JP3807782B2

JP3807782B2 - Hyaluronidase inhibitor

Info

Publication number: JP3807782B2
Application number: JP15446896A
Authority: JP
Inventors: 真也江幡; 八広滝田; 恒雄宮原
Original assignee: Lion Corp
Current assignee: Lion Corp
Priority date: 1995-06-22
Filing date: 1996-06-14
Publication date: 2006-08-09
Anticipated expiration: 2016-06-14
Also published as: JPH0967266A

Description

【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、優れたヒアルロニダーゼ阻害活性を有する、極めて安全性の高い海藻抽出物よりなるヒアルロニダーゼ阻害剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヒアルロニダーゼは、ヒアルロン酸の加水分解酵素であり、皮膚のほか動物組織に広く分布している。本酵素の基質となるヒアルロン酸は、皮膚、靭帯、関節液、眼の硝子体などの組織に多く存在するムコ多糖の一種であり、例えば、皮膚においては、細胞の保護、栄養の運搬、組織水分の保持、柔軟性の維持等に、また関節液として組織構造、機能の維持および潤滑性の保持等に、重要な役割を果たしている。
【０００３】
皮膚や関節における生体ヒアルロン酸量は、老化または病的状態により減少することが知られており、その結果、皮膚の乾燥、肌荒れ、ハリ、弾力性の低下、シミ、シワの増加、あるいは関節の湿潤性悪化による関節痛等を引き起こす。
このような状態に対して、ヒアルロニダーゼ阻害剤は、ヒアルロン酸の分解を抑制することにより生体ヒアルロン酸量の維持に寄与すると考えられている。
また、最近では、ヒアルロン酸を配合した化粧料の皮膚への塗布や関節へのヒアルロン酸の注入等の措置がとられているが、ヒアルロニダーゼ阻害剤は、これら外因性ヒアルロン酸の安定化にも利用することができる。
【０００４】
さらに、ヒアルロニダーゼは、炎症時に活性化され、結合組織のマトリックスを破壊し、炎症系の細胞の組織への浸潤、血管の透過性を亢進すること、Ｉ型アレルギーにおける肥満細胞からのヒスタミン遊離の過程に介在している可能性が高いことなどが知られている。
従って、ヒアルロニダーゼ阻害活性は、生体中のヒアルロン酸レベルの維持に関与するだけでなく、抗炎症、抗アレルギー活性とも高い相関を示す。実際、これまでに開発された抗炎症剤、抗アレルギー剤であるインドメタシン、アスピリン、クロモグリク酸ナトリウム、トラニラストなど多くにヒアルロニダーゼ阻害活性が認められている。
【０００５】
以上のようなことから、優れたヒアルロニダーゼ阻害活性を有し、かつ皮膚等の人体への適用に際し、高い安全性をもったヒアルロニダーゼ阻害剤の開発が期待されている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、優れたヒアルロニダーゼ阻害活性を有し、しかも安全性に優れたヒアルロニダーゼ阻害剤を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決すべく、種々の天然物、特に植物抽出物を対象として検討を行った。
既に陸上植物については、飲用に供されている茶から抽出される茶ポリフェノール類（特開平６−９３９１号）、生薬又は飲食物として使用されているチンピ、キジツ、羅漢果の抽出物（特開平６−８０５７６号）、ブナ科の植物であるウラジロガシ抽出物（特開平６−２３９７５７号）、カシューナッツ殻油（特開平６−３２９５２６号）、ウルシ科植物抽出物（特開平７−１０７６５号）等からヒアルロニダーゼ阻害活性等をもつ物質が見い出されているが、本発明者らは、新たなヒアルロニダーゼ阻害剤を開発すべく、鋭意スクリーニングを行った結果、以下に示す海藻類の抽出物に目的のヒアルロニダーゼ阻害活性を見い出し、本発明を完成するに至ったのである。
【０００８】
すなわち、本発明のヒアルロニダーゼ阻害剤は、緑藻類のハネモ属、イワヅタ属、ミル属、褐藻類のマツモ属、オキナワモズク属、モズク属、レッソニア属、マクロシスティス属、ヒバマタ属、ダービリア属、紅藻類のアマノリ属、ヒラクサ属、オバクサ属、フノリ属、スギノリ属、イリダエ属（Ｉｒｉｄａｅａ属）、ツノマタ属、ダルス属、イギス属に属する海藻の抽出物を有効成分として含有することを特徴とする。
【０００９】
【作用】
本発明の海藻抽出物が、皮膚等に対して優れた老化防止効果等を発揮する機構については、抽出物中に含まれるヒアルロニダーゼ阻害活性物質が、皮膚細胞におけるヒアルロン酸の分解を抑制、そのレベルを維持することにより、皮膚の保湿性、柔軟性、弾力性の低下を抑え、顕著な皮膚老化防止効果等を示すものと推測される。
また、その優れたヒアルロニダーゼ阻害活性により、ヒアルロニダーゼに起因する炎症やアレルギーの予防、治療に有効となる。
【００１０】
以下に、本発明の内容を詳細に説明する。
本発明に用いられる海藻としては、例えば、緑藻類の、ハネモ属ではハネモ（Bryopsis plumosa）、イワヅタ属では、クビレヅタ（Caulerpa lentillifera）、ミル属ではミル（Codium fragile）、褐藻類の、マツモ属ではマツモ（Analipus japonicus）、オキナワモズク属ではオキナワモズク（Cladosiphon okamuranus）、モズク属ではモズク（Nemacystis decipiens）、レッソニア属ではLessonia nigrescens 、マクロシスティス属ではジャイアントケルプ（Macrocystis pyrifera）、ヒバマタ属ではヒバマタ（Fucus evanescens）、ダービリア属ではDurvillea antarctica、紅藻類の、アマノリ属ではアサクサノリ（Porphyra tenera）、スサビノリ（Porphyra yezoensis）、ヒラクサ属ではヒラクサ（Beckerella subcostata）、オバクサ属ではPterocladia tenuis、フノリ属ではフクロフノリ（Gloiopeltis furcata）、マフノリ（Gloiopeltis tenax）、スギノリ属ではGigartina chamissoi、イリダエ属（Ｉｒｉｄａｅａ属）ではIridaea pulchra、エゾツノマタ（別名クロハギンナンソウ）（Iridaea cornucopiae）、ツノマタ属ではトチャカ（Chondrus crispus）ツノマタ（Chondrus occellatus）、ダルス属ではダルス（Rhodymenia palmata）、イギス属ではアミクサ（Ceramium boydenii）などを挙げることができる。
【００１１】
本発明物質を抽出する方法は、特に制限はなく、通常の抽出法が採用され、水、親水性有機溶媒、その他の有機溶媒等よりなる群から選ばれる単独あるいは２種以上の任意の混合溶剤を使用して海藻から抽出される。
有機溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、酢酸エチル、アセトン、メチルエチルケトン、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、クロロホルム、ｎ−ヘキサン、ベンゼン等が挙げられる。
これらの中でも、特に、水または水とメタノール、エタノール、イソプロパノール等の低級アルコールとの混合物を用いて抽出することが好ましい。この場合の水と低級アルコールの比率は、水／低級アルコールが１００／０〜３０／７０（Ｖ／Ｖ、体積比）であることが好ましい。
海藻原体と抽出溶媒との比率は、海藻原体（乾燥物）／溶媒比が１／５０〜１／２の範囲が好ましい。
その他の抽出条件としては、抽出温度は特に制限はないが、好ましくは５〜８０℃の範囲で、１〜２４時間、撹拌しながら行うのが好ましい。抽出ｐＨは、極端な酸性、極端なアルカリ性に傾かなければ、特に制限はない。
【００１２】
この抽出液は、そのまま用いても、あるいは希釈液としたり、濃縮エキスとしてもよく、また凍結乾燥などにより乾燥粉末物としたり、ペースト状に調製してもよい。
乾燥粉末に調製した場合には、水または水を含むメタノール、エタノール、イソプロパノール等の低級アルコールに予め溶解して用いるか、あるいは後述の水を含む外用組成物中で可溶化して用いるのが好ましい。
【００１３】
本発明のヒアルロニダーゼ阻害剤の剤型としては、例えば、錠剤、カプセル剤、散剤、内服液、細粒剤等の内服剤とすることができ、また、リニメント剤、スプレー剤、ローション剤、軟膏等の外皮用とすることができる。
皮膚外用剤として用いる場合には、必須成分である海藻抽出物を任意の濃度で配合できるが、通常、各種皮膚外用剤中に０．０１〜３０重量％（以下、単に「％」という。）、好ましくは０．１〜１０％配合させるのがよい。
【００１４】
本発明の必須成分である海藻抽出物を配合した皮膚外用剤には、上記必須成分の他に、通常外用剤に用いられる原料、例えば、界面活性剤、油分、アルコール類、保湿剤、増粘剤、防腐剤、酸化防止剤、キレート剤、ｐＨ調整剤、香料、色素、紫外線吸収・散乱剤、ビタミン類、アミノ酸類、水等を配合することができる。
【００１５】
具体的には、界面活性剤としては、親油型グリセリンモノステアレート、自己乳化型グリセリンモノステアレート、ポリグリセリンモノステアレート、ソルビタンモノオレート、ポリエチレングリコールモノステアレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレート、ポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレン化ステロール、ポリオキシエチレン化ラノリン、ポリオキシエチレン化蜜ロウ、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油等のノニオン界面活性剤、ステアリン酸ナトリウム、パルミチン酸カリウム、セチル硫酸ナトリウム、ラウリルリン酸ナトリウム、パルミチン酸トリエタノールアミン、ポリオキシエチレンラウリルリン酸ナトリウム、Ｎ−アシルグルタミン酸ナトリウム等のアニオン界面活性剤、塩化ステアリルジメチルベンジルアンモニウム、塩化ステアリルトリメチルアンモニウム等のカチオン界面活性剤、塩酸アルキルアミノエチルグリシン液、レシチン等の両性界面活性剤等を例示することができる。
【００１６】
油分としては、ヒマシ油、オリーブ油、カカオ油、椿油、ヤシ油、木ロウ、ホホバ油、グレープシード油、アボガド油等の植物油脂類、ミンク油、卵黄油等の動物油脂類、蜜ロウ、鯨ロウ、ラノリン、カルナウバロウ、キャンデリラロウ等のロウ類、流動パラフィン、スクワラン、マイクロクリスタリンワックス、セレシンワックス、パラフィンワックス、ワセリン等の炭化水素類、ラウリン酸、ミリスチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、イソステアリン酸、ベヘニン酸等の天然および合成脂肪酸類、セタノール、ステアリルアルコール、ヘキシルデカノール、オクチルドデカノール、ラウリルアルコール等の天然および合成高級アルコール類、ミリスチン酸イソプロピル、パルミチン酸イソプロピル、ミリスチン酸オクチルドデシル、オレイン酸オクチルドデシル、コレステロールオレート等のエステル類等を例示することができる。
【００１７】
保湿剤としては、グリセリン、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ソルビトール、ポリグリセリン、ポリエチレングリコール、ジプロピレングリコール等の多価アルコール類、アミノ酸、乳酸ナトリウム、ピロリドンカルボン酸ナトリウム等のＮＭＦ成分、ヒアルロン酸、コラーゲン、ムコ多糖類、コンドロイチン硫酸等の水溶性高分子物質等を例示することができる。
【００１８】
増粘剤としては、アルギン酸ナトリウム、キサンタンガム、硅酸アルミニウム、マルメロ種子抽出物、トラガントガム、デンプン等の天然高分子物質、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、可溶性デンプン、カチオン化セルロース等の半合成高分子物質、カルボキシビニルポリマー、ポリビニルアルコール等の合成高分子物質等を例示することができる。
【００１９】
防腐剤としては、安息香酸塩、サリチル酸塩、ソルビン酸塩、デヒドロ酢酸塩、パラオキシ安息香酸エステル、２，４，４’−トリクロロ−２’−ヒドロキシジフェニルエーテル、３，４，４’−トリクロロカルバニリド、塩化ベンザルコニウム、ヒノキチオール、レゾルシン、エタノール等を例示することができる。
【００２０】
酸化防止剤としては、ジブチルヒドロキシトルエン、ブチルヒドロキシアニソール、没食子酸プロピル、アスコルビン酸等を、キレート剤としては、エデト酸二ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸塩、ピロリン酸塩、ヘキサメタリン酸塩、クエン酸、酒石酸、グルコン酸等を、ｐＨ調整剤としては、水酸化ナトリウム、トリエタノールアミン、クエン酸、クエン酸ナトリウム、ホウ酸、ホウ砂、リン酸水素カリウム等をそれぞれ例示することができる。
【００２１】
紫外線吸収・散乱剤としては、２−ヒドロキシ−４−メトキシベンゾフェノン、オクチルジメチルパラアミノベンゾエート、エチルヘキシルパラメトキシサイナメート、酸化チタン、カオリン、タルク等を例示することができる。
ビタミン類としては、ビタミンＡ、ビタミンＢ、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＦ、ビタミンＫ、ビタミンＰ、ビタミンＵ、カルニチン、フェルラ酸、γ−オリザノール、α−リポ酸、オロット酸およびそれらの誘導体等を例示することができる。
アミノ酸類としては、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、シスチン、システイン、メチオニン、プロリン、ヒドロキシプロリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、ヒスチジン、リジンおよびそれらの誘導体等を例示することができる。
【００２２】
なお、任意成分は、これらに限定されるものではない。上記必須成分と任意成分を適当に配合することにより、例えば、本発明の海藻抽出物０．０１〜３０％、任意成分として油分０〜８０％、界面活性剤０〜１２％、保湿剤１〜１５％、精製水バランス、防腐剤微量を含有する皮膚外用剤を提供することができる。具体的には、クリーム、乳液、化粧水、美容液、パック剤、アンダーメークアップ、ファンデーション、ゼリー剤、軟膏等の製品形態として用いることができる。
【００２３】
本発明のヒアルロニダーゼ阻害剤を皮膚化粧料として用いる場合の具体例を示すと以下の(1)〜(4)の通りである。
(1) 皮膚用クリームの場合
本発明の海藻抽出物０．１〜１０％、油分２０〜７０％、界面活性剤２〜７％、保湿剤１〜１０％、精製水バランス、防腐剤微量、香料微量を含有する皮膚用クリーム。
【００２４】
(2) 乳液の場合
本発明の海藻抽出物０．１〜１０％、油分１０〜４０％、アルコール類０〜１５％、界面活性剤１〜５％、保湿剤１〜１０％、増粘剤０〜２％、精製水バランス、防腐剤微量、香料微量を含有する乳液。
【００２５】
(3) 化粧水、美容液の場合
本発明の海藻抽出物０．１〜１０％、アルコール類５〜２０％、界面活性剤０〜２％、保湿剤２〜８％、増粘剤０〜２％、酸化防止剤０〜０．５％、キレート剤０〜０．１％、ｐＨ調整剤０〜０．２％、精製水バランス、防腐剤微量、色素０〜微量、香料微量を含有する化粧水、美容液。
【００２６】
(4) パック剤の場合
本発明の海藻抽出物０．１〜１０％、アルコール類２〜１０％、保湿剤２〜１０％、無機粉体０〜２０％、造膜剤１０〜２０％、精製水バランス、防腐剤微量、香料微量を含有するパック剤。
【００２７】
【実施例】
次に、実施例、試験例等により本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００２８】
製造例（海藻抽出物の製造）
マツモの乾燥物１００ｇを２０倍量の水にて３時間撹拌し、その上澄みを濃縮および凍結乾燥することにより、マツモ抽出物１６ｇを得た。また、同様にして、マツモ以外の海藻、すなわち、緑藻類のハネモ、クビレヅタ、ミル、ホソジュズモ、褐藻類のオキナワモズク、モズク、Ecklonia maxima、ジャイアントケルプ、Lessonia nigrescens 、ヒバマタ、Durvillea antarctica、シオミドロ、紅藻類のオゴノリ、アサクサノリ、スサビノリ、ヒラクサ、Pterocladia tenuis、フクロフノリ、マフノリ、Gigartina chamissoi、Iridaea pulchra、エゾツノマタ、トチャカ、ツノマタ、ダルス、カギノリ、アミクサについて、夫々の抽出物を得た。
さらに、他の溶媒、すなわち、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、酢酸エチル、アセトン、メチルエチルケトン、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、クロロホルム、ｎ−ヘキサン、ベンゼンについても、上記水と同様の方法で上記夫々の海藻類から抽出物を得た。
【００２９】
試験例１（ヒアルロニダーゼ阻害活性試験）
上記製造例で得た夫々の海藻抽出物（エキス試料）のヒアルロニダーゼ阻害活性の測定は、以下の方法で行った。
酵素（type IV−S from Bovine testis,SIGMA社製）溶液１００μｌ（1,580unit/ml）に上記製造例で得た夫々の海藻抽出エキス試料２００μｌを加えて、３７℃で２０分間放置した。次に、酵素活性化剤（Compound 48/80,SIGMA社製）溶液（0.1mg/ml）２００μｌを加え、３７℃で２０分間放置した後、基質であるヒアルロン酸カリウム（from rooster comb,和光純薬社製）溶液（0.4mg/ml）５００μｌを入れ、３７℃で４０分間放置した。
次いで、０．４Ｎ水酸化ナトリウム溶液２００μｌを加えて反応を停止させた後、Morgan-Elson法の変法（J. Biol. Chem.,217,959(1955)）で生成したＮ−アセチルヘキソサミン量を吸光度ＯＤ₅₈₅nmから求めた。
また、酵素反応には0.1mM 酢酸緩衝液(pH３.５）を用い、ヒアルロニダーゼ阻害活性は次式より求められる阻害率で算出した。
【００３０】
【数１】

【００３１】
上記製造例で得た夫々の海藻類の水抽出物（エキス試料）について、種々試料濃度での阻害率から５０％阻害濃度（ＩＣ₅₀）を算出した結果を下記表１に示す。数値が低い程、ヒアルロニダーゼ阻害活性が高いことを示す。
【００３２】
【表１】

【００３３】
（表１の考察）
上記表１に示した結果から明らかなように、本発明の海藻抽出物、すなわち、緑藻類のハネモ、クビレヅタ、ミル、褐藻類のマツモ、オキナワモズク、モズク、Ecklonia maxima、ジャイアントケルプ、Lessonia nigrescens 、ヒバマタ、Durvillea antarctica、紅藻類のアサクサノリ、スサビノリ、ヒラクサ、Pterocladia tenuis、フクロフノリ、マフノリ、Gigartina chamissoi、Iridaea pulchra、エゾツノマタ、トチャカ、ツノマタ、ダルス、アミクサの各抽出物は、ヒアルロニダーゼ阻害活性が知られているクロモグリク酸ナトリウム（対照）に匹敵する非常に高いヒアルロニダーゼ阻害活性を示すものが多く認められた。また、他の抽出溶媒から得られた抽出物も、水抽出物とほぼ同様の結果を示した。
特に、レッソニア属のLessonia nigrescens 、ダービリア属のDurvillea antarctica、フノリ属のマフノリ、Ｉｒｉｄａｅａ属のIridaea pulchra、エゾツノマタは、ヒアルロニダーゼ阻害活性が著しく高いことが判明した。
これに対し、同じ海藻抽出物であっても、本発明の範囲外となる海藻抽出物、すなわち、緑藻類のジュズモ属のホソジュズモ、褐藻類のシオミドロ属のシオミドロ、紅藻類のオゴノリ属のオゴノリ、カギノリ属のカギノリの夫々の抽出物は、ヒアルロニダーゼ阻害活性を示さなかった。
【００３４】
実施例１、比較例１（クリームの製造）
下記表２に示す成分１〜７および８〜１１を別々に混合溶解した後、成分８〜１１の溶液を撹拌しながら、ここに成分１〜７の溶液を添加し乳化させた後、冷却しながら途中で成分１２を加えて室温まで冷却し、下記表２に示すクリームを調製した。
なお、表中の数字は、配合量（重量％）を示し、ＰＯＥ（２０）は、ポリオキシエチレンとその付加モル数を示す（以下の実施例等においても同様）。また、比較例１は、成分８の本発明の海藻抽出物を配合しないでクリームを調製した場合である（以下の比較例２〜４においても海藻抽出物を配合しないで調製したものである）。
【００３５】
【表２】

【００３６】
実施例２、比較例２（化粧水の製造）
下記表３に示す成分１〜６を順次成分７に加えて溶解し、さらに成分８を加え下記表３に示す化粧水を調製した。
【００３７】
【表３】

【００３８】
実施例３、比較例３（美容液の製造）
下記表４に示す成分１〜４と成分５〜９を別々に溶解後、混合して美容液を調製した。
【００３９】
【表４】

【００４０】
実施例４、比較例４（乳液の製造）
下記表５に示す成分１〜７を７０℃で加熱溶解した。一方、成分８〜１３を７０℃で加熱溶解し、前記油脂溶液（成分１〜７）を添加し、乳化させた後、冷却しながら、途中で成分１４を加えて室温まで冷却し、下記表５に示す乳液を調製した。
【００４１】
【表５】

【００４２】
試験例２（使用テスト評価結果）
上記製造例で得た各海藻の水抽出物を含む上記実施例１〜４及び比較例１〜４のクリーム、化粧水、美容液、乳液の有効性を下記の使用テストにより評価した。
（使用テスト）
女性（３０〜５０才）５名づつに、１日２回（朝と夜）、連続３カ月間実施例１〜４と比較例１〜４をハーフ・フェイス法で左右顔面に別々に使用させた後、小皺（Ａ）および質〔艶（Ｂ）、潤い（Ｃ）〕についてアンケート調査を行った。
アンケート調査は、実施例（本発明品）が良い場合には○（改善効果あり）、実施例（本発明品）と比較例が変わらない場合には△、比較例が良い場合には×（改善効果なし）とした。
これらの使用テストの結果を下記表６に示す。
【００４３】
【表６】

【００４４】
（表６の考察）
上記表６に示す結果から明らかなように、本発明範囲の海藻の抽出物を配合した製剤（実施例）〔クリーム、化粧水、美容液、乳液〕は、小皺（Ａ）、艶（Ｂ）、潤い（Ｃ）の改善効果が認められた。この効果は、海藻抽出物中に含まれるヒアルロニダーゼ阻害活性物質が、皮膚細胞におけるヒアルロン酸の分解を抑制、そのレベルを維持することにより、皮膚の保湿性、柔軟性、弾力性の低下を抑え、顕著な皮膚細胞の賦活化及び皮膚老化防止効果等を図り、皺や肌荒れの発生を予防し、滑らかでしっとりとした若々しい肌を与えたものと推測される。
一方、同じ海藻抽出物であっても、本発明範囲外となる海藻の抽出物、すなわち、緑藻類のジュズモ属のホソジュズモ、褐藻類のシオミドロ属のシオミドロ、紅藻類のオゴノリ属のオゴノリ、カギノリ属のカギノリの夫々の抽出物を配合した製剤（比較例）〔クリーム、化粧水、美容液、乳液〕は、小皺（Ａ）、艶（Ｂ）、潤い（Ｃ）とも改善効果は認められなかった。
【００４５】
【発明の効果】
本発明によれば、ヒアルロン酸分解抑制作用により、皮膚細胞の賦活化、皮膚の老化防止が図られ、皺や肌荒れの発生を予防、滑らかでしっとりとした若々しい肌を与える効果が得られ、これを配合することにより、安全性の高い皮膚外用剤等に好適なヒアルロニダーゼ阻害剤が提供される。
また、本発明のヒアルロニダーゼ阻害剤は、関節の湿潤性を保ち、関節の治療剤等としても利用でき、また、抗炎症、抗アレルギー剤としても有用である。
さらに、本発明のヒアルロニダーゼ阻害剤は、古くから食用等に用いられる海藻類から抽出されるものであるため、人体への安全性が極めて高く、しかも、優れたヒアルロニダーゼ阻害活性を有することから医薬品、医薬部外品、化粧品等の各種用途に使用することができる。[0001]
[Industrial application fields]
The present invention relates to a hyaluronidase inhibitor comprising a highly safe seaweed extract having excellent hyaluronidase inhibitory activity.
[0002]
[Prior art]
Hyaluronidase is a hydrolase of hyaluronic acid and is widely distributed in animal tissues as well as skin. Hyaluronic acid, which is a substrate for this enzyme, is a kind of mucopolysaccharide that is abundant in tissues such as skin, ligament, joint fluid, and vitreous body of the eye. For example, in the skin, cell protection, nutrient transport, tissue It plays an important role in maintaining moisture, maintaining flexibility, etc., and as synovial fluid in maintaining tissue structure, function and maintaining lubricity.
[0003]
The amount of living hyaluronic acid in skin and joints is known to decrease with aging or pathological conditions, resulting in dry skin, rough skin, firmness, reduced elasticity, increased spots, wrinkles, or joints Causes joint pain, etc. due to deterioration of wettability.
In such a state, the hyaluronidase inhibitor is considered to contribute to the maintenance of the amount of biological hyaluronic acid by suppressing the degradation of hyaluronic acid.
Recently, hyaluronic acid-containing cosmetics are applied to the skin and hyaluronic acid is injected into the joints. Hyaluronidase inhibitors are also used to stabilize these exogenous hyaluronic acids. Can be used.
[0004]
In addition, hyaluronidase is activated during inflammation, destroying the matrix of connective tissue, infiltrating the tissues of inflammatory cells, enhancing vascular permeability, and the process of histamine release from mast cells in type I allergy It is known that there is a high possibility of intervening in
Therefore, the hyaluronidase inhibitory activity is not only involved in maintaining the hyaluronic acid level in the living body, but also shows a high correlation with anti-inflammatory and anti-allergic activities. In fact, hyaluronidase inhibitory activity has been observed in many of the anti-inflammatory agents and antiallergic agents developed so far, such as indomethacin, aspirin, sodium cromoglycate, and tranilast.
[0005]
From the above, development of a hyaluronidase inhibitor having excellent hyaluronidase inhibitory activity and high safety when applied to the human body such as skin is expected.
[0006]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a hyaluronidase inhibitor having excellent hyaluronidase inhibitory activity and excellent safety.
[0007]
[Means for Solving the Problems]
In order to solve the above-mentioned problems, the present inventors have studied various natural products, particularly plant extracts.
For land plants already, tea polyphenols extracted from tea for drinking (Japanese Patent Laid-Open No. 6-9391), extracts of chimpi, pheasant and rakan fruit used as herbal medicine or food and drink (Japanese Patent Laid-Open No. 6) No.-80576), Vulgaris extract which is a beech family plant (JP-A-6-239757), cashew nut shell oil (JP-A-6-329526), Urushiaceae plant extract (JP-A-7-10765), etc. Although substances having hyaluronidase inhibitory activity have been found, the present inventors conducted extensive screening to develop a new hyaluronidase inhibitor, and as a result, the following hyaluronidase inhibition was performed on the following seaweed extract. They found the activity and completed the present invention.
[0008]
That is, the hyaluronidase inhibitor of the present invention is a green algae of the genus Hanemo, Iwata, Mir, Brown algae Matsumo, Okinawa mozuku, Mozuku, Lessonia, Macrocystis, Hibamata, Davilia, Red algae It is characterized by containing as an active ingredient an extract of seaweeds belonging to the genus Amanori, Hiluxa, Obakusa, Funori, Suginori, Iridaae, Tsunogata, Darus and Igis.
[0009]
[Action]
Regarding the mechanism by which the seaweed extract of the present invention exhibits an excellent anti-aging effect on the skin and the like, the hyaluronidase inhibitory active substance contained in the extract suppresses the degradation of hyaluronic acid in skin cells, its level By maintaining the above, it is presumed that the skin moisturizing property, flexibility, and elasticity are prevented from being lowered and a remarkable skin aging preventing effect or the like is exhibited.
In addition, its superior hyaluronidase inhibitory activity is effective in preventing and treating inflammation and allergies caused by hyaluronidase.
[0010]
The contents of the present invention will be described in detail below.
Examples of the seaweed used in the present invention include, for example, the green algae of the genus Anemone (Bryopsis plumosa), the genus Iwata, the caulerpa lentillifera, the genus Mill (Codium fragile), the brown algae, the pine genus Matsumo. (Analipus japonicus), Okinawa mozuku (Cladosiphon okamuranus), Mozuku mosquito (Nemacystis decipiens), Lessonia genus Lessonia nigrescens, Macrocystis genus Giant kelp (Macrocystis pyrifera), Hibama cens uc ), Durvillea antarctica in the genus Davilia, red physae, Asperm (Porphyra tenera) in the genus Amanori, Porphyra yezoensis, Pterocladia tenuis in the genus Pterocladia tenuis, The mafnori (Gloiopel tis tenax), Gigartina chamissoi in the genus Suginori, Iridaea pulchra in the genus Iridaea, aka Iridaea cornucopiae, Chodrus crispus in the genus genus cc (Rhodymenia palmata), and the genus Igis can include amera (Ceramium boydenii).
[0011]
The method for extracting the substance of the present invention is not particularly limited, and a normal extraction method is adopted. The solvent is selected from the group consisting of water, hydrophilic organic solvents, other organic solvents and the like, or any two or more kinds of mixed solvents. Extracted from seaweed.
Examples of the organic solvent include methanol, ethanol, isopropanol, n-butanol, 1,3-butylene glycol, propylene glycol, ethyl acetate, acetone, methyl ethyl ketone, acetonitrile, dimethyl sulfoxide, dimethylformamide, chloroform, n-hexane, benzene and the like. Is mentioned.
Among these, it is particularly preferable to perform extraction using water or a mixture of water and a lower alcohol such as methanol, ethanol, or isopropanol. In this case, the ratio of water to lower alcohol is preferably 100/0 to 30/70 (V / V, volume ratio) of water / lower alcohol.
The ratio between the seaweed bulk and the extraction solvent is preferably such that the seaweed bulk (dry matter) / solvent ratio is 1/50 to 1/2.
As other extraction conditions, the extraction temperature is not particularly limited, but it is preferably performed in the range of 5 to 80 ° C. with stirring for 1 to 24 hours. The extraction pH is not particularly limited as long as it is not extremely acidic or extremely alkaline.
[0012]
This extract may be used as it is, or may be a diluted solution, a concentrated extract, a dry powder by freeze drying, or a paste.
When prepared as a dry powder, it is preferably used by dissolving in water or lower alcohol such as methanol, ethanol or isopropanol containing water in advance, or solubilizing in a composition for external use containing water described below. .
[0013]
Examples of the dosage form of the hyaluronidase inhibitor of the present invention include tablets, capsules, powders, oral liquids, fine granules and the like, and liniments, sprays, lotions, ointments and the like. Can be used for the outer skin.
When used as a skin external preparation, the seaweed extract, which is an essential component, can be blended at an arbitrary concentration, but usually 0.01 to 30% by weight (hereinafter simply referred to as “%”) in various skin external preparations. Preferably, 0.1 to 10% is added.
[0014]
In addition to the above essential components, the external preparation for skin containing the seaweed extract, which is an essential component of the present invention, is a raw material usually used for external preparations, for example, surfactants, oils, alcohols, humectants, thickening agents. Additives, preservatives, antioxidants, chelating agents, pH adjusters, fragrances, pigments, UV absorbers / scatterers, vitamins, amino acids, water, and the like can be added.
[0015]
Specifically, as the surfactant, lipophilic glycerin monostearate, self-emulsifying glycerin monostearate, polyglycerin monostearate, sorbitan monooleate, polyethylene glycol monostearate, polyoxyethylene sorbitan monooleate, Nonionic surfactants such as polyoxyethylene cetyl ether, polyoxyethylenated sterol, polyoxyethylenated lanolin, polyoxyethylenated beeswax, polyoxyethylene hydrogenated castor oil, sodium stearate, potassium palmitate, sodium cetyl sulfate, Anionic surfactants such as sodium lauryl phosphate, triethanolamine palmitate, sodium polyoxyethylene lauryl phosphate, sodium N-acyl glutamate, stearyl chloride Le benzyl ammonium cationic surfactants such as stearyltrimethylammonium chloride, may be exemplified hydrochloric alkylamino ethyl glycine solution, amphoteric surfactants such as lecithin.
[0016]
Oils include castor oil, olive oil, cacao oil, coconut oil, palm oil, tree wax, jojoba oil, grape seed oil, avocado oil and other animal oils such as mink oil and egg yolk oil, beeswax, whale Waxes such as wax, lanolin, carnauba wax and candelilla wax, hydrocarbons such as liquid paraffin, squalane, microcrystalline wax, ceresin wax, paraffin wax, petrolatum, lauric acid, myristic acid, stearic acid, oleic acid, isostearic acid Natural and synthetic fatty acids such as behenic acid, natural and synthetic higher alcohols such as cetanol, stearyl alcohol, hexyl decanol, octyldodecanol, lauryl alcohol, isopropyl myristate, isopropyl palmitate, octyldodecyl myristate, In octyldodecyl, it can be exemplified esters of cholesterol oleate, etc. and the like.
[0017]
Examples of humectants include polyhydric alcohols such as glycerin, propylene glycol, 1,3-butylene glycol, sorbitol, polyglycerin, polyethylene glycol and dipropylene glycol, amino acids, NMF components such as sodium lactate and sodium pyrrolidonecarboxylate, and hyaluron. Examples thereof include water-soluble polymer substances such as acid, collagen, mucopolysaccharide, and chondroitin sulfate.
[0018]
Thickeners include natural polymeric substances such as sodium alginate, xanthan gum, aluminum oxalate, quince seed extract, tragacanth gum, starch, semi-synthetic polymers such as methylcellulose, hydroxyethylcellulose, carboxymethylcellulose, soluble starch, and cationized cellulose. Examples include materials, synthetic polymer materials such as carboxyvinyl polymer and polyvinyl alcohol.
[0019]
Examples of preservatives include benzoate, salicylate, sorbate, dehydroacetate, p-hydroxybenzoate, 2,4,4′-trichloro-2′-hydroxydiphenyl ether, 3,4,4′-trichlorocarbani Lido, benzalkonium chloride, hinokitiol, resorcin, ethanol and the like can be exemplified.
[0020]
Dibutylhydroxytoluene, butylhydroxyanisole, propyl gallate, ascorbic acid, etc. as antioxidants, and disodium edetate, ethylenediaminetetraacetate, pyrophosphate, hexametaphosphate, citric acid, tartaric acid as chelating agents Examples of pH adjusters such as gluconic acid include sodium hydroxide, triethanolamine, citric acid, sodium citrate, boric acid, borax, and potassium hydrogen phosphate.
[0021]
Examples of the ultraviolet absorbing / scattering agent include 2-hydroxy-4-methoxybenzophenone, octyldimethylparaaminobenzoate, ethylhexylparamethoxycynamate, titanium oxide, kaolin, talc and the like.
As vitamins, vitamin A, vitamin B, vitamin C, vitamin D, vitamin E, vitamin F, vitamin K, vitamin P, vitamin U, carnitine, ferulic acid, γ-oryzanol, α-lipoic acid, orotic acid and the like And derivatives thereof.
As amino acids, glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, serine, threonine, phenylalanine, tyrosine, tryptophan, cystine, cysteine, methionine, proline, hydroxyproline, aspartic acid, glutamic acid, arginine, histidine, lysine and their derivatives Etc. can be illustrated.
[0022]
The optional component is not limited to these. By appropriately blending the above essential components and optional components, for example, the seaweed extract of the present invention 0.01 to 30%, oil components 0 to 80%, surfactants 0 to 12%, moisturizer 1 to An external preparation for skin containing 15%, purified water balance, and a small amount of antiseptic can be provided. Specifically, it can be used as a product form such as cream, milky lotion, skin lotion, cosmetic liquid, pack agent, under make-up, foundation, jelly agent, ointment and the like.
[0023]
Specific examples in the case of using the hyaluronidase inhibitor of the present invention as a skin cosmetic are as follows (1) to (4).
(1) In the case of skin cream, the seaweed extract of the present invention 0.1 to 10%, oil 20 to 70%, surfactant 2 to 7%, moisturizer 1 to 10%, purified water balance, preservative trace amount, Skin cream containing a small amount of fragrance.
[0024]
(2) In the case of emulsion, the seaweed extract of the present invention 0.1 to 10%, oil 10 to 40%, alcohols 0 to 15%, surfactant 1 to 5%, humectant 1 to 10%, thickener An emulsion containing 0-2%, purified water balance, preservative traces, fragrance traces.
[0025]
(3) In the case of lotion and serum, the seaweed extract of the present invention 0.1 to 10%, alcohols 5 to 20%, surfactant 0 to 2%, moisturizer 2 to 8%, thickener 0 to Contains 2%, antioxidant 0-0.5%, chelating agent 0-0.1%, pH adjuster 0-0.2%, purified water balance, preservative trace, dye 0 trace, fragrance trace. Lotion, essence.
[0026]
(4) In the case of a pack agent The seaweed extract 0.1 to 10% of the present invention, alcohols 2 to 10%, humectant 2 to 10%, inorganic powder 0 to 20%, film forming agent 10 to 20%, Packing agent containing purified water balance, preservatives and fragrances.
[0027]
【Example】
Next, the present invention will be specifically described with reference to examples and test examples, but the present invention is not limited to the following examples.
[0028]
Production example (production of seaweed extract)
100 g of dried matsumo was stirred with 20 times the amount of water for 3 hours, and the supernatant was concentrated and freeze-dried to obtain 16 g of matsumo extract. Similarly, seaweeds other than pineapples, namely, green alga honey, squirrels, mills, jujusmo, brown alga Okinawa, mozuku, Ecklonia maxima, giant kelp, Lessonia nigrescens, hibermata, Durvillea antarctica, red moss, red algae Extracts were obtained for each of Ogonori, Asakusanori, Susbinori, Hiraksa, Pterocladia tenuis, Ochlochori, Makhnori, Gigartina chamissoi, Iridaea pulchra, Ezotsunomata, Tochaka, Tsunomata, Durus, Kaginori and Amica.
In addition, other solvents such as methanol, ethanol, isopropanol, n-butanol, 1,3-butylene glycol, propylene glycol, ethyl acetate, acetone, methyl ethyl ketone, acetonitrile, dimethyl sulfoxide, dimethylformamide, chloroform, n-hexane, benzene Also for the above, extracts were obtained from the respective seaweeds in the same manner as the above water.
[0029]
Test Example 1 (hyaluronidase inhibitory activity test)
The hyaluronidase inhibitory activity of each seaweed extract (extract sample) obtained in the above production example was measured by the following method.
200 μl of each seaweed extract sample obtained in the above production example was added to 100 μl (1,580 units / ml) of an enzyme (type IV-S from Bovine testis, manufactured by SIGMA) solution, and the mixture was allowed to stand at 37 ° C. for 20 minutes. Next, 200 μl of enzyme activator (Compound 48/80, manufactured by SIGMA) solution (0.1 mg / ml) was added and allowed to stand at 37 ° C. for 20 minutes, and then the substrate was potassium hyaluronate (from rooster comb, Jun Wako). 500 μl of solution (0.4 mg / ml) was added and left at 37 ° C. for 40 minutes.
Next, 200 μl of 0.4N sodium hydroxide solution was added to stop the reaction, and the amount of N-acetylhexosamine produced by a modification of the Morgan-Elson method (J. Biol. Chem., 217, 959 (1955)) was measured as the absorbance. Obtained from OD ₅₈₅ nm.
In addition, 0.1 mM acetic acid buffer (pH 3.5) was used for the enzyme reaction, and the hyaluronidase inhibitory activity was calculated by the inhibition rate obtained from the following formula.
[0030]
[Expression 1]

[0031]
Table 1 below shows the results of calculating the 50% inhibition concentration (IC ₅₀ ) from the inhibition rates at various sample concentrations for each seaweed water extract (extract sample) obtained in the above production example. It shows that hyaluronidase inhibitory activity is so high that a numerical value is low.
[0032]
[Table 1]

[0033]
(Consideration of Table 1)
As is clear from the results shown in Table 1 above, the seaweed extract of the present invention, that is, the green alga honey, scallop, mill, brown algae pine, Okinawa mozuku, mozuku, Ecklonia maxima, giant kelp, Lessonia nigrescens, hibamata , Durvillea antarctica, red alga Asakusa Nori, Susabi Nori, Hiraksa, Pterocladia tenuis, Fukurofunori, Mafunori, Gigartina chamissoi, Iridaea pulchra, Ezotsuno Mata, Tochaka, Tsunogata, Darus, Amyxa Many of them showed very high hyaluronidase inhibitory activity comparable to sodium acid (control). In addition, the extracts obtained from other extraction solvents showed almost the same results as the water extract.
In particular, Lessonia nigrescens belonging to the genus Lessonia, Durvillea antarctica belonging to the genus Davilia, Mafunori belonging to the genus Funori, Iridaea pulchra belonging to the genus Iridaea, and Ezotsunomata were found to have extremely high hyaluronidase inhibitory activity.
In contrast, even for the same seaweed extract, the seaweed extract that is outside the scope of the present invention, i.e., the green alga Jujumo sp., The brown algae Shiomidomo, the red alga Ogonori, Each extract of the genus Kaginori showed no hyaluronidase inhibitory activity.
[0034]
Example 1, Comparative Example 1 (Production of cream)
Components 1 to 7 and 8 to 11 shown in Table 2 below were separately mixed and dissolved, and then the components 1 to 7 solution was added and emulsified while stirring the components 8 to 11, and then cooled. While adding the component 12, the solution was cooled to room temperature, and creams shown in Table 2 below were prepared.
In addition, the number in a table | surface shows compounding quantity (weight%) and POE (20) shows polyoxyethylene and its addition mole number (same also in a following example etc.). Moreover, the comparative example 1 is a case where a cream is prepared without blending the seaweed extract of the present invention as component 8 (also prepared without blending the seaweed extract in the following comparative examples 2 to 4). .
[0035]
[Table 2]

[0036]
Example 2, Comparative Example 2 (Manufacture of lotion)
Components 1 to 6 shown in Table 3 below were sequentially added to component 7 and dissolved, and further component 8 was added to prepare a lotion shown in Table 3 below.
[0037]
[Table 3]

[0038]
Example 3 and Comparative Example 3 (Manufacture of serum)
Components 1 to 4 and components 5 to 9 shown in Table 4 below were separately dissolved and then mixed to prepare a cosmetic liquid.
[0039]
[Table 4]

[0040]
Example 4, Comparative Example 4 (production of emulsion)
Components 1 to 7 shown in Table 5 below were dissolved by heating at 70 ° C. On the other hand, components 8 to 13 were heated and dissolved at 70 ° C., and the oil solution (components 1 to 7) was added and emulsified. Then, while cooling, component 14 was added on the way and cooled to room temperature. The emulsion shown in 5 was prepared.
[0041]
[Table 5]

[0042]
Test example 2 (use test evaluation result)
The effectiveness of the creams, lotions, serums, and emulsions of Examples 1 to 4 and Comparative Examples 1 to 4 including the water extract of each seaweed obtained in the above production example was evaluated by the following use test.
(Use test)
Five women (30 to 50 years old) are allowed to use Examples 1 to 4 and Comparative Examples 1 to 4 separately for the left and right faces twice a day (morning and evening) for 3 consecutive months for half a face. After that, a questionnaire survey was conducted on the small wrinkles (A) and the quality [gloss (B), moisture (C)].
Questionnaire surveys are: ○ (with improvement effect) when the example (invention product) is good, △ when the example (invention product) and the comparative example are not different, and × (when the comparison example is good) No improvement effect).
The results of these use tests are shown in Table 6 below.
[0043]
[Table 6]

[0044]
(Consideration of Table 6)
As is apparent from the results shown in Table 6 above, preparations (Examples) [creams, lotions, serums, emulsions] containing the extract of seaweed within the scope of the present invention are small wrinkles (A) and glosses (B). The improvement effect of moisture (C) was recognized. This effect is because the hyaluronidase inhibitory active substance contained in the seaweed extract suppresses the degradation of hyaluronic acid in skin cells and maintains its level, thereby suppressing the decrease in skin moisture retention, flexibility, elasticity, It is presumed that remarkable skin cell activation and skin aging preventive effects, etc., prevent wrinkles and rough skin, and give a smooth, moist and youthful skin.
On the other hand, even in the same seaweed extract, the seaweed extract that is outside the scope of the present invention, that is, the green alga Jujumo sp., The brown algae Shiomidro genus, the red algae Ogonori genus, Kagonori genus The preparation (comparative example) [cream, lotion, cosmetic liquid, milky lotion] containing each extract of Kaginori showed no improvement effect in any of small wrinkles (A), gloss (B), and moisture (C).
[0045]
【The invention's effect】
According to the present invention, the hyaluronic acid decomposition inhibitory action can activate skin cells and prevent skin aging, prevent the occurrence of wrinkles and rough skin, and provide an effect of giving a smooth, moist and youthful skin. By blending this, a hyaluronidase inhibitor suitable for a highly safe external preparation for skin and the like is provided.
The hyaluronidase inhibitor of the present invention maintains joint wettability and can be used as a therapeutic agent for joints, and is also useful as an anti-inflammatory and anti-allergic agent.
Furthermore, since the hyaluronidase inhibitor of the present invention is extracted from seaweed that has been used for food since ancient times, it is extremely safe to human body, and has excellent hyaluronidase inhibitory activity, It can be used for various applications such as quasi drugs and cosmetics.

Claims

Green algae Hanemo spp., Illus spp., Mill spp. A hyaluronidase inhibitor comprising, as an active ingredient, an extract of a seaweed belonging to the genus Funori, Suginotori, Iridae (Irideaa), Tsunomata, Darus, and Igis.