JP3882943B2 - 瘢痕形成剤としてのコンポーネントｂ - Google Patents

Description

本発明は、瘢痕形成剤としてのコンポーネントＢの使用、特に、体内のあらゆる組織に対する創傷、潰瘍および他の外傷性損傷の治療に関する。
コンポーネントＢは、ヒトの尿から最初に単離された８１アミノ酸の蛋白質である。ヒト遺伝子がクローン化されてＣＨＯ細胞中において組換えヒトコンポーネントＢとして発現された。この分子は約８．９ｋＤの分子量を有する。それは、さらにＷＯ９４／１４９５９に記載される。
そのような蛋白質は１０のシステイン残基を含み、そしてセリンプロテアーゼ酵素に典型的なモチーフを示す。蛋白質データバンクに対する配列の並びは、コンポーネントＢの、公知分子、例えばＣＤ５９、ウロキナーゼ受容体（ｕＰＡ−Ｒ）および幾つかの毒液の毒素（venom toxins）に対する幾らかの相同性を示した。
マウス中の器官および組織の分配の調査から出願人が得たデータは、目、肺、および皮膚が、コンポーネントＢのＲＮＡを主に発現する部位であることを示した。ヒトの組織中では、コンポーネントＢは、免疫組織化学による測定により、偏平上皮および粘膜、例えば皮膚、食道および頸外部（exocervix）において高度に発現されていることが見いだされた。最後に、ＥＧＦはヒト偏平上皮Ａ４３１細胞においてコンポーネントＢのＲＮＡの発現を誘導することが見いだされた。
コンポーネントＢは、抗炎症、抗凝血および抗腫瘍活性並びにＴＧＦ−αのその受容体への結合の阻害剤としての活性を有することが報告されている。
出願人は、今、コンポーネントＢが瘢痕形成剤としても有用であり、したがって、特に、体内のあらゆる組織に対する創傷、潰瘍および他の外傷性損傷の治療に有用であることを見いだした。
したがって、本発明の主題は、瘢痕形成剤として有用な、特に体内のあらゆる組織に対する創傷、潰瘍および他の外傷性損傷の治療に有用な、薬剤組成物の製造のためのコンポーネントＢの使用である。
本発明のさらなる目的は、有効量のコンポーネントＢを薬学上受容される賦形剤と共に投与することからなる、体内のあらゆる組織に対する創傷、潰瘍および他の外傷性損傷の治療方法である。
本発明の他の目的は、上記により製造された薬剤組成物である。
コンポーネントＢの製造方法およびそのアミノ酸配列に関しては、ＷＯ９４１１４９５９の開示を引用する。
活性成分の投与は、経口、静脈内、筋肉内、皮下または局所ルートによってよい。他の投与ルートは各々の成分の所望の血液レベルを確立してよく、本発明により包含される。
ヒトの治療のためには、好ましい投薬量は全身投与には１ｍｇ／ｋｇまたはそれ以下であり、そして局所投与には４μｇ／ｃｍ²またはそれ以下である。
本発明は以下の実施例により今記載されるが、実施例は本発明の限定する手段として解釈されるべきではない。実施例は、以下に特定される図面を引用する。
【図面の簡単な説明】
図１：コンポーネントＢの静脈内投与のベタメタゾン（Bentelan（ベンテラン）、登録商標）の静脈内投与との比較における実験用創傷治癒に対する作用を示す。特に、実験１の結果を要約する。試験薬剤は、連続６日間、０日目（創傷誘導の日）から５日目まで毎日投与した。
図２：コンポーネントＢ（バッチ００４−００１ｂ）の静脈内投与のベタメタゾンメタソン（Bentelan、登録商標）の静脈内投与との比較における実験用創傷治癒に対する作用を示す。特に、実験２の結果を要約する。試験薬剤は、連続６日間、０日目（創傷誘導の日）から５日目まで毎日投与した。
図３：コンポーネントＢ（バッチ００４−００１）の局所投与の実験用創傷治癒に対する作用を示す。特に、実験３の結果を要約する。試験薬剤は、連続５日間、０日目（創傷誘導の日）から４日目まで毎日投与した。
図４：ウシ血清アルブミンの局所投与の実験用創傷治癒に対する作用を示す。特に、実験４の結果を要約する。試験薬剤は、連続５日間、０日目（創傷誘導の日）から４日目まで毎日投与した。
図５：実験１の結果に適用されたＳ字状投薬量応答分析を報告する。コンポーネントＢ（バッチ００４−００１および００４−００１ｂ、それぞれ「００１」および「００１ｂ」と示す）およびベタメタゾン（Bentelan、登録商標）の静脈内投与の実験用創傷治癒に対する作用は、したがって、実験１の結果を基にして統計学により評価される。
図６：実験２の結果に適用されたＳ字状投薬量応答分析を報告する。コンポーネントＢ（バッチ００４−００１ｂ、「００１ｂ」と示す）およびベタメタゾン（Bentelan、登録商標）の静脈内投与の実験用創傷治癒に対する作用は、したがって、実験２の結果を基にして統計学により評価される。
図７：実験１および２の累積された結果に適用されたＳ字状投薬量応答分析を報告する。コンポーネントＢ（バッチ００４−００１ｂ）の静脈内投与の実験用創傷治癒に対する作用は、したがって、実験１および２の結果の組み合わせを基にして統計学により評価される。
図８：実験１および２の組み合わせに対する、累積された度数に適用されたＳ字状投薬量応答分析を報告する。コンポーネントＢ（バッチ００４−００１ｂ）の作用がそのように評価される。
図９：実験３の結果に適用されたＳ字状投薬量応答分析を報告する。コンポーネントＢ（バッチ００４−００１）の局所投与並びに静脈内投与の実験用創傷治癒に対する作用は、したがって、実験３の結果を基にして統計学により評価される。
図１０：実験４の結果に適用されたＳ字状投薬量応答分析を報告する。バッファーとＢＳＡの創傷減少における作用の比較は、したがって、実験４の結果を基にして統計学により評価される。
実施例
材料
動物
雄雌両方のＳＰＦ ＣＤ−１マウスをチャールズリバーイタリア（Ｃａｌｃｏ，Ｃｏｍｏ，イタリア）から購入して、制御された環境条件下で（温度：２２±２℃；湿度：５５±１０％および１２時間の日照／暗黒サイクル）、少なくとも７日間の順応期間後に、実験に使用した。
試験化合物
−本質的にはＷＯ９４／１４９５９に記載されたとおりにＣＨＯ細胞中で発現させて生成したｒｅｃ−ｈコンポーネントＢバッチ００４−００１（硫酸塩の形態）および００４−００１ｂ（非硫酸塩の形態）
−Ｇｌａｘｏ（Ｖｅｒｏｎａ，イタリア）からのベタメタゾンの市販の製造物（Bentelan、登録商標）
−Ｂａｘｔｅｒ（Ｔｒｉｅｓｔｅ，イタリア）からの塩化ナトリウム０．９％（塩水）
−シグマケミカルズ社（セントルイス、ＭＯ，アメリカ合衆国）から供給されたウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）のフラクションＶ
方法
実験用の十分な厚さの創傷の治癒
用いられた方法は、Ｊ．Ｊ．Ｐ．ＭｏｒｔｏｎとＭ．Ｈ．Ｍａｌｏｎｅにより示唆された方法であったが（Ｍｏｒｔｏｎ Ｊ．Ｊ．Ｐ．ａｎｄＭａｌｏｎｅ Ｍ．Ｈ．，Ａｒｃｈ．Ｉｎｔ．Ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎ．１９６：１１７，１９７）、彼らは、多くの薬剤のラットにおける創傷治癒活性の評価に、この方法を用いた。
コンポーネントＢの本調査のために、元の方法を、以下のとおりにマウスにて用いられるように適切に修飾した。
円のインクマーク（１センチの直径）をオスのマウス（３０−３５ｇ，６−７週齢）の背中の領域に刻印し、そしてこの標識されたエリアの皮膚（皮筋層および接着組織を含む）を外科用ハサミおよび鉗子により切り出した。次に、創傷をガーゼのパッドにより造血が起こるまで吸い取り乾燥した（blotted dry）。０日目、即ち外科手術日に、縦、横、および２つの対角線の測定（脊椎柱に対して）を、創傷の直径に対して最短０．１ｍｍまで、直接読み取りカリパスで行った。測定の正確な点は、消えないインクにより隣接する皮膚をマークすることにより保護した。次の創傷実験は、日曜日以外の毎日、創傷が完全に閉じるまで行った。外科手術および測定は、共に、マウスを軽いエーテル麻酔することにより行った。
各創傷の面積は、その平均直径の二乗に０．７８５４を掛けることにより得た。次に、パーセントの創傷の閉鎖を０日目に比較して計算した。各々の測定日に関する平均パーセント創傷閉鎖の値は、各実験群に関して表にされて、閉鎖時間５０％（ＣＴ₅₀）を相互にプロットした。
全身処置
２つの実験（実験１および２）を実施した。第２の実験においては、処置スケジュールを知らされなかった同じ操作者が各実験日に実施した。各実験において、動物は４つの群に分けられて、以下のスケジュールにしたがって処置した。

動物は１日１回６日続けて処置された。動物の体重はこの調査の全期間を通じて監視された。
局所処置
さらなる実験（実験３）においては、異なる投薬量のコンポーネントＢ（バッチ００４−００１）の局所投与の効果を、以下の表に報告された処置スケジュールに従い、創傷誘導のための前に記載された方法を用いて調査した。

試験生成物の溶液を１日目および２日目に創傷上に塗ったが（体積０．０５ｍｌ）、連続する日において、かさぶたが形成されていたら、２５Ｇの針を有するシリンジによりかさぶたの下に注射された。
１ｍｇ／ｋｇの投薬量にて静脈内（ｉ．ｖ.）投与されたコンポーネントＢは陽性参照基準として用いられた。
蛋白質溶液の局所投与の特異的効果の可能性を除外するために、平行実験においては、コンポーネントＢと同じモル濃度において（８．８×１０^-6Ｍ）、ＢＳＡの効果をリン酸バッファーと比較して局所アッセイした（実験４）。
結果
創傷治癒
図１は第１の実験のデータを報告するが、コンポーネントＢの２つのバッチ（００４−００１および００４−００１ｂ）の活性を比較した。両方とも瘢痕形成過程を促進することができたが、それらの効果は処置１日後に既に明らかであった。ＣＴ₅₀、即ち５０％の創傷減少が生じる時間はそれぞれ３．０および３．４日であり、それらの値は統計学上は異ならない。対照的に、７．８日および７．２日のＣＴ₅₀がベタメタゾン（Bentelan、登録商標）および塩水においてそれぞれ観察された（「統計分析」と題される段落を参照されたい）。
第２の実験において（図２）、２種類の投薬量のコンポーネントＢ（バッチ００４−００１ｂ）を調査した。もっとも高い投薬量１ｍｇ／ｋｇにおいて、ＣＴ₅₀は３．７日であり、最も低い投薬量において（０．１ｍｇ／ｋｇ）６．６日であった。塩水およびベタメタゾン処理した群は、それぞれ９．１日および１０日のＣＴ₅₀を示した（「統計分析」と題される段落を参照されたい）。
創傷治癒におけるコンポーネントＢの正の効果は他の指数即ちＥＴ₅₀によっても確認され、動物の５０％が完全な創傷の閉鎖を示した時間を示唆する（「統計分析」と題される段落を参照されたい）。
コンポーネントＢを創傷上に局所適用した際の実験結果（実験３）を図３に報告する。該化合物を投薬量１、２および４μｇ／日で５日連続して調査した。アッセイした全ての投薬量は対照に比して創傷の治癒の進行を高めることができた。特に、２および４μｇの投薬量はそれぞれ３．８および４．４のＣＴ₅₀値を提供し、これらは静脈内投与されたコンポーネントＢ１ｍｇ／ｋｇを用いて見いだされた値（３．９）に匹敵した。最も低い投薬量（１μｇ）においては、５．３日のＣＴ₅₀値が観察され、他の２つの局所投薬量で得られた価よりも高かったが、対照よりは顕著に低かった（「統計分析」と題される段落を参照されたい）。
これらのデータは、創傷に局所投与された２μｇの投薬量が最大の効果を生じること、および１μｇは瘢痕形成の進行を高めるのにそれでもやはり効果的であることを暗示する。
創傷治癒の進行に対するコンポーネントＢの正の効果が生成物に特定の特徴であるか否かを確認するために、平行実験を実施したが、該実験においては、コンポーネントＢと同じモル濃度のＢＳＡの効果をリン酸バッファーの効果と比較した（実験４）。これらのデータを図４に報告する。９．９日および７．９日のＣＴ₅₀がＢＳＡおよびリン酸バッファーにそれぞれ記録された。上記値は顕著に異ならないことから（「統計分析」と題される段落を参照されたい）、即ち、ＢＳＡのような標準蛋白質溶液は皮膚の創傷修復に影響しないことが示唆される。
これらの実験の個々のデータは表１Ａ−４Ｂに記録される。
統計分析
統計戦略
統計分析はコンポーネントＢ（Ｃｏｍｐ．Ｂ）対塩水と標準薬剤ベンテランの２つの調製物の時間に関しての効果を比較することを目的とした。
さらに、コンポーネントＢの一つの調製物の全身および局所投与の効果も評価した。
処置のプロトコルにしたがい、試験薬剤の効果を全観察期間を通して調査した。
異なる投薬量レベルにおけるコンポーネントＢの効果を確認するために、創傷減少実験を２回繰り返した。
統計試験
ＣＴ₅₀（即ち、創傷領域が５０％減少した時間）の評価のために、Ｓ字状投薬量応答分析を統計試験として使用した（Ｆｉｎｎｅｙ Ｄ．Ｊ．，Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃｓ，３２，ｐｐ．７２１−４０，１９７６を参照されたい）。
統計ユニット
１）創傷減少（ＣＴ₅₀）：変化の平均パーセンテージ対平均基底値
２）累積度数（ＥＴ₅₀）：各時間点における完全な創傷閉鎖を示す動物の累積度数処置群（実験１）
１−塩水−１０ｍｌ／ｋｇ／日、ｉ．ｐ．６日間
２−ベンテラン−１ｍｇ／ｋｇ／日、ｉ．ｐ．６日間
３−コンポーネントＢ 004-001−１ｍｇ／ｋｇ／日、ｉ．ｖ．６日間
４−コンポーネントＢ 004-001b−１ｍｇ／ｋｇ／日、ｉ．ｖ．６日間
処置群（実験２）
１−塩水−１０ｍｌ／ｋｇ／日、ｉ．ｖ．６日間
２−ベンテラン−１ｍｇ／ｋｇ／日、ｉ．ｖ．６日間
３−コンポーネントＢ 004-001b−０．１ｍｇ／ｋｇ／日、ｉ．ｖ．６日間
４−コンポーネントＢ 004-001b−１ｍｇ／ｋｇ／日、ｉ．ｖ．６日間
処置群（実験３）
１−リン酸バッファー−５０μｌ／日、局所５日間
２−コンポーネントＢ 004-001−１μｇ／日、局所５日間
３−コンポーネントＢ 004-001−２μｇ／日、局所５日間
４−コンポーネントＢ 004-001−４μｇ／日、局所５日間
５−コンポーネントＢ 004-001−１ｍｇ／日、ｉ．ｖ．５日間
処置群（実験４）
１−リン酸バッファー−５０ｍｌ／日、局所５日間
２−ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）−５０μｌ／日（8.8×10^-6M）、局所５日間処置スケジュール（実験１、２、３および４）
フェーズ１：上記処置群の記載に従った繰り返しの処置日
フェーズ２：創傷が完全に閉鎖した日までの観察期間
統計分析の結果
図５−１０に記録されたダイアグラム（Ｓ字状投薬量応答分析）は、創傷面積を変数として使用した試験薬剤の効果を要約する。
実験１
図５を引用する。
実験１に関して創傷面積（area）に適用されたＳ字状投薬量応答分析の結果（ＣＴ₅₀）を以下の表に記録する。

実験２
図６を引用する。
実験２に関して創傷面積（area）に適用されたＳ字状投薬量応答分析の結果（ＣＴ₅₀）を以下の表に記録する。

実験１および２の組み合わせ
実験１および２の両者に共通な処置群のデータ、即ち塩水対コンポーネントＢ−００４−００１ｂ １ｍｇ／ｋｇの組み合わせから得られたデータを要約する。
さらに、創傷の完全な閉鎖を示す動物の時間に関する頻度も実験１および２の累積から評価した（Ｓ字状投薬量応答分析により）。
実験１および２の組み合わせに関して創傷面積（area）に適用されたＳ字状投薬量応答分析の結果（ＣＴ₅₀）を以下の表に記録する。

結論として、ＣＴ₅₀値およびＥＴ₅₀値の間の比較は実験モデル上の各々の試験薬剤の効果の良好な評価となる。
コンポーネントＢ−００１（１ｍｇ／ｋｇ，ｉ．ｖ.）およびコンポーネントＢ−００１ｂ（投薬量レベル０．１ｍｇ／ｋｇおよび１ｍｇ／ｋｇ，ｉ．ｖ.）の両方が実験１および２における塩水およびベンテランとは統計学上異なることが見いだされた。実験１および２に共通の処置群の組み合わせの結果は、コンポーネントＢ １ｍｇ／ｋｇによる投与の静脈内（ｉ.ｖ．）ルートの効果を確証する。
実験３
図９を引用する。
生成物を局所投与した場合のさらなる実験セットを実施した。静脈内投与のルートを陽性参照基準として用いた。データは上記と同じ統計モデルを用いて分析した。
実験３に関して創傷面積（area）に適用されたＳ字状投薬量応答分析の結果（ＣＴ₅₀）を以下の表に記録する。

結論として、コンポーネントＢ−００１ｂの局所投与は、試験された全ての投薬量において、リン酸バッファーとは顕著に異なる創傷の減少（ＣＴ₅₀）を示した。
実験４
図１０を引用する。
ダイアグラムは、コンポーネントＢの起こり得る副作用を除外するために、創傷の減少におけるリン酸バッファーとＢＳＡの間の局所投与の比較を報告する。

上記データは、リン酸バッファーとＢＳＡの間の局所投与に何ら差異を示さなかった。
全ての調査の結論
本調査の興味ある結果は、静脈内投与または局所投与の両者による瘢痕形成過程におけるコンポーネントＢの活性である。本研究に用いられた実験モデルはヒトの外傷等価物に直接関連し、そして皮膚の外傷性損傷の治癒および粘膜並びに上皮のプラスチックおよび再生外科手術におけるコンポーネントＢの適用に関する予報である。

Claims (2)

1. 活性成分として以下のアミノ酸配列：
   

   

   からなるコンポーネントＢまたは上記アミノ酸配列においてひとつまたは数個のアミノ酸残基が置換、欠失または付加されたアミノ酸配列からなり且つ瘢痕形成性を有するポリペプチド並びに薬学上受容可能な賦形剤を含む、瘢痕形成剤として適切な形態の医薬組成物。
2. 体内のあらゆる組織に対する創傷、潰瘍および他の外傷性損傷の処置のための、請求項１記載の医薬組成物。

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