ尾部に及ぶ）に増幅した。ＰＣＲフラグメントをPac IまたはSwa Iで消化することにより遺伝子マーカーの存在を検出した。
ＲＮＡのin vitro転写およびトランスフェクション
ＬＶの全長ゲノムｃＤＮＡフラグメントを含むプラスミドｐＡＢＶ４１４、ｐＡＢＶ４１６をPvu Iで線形化したが、このものはポリ（Ａ）伸長部の直ぐ下流に位置している。セムリキ森林熱ウイルス（ＳＦＶ）発現ベクターｐＳＦＶ１（ミューレンベルフ（Muelenberg）ら、１９９７）のＯＲＦ４からなるプラスミドｐＡＢＶ２９６をSpeIで線形化し、in vitroの転写およびトランスフェクション実験用対照として用いた。線形化したプラスミドをエタノールで沈殿し、そのプラスミドの１．５μｇを、リルジェストロームおよびガロフ

（１９９１年と１９９３年）によるＳＦＶについての記載方法に従い、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（プラスミドｐＡＢＶ４１４、ｐＡＢＶ４１６）またはSp6 ＲＮＡポリメラーゼ（ｐＡＢＶ２９６）によるin vitro転写に使用した。in vitro転写したＲＮＡをイソプロパノールで沈殿させ、７０％エタノールで洗浄し、用時まで−２０℃で保存した。ＢＨＫ−２１細胞をＭ６ウエルに接種し（約１０⁶細胞/ウエル）、リルジェストロームおよびガロフ

（１９９３年）記載の最適条件に従い、リポフェクチン１０μｌと混合したＲＮＡ２．５μｇでトランスフェクションした。別法として、ＲＮＡをエレクトロポレーションによりＢＨＫ−２１細胞に導入した。この場合、１０μｇのin vitro転写したＲＮＡまたは細胞内ＬＶ ＲＮＡをリルジェストロームおよびガロフ

（１６）のエレクトロポレーション条件を用い、約１０⁷ＢＨＫ−２１細胞にトランスフェクションした。培地をトランスフェクション２４時間後に採取し、ＣＬ２６２１細胞に転移させ、感染性ウイルスを回収した。トランスフェクションし感染させた細胞は、実質的にウエンスボート（Wensvoort）ら（１９８６）記載のように、免疫ペルオキシダーゼ単層アッセイ（ＩＰＭＡ）によりＬＶ−特異タンパクの発現について試験した。GP₃、GP₄、ＭおよびＮタンパクに対するモノクローナル抗体（MAbs）１２２．１３、１２２．５９、１２２．９および１２２．１７（バン・ニューシュタット（van Nieuwstadt）ら、１９９６）をＩＰＭＡの染色に用いた。
結果
ＬＶゲノムＲＮＡの５’末端配列の再構築
切断型５’末端を有するin vitro転写ＲＮＡの感染性は報告されているが（デイビス（Davis）ら、１９８９；クランプ（Klump）ら、１９９０）、感染性クローンを得るためには最末端の５’端と３’端を含む全ウイルス配列が必要であることが一般に認められている。ＬＶゲノムの５’末端をクローニングするためには、一本鎖ｃＤＮＡに一本鎖を結合する改善した手法（ＳＬＩＣ；エドワード（Edwards）ら、１９９１）が用いられた。ＬＶで感染したＣＬ２６２１細胞から単離した細胞内ＲＮＡおよび精製したビリオンからのＬＶ ＲＮＡの両方を、ＯＲＦ１Ａの５’末端に相補的なプライマーＬＶ９６を用いた逆転写した。第一鎖ｃＤＮＡ産物を、３’末端の自己結合を防止した固定プライマーＡＬＧ３に結合した。結合した産物をＰＣＲにより増幅し、クローニングした。ＬＶ細胞内ＲＮＡから誘導し、二通りの独立したＰＣＲから得られる１２種のクローン、およびビリオンＲＮＡから誘導し、二通りの独立したＰＣＲから得られる１４種のクローンを配列決定した。これら２６種のｃＤＮＡクローンからの２２クローンは当該ｃＤＮＡ配列に比べ、１０のヌクレオチド（５’ATGATGTGTA ３’）の伸長部分を含んでいた（既に公開、ミューレンベルフ（Muelenberg）ら、１９９３a）。一方、４種のクローンはこの付加配列の５’末端に１〜３個のヌクレオチドを欠いていた（表１）。このことから我々が結論したことは、これらの１０種のヌクレオチドがＬＶゲノムの最末端５’端を表し、従って、ゲノム長ｃＤＮＡクローンに包含されているということであった。
ＬＶゲノム長ｃＤＮＡクローンの構築
ＬＶのゲノム長ｃＤＮＡクローンを構築するために、図１に図示した方策に従って、既に単離、配列決定されているｃＤＮＡ（ミューレンベルフ（Muelenberg）ら、１９９３a）を共有した制限酵素部位で結合させた。さらに、新しいｃＤＮＡフラグメントをゲノム長ｃＤＮＡクローンに組み上げるために産生した。ヌクレオチド５１６８〜６７４０にわたる１種のｃＤＮＡフラグメントをＲＴ−ＰＣＲにより創製し、クローンｐＡＢＶ５およびｐＡＢＶ２０からのｃＤＮＡ配列の連結反応を可能とした。in vitro転写用のＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターをＰＣＲによりＬＶゲノムの５’末端に直接結合し、ｐＡＢＶ３９６にクローニングしたこの新しいｃＤＮＡフラグメントをゲノム長ｃＮＤＡクローンに挿入した。６種の新たな独立したｃＤＮＡクローンにつきヌクレオチド３４２０〜３７２５を再度配列決定した結果、ＯＲＦ１aのアミノ酸１０８４にLeuおよびProが１：１の割合で存在していることを示していた。我々は最終的ゲノム長ｃＤＮＡクローンから転写されるＲＮＡの感染性に対してこのアミノ酸の影響を予測し得なかったので、このクローンを構築するために両方を使用した。３’末端では、２種の異なるｃＤＮＡクローンを使用した。我々は以前に最大２０個のＡのポリ（Ａ）尾部を含む３’末端ｃＤＮＡクローンを得ていた（ミューレンベルフ（Muelenberg）ら、１９９３a）。しかし、ＬＤＶなど関連ウイルスのポリ（Ａ）尾部の長さについて報告された研究（チェン（Chen）ら、１９９４）の観点で、全ポリ（Ａ）尾部はより長いことが期待された。それ故、新たな３’末端ｃＤＮＡクローンを４０個のＴ残基伸長部を有するプライマーＬＶ７６を用い、産生させた。これらｃＤＮＡクローンの配列を決定すると、４０〜１０９個のＡ残基の伸長部を包含していた。最長のポリ（Ａ）伸長部（１０９Ａ残基、ｐＡＢＶ３９２）を含むｃＤＮＡクローンをゲノム長ｃＤＮＡクローン用に用いた。長鎖ホモ−ポリマー系は大腸菌中プラスミドの複製に干渉する可能性があるので（デンおよびウー（Deng and Wu）、１９８１）、我々はまた、次工程のクローニングにおいて使用するように、４５個のＡ残基を含む第二クローン、ｐＡＢＶ３８２を選択した。既に観察されたことであるが、ゲノム長ｃＤＮＡクローンを高コピー数のプラスミド中に保持すると、変異または欠失の蓄積が起こり、これらのクローンから合成された転写物の感染性喪失に至る（レイ（Lai）ら、１９９１；ライス（Rice）ら、１９８７；スミヨシ（Sumiyoshi）ら、１９９２）。また、我々はｐＡＢＶクローン３３１/３６９、３８４、および３６８のより大きなｃＤＮＡフラグメントをｐＧＥＭ−４Ｚの５’および３’末端に結合させようとしたとき、プラスミドが不安定となることを観察した。それ故、我々は最終的にこれらのクローンを低コピー数のベクターｐＯＫ１２中互いに融合させた（ビエラおよびメッシング（Viera and Messing）ら、１９９１）。その結果、ゲノム長ｃＤＮＡクローンｐＡＢＶ４１４/４１５および４１６となるが、このものは使用した増殖条件下で大腸菌中安定的に繁殖することが可能であった。４５または１０９個のＡ残基を含むゲノム長ｃＤＮＡクローンの安定性に差異は認めなかった。
ＬＶ ＲＮＡの感染性
ＬＶはブタ肺胞マクロファージ中で優先的に増殖する。これまで、細胞株ＣＬ２６２１またはサル腎臓細胞株ＭＡ１０４から誘導された他のクローンはＬＶを繁殖させることが示されている細胞株である（ベンフィールド（Benfield）ら、１９９２；コリンズ（Collins）ら、１９９２；キム（Kim）ら、１９９３）。それ故、ＣＬ２６２１細胞はＬＶ ＲＮＡのトランスフェクションの最適条件を決めるために用いられた。ＬＶで感染したＣＬ２６２１細胞から単離したＲＮＡは、リポフェクチン、リポフェクタミン、ＤＥＡＥ−デキストランおよびエレクロトロポレーションなどの異なる方法を用いて、異なる用量でＣＬ２６２１にトランスフェクションした。トランスフェクション後７日までの細胞変性効果およびプラークにつき細胞をスクリーニングしたが、感染性ウイルスのこれらの徴候は検出できなかった。さらに、ＬＶ−特異抗原もＬＶ−特異MAbsを使用するＩＰＭＡでは検出できなかった。ｐＡＢＶ２９６からin vitroで転写したＲＮＡはこれらの実験の対照として用いた。プラスミドｐＡＢＶ２９６は発現ベクターｐＳＦＶ１に挿入したＧＰ₄コード化ＯＲＦ４遺伝子からなる（ミューレンベルフ（Muelenberg）ら、１９９７）。ｐＡＢＶ２９６ ＲＮＡのトランスフェクション効率は、ＧＰ₄−特異MAbsでのＩＰＭＡによりトランスフェクションした細胞の染色により試験した。０．０１％陽性ＣＬ２６２１細胞に至る最高のトランスフェクション効率がエレクトロポレーションで得られたが、一方、ＢＨＫ−２１細胞では同様の条件を用いて８０〜９０％の陽性細胞を得た。これらの結果が示しているのは、ＣＬ２６２１細胞がトランスフェクション実験に適さず、一方、ＢＨＫ−２１細胞（野生型ウイルスでの感染に感受性でない）は驚くべきことに非常に適しているように思えることであった。従って、ＢＨＫ−２１細胞をＬＶＲＮＡの感染性試験に用いた。ＬＶで感染したＣＬ２６２１細胞から単離したＲＮＡ ２μgを、ＳＦＶについて記載した条件（リルジェストロームおよびガロフ

１９９３）に従い、約１０⁶ＢＨＫ−２１細胞にリポフェクチンでトランスフェクションした。トランスフェクションの２４時間後、細胞をＬＶのＮタンパクに対するＬＶ−特異MAb １２２．１７で染色した。約３〜１０個の個々の細胞が陽性に染色されたが、感染中心もしくはプラークが細胞から細胞に拡散している様子は観察されなかった。ｐＡＢＶ２９６から転写した対照ＲＮＡのトランスフェクションではこれらの条件を用いて、ＢＨＫ−２１細胞の６０〜７０％が陽性となった。細胞内ＬＶ ＲＮＡとｐＡＢＶ２９６ＲＮＡでトランスフェクションしたＢＨＫ−２１細胞の上清をＣＬ２６２１細胞に移した。３〜４日後、細胞内ＬＶ ＲＮＡでトランスフェクションしたＢＨＫ−２１細胞からの上清と共に培養した細胞内にプラークを観察したが、ｐＡＢＶ２９６ ＲＮＡでトランスフェクションしたＢＨＫ−２１細胞からの上清で培養したものには観察しなかった。当該プラークはＩＰＭＡにおいてＬＶ−特異MAbsで陽性に染色された。同様の結果は精製したＬＶバリオンから単離したＲＮＡを用いたときに得られた。さらに、陽性に染色された細胞数は細胞をエレクトロポレーションによりトランスフェクションしたときの２〜４倍に増大した。これらのデータが示すのは、ＬＶはＢＨＫ−２１細胞に感染し得ないということであり、その最も可能性のある理由はそれらがＬＶのレセプターを欠いているからということである。しかし、ゲノムＲＮＡが一旦ＢＨＫ−２１細胞に導入された場合には、新たな感染性ウイルス粒子が産生され始め、培地中に分泌される。既にトランスフェクションされたＢＨＫ−２１細胞をこれらの粒子、すなわち裸のキャプシドであるか、完全にもしくは部分的に包膜された粒子で再感染しようとしても感染は再び可能でなくなる。
感染性ＲＮＡのin vitro合成
野生型ＰＲＲＳＶに本質的に感受性でないＢＨＫ−２１細胞は細胞内ＬＶ ＲＮＡからウイルスを回収するのに特に適切であり、感受性であるＣＬ２６２１細胞は適切でないので、ゲノム長ｃＤＮＡクローンから転写したＲＮＡが感染性であるか否かの試験にはＢＨＫ−２１細胞を用いた。プラスミドｐＡＢＶ４１４/４１６をPvuIで線形化し、Ｔ7 ＲＮＡポリメラーゼを用いin vitroで転写した。PvuI部位はポリ（Ａ）伸長部の直ぐ下流に位置し、転写したＲＮＡは３’末端に２つの非ウイルス性ヌクレオチドを含むようなものである。さらに、転写物は５’末端に非ウイルス性Ｇを含むべきであって、それがＴ7 ＲＮＡポリメラーゼの転写開始部位となる。in vitroで転写したＲＮＡ約２．５μgをＢＨＫ−２１細胞にトランスフェクションしたが、その際、ＣＬ２６２１細胞における引き続いてのウイルス回収用陽性対照として細胞内ＬＶ ＲＮＡ ２μgを、およびＢＨＫ−２１細胞にＲＮＡトランスフェクションするための陽性対照として、また、ＣＬ２６２１細胞における引き続いてのウイルス回収用陰性対照としてｐＡＢＶ２９６ ＲＮＡを共に用いた。トランスフェクション後２４時間目に、細胞上清を採取し、細胞を固定、ＩＰＭＡ中Ｎ−特異MAb１２２．１７で染色した。細胞内ＬＶ ＲＮＡでトランスフェクションしたＢＨＫ−２１細胞を入れたウエル中ではほんの僅かの陽性細胞を観察しただけであるが、ｐＡＢＶ４１４/４１６から転写したＲＮＡでトランスフェクションしたＢＨＫ−２１細胞のウエルでは８００〜２７００の陽性細胞を観察した。感染性ウイルスが細胞から遊離したか否かをチェックするために、その上清をＣＬ２６２１細胞の感染に用いた。プラークは、細胞内ＬＶ ＲＮＡおよびｐＡＢＶ４１４/４１５の転写物でトランスフェクションしたＢＨＫ−２１細胞からの上清で感染したＣＬ２６２１培養物に産生していた。該プラークはＮ、Ｍ、ＧＰ₄、およびＧＰ₃タンパクに対するMAbsでＩＰＭＡ中陽性に染色したが、このことはこれらのタンパクがすべて適切に発現されたことを示唆している。ｐＡＢＶ２９６から転写したＲＮＡでトランスフェクションしたＢＨＫ−２１細胞の上清と共に培養したＣＬ２６２１培養物には、ＩＰＭＡ中プラークも染色も認めなかった。従って、これらの結果が明白に示していることは、ゲノム長ｃＤＮＡクローンｐＡＢＶ４１４およびｐＡＢＶ４１６からＢＨＫ−２１細胞に転写したＲＮＡをトランスフェクションすると、感染性ＬＶの産生と遊離に至るということである。さらに、ｐＡＢＶ４１４およびｐＡＢＶ４１６の転写物をリポフェクチンの代りにエレクトロポレーションによりＢＨＫ−２１細胞にトランスフェクションした場合には、ＬＶ−特異MAbsに染色陽性の細胞が２〜４倍に増大して得られた。これらエレクトロポレーションによるＢＨＫ−２１細胞上清中の組換えウイルス力価は約１０⁵ＴＣＩＤ₅₀/mlであった。
感染性コピーウイルスをター・ハーンおよびLV4.2.1に比較した増殖曲線
回収ウイルスの増殖特性
当初のトランスフェクションおよび感染実験は、ｖＡＢＶ４１４およびｖＡＢＶ４１６と命名した回収組換えウイルスが同等に首尾よくブタ肺胞マクロファージに感染し増殖するが、細胞内ＬＶ ＲＮＡでトランスフェクションしたＢＨＫ−２１細胞から回収したウイルスよりもＣＬ２６２１細胞上でより緩慢に増殖することを示唆した。この細胞内ＬＶ ＲＮＡは、ＣＬ２６２１上での増殖に適合するLV4.2.1で感染したＣＬ２６２１細胞から単離された。ｖＡＢＶ４１４およびｖＡＢＶ４１６の増殖性をより徹底的に研究するために、増殖曲線をＣＬ２６２１細胞およびブタ肺胞マクロファージ中で決定し、ブタ肺胞マクロファージ（ＴＨ）に移動しただけの野生型ＬＶの曲線ならびにＣＬ２６２１細胞上での増殖したLV4.2.1の曲線と比較した。２つの組換えウイルスの増殖速度は異なっておらず、それらがＢＨＫ−２１から直接誘導したか、あるいはさらにブタの肺胞マクロファージに移動したかに関係なく同等に好適に増殖した（図３）。ブタの肺胞マクロファージ中の力価（７．１〜７．９TCID₅₀/ml）は感染後３２時間頃にピークとなるが、一方、ＣＬ２６２１の力価はこの場合よりも遅く、感染後９６時間目でもなおピークに達しなかった。ＴＨウイルスは組換え体と類似の増殖特性を保持していた。逆に、ＣＬ２６２１−適合ウイルスLV4.2.1はウイルスｖＡＢＶ４１４、ｖＡＢＶ４１６およびＴＨよりもＣＬ２６２１細胞上でより急速に増殖した（図３）。要約すると、これらの結果が示しているのは、組換えウイルスの増殖性はＴＨウイルスの増殖性に似ているということである。このことは予期された。というのは、感染性クローンを構築するのに用いたｃＤＮＡ配列は、親の「非適合性」ＴＨウイルスから誘導したからである。
ＬＶ感染性クローンにおける遺伝子マーカー導入
ゲノム長ｃＮＤＡクローンが変異ＬＶウイルスを産生させるのに用い得ることを証明するために、ユニークPacIとSwaI部位をＯＲＦ7遺伝子の直ぐ下流に、ＰＣＲ指向変異誘発により導入した（図４）。Pac I部位を含むゲノム長ｃＤＮＡクローンｐＡＢＶ４３７およびSwa I部位を含むｐＡＢＶ４４２から転写したＲＮＡをＢＨＫ−２１細胞にトランスフェクションし、トランスフェクション後２４時間目にその上清をブタ肺胞マクロファージおよびＣＬ２６２１細胞に転移したときに、感染性ウイルスが産生された。回収したウイルスｖＡＢＶ４３７およびｖＡＢＶ４４２はブタの肺胞マクロファージおよびＣＬ２６２１細胞において親ウイルスｖＡＢＶ４１４と類似の増殖性を示した（データ未開示）。約０．６kbの特異領域（ヌクレオチド１４５７６〜ポリ（Ａ）尾部）を逆転写およびｖＡＢＶ４１４とｖＡＢＶ４１６で感染させたブタの肺胞マクロファージ上清から単離したウイルスＲＮＡのＰＣＲにより増幅した。Pac Iで消化すると、この制限部位はｖＡＢＶ４３７から誘導したフラグメントには実際に存在するが、ｖＡＢＶ４１４から誘導したフラグメントには存在しないことを示した。同様に、ｖＡＢＶ４４２にSwa I部位の存在することが証明された（データ未開示）。このように我々は野生型ウイルスの混在可能性を排除することができた。従って、我々はｖＡＢＶ４３７とｖＡＢＶ４４２の本質を確認した。
考察
現代の組換えＤＮＡ技術は我々が分子レベルでゲノムを分析、改変し、その体制と発現につきより深く洞察することを可能にした。ＲＮＡウイルスの場合には、そのためにゲノム長のｃＤＮＡクローンの生成とそこから感染性転写物を合成し得ることが必要である。殆どの場合、感染性クローン構築のための必要条件はそれぞれのウイルスゲノムの末端配列を同定することであり、それが恐らくウイルスＲＮＡの複製にとって重要である。以前の研究では、ＬＶは３’末端にポリ（Ａ）尾部が含まれていることを示した（ミューレンベルフ（Muelenberg）ら、１９９３ａ）。本研究では、ＬＶゲノムの確かな５’末端が決定された。ウイルスゲノムＲＮＡまたはｍＲＮＡの５’末端を決定する方法はいくつも発表されているが、その殆どには重大な制限がある。フラビウイルスおよびペスチウイルスに対して用いられる一つの方法はゲノムＲＮＡの環状化に基づいている。しかし、この方法ではゲノムの５’末端と３’末端の間の境界を明確にするために分析することが必要である。ｃＤＮＡの５’末端を迅速に増幅する方法（５’ＲＡＣＥ）は、末端デオキシリボヌクレオチド転移酵素（ＴｄＴ）により、第一鎖ｃＤＮＡ鎖にホモポリマー尾部を付加することに基づいている。しかし、尾部形成反応はむしろ非効率であり、また、この反応は付加的な分析を必要とする。何故なら尾部の最初のヌクレオチドがウイルスの配列を表しているのか、あるいは既に酵素的に付加した尾部の部分なのか結論し得ないからである。この研究で我々はウイルスゲノムの最末端５’端を、特定配列を有するオリゴヌクレオチドを第一鎖プライマー伸長産物に結合し、ＰＣＲにより増幅することにより決定した。公開された配列に関し１０個のヌクレオチド（ATGATGTGTA）の伸長が数種の独立したクローンに見出され、従って、それがウイルスゲノムの最末端５’端を表していると考えられた。要約すると、これは２２１個のヌクレオチドのリーダー配列となるが、これはＥＡＶ（２０７ヌクレオチド；デン・ブーン（den Boon）ら、１９９１）、ＳＨＦＶ（２０８ヌクレオチド；ゼン（Zeng）ら、１９９５）のリーダーの長さに似ているが、ＬＤＶ（１５５ヌクレオチド；チェン（Chen）ら、１９９４）のリーダーより長い。しかし、これらアルテリウイルスのリーダー配列間に有意な相同性は存在しない。
最末端５’端をゲノム長ｃＤＮＡに包含させ、感染性クローンを創製した。感染性クローンを産生させる際の主な問題は、バクテリアでクローニングする際のウイルス配列の安定性ならびに正確な５’および３’末端生成の問題である。ゲノム長ｃＤＮＡクローンをｐＧＥＭ−４Ｚに組込む最初の試みは失敗したが、ＬＶの１５，２０７ヌクレオチド長のゲノムｃＤＮＡフラグメントは低コピー数プラスミドｐＯＫ１２において安定であり、これまでに生成させたプラスＲＮＡ鎖ウイルスでは今や最も長い感染性クローンである。ゲノム長ｃＤＮＡクローンの転写物は５’末端に５’キャップ構造と余分の非ウイルス性Ｇおよび３’末端に非ウイルス性ＣＧを含むが、これらの拡張はその感染性を損なうものではなかった。幾人もの研究者が全長ｃＤＮＡクローンから転写したＲＮＡが、５’もしくは３’末端のいずれかで外来性非標準配列のために、あるいは不完全なキャッピングのために減弱した初期感染について報告している。キャップ構造を欠くＬＶ全長ｃＤＮＡの転写物は感染性ではなかった。感染性ｃＤＮＡクローン転写物の感染性は常にウイルス感受性の細胞株で試験したが、ゲノム長ｃＤＮＡクローンからの転写物あるいはＣＬ２６２１細胞から単離したＬＶ ＲＮＡの感染性は、これらＲＮＡをＣＬ２６２１細胞にトランスフェクションすることによって証明することはできなかった。これはＣＬ２６２１細胞のトランスフェクション効率が乏しいことによるものであったが、それは恐らくウイルスＲＮＡ鎖合成が、ウイルスゲノムのフラグメントのみを含む裸のキャプシドなど、欠陥のある干渉性粒子でＣＬ２６２１細胞が再感染されることから生じる不完全ＲＮＡフラグメントまたはキャプシドタンパクの干渉あるいは相互作用により妨げられるからである。しかし、全長ｃＤＮＡクローンからの転写物または細胞ＬＶ ＲＮＡをＢＨＫ−２１にトランスフェクションすると感染性ウイルスの産生と遊離に至り、このウイルスはＣＬ２６２１細胞中に回収することができた。ＢＨＫ−２１細胞を裸のキャプシドで再感染しても感染は起こらず、従って、全長ウイルスＲＮＡの合成も妨げることはない。特異的感染性ではin vitro転写ＲＮＡ１μg当り凡そ４００〜１５００個が陽性細胞であったが、ＬＶ細胞内ＲＮＡでは１μg当たり２〜５個の陽性細胞が得られた。しかし、これらの特異的感染性は、ＬＶ−感染ＣＬ２６２１細胞から単離した細胞内ＲＮＡの非常に小さいフラクションのみがゲノムＬＶ ＲＮＡを代表するものであるが故に比較することができない。さらに、ビリオンから単離したゲノムＲＮＡをトランスフェクションに使用したが、その量は正確な定量を可能とするにはあまりに少なかった。
さらに、ＢＨＫ−２１細胞はＬＶ−特異MAbsでのＩＰＭＡにより抗原産生につき点数を付けたが、それは必ずしも感染性ウイルスの産生と相関するものではない。このことは以下の事実から明らかである。すなわち、細胞内ＬＶ ＲＮＡ２μgでトランスフェクションしたＢＨＫ−２１細胞の上清は、ＣＬ２６２１細胞によりアッセイしたとき、全長ｃＤＮＡクローンの転写物２．５μgでトランスフェクションしたＢＨＫ−２１細胞の上清よりも高い力価のプラーク形成単位を有していた。ポリ（Ａ）尾部の長さがウイルス転写物の感染性に影響することが多くのウイルスについて既に示されているが（ホリーおよびアバウヘイダー（Holy and Abouhaidar）、１９９３；サロウ（Sarow）、１９８９）、４５または１０９の残基をもつゲノムｃＤＮＡクローンからの転写物間の感染性において、我々は何らの差異も見出さなかった。その可能性としては、４５Ａ残基の尾部は長さの閾値を超えていて、対応する転写物の安定性がそれよりも低い値で変化しているのだろうということである。我々はＯＲＦ1aのアミノ酸１０８４にクローンの差異を見出したが、そこではPROとLEUが１：１の比を与えた。このアミノ酸は感染性に影響しなかった。その理由はこのLEUまたはPROコドンを有する全長ｃＤＮＡクローンの転写物がＢＨＫ−２１細胞の感染性に何らの差異も示さなかったからである。
ゲノム長感染性クローンはＰＲＲＳＶ株ＡＴＣＣ ＶＲ２３３２のヌクレオキャプシド・タンパクを発現するキメラウイルスの産生に使用した。さらに、ゲノム長感染性クローンはマウス・ウイルスＬＤＶのヌクレオキャプシド・タンパクを発現するキメラウイルスの産生に使用した。キメラウイルスは株−特異MAbsにより親ウイルスと区別し得るが、ＰＲＲＳＶのター・ハーン（Tur Huurne）株のＮ（ＯＲＦ７）タンパクと特異的に反応するモノクローナル抗体では着色しない。さらに、ＰＲＲＳＶのＮタンパクがＬＤＶのＮタンパクと置換しているキメラウイルスは、ＰＲＲＳＶのＮタンパクと反応するブタ回復期抗体とは反応しない。ＰＲＲＳＶ感染ブタはすべてＰＲＲＳＶのＮタンパクに対する抗体を発現させるので、該キメラウイルスはＰＲＲＳＶに対する新しい生ワクチンを使用する将来のプロジェクトに使用されるだろう。また、このウイルスは特異的にその宿主細胞、肺胞マクロファージを標的とするベクター系として使用するプロジェクトにも使用されるだろう。この点では、死滅させたウイルスあるいは組換えサブユニットで防御しようとした初期の試みが無念に終わったことに言及しておく必要がある。これまでに入手し得る唯一の有効なＰＲＲＳワクチンはＵＳ株に基づき改良した生ワクチンである（ゴルシカ（Gorcyca）ら、１９９５）。しかし、この改良生産物を接種したブタは野生のウイルスを感染させたブタと識別することができない。PRRSVの感染性クローンはこのようにゲノムの部位指向変異誘発により、いわゆるマーカーワクチンを提供するが、その結果、予防接種したブタは野生ウイルス感染ブタと、血清抗体の差に基づき識別することができる。
本明細書に記載するＬＶの感染性クローンは、プラス鎖ＲＮＡウイルスについてかって開発された最も長い感染性クローンであり、アルテリウイルス科の最初のものである。このＰＲＲＳＶの感染性クローンを産生することは、このウイルスの病因論、宿主向性、および複製と転写を目指した研究に対し新たな機会を開くものである。アルテリウイルスおよびコロナウイルスは、リーダー・プライマー転写とも言う特異転写メカニズムを共有し、共通の５’リーダーを含むサブゲノムＲＮＡのいわゆるネスト・セット（nested set）の産生に関与する（スパーン（Spaan）ら、１９８８；プラゲマンおよびメーニッヒ（Plagemann and Moennig）、１９９１）。このリーダー・プライマー転写は複雑な工程であり、未だに完全には理解されていない。リーダー・プライマー転写の基本的なメカニズムを解明するコロナウイルスのウイルス学者の研究は、欠陥のある障害となるＲＮＡのｃＤＮＡの分析と部位指向の変異誘発に限定されるが、その理由はゲノムの大きなサイズ（２８〜３０kb）が感染性クローンの構築を妨げるからである。ＰＲＲＳＶの感染性クローンはアルテリウイルスとコロナウイルスの転写と複製の興味あるメカニズムを研究、解明するためのモデル系として有用である。
ＰＲＲＳＶから誘導される感染性クローンは、ＰＲＲＳＶゲノムに挿入された外来性抗原のための送達システムまたはベクターワクチンウイルスとしても使用することができる。その理由は、該ウイルスが骨髄中のマクロファージおよびマクロファージ系列細胞に感染し、その孫細胞を介して抗原含有ウイルスに分布するからである。アルテリウイルスまたはＰＲＲＳＶのＯＲＦ７もしくはＮタンパクのフラグメントを含む抗原の特別な例では、これらの抗原が感染細胞の細胞膜外側に（過剰）発現し、それによって免疫応答をさらに高める。そのような免疫ブースター効果は病原に対する終生の免疫をもたらす（低レベルで刺激し続ける故に）。我々は当該ウイルスを抗原キャリアーとして用いることができるが、その際、他の病原性生物もしくは物質のエピトープに対する情報をもとに構築する。外来性エピトープ情報を担持する幾つかの修飾ＰＲＲＳウイルスを混合し、一時に投与する。これにより、１種の病原の幾つかの異なるエピトープに対する活性な免疫を、または、幾つかの異なる病原に対する活性な免疫を可能とする。修飾ＰＲＲＳＶワクチン（非脱粒など）の安定性は包膜感染性ウイルスを産生するのに必要なこれらウイルスタンパクの情報を削除することにより確実にすることができる。このウイルスは当該包膜タンパクを構成的に発現する細胞株で繁殖させねばならない。この相補的細胞株で複製するウイルスは完全な包膜を有し、ブタのマクロファージに感染させることができる。１回の複製サイクルの後、包膜タンパクの情報を欠いている孫のウイルスは、完全に包膜したウイルスのように最早他の細胞に感染することができない。体内のマクロファージ感染は裸のキャプシドとしてなお起こり得る。この様式で、当該ワクチンは予防接種した動物に包含され、他の動物には拡散しないこととなる。
図面の説明
図１．ＬＶのゲノム長ｃＤＮＡクローンの構築。上部（Ａ）はｃＤＮＡクローンの融合を示し、ｐＧＥＭ−４Ｚ中に以前に配列決定されたものである（ミューレンベルフ（Muelenberg）ら、１９９３ａ）。使用したクローンのｐＡＢＶ番号と制限部位を示す。黒棒は次クローニング工程で融合されるｃＤＮＡクローンのその部分を表す。Ｒ．Ｔ．で示した淡灰色棒はＲＴ−ＰＣＲにより新たに生成したｃＤＮＡクローンであり、濃灰色棒はＰＣＲにより新たに生成したｃＤＮＡクローンを表す。下部（Ｂ）は低コピー数ベクターｐＯＫ１２中の５’末端クローンｐＡＢＶ３９６をもつより大きなｃＤＮＡクローンｐＡＢＶ３３１/３６９、ｐＡＢＶ３８４、およびｐＡＢＶ３６８を示し、Ｔ7 ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターおよびポリ（Ａ）尾部をもつ３’末端クローンｐＡＢＶ３９５を包含している。ｐＯＫ１２多重クローニング部位の内側および外側の制限部位を示す。制限エンドヌクレアーゼ部位は以下のとおり：A、ApaI; Ap、ApoI; B、BamI；Bg、BglII；Bs、BspE1；Bc、BclI；E、EcoRI；Ec、EcoRV；H、HindIII；K、KpnI；N、NarI；Nc、NcoI；S、SacII；Sp、SpeI；Sa、SalI；Sc、ScaI；P、PstI；Pm、PmlI；X、XbaI；Xh、XhoI。
図２．クローン化全長ＬＶ ｃＤＮＡおよび該ｃＤＮＡクローンから転写された感染性ＲＮＡの末端配列。ゲノム長ｃＤＮＡクローンをPvuIで線形化し、合成キャップ類似体m⁷G(5')ppp(5')Gの存在下Ｔ7 ＲＮＡポリメラーゼにより転写した。得られるＲＮＡは５’端末に１個の余分のヌクレオチド（Ｇ）および３’末端に２個の余分のヌクレオチド（ＧＣ）を含んでいなければならない。ＲＮＡ矢印は標準ＬＶ ＲＮＡ配列に対応する５’および３’末端ヌクレオチドに対応する。
図３．ＬＶ野生型ウイルスＴＨ、ＬＶ4.2.1、およびブタの肺胞マクロファージ（Ａ）とＣＬ２６２１細胞（Ｂ）中の組換えウイルスｖＡＢＶ４１４およびｖＡＢＶ４１６の増殖曲線。ＢＨＫ−２１細胞中に産生される組換えウイルスｖＡＢＶ４１４およびｖＡＢＶ４１６はいずれかを直接用いるか（ＢＨＫ）、あるいはブタの肺胞マクロファージ（ＰＡＭ）中で増幅後に用いた。ＴＨウイルスはブタの肺胞マクロファージ（ＰＡＭ）中で調製し、一方、ＬＶ4.2.1はＣＬ２６２１細胞（ＣＬ）中で調製した。細胞培養物を０．０５のＭＯＩで所定のウイルスにより感染させ、所定時点で採取した。ウイルスの力価（ＴＣＩＤ₅₀／ml）はブタの肺胞マクロファージまたはＣＬ２６２１細胞上、終点希釈法により決定した。
図４．ＬＶ感染性ｃＤＮＡクローンへのユニークPacIおよびSwaI部位の導入。「材料と方法」の項で詳細に記載したように、PacIおよびSwaI部位をＰＣＲ指向変異誘発により創製した。PacIおよびSwaI部位を含むｃＤＮＡフラグメントをｐＡＢＶ４１４中に図示したそのユニークHpaIとXbaI部位を用いて交換した。これはそれぞれｐＡＢＶ４３７とｐＡＢＶ４２２に至った。
参考文献：

Claims (23)

1. ＰＲＲＳＶのゲノムに基づく感染性クローンの産生方法であって、
   （ｉ）３’末端がアミノ保護基で修飾されているプライマーを用いてＰＲＲＳＶのゲノムの５’末端配列を構築する工程と、
   （ｉｉ）４０〜１０９個のＡ残基のポリＡ配列を有する３’末端配列を構築する工程と、
   （ｉｉｉ）（ａ）少なくとも１個の全長ＤＮＡコピーであって、１５０９８ｂのゲノムサイズと、前記ＤＮＡコピーの３’末端における４０〜１０９個のＡ残基のポリＡ配列とを有する、少なくとも１個の全長ＤＮＡコピーを含む組換え核酸、または
   （ｂ）前記組換え核酸の誘導体であって、ＰＲＲＳＶのＯＲＦ１ａにおける変異、ＰＲＲＳＶのＯＲＦ７の下流にＰａｃＩ部位を有する変異、および／またはＰＲＲＳＶのＯＲＦ７の下流にＳｗａＩ部位を有する変異を含む誘導体を産生させる工程と、
   （ｉｖ）（ａ）前記組換え核酸または（ｂ）前記組換え核酸の誘導体をそのＲＮＡコピーに転写する、in vitro転写工程とを含むことを特徴とする方法。
2. ＰＲＲＳＶのゲノムに基づく感染性クローンの産生方法であって、
   （ｉ）野生型ＰＲＲＳＶに非感受性の宿主細胞を、（ａ）少なくとも１個の全長ＤＮＡコピーであって、１５０９８ｋｂのゲノムサイズと前記ＤＮＡコピーの３’末端における４０〜１０９個のＡ残基のポリＡ配列とを有する、少なくとも１個の全長ＤＮＡコピーを含む組換え核酸の転写ＲＮＡコピー、または（ｂ）前記組換え核酸の誘導体であって、ＰＲＲＳＶのＯＲＦ１ａにおける変異、ＰＲＲＳＶのＯＲＦ７の下流にＰａｃＩ部位を有する変異、および／またはＰＲＲＳＶのＯＲＦ７の下流にＳｗａＩ部位を有する変異を含む誘導体の転写ＲＮＡコピーでトランスフェクションし、
   （ｉｉ）感染性クローンを選択することを特徴とする方法。
3. 宿主細胞がＢＨＫ−２１細胞であることを特徴とする請求項２記載の方法。
4. 請求項１〜３のいずれかに記載の方法により得られる感染性クローンからなる組換え核酸。
5. 請求項４記載の組換え核酸からなることを特徴とする修飾ＲＮＡウイルス。
6. 請求項５に記載の修飾ＲＮＡウイルスで感染した細胞。
7. 単離されたＰＲＲＳＶであって、ＯＲＦ１ａ，１ｂまたは２〜７のいずれかから選ばれるＯＲＦに欠失を有するＰＲＲＳＶゲノムのｃＤＮＡコピーのin vitro転写ＲＮＡである組換え核酸を含み、ＰＲＲＳＶの全長ゲノムのサイズは１５０９８ｂであることを特徴とする単離されたＰＲＲＳＶ。
8. 組換え核酸を有する、または組換え核酸でトランスフェクションされた宿主細胞であって、少なくとも１個の全長ＤＮＡコピーまたはＲＮＡウイルスのゲノムのin vitro転写ＲＮＡコピーを含み、該ＲＮＡウイルスのゲノムが、ＰＲＲＳＶであり、該ＤＮＡまたはＲＮＡコピーは、ＡＴＧＡＴＧＴＧＴＡの配列を含む全長ＰＲＲＳＶゲノムを含むことを特徴とする宿主細胞。
9. 単離されたＤＮＡ分子であって、ＰＲＲＳＶゲノムに基づく感染性クローンを含み、該感染性クローンは、
   ＲＮＡウイルスの全長ゲノムのin vitro転写ＲＮＡコピーおよびＲＮＡウイルスの全長ゲノムに相補的なＤＮＡから成る群から選ばれる核酸を含む組換え核酸を産生させることを含む工程によって産生され、前記ＲＮＡコピーまたは相補的ＤＮＡは、ＡＴＧＡＴＧＴＧＴＡを含む全長ＰＲＲＳＶゲノムを含むことを特徴とする単離されたＤＮＡ分子。
10. ＰＲＲＳＶのゲノムに基づく遺伝子組換えＲＮＡウイルスであって、該遺伝子組換えＲＮＡウイルスのゲノムはＡＴＧＡＴＧＴＧＴＡを含み、該遺伝子組換えＲＮＡウイルスは、
    ＰＲＲＳＶの全長ゲノムのin vitro転写ＲＮＡコピー、包膜された感染性ＲＮＡウイルスを産生するために必要とされる遺伝情報を欠くＰＲＲＳＶゲノムのin vitro転写ＲＮＡコピー、ＰＲＲＳＶ全長ゲノムに相補的なＤＮＡ、および包膜された感染性ＰＲＲＳＶを産生するために必要とされる遺伝情報を欠くＰＲＲＳＶゲノムに相補的なＤＮＡから成る群から選ばれる核酸配列を含む組換え核酸で、前記遺伝子組換えＲＮＡウイルスを産生するために前記ＰＲＲＳＶでの感染に非感受性である宿主細胞をトランスフェクションすることを含む工程によって産生され、ＰＲＲＳＶの全長ゲノムのサイズは１５０９８ｂであることを特徴とする遺伝子組換えＲＮＡウイルス。
11. 感染性クローンは、ＰＲＲＳＶに特定の病原性マーカーおよび／または血清マーカーをコード化する少なくとも１個の核酸配列をさらに含み、前記少なくとも１個の核酸配列は病原性変化および／または変化した血清学的免疫反応を生じるように修飾されることを特徴とする請求項１０記載の遺伝子組換えＲＮＡウイルス。
12. 前記病原性マーカー、もしくは前記血清マーカー、または前記病原性マーカーおよび前記血清マーカーをコード化する前記核酸配列は、構造ウイルス・タンパクをコード化するゲノムのＯＲＦ７内に位置することを特徴とする請求項１１記載の遺伝子組換えＲＮＡウイルス。
13. ＯＲＦ７を含む核酸配列をさらに含み、前記ＯＲＦ７はＰＲＲＳＶのＯＲＦ７のオーソログによって置換されることを特徴とする請求項１０記載の遺伝子組換えＲＮＡウイルス。
14. 少なくとも１個の付加的異種核酸配列が組換え核酸に挿入され、遺伝子組換えＲＮＡウイルスを前記少なくとも１個の異種核酸配列の送達システムとして機能させることを特徴とする請求項１０記載の遺伝子組換えＲＮＡウイルス。
15. 前記異種核酸配列が抗原をコード化していることを特徴とする請求項１４記載の遺伝子組換えＲＮＡウイルス。
16. 少なくとも１個のＯＲＦを含む核酸配列をさらに含み、前記少なくとも１個のＯＲＦは、遺伝子組換えＲＮＡウイルスが導入された動物における病原性変化および／またはin vitro血清学的反応変化を生じるように修飾されることを特徴とする請求項１０記載の遺伝子組換えＲＮＡウイルス。
17. 前記宿主細胞が前記ＰＲＲＳＶの少なくとも１個の構造タンパクを発現することを特徴とする請求項１０記載の遺伝子組換えＲＮＡウイルス。
18. 請求項１０記載の遺伝子組換えＲＮＡウイルスで感染した細胞培養物。
19. ＯＲＦ１ａ，１ｂまたは２〜７のいずれかから選ばれるＯＲＦに欠失を有するＰＲＲＳＶゲノムに相補的なＤＮＡを含む核酸を含み、ＰＲＲＳＶ全長ゲノムのサイズが１５０９８ｂであることを特徴とするＤＮＡ。
20. 宿主細胞がＲＮＡウイルスの感染性クローンでトランスフェクションされて遺伝子組換えＲＮＡウイルスを産生するタイプの工程によって産生された遺伝子組換えＲＮＡウイルスであって、該工程において、ＲＮＡウイルスとしてＰＲＲＳＶを使用し、前記遺伝子組換えＲＮＡウイルスを産生するために前記ＲＮＡウイルスでの感染に非感受性である宿主細胞を使用し、そこから遺伝子組換えＲＡＮウイルスを回収し、ＰＲＲＳＶの全長ゲノムのサイズは１５０９８ｂであることを特徴とする遺伝子組換えＲＮＡウイルス。
21. プラス鎖ＲＮＡウイルスのゲノムに基づく感染性クローンを含む組換え核酸であって、該ＲＮＡウイルスがＰＲＲＳＶであり、該ＲＮＡウイルスのゲノムがＡＴＧＡＴＧＴＧＴＡを含み、前記感染性クローンは、
    前記ＲＮＡウイルスの全長ゲノムのin vitro転写ＲＮＡコピー、少なくとも１個の包膜タンパクをコード化する遺伝情報を欠く前記ＲＮＡウイルスのin vitro転写ＲＮＡコピー、前記ＲＮＡウイルスの全長ゲノムに相補的なＤＮＡおよび少なくとも１個の包膜タンパクをコード化する遺伝情報を欠く前記ＲＮＡウイルスゲノムに相補的なＤＮＡから成る群から選ばれる核酸配列を含む組換え核酸を産生することを含む工程によって産生され、ＰＲＲＳＶの全長ゲノムのサイズが１５０９８ｂであることを特徴とする組換え核酸。
22. 動物におけるプラス鎖ＲＮＡウイルスのゲノムに対して免疫反応を高めるための組成物であって、該プラス鎖ＲＮＡウイルスはＰＲＲＳＶであり、該プラス鎖ＲＮＡウイルスのゲノムはＡＴＧＡＴＧＴＧＴＡを含み、該組成物は、
    少なくとも１個の包膜タンパクをコード化する遺伝情報を欠く前記プラス鎖ＲＮＡウイルスゲノムのin vitro転写ＲＮＡコピー、
    前記プラス鎖ＲＮＡウイルスの全長ゲノムに相補的なＤＮＡ、および
    少なくとも１個の包膜タンパクをコード化する遺伝情報を欠く前記プラス鎖ＲＮＡウイルスゲノムに相補的なＤＮＡから成る群から選ばれる組換え核酸配列を含み、ＰＲＲＳＶの全長ゲノムのサイズは１５０９８ｂであることを特徴とする組成物。
23. プラス鎖ＲＮＡウイルスのゲノムを含む細胞培養物であって、該プラス鎖ＲＮＡウイルスはＰＲＲＳＶであり、該プラス鎖ＲＮＡウイルスのゲノムはＡＴＧＡＴＧＴＧＴＡを含み、該細胞培養物は、
    少なくとも１個の包膜タンパクをコード化する遺伝情報を欠く前記プラス鎖ＲＮＡウイルスゲノムのin vitro転写ＲＮＡコピー、
    前記プラス鎖ＲＮＡウイルスの全長ゲノムに相補的なＤＮＡ、および
    少なくとも１個の包膜タンパクをコード化する遺伝情報を欠く前記プラス鎖ＲＮＡウイルスゲノムに相補的なＤＮＡから成る群から選ばれる組換え核酸で、感染またはトランスフェクションされ、ＰＲＲＳＶの全長ゲノムのサイズは１５０９８ｂであることを特徴とする細胞培養物。

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