JP3759104B2

JP3759104B2 - 有機酸生産微生物およびこれを利用した有機酸調製方法

Info

Publication number: JP3759104B2
Application number: JP2002505962A
Authority: JP
Inventors: リー，サン−ユプ; チャン，ホー−ナム; リー，ピュン−チェオン; リー，ウー−ギ
Original assignee: Korea Advanced Institute of Science and Technology KAIST
Current assignee: Korea Advanced Institute of Science and Technology KAIST
Priority date: 2000-06-29
Filing date: 2001-06-29
Publication date: 2006-03-22
Anticipated expiration: 2021-06-29
Also published as: US20030113885A1; WO2002000846A9; JP2004501634A; WO2002000846A1; AU2001271085A1; US7063968B2; KR20020003712A; KR100372218B1

Description

【０００１】
技術分野
本発明は有機酸を生産することができる微生物および該微生物を利用した有機酸調製方法に関し、より詳細には、有機酸を生産できる新規微生物であるマンヘイミアエスピー５５Ｅ（Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａｓｐ．５５Ｅ）および該微生物を嫌気的または好気的条件下で培養することにより有機酸を生産する方法に関する。
【０００２】
背景技術
石油化学工業の発達のおかげで、大部分の化学物質が石油および天然ガスから生産されている。しかしながら、最近地球温暖化のような環境問題の台頭によって全世界的に化学物質の生産に対する規制が強化され、従来の化学物質生産工程に替わる工程の開発への要求が増加しつつある。
【０００３】
微生物培養技術および遺伝工学的技術の急速な発展によって、化学物質の生化学的生産が従来の石油化学的工程に対して競争的な地位を有するようになった。生化学的な方法は、安価で再生可能な資源を利用し、二酸化炭素（ＣＯ₂）のような地球温暖化を引き起こすガスの発生を抑制できるため、環境的に妥当で環境問題を解決可能であることが知られている。したがって、新規菌株の単離および工程改善によるコスト削減のための試みが生化学的分野に拡大しつつある。さらに、生化学的物質の市場価値が増大しており、微生物を利用したバイオマスからの生化学的物質の生産に関する研究が全世界的に活発に進んでいる。
【０００４】
詳細には、コスト競争力、並びに生分解性プラスチックモノマー、食品添加剤、および他の有機化合物の中間体としての多様な利用性のために、生化学的物質、特にコハク酸および乳酸に対する関心がますます増加しつつある。
【０００５】
コハク酸の生物学的生産に関する研究は、１９３８年Ｌｏｃｋｗｏｏｄがフザリウムマーティ（Ｆｕｓａｒｉｕｍｍａｒｔｉｉ）を利用して糖からコハク酸を１８％の収率で生産したことを発表したことにより始まった。スクシニビブリオデキストリノソルベンス（Ｓｕｃｃｉｎｉｖｉｂｒｉｏｄｅｘｔｒｉｎｏｓｏｌｖｅｎｓ）、フィブロバクタースクシノゲネス（Ｆｉｂｒｏｂａｃｔｅｒｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ）、およびラミノコッカスフラベファシエンス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓｆｌａｖｅｆａｃｉｅｎｓ）のような種々の嫌気性微生物の解糖によるコハク酸の生産が報告された（Ｚｅｉｋｕｓ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３４：４２３−４６４，１９８０）。過量の炭素存在下で葡萄糖から高い収率および濃度でコハク酸を生産できることが知られているアネアロバイオスピリルムスクシニシプロデュセンス（Ａｎａｅｒｏｂｉｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ）を除いては、工業用途のために高い収率でコハク酸を生産することができる微生物は開示されなかった（Ｄａｖｉｄｅｔａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，２６：４９８−５０４，１９７６）。アネアロバイオスピリルムスクシニシプロデュセンスは偏性嫌気性微生物であるため、微量の酸素の存在によっても、該微生物を用いるコハク酸生産のための安定な醗酵は確保されない。
【０００６】
微生物の醗酵を通じて有機酸を経済的に生産するためには、生産収率、醗酵条件などの様々な要素を慎重に考慮しなければならない。特に、有機酸を生産できる新規微生物の単離が他の考慮すべき要素よりも優先される。有機酸を生産するために現在入手可能な大部分の微生物は嫌気性微生物であり、したがって高価な培養設備が必要とされ、微量の酸素の存在により予期される醗酵失敗の可能性が大きい。したがって、酸素に対して耐性を有し、有機酸を高収率で生産できる微生物の開発が切実に要求されている。
【０００７】
このような、有機酸を高収率で生産できる酸素耐性微生物についての研究の結果、本発明者らは、ウシの胃液から新規な通性嫌気性生物であるマンヘイミアエスピー５５Ｅを分離し、該新規微生物が酸素に耐性で嫌気的および好気的条件において有機酸を生産できることを確認することに成功した。
【０００８】
発明の開示
本発明の第一の目的は、有機酸を生産できる新規微生物、マンヘイミアエスピー５５Ｅ（ＫＣＴＣ０７６９ＢＰ）を提供することである。
【０００９】
本発明の第二の目的は、前記微生物を用いて、嫌気的および好気的条件下で有機酸を生産する方法を提供することである。
【００１０】
発明を実施するための最良の態様
酸素に耐性で有機酸を高収率で生産できる新規微生物を単離するために、本発明者らは、牛の胃液から得た希釈試料を固形培地上に接種して単一コロニーを形成させ、過量の二酸化炭素（ＣＯ_２）を含有する増殖培地上で培養して、コハク酸を生産する能力を有する菌株を選別した。選別された菌株について１６ＳｒＤＮＡ分析を行い、以前から知られている菌株と相似性を有するかどうかを確認した。その結果、単離された菌株はマンヘイミアバリエナ（Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａｖａｒｉａｅｎａ）と９５％の相似性を有する新規微生物として同定され、マンヘイミアエスピー５５Ｅと命名した。マンヘイミアエスピー５５Ｅは２０００年４月１０日付で生命工学研究所（ＫＲＩＢＢ）内にある国際寄託機関（ＩＤＡ）である遺伝子銀行（ＫＣＴＣ、大韓民国大田広域市儒城区オウン洞５２）に寄託され、受託番号ＫＣＴＣ０７６９ＢＰを付与された。
【００１１】
本発明において同定されたマンヘイミアエスピー５５Ｅは通性嫌気性、グラム陰性、非運動性であり、桿状（ｒｏｄ）または球桿菌状（ｃｏｃｃｏｂａｃｉｌｌｉ）であり、内生胞子を形成せず、コハク酸、乳酸、酢酸、ギ酸などの有機酸を生産する能力を有する。マンヘイミアエスピー５５Ｅは３０〜５０℃の増殖温度範囲を有し、最適増殖温度は３９℃であり、６．０〜７．５のｐＨ範囲を有し、最適ｐＨは６．５である。
【００１２】
マンヘイミアエスピー５５Ｅを用いて有機酸を生産する方法は、嫌気的または好気的条件でマンヘイミアエスピー５５Ｅ（ＫＣＴＣ０７６９ＢＰ）を培養し、これより有機酸を収得することを含む。嫌気的条件は、二酸化炭素（ＣＯ₂）または窒素を０．１〜０．４ｖｖｍ、好ましくは０．２〜０．３ｖｖｍ、最も好ましくは０．２５ｖｖｍの流速で供給することにより作られる。好気的条件は、酸素（Ｏ₂）を０．５〜１．０ｖｖｍ、好ましくは０．７〜０．８ｖｖｍ、最も好ましくは０．７５ｖｖｍの流速で供給することにより作られる。
【００１３】
どのような培地も制限なくマンヘイミアエスピー５５Ｅの培養に使用可能であるが、好ましくは培地中の葡萄糖の含量が５〜６０ｇ／Ｌの範囲であり、最も好ましくは２０ｇ／Ｌである。培養は３５〜４５℃の温度で、好ましくは３８〜４１℃の温度で、最も好ましくは３９℃で、ｐＨ６．０〜７．５で、好ましくはｐＨ６．３〜６．７で、最も好ましくはｐＨ６．５で行われる。
【００１４】
嫌気的条件下では乳酸、クエン酸、コハク酸またはギ酸が生産される。コハク酸の収率を高めるためには二酸化炭素を、乳酸の収率を高めるためには窒素を使用して嫌気的条件を作り出すことが好ましい。好気的条件下では乳酸、クエン酸、またはギ酸が生産され、乳酸が最も高い収率を有する。
【００１５】
以下の実施例により本発明はより詳細に説明されるだろう。以下の実施例は例示の目的のためのものであり、本発明の範囲が限定されることは意図されていない。
【００１６】
実施例１：１６ＳｒＤＮＡ配列分析によるマンヘイミアエスピー５５Ｅの単離および同定
牛の第一胃液（ｒｕｍｅｎｆｌｕｉｄ）１ｍｌを１リットルあたり２０ｇの葡萄糖、５ｇのポリペプトン、５ｇの酵母抽出物、３ｇのＫ₂ＨＰＯ₄、１ｇのＮａＣｌ、５ｇの（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、０．２ｇのＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ、０．２ｇのＭｇＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏ、および５ｇのＮａ₂ＣＯ₃からなる培地で１００倍希釈し、次いで前記培地と同じ組成を有する１％アガロース固形培地に塗抹して１０時間培養した。培養物から単一コロニーを単離し、二酸化炭素で飽和された前記培地３ｍｌに移して１０時間培養した。培地中のコハク酸の収量は高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ、ＡｍｉｎｅｘＨＰＸ−８７Ｈカラム、Ｂｉｏ−Ｒａｄ、ＵＳＡ）で測定し、コハク酸を５０％以上の収率で生産する菌株を選別した。選別された菌株の生理的な特性の評価の結果、選別された菌株はグラム陰性であり、内生胞子を形成しないことが判明した。該菌株の増殖は３０〜５０℃の温度で観察され、最適の増殖温度は３９℃であり、６．０〜７．５のｐＨで観察され、最適の増殖ｐＨは６．５であった。
【００１７】
Ｒｏｃｈｅｌｌｅの方法（Ｒｏｃｈｅｌｌｅｅｔａｌ．，ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，１００：５９−６６，１９９２）を応用することにより、前記選別された菌株からゲノムＤＮＡを単離した。鋳型としての単離したゲノムＤＮＡ、プライマー１（５’−ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＭＴＧＧＣＴＣＡＧ−３’（配列番号１））およびプライマー２（５’−ＡＡＧＧＡＧＧＴＧＷＴＣＣＡＲＣＣ−３’（配列番号２））を使用してポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行い、１６ＳｒＤＮＡを増幅した。１６ＳｒＤＮＡの増幅産物の配列を同定し、ＤＮＡ配列分析プログラムであるＰＨＹＬＩＰ（ＰＨＹｌｏｇｅｎｙＩｎｆｅｒｅｎｃｅｐａｃｋａｇｅ，バージョン３．５ｃ）を利用して、１６ＳｒＤＮＡの、他の知られている菌株に対する相似性を分析した。表１は各種の相似性分析の結果を示し、図１は相似性分析により作成された進化系統樹である。
【００１８】
表１および図１に示されるように、単離された菌株はパスツレラ科（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｃｅａｅｆａｍｉｌｙ）のマンヘイミア属に属し、マンヘイミアバリエナと９５．１％の相似性を示す新規菌株であると判明し、マンヘイミアエスピー５５Ｅと命名した。マンヘイミアエスピー５５Ｅは２０００年４月１０日付で生命工学研究所（ＫＲＩＢＢ）内にある国際寄託機関（ＩＤＡ）である遺伝子銀行（ＫＣＴＣ、大韓民国大田広域市儒城区オウン洞５２）に寄託され、受託番号ＫＣＴＣ０７６９ＢＰを付与された。
【００１９】
【表１】

【００２０】
実施例２：マンヘイミアエスピー５５Ｅの特性
マンヘイミアエスピーの増殖に適切であるとして知られている血液寒天平板上で３９℃で２４時間、マンヘイミアエスピー５５Ｅを培養した。その結果、灰白色の滑らかな表面の１〜２ｍｍの直径を有するコロニーが観察された。走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を利用して、マンヘイミアエスピー５５Ｅの単細胞を観察した。図２に示されるように、マンヘイミアエスピー５５Ｅの細胞は、０．３〜０．５×１．０ミクロンの大きさを有する、桿状（ｒｏｄ）または球桿菌状（ｃｏｃｃｏｂａｃｉｌｌｉ）であることが分かる。
【００２１】
実施例３：二酸化炭素で飽和された嫌気的条件下でのマンヘイミアエスピー５５Ｅの醗酵特性
マンヘイミアエスピー５５Ｅの醗酵能を調べるために、二酸化炭素で飽和された嫌気的条件下で培養し、反応産物を分析した。
【００２２】
１リットルあたり２０ｇの葡萄糖、５ｇのポリペプトン、５ｇの酵母抽出物、３ｇのＫ₂ＨＰＯ₄、１ｇのＮａＣｌ、１ｇの（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、０．２ｇのＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ、０．２ｇのＭｇＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏ、および１０ｇのＭｇＣＯ₃からなる前培養培地１００ｍｌを調製し、該培地にＣＯ₂ガスを供給した。マンヘイミアエスピー５５Ｅを接種した後、３９℃で９時間前培養した。
【００２３】
１リットルあたり２０ｇの葡萄糖、５ｇのポリペプトン、５ｇの酵母抽出物、３ｇのＫ₂ＨＰＯ₄、１ｇのＮａＣｌ、１ｇの（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、０．２ｇのＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ、０．２ｇのＭｇＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏおよび１０ｇのＭｇＣＯ₃からなる本培養培地０．９ｍＬを２．５Ｌの培養槽に入れた。コハク酸生産微生物の前培養液１００ｍｌを本培養培地に移し、３９℃およびｐＨ６．５で、ＣＯ₂ガスを０．２５ｖｖｍの流速で供給しながら回分式培養を行った。培養中に１時間おきに培地を採取し、細胞濃度、並びにコハク酸、葡萄糖、酢酸、およびギ酸の量を分光光度計（Ｕｌｔｒａｓｐｅｃ３０００、ＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ．，Ｓｗｅｄｅｎ）により測定した。
【００２４】
図３は培養時間に対する細胞（●）、コハク酸（○）、葡萄糖（■）、乳酸（◇）、およびギ酸（□）の濃度変化を示すグラフである。図３に示されるように、７．５時間培養後、１９．８ｇ／Ｌの葡萄糖が消費され、１３．３ｇ／Ｌの乳酸が６７％の収率（消費された葡萄糖の量あたりの生成されたコハク酸の量）で生産されている。コハク酸の容積生産性（１時間あたりの生成されたコハク酸の量）は１．８ｇ／Ｌ／ｈである。
【００２５】
ＣＯ₂で飽和された嫌気的条件でマンヘイミアエスピー５５Ｅを用いるコハク酸の生産方法は、アネアロバイオスピリウムスクシニシプロデュセンス（ＡＴＣＣ２９３０５）を用いる従来の嫌気的なコハク酸生産方法（Ｌｅｅｅｔａｌ．，ＥｎｚｙｍｅＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，２４：５４９−５５４，１９９９）に比べ、収率ではやや劣るが、約８０％高い容積生産性を有している。
【００２６】
実施例４：Ｎ₂で飽和された嫌気的条件下でのマンヘイミアエスピー５５Ｅの醗酵特性
窒素で飽和された嫌気的条件下でのマンヘイミアエスピー５５Ｅの醗酵能を調べるために、窒素を０．２５ｖｖｍの流速で供給したことを除いては、実施例３においてと同じ方法で２２時間培養を行った。培養中、１時間おきに培地を採取し、実施例３においてと同じ方法により細胞濃度並びに乳酸、葡萄糖、ギ酸、酢酸、およびコハク酸の量を測定した。
【００２７】
図４は、培養時間に対する細胞（●）、コハク酸（○）、乳酸（◇）、葡萄糖（■）、ギ酸（□）、および酢酸（△）の濃度変化を示すグラフである。図４に示されるように、図３の結果とは異なり、本発明に係るマンヘイミアエスピー５５Ｅは、Ｎ₂で飽和された嫌気条件下では主生産物として乳酸を生産し、コハク酸は９％未満の低い収率で生産する。嫌気的醗酵中、１８ｇ／Ｌの葡萄糖が消費され、９．８ｇ／Ｌの乳酸が５４％の収率、０．４５ｇ／Ｌ／ｈの容積生産性で生産される。
【００２８】
この結果は、マンヘイミアエスピー５５Ｅはコハク酸を生産するためにＣＯ₂を必要とすることを示している。マンヘイミアエスピー５５Ｅは、コハク酸の生産において利用するために二酸化炭素を固定していると考えられる。
【００２９】
実施例５：Ｏ₂で飽和された好気的条件下でのマンヘイミアエスピー５５Ｅの醗酵特性
好気的条件下でのマンヘイミアエスピー５５Ｅの醗酵能を確認するために、酸素を０．７５ｖｖｍの流速で供給したことを除いては、実施例３においてと同じ方法で１４時間培養を行った。培養中、１時間おきに培地を採取し、実施例３においてと同じ方法で細胞濃度並びに乳酸、葡萄糖、および酢酸の量を測定した。
【００３０】
図５は、培養時間に対する細胞（●）、乳酸（◇）、葡萄糖（■）、および酢酸（△）の濃度変化を示すグラフである。図５に示されるように、本発明に係るマンヘイミアエスピー５５Ｅは、Ｏ₂好気的条件下での醗酵後、６６０ｎｍでの光学密度（ＯＤ）が１１にまで達する細胞濃度の増加を示す。この結果は、マンヘイミアエスピー５５Ｅは、酸素の存在により細胞増殖が影響を受けない通性嫌気性生物であることを示している。このマンヘイミアエスピー５５Ｅを用いた好気的醗酵は、コハク酸およびギ酸を全く生産せず、乳酸を主生産物として生産する。該好気的醗酵中、２２ｇ／Ｌの葡萄糖が消費され、９．８ｇ／Ｌの乳酸が４５％の収率、０．７ｇ／Ｌ／ｈの容積生産性で生産される。
【００３１】
上記の結果によって支持されるように、本発明に係るマンヘイミアエスピー５５Ｅは通性嫌気性生物であるため、ＣＯ₂嫌気的条件下でのコハク酸の生産のためには溶存酸素の除去が不要である。醗酵のために供給されるＣＯ₂の量が十分であれば、コハク酸の生産は酸素の存在により影響を受けないことが予想される。
産業上の利用可能性
本発明は、有機酸を生産できる新規微生物であるマンヘイミアエスピー５５Ｅ、および該新規微生物を用いて嫌気的および好気的醗酵により有機酸を生産する方法を提供する。上記のように、本発明に係るマンヘイミアエスピー５５Ｅは、ＣＯ₂嫌気的条件下ではコハク酸、乳酸、およびギ酸を生産し、好気的またはＮ₂嫌気的条件下ではコハク酸、乳酸、酢酸、およびギ酸を生産する。本発明に係るマンヘイミアエスピー５５Ｅは、酸素に耐性の通性嫌気性生物である。したがって、有機酸の生産においてマンヘイミアエスピー５５Ｅを利用することにより、偏性嫌気性生物を用いて有機酸を生産する従来の醗酵工程では酸素の存在により生じていた、工程の不安定性の問題を除去することができる。
【００３２】
本発明は、好ましい実施形態を参照して具体的に例示および記載されているが、添付の請求の範囲により定義される本発明の意図および範囲を逸脱せずに、形式および詳細において種々の変更がなされてもよいということは、当業者により理解されるだろう。

【００３３】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、マンヘイミアエスピー５５Ｅに対する１６ＳＲＮＡ分析により作成された進化系統樹である。
【図２】図２は、マンヘイミアエスピー５５Ｅの形態的特性を示す走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）写真である。
【図３】図３は、ＣＯ₂で飽和された嫌気的条件下でのマンヘイミアエスピー５５Ｅの醗酵特性を示すグラフである。
【図４】図４は、Ｎ₂で飽和された嫌気的条件下でのマンヘイミアエスピー５５Ｅの醗酵特性を示すグラフである。
【図５】図５は、好気的条件下でのマンヘイミアエスピー５５Ｅの醗酵特性を示すグラフである。

Claims

嫌気的および好気的条件下で有機酸を生産することができる、受託番号ＫＣＴＣ０７６９ＢＰのマンヘイミアエスピー５５Ｅ。
請求項１に記載の受託番号ＫＣＴＣ０７６９ＢＰのマンヘイミアエスピー５５Ｅを、二酸化炭素または窒素で飽和された嫌気的条件下で５〜６０ｇ／Ｌの葡萄糖を含有する培地中で培養すること；および
前記培地から有機酸を収得すること：
を含む有機酸の生産方法。
前記有機酸が、コハク酸、ギ酸、酢酸、および乳酸のうちの一つである、請求項２に記載の方法。
前記培養は、二酸化炭素または窒素を０．１〜０．４ｖｖｍの流速で供給しながら、３５〜４５℃の温度で６．０〜７．５のｐＨで行う、請求項２または３に記載の方法。
請求項１に記載の受託番号ＫＣＴＣ０７６９ＢＰのマンヘイミアエスピー５５Ｅを、５〜６０ｇ／Ｌの葡萄糖を含有する培地中で二酸化炭素を０．１〜０．４ｖｖｍの流速で供給しながら、３５〜４５℃の温度で６．０〜７．５のｐＨで培養すること；および
前記培地からコハク酸を収得すること：
を含むコハク酸の生産方法。
請求項１に記載の受託番号ＫＣＴＣ０７６９ＢＰのマンヘイミアエスピー５５Ｅを、５〜６０ｇ／Ｌの葡萄糖を含有する培地中で窒素を０．１〜０．４ｖｖｍの流速で供給しながら、３５〜４５℃の温度で６．０〜７．５のｐＨで培養すること；および
前記培地から乳酸を収得すること：
を含む乳酸の生産方法。
請求項１に記載の受託番号ＫＣＴＣ０７６９ＢＰのマンヘイミアエスピー５５Ｅを、好気的条件下で５〜６０ｇ／Ｌの葡萄糖を含有する培地中で培養すること；および
前記培地から有機酸を収得すること：
を含む有機酸の生産方法。
前記有機酸が乳酸および酢酸のうちの一つである、請求項７に記載の方法。
前記培養は、酸素を０．５〜１．０ｖｖｍの流速で供給しながら、３５〜４５℃の温度で６．０〜７．５のｐＨで行う、請求項７または８に記載の方法。
請求項１に記載の受託番号ＫＣＴＣ０７６９ＢＰのマンヘイミアエスピー５５Ｅを、５〜６０ｇ／Ｌの葡萄糖を含有する培地中で酸素を０．５〜１．０ｖｖｍの流速で供給しながら、３５〜４５℃の温度で６．０〜７．５のｐＨで培養すること；および
前記培地から乳酸を収得すること：
を含む乳酸の生産方法。