JP3845675B2 - 核酸分離剤 - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、螺旋状高分子、特に、核酸を選択的に分離、精製する新規な材料に関する。
【０００２】
【従来の技術】
遺伝子操作やヒトゲノム解析をはじめとする近年のバイオテクノロジーの著しい進歩には目を見張るものがある。特に核酸、タンパク質、糖質などは、生命活動の本質をつかさどる物質として医学、化学、農学といった広い領域において研究されている。また、学術的な知見をもとに産業界への応用も急速に広まっている。
【０００３】
このようなバイオテクノロジー興隆の時代においては、生物内の微量な有効成分をいかにして大量に純度良く精製することができるかということが重要課題となる。しかし、生体内の物質は微量且つ不安定であることも多く、従来の技術において安価で大量に精製することは困難である。
【０００４】
例えば核酸の精製においては、相補的な塩基配列を有するＤＮＡを修飾したアフィニティーカラムが多く用いられるが、非常に高価である上に加水分解酵素による分解を受けやすい為に寿命が短いことが欠点となっている。また、タンパク質の精製については、抗体によるアフィニティーカラム、イオン交換カラム、ゲルろ過カラム等が用いられているが、高い分離度でタンパク質が失活することなく精製する条件は非常に限定されている。
【０００５】
【発明が解決しようとしている課題】
本発明の目的は、螺旋構造を有する生体高分子の分離、精製に有効な、新しい分離剤を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の目的を達成するため鋭意研究を行い、β-1,3-グルカン誘導体又はβ-1,3-キシラン誘導体を支持体に固定化した分離剤が核酸のような螺旋状高分子の分離剤として有効であることを見出し本発明を導き出した。
【０００７】
本発明で言う、β-1,3-グルカン又はβ-1,3-キシランとは、天然または人工的に合成される、多糖の一種で、グルコース又はキシロース環が、β結合で１位と３位の水酸基間が結合したものである。このようなβ−1,3−グルカン又はβ−1,3−キシランの典型例は、シゾフィラン、カードラン、レンチナン、パーキマン、グリホラン、ラミナラン、又はスクレログリカンの一般名（通称）で知られたものである。本発明で言う、β-1,3-グルカン誘導体又はβ-1,3-キシラン誘導体とは、化学的に純粋な、上記のようなβ-1,3-グルカン又はβ-1,3-キシランを含む化合物の総称であり、具体的には、10重量パーセント以上、好ましくは、20重量パーセント以上の当該多糖（β−1,3−グルカン又はβ−1,3−キシラン）を含むものを指称し、ここで、後に述べるような化学修飾の方法を用いて、β-1,3-グルカン又はβ-1,3-キシランの構造の一部に官能基を付加したものも、β-1,3-グルカン又はβ-1,3-キシランに含まれるものとする。以下、このようなβ-1,3-グルカン誘導体又はβ-1,3-キシラン誘導体を「本発明の多糖」と言うことがある。
【０００８】
さらに、本発明の多糖はその重量平均分子量が100以上、さらに好ましくは1000以上、最もこの好ましくは2000以上であることが求められる。この分子量は、無論、捕捉する分子（分離すべき分子）の種類によって異なる。
【０００９】
本発明は、本発明の多糖を支持体に固定して使用される。支持体に固定する方法の例としては、本発明の多糖の糖鎖の還元末端、側鎖、主鎖の未反応水酸基を支持体の適当な官能基と結合させる方法が挙げられる。糖鎖の還元末端を結合部位とする場合は、例えばアミノ基を有する支持体との結合が可能である。また、主鎖や側鎖の未反応水酸基に導入する場合は、例えば水酸基、カルボキシル基を有する支持体との結合が可能である。また、必要ならば適当なスペーサーを入れてもよい。このようなスペーサーとしては例えばブタンジアミンや各種アミノ酸等の２官能性化合物を利用することができる。また、本発明の多糖に官能基を付加し、支持体の反応性基と化学結合で固定化することが出来る。本発明の多糖に導入する官能基としては、アミノ基、アルデヒド基、カルボニル基、チオール基等が例示される。また、水素結合、疎水的相互作用、静電的相互作用、物理的吸着等も挙げられる。この場合も、その効率を高めるために前述の化学修飾を行うことができる。
【００１０】
上述の方法で、導入された官能基は、支持体上の官能基と反応させることにより、本発明の多糖は固定化される。このような支持体としては、β−1,3−グルカン誘導体又はβ−1,3−キシラン誘導体から成る本発明の多糖を上述したような結合様式または相互作用を介して固定化し得る各種の物質を利用することができる。
【００１１】
本発明において用いられるのに好ましい支持体の例としては、クロマトグラフィーの固定相の担体等として用いられている各種の材料、例えば、スチレンゲル、セルロースゲルまたはシリカゲルのようなゲルを本発明の多糖と反応し得るような官能基を有するように修飾されたスチレンゲル誘導体、セルロースゲル誘導体又はシリカゲル誘導体を挙げることができる。例えば、スチレンゲル誘導体の１種である東ソー社のトヨパールもしくはその類似品を本発明の支持体として使用することができる。さらに詳しくは、アミノトヨパールの場合は、本発明の多糖の糖鎖にカルボキシル基を、カルボキシトヨパールの場合は本発明の多糖の糖鎖にアミノ基を導入することが好ましく、これによって本発明の多糖が該支持体に固定化される。その他のスチレンゲル誘導体、セルロースゲル誘導体、シリカゲル誘導体なども同様に本発明の多糖を固定化するのに使用される。
【００１２】
本発明において用いられる支持体の他の好ましい例としては、電気泳動法に用いられているようなアガロースゲル誘導体やアクリロアミドゲル誘導体を挙げることができる。本発明の多糖を上述したような方法で、これらのゲルに固定化し、核酸のような生体高分子を該ゲル中で電気泳動することにより分離を行なうことも可能である。この場合、本発明の多糖と相互作用の強い生体高分子ほど泳動度が低く、選択的に分離することができる。
なお、本発明における支持体に関して用いている各種の「ゲル誘導体」という表現は、以上の説明からも理解されるように、本発明の多糖の官能基と反応し得るようにそれぞれのゲルが化学修飾されていることを意味する。
【００１３】
本発明の分離剤は、本発明の多糖に類似したヘリックスパラメーターを有する螺旋状高分子の分離、精製において有効であり、特に核酸の分離、精製に有効である。DNAの２重螺旋にみられるように、螺旋状高分子は類似したヘリックスパラメーターを有する他の高分子と高分子複合体を形成する。その結合は、疎水性相互作用（水中で使用する場合）や水素結合による。本発明の多糖は多くの水素結合点を持ち、水素結合性のサイトを有する螺旋状高分子を選択的に補足する。このような螺旋状高分子としては、核酸や蛋白質が例示される。
【００１４】
かくして、本発明の特に好ましい態様に従えば、核酸のような螺旋状高分子と相互作用して複合体を形成することのできる多糖を固定化した分離剤であって、本発明の多糖と類似したへリックスパラメーターを有する高分子鎖を捕捉する分離剤が提供される。ここで、ヘリックスパラメーターとは、当該分野で知られているように螺旋状化合物の形態を表示するのに用いられ、ヘリックスピッチ（ｈ）、１ヘリックスピッチ中の官能基の数（Ｒ）、および螺旋の巻き方向（右巻きまたは左巻き）で定義される量である。
【００１５】
本発明の多糖のヘリックスパラメーターは、相互作用して複合体を形成すべき核酸のような螺旋状高分子に応じてコントロールされる。螺旋状高分子と複合体を形成するためには、巻き方向は一致する必要があるが、他の量であるｈとRについては近い値を持っていれば十分で、完全に一致する必要はない。すなわち、本発明に関して用いる「類似した（類似の）ヘリックスパラメーターを有する」という表現は、巻き方向が一致するとともに、ｈとＲが同一または近似の値を（ｈ／Ｒとして、一般に、±50％以内、好ましくは±30％以内）を有していることを意味し、そして、本発明の多糖は、使用する溶液（一般に水溶液）中で部分的にでも核酸のような螺旋状高分子と類似のヘリックスパラメーターを有していればよい。近似の目安としては、核酸を分離する場合には、核酸のｈ／Ｒ（一官能基あたりのピッチ長）の値が、２から４Åの間にあることより、本発明の多糖は、好ましくは、2〜４Å、さらに好ましくは単一核酸鎖の値である、2.4〜3.6Å、より好ましくは多くの単一核酸鎖の値である、2.4〜3.3Åのｈ／Ｒ値を有するようにする。
【００１６】
核酸および高分子を含む各種の螺旋状化合物のヘリックスパラメーターの値は、各種の文献の記述から容易に知ることができる。例えば、Ｗゼンガーの「核酸構造」（シュプリンガー・フェアラ−ク東京、昭和６２年刊）に記載されている如く、A型ＤＮＡのヘリックスパラメーターはｈ＝28.2Å、R=11、ｈ／Ｒ＝2.56、右巻きであり、また、合成ＲＮＡのpoly（Ｃ）ではｈ＝18.6 Å、R＝6、ｈ／Ｒ＝3.10、右巻きである。本発明においては核酸と類似のヘリックスパラメーターを有する高分子鎖を用いることが肝要であり、核酸のヘリックスパラメーターと類似の高分子鎖を用いることにより、核酸との複合体形成が熱力学的に容易になる。例えば、実施例に示す、主鎖がβ−1,3−グルカンからなる多糖であるシゾフィランやレンチナンのヘリックスパラメーターは“高橋、小畠、鈴木、Prog. Polym. Phys. Jpn. 27巻、767ページ”、または“Conformation of Carbohydrates, harwood academic publisher, 1998年”に記述されており、ｈ＝17.4Å、Ｒ＝6.0、ｈ／Ｒ＝2.90、右巻きと、Poly（Ｃ）に極めて近い。この為に、主鎖がβ−1,3−グルカンから成る多糖、例えば、シゾフィラン、レンチナン、カードラン、パーキマン、グリホラン又はスクレログリカンは核酸と容易に複合体を形成する。
【００１７】
へリックスパラメーターが不明の場合には、溶液中の高分子の局所的なコンフォメーションは結晶構造を反映していると考えられるので、結晶解析のデータを利用することによって、ヘリックスパラメーターの値を求めることができる。例えば、溶液中の光散乱や極限粘度、ＭＮＲなどの測定データを、「Helical Wormlike Chains in Polymer Solutions, 山川裕美、Springer Verlag 1997年」に記載されている方法を用いて解析し、へリックスパラメーターの値がを求められる。
【００１８】
後に述べる実施例は、選択カラムとして本発明の分離剤を用いるの例であるが、無論、本発明の具体的な実施形態はこれに限るものでは無い。たとえば、本発明の多糖を上述した方法にて、粒状セルロースやスチレン、シリカ等に固定化したラテックス（これを、本発明の多糖修飾粒子という）を用意し、これを分離したい溶液に浸し、本発明の多糖修飾粒子上に核酸等を保持させる。例えば、poly(A)のテイルを有するｍＲＮＡを分離したい場合は、mRNAのテイルに結合するに十分な長さを有する本発明の多糖を粒子上に修飾する。その後、ｍＲＮＡに入った溶液中に浸す。この粒子の分離は、例えば、遠心分離やろ過を用いることもできる。また、あらかじめ粒子の中に磁性を有する金属をいれ、磁石で目的とする粒子を分離しても良い。
【００１９】
【実施例】
以下、本発明の特徴を更に明らかにするため実施例及び比較例を示すが、これらの例は本発明を例示するためのものであり、本発明を制限するためのものではない。
実施例１から３はβ-1,3 -グルカンとしてシゾフィランまたはレンチナンをゲル支持体に固定化することにより得られる多糖修飾ゲルカラムが核酸の分離、精製用のアフィニティーカラムとして適用できることを示すものである。また、実施例４は、同様に調製したシゾフィラン修飾ゲルカラムを使用して、ＲＮＡ混合物の中からｍＲＮＡを選択的に分離、精製することができることを示すものである。
【００２０】
実施例１
アミノ基を含むゲル支持体（アミノトヨパール（AF-Amino TOYOPEARL）、東ソー社製）にシゾフィラン（分子量 150000）及びシアノボロハイドレートナトリウム、酢酸ナトリウム水溶液を加え、60℃で40時間振とうし、シゾフィラン修飾ゲルカラムを得た。ゲルを洗浄後カラム管に充填した。
【００２１】
実施例２
分子量6000のシゾフィランを用いた以外は実施例１と同様にしてシゾフィラン修飾ゲルカラムを作成した。
【００２２】
実施例３
シゾフィランの代わりにレンチナンを用い、実施例１と同様の操作によりレンチナン修飾ゲルカラムを作成した。
【００２３】
比較例１ - ３
シゾフィランの代わりにデキストラン、プルラン、アミロースを用い、実施例１と同様の操作により多糖修飾ゲルカラムを作成した。
【００２４】
以上の各実施例及び比較例において得られたゲルカラムに核酸水溶液を流入し、溶離液を吸収スペクトルにより測定することで、溶出挙動を確認した。図１に実施例１のカラムを用いた場合の核酸の分離挙動を示す。溶出に用いる溶媒は0-30 mlは50 mM(pH7.5)リン酸緩衝液で、30 ml以降は200 mMリン酸緩衝液(pH6.0)とした。この結果より、核酸の種類によってシゾフィラン修飾カラムからの溶出挙動が異なることがいえる。同様の挙動が実施例２、３のカラムについても観察された。
【００２５】
これに対し比較例１のカラムを用いた場合の核酸の分離挙動を図２に示す。この図より、各核酸はカラム担体とほとんど相互作用することなく溶出し、従って核酸の分離精製は不可能であることが示された。この挙動は比較例２、３についても同様であった。
各カラムからの核酸の溶出挙動について表１にまとめる。
【００２６】
【表１】

【００２７】
表１に示されるように実施例1-3については、poly(A)及びpoly(C)は塩強度50 mM, pH7.5の条件下においてカラム中に保持される。これに対しpoly(U)及びpoly(G)は同条件下で溶出するためにこれらの分離が可能であるといえる。また、カラム中に保持された核酸も、溶離液を塩強度200 mM, pH6.0とすることで溶出させることができる。これに対して比較例1-3では、核酸の種類及び溶離液の性質にかかわらず核酸は溶出してしまうので分離、精製に用いることは出来ない。
【００２８】
実施例４
シゾフィラン（分子量150000）、ジアミノブタンおよびシアノボロハイドレートナトリウム、酢酸ナトリウム水溶液を加え、60℃で40時間攪拌した。溶液を透析により精製し凍結乾燥することにより、アミノ化シゾフィランを得た。得られたアミノ化シゾフィランと、カルボキシル基を含むゲル支持体（カルボキシトヨパール（AF-Carboxy TOYOPEARL）、東ソー社製）を脱水下ジメチルスルホキシドに溶解し、ジフェニルホスホロアジデートおよびトリエチルアミンを加え、30℃で１晩振とうし、シゾフィラン修飾ゲルカラムを得た。ゲルを洗浄後カラム管に充填した。
【００２９】
以上のようにして得られたゲルカラムに酵母由来のＲＮＡ混合物を含む水溶液を流入し一晩熟成後溶出させた。溶離液を吸収スペクトルにより測定することで、溶出挙動を確認した。図３に核酸の溶出曲線を示す。溶出に用いる条件は０〜30mlでは条件１〔温度：5℃、溶出液：50mM（pH7.5）リン酸緩衝液〕で、30ml以降は条件２〔温度60℃、溶出液：200mM（pH6.0）リン酸緩衝液〕とした。この操作により、２つの核酸由来のピークを得ることができた。すなわち、条件１においてカラム中に保持されない核酸（ピーク１）と条件１においては保持される核酸（ピーク２）に分けることができた。
【００３０】
各ピークの成分をゲル電気泳動法により測定した。図４に各フラクションのゲル電気泳動写真を示す。ゲル電気泳動においてｍＲＮＡはブロードなバンドとして現れる。これに対してリポソーマルＲＮＡ、トランスファーＲＮＡはシャープなバンドとなって現れる。例えば、レーン３を例にとると、１番下の最も泳動度の大きいバンドがトランスファーＲＮＡ由来で、その上の２本のバンドがリポソーマルＲＮＡ由来のバンドとされている。また、原点からトランスファーＲＮＡ由来のバンドの間で全体的に光っているものがｍＲＮＡである。つまり、レーン中のトランスファーＲＮＡ、リポソーマルＲＮＡ由来のバンドが減少または消失し、ｍＲＮＡ由来のバンドの輝度が増加すると、ｍＲＮＡが分離精製できたと評価することができる。
【００３１】
この写真によると、ピーク１の核酸は強い強度でリポソーマルＲＮＡ、トランスファーＲＮＡ由来のバンドを発現した。これに対して、ピーク２ではリポソーマルＲＮＡ、トランスファーＲＮＡ由来のバンドが明らかに減少し、相対的にｍＲＮＡ由来のバンドの輝度が増加していることが分かる。すなわち、ピーク２を分取することによりｍＲＮＡを高純度で得ることができる。これらの結果より、シゾフィラン修飾カラムによってＲＮＡ混合物よりｍＲＮＡを選択的に分離精製できることが理解される。
【図面の簡単な説明】
【図１】β-1,3-グルカンの１種シゾフィランを支持体に担持したゲルカラムに核酸水溶液を流入したときの溶出挙動を示す。
【図２】デキストランを支持体に担持したゲルカラムに核酸水溶液を流入したときの溶出挙動を示す。
【図３】β−1,3−グルカンの１種であるシゾフィランを支持体に固定化したゲルカラムに酵母由来のＲＮＡ混合物水溶液を流入したときの溶出挙動を示す。
【図４】実施例４で得られたＲＮＡのフラクションのゲル電気泳動実験の結果を示す。

Claims (5)

1. β-1,3-グルカン誘導体又はβ-1,3-キシラン誘導体を支持体に固定化して成り、ＲＮＡ混合物よりｍＲＮＡを選択的に分離精製するｍＲＮＡ分離剤。
2. β -1,3- グルカン誘導体又はβ− 1,3 −キシラン誘導体として、シゾフィラン誘導体、カードラン誘導体、レンチナン誘導体、パーキマン誘導体、グリホラン誘導体、ラミナラン誘導体又はスクレログリカンの誘導体を支持体に固定化した、請求項１に記載の分離剤。
3. β -1,3- グルカン誘導体又はβ -1,3- キシラン誘導体の重量平均分子量が２０００以上である、請求項１〜２のいずれかに記載の分離剤。
4. 支持体がスチレンゲル誘導体、セルロースゲル誘導体又はシリカゲル誘導体である、請求項１〜３のいずれかに記載の分離剤。
5. 支持体がアガロースゲル誘導体又はアクリルアミドゲル誘導体である、請求項１〜３のいずれかに記載の分離剤。

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