JP3756477B2 - デンドリマーによる核酸またはタンパク質の抽出方法およびデンドリマー組成物 - Google Patents
デンドリマーによる核酸またはタンパク質の抽出方法およびデンドリマー組成物 Download PDFInfo
- Publication number
- JP3756477B2 JP3756477B2 JP2002269867A JP2002269867A JP3756477B2 JP 3756477 B2 JP3756477 B2 JP 3756477B2 JP 2002269867 A JP2002269867 A JP 2002269867A JP 2002269867 A JP2002269867 A JP 2002269867A JP 3756477 B2 JP3756477 B2 JP 3756477B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- dendrimer
- protein
- nucleic acid
- magnetic material
- magnetic
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
- C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
- C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、核酸またはタンパク質を抽出する方法に関し、詳しくは、微粒子を用いたデンドリマーによって核酸またはタンパク質を抽出する方法および組成物に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
近年、DNA抽出の自動化は医療および実験現場で強く求められている。市販されている核酸またはタンパク質の抽出用の前処理装置としては、磁気ビーズ方式（磁気ビーズは、例えば非特許文献１参照。なお、磁気ビーズに限らず、磁性粒子、磁性体もある。磁性粒子については、例えば特許文献１参照。磁性体については、例えば特許文献２参照。）のものと遠心分離方式のものに大別される。
【０００３】
【非特許文献１】
松永是監修、「DNAチップ応用技術」、株式会社シーエムシー、２０００年７月発行、第７章 磁気ビーズ利用DNAチップ 竹山春子，松永是
【特許文献１】
特開平８−１７６２１２号公報
【特許文献２】
特開平１１−３１３６７０号公報
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
上記磁気ビーズ方式は、遠心分離方式に比べて小型であり利便性がある。しかし、磁気ビーズの表面に形成した、核酸またはタンパク質を絡めとるための突起構造物が疎であるため、核酸またはタンパク質を絡めとる割合が少なく収率においては必ずしも満足のいく結果が得られないという問題があった。
【０００５】
本発明の目的は、上記の課題を解決するもので、微粒子を内包したデンドリマーを構築し、核酸またはタンパク質を捕獲するためのアミノ末端基で被覆して、核酸またはタンパク質の回収率を大幅に増やすことのできる、デンドリマーによる核酸またはタンパク質の抽出方法およびデンドリマー組成物を実現することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
このような目的を達成するために、請求項１の発明では、
微粒子の表面に多層のデンドリマーを生成し、このデンドリマーの表面にアミノ基を生成して、このアミノ基により核酸またはタンパク質を抽出もしくは回収することを特徴とする。
微粒子の表面に複数世代のデンドリマーを生育させ、その表面にアミノ基を生成すると、核酸またはタンパク質を効率よく絡め取る能力がある。本発明はこの能力を巧みに用いた核酸またはタンパク質の抽出方法である。
【０００７】
この場合、微粒子としては、請求項２のように、バクテリア由来の磁性体、人工磁性体、金属、プラスチックビーズ、ガラスビーズ、ゲル状物質などの微粒子を用いることができる。また、前記デンドリマーは、請求項３のように微粒子の表面にシリル化剤やシランカップリング剤を用いてシラン処理を施した上に積層される。
また、デンドリマーは、請求項４のように２層以上であるのが望ましい。
【０００８】
また、請求項５のように、デンドリマー表面に抗体を結合し、抗原抗体反応によりタンパク質を抽出することもできる。
【０００９】
請求項６の発明は、微粒子と、この微粒子の表面に繰返し合成される多層のデンドリマーと、このデンドリマー表面を被覆するアミノ基から成り、このアミノ基により核酸またはタンパク質を捕捉することができるように構成されたことを特徴とする。
【００１０】
この場合、微粒子としては、請求項７のように、バクテリア由来の磁性体、人工磁性体、金属、プラスチックビーズ、ガラスビーズ、ゲル状物質などの微粒子を用いることができる。また、前記デンドリマーは、請求項８のように微粒子の表面にアミノシラン処理を施した上に積層する。また、デンドリマーは、請求項９のように２層以上であるのが望ましい。
また、請求項１０のように、デンドリマー表面に抗体を結合し、抗原抗体反応によりタンパク質を抽出することもできる。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明は、微粒子の表面にポリアミドアミンデンドリマーによる多重分岐修飾を合成させることにより、液体試料中から効率よく核酸またはタンパク質（以下DNAを例にとる）を抽出する方法およびデンドリマー組成物である。
なお、本発明における微粒子としては、バクテリア由来の磁性体、人工磁性体、金属、プラスチックビーズ、ガラスビーズ、ゲル状物質などの微粒子が使用可能である。ただし、本実施例においては説明を簡潔にするためその一例であるバクテリア由来の磁性体を例に採って説明する。
【００１２】
固相磁性体は細胞質の夾雑物からDNAを抽出する際に非常に有効な手段である。従来方法に比べ、磁性体による抽出方法は時間が短縮でき、試薬使用量も少なく、また分離する際に自動化し易い。磁性体としてバクテリア由来の磁性体を用いた場合、その磁性体は大きさが50-60nmの酸化鉄で構成され単磁区構造を有しており、DNA抽出に適した大きさである。
【００１３】
以下図面を用いて本発明の一実施例を詳しく説明する。本発明では、微粒子、例えば生物由来の磁性体、の表面にシリル化剤やシランカップリング剤を用いてシラン処理を施し、その上にアクリル酸メチルとエチレンジアミンの反応により生成するアミドアミンをデンドロユニットとして積層させることにより多重分岐ポリアミドアミンデンドリマーを得る。
図１はこのような方法により作成されるデンドリマーの概念的構成図である。
【００１４】
（１）図１に示す磁性体１として、例えばバクテリア由来の磁性体が用いられる。バクテリア由来の磁性体は、バクテリアの細胞に圧力を加えて破壊した後、磁石を用いて回収し、これに適宜の処理を施すことにより得ることができる。
【００１５】
さらに詳述すれば次の通りである。集めたバクテリアの細胞を1100ｋｇ/ｃｍ2の圧力で５段階のステップを経て破壊する。破壊した細胞に均一磁場（表面磁場は0.37T）を与えた後、Nd-B磁石（10ｍｍ×10ｍｍ×6ｍｍ）により磁性体を取り出す。集めた磁性体は、超音波洗浄による減菌処理を３回行い、その後バッファ液中に４゜Ｃで保存する。
【００１６】
磁性体濃度は乾燥時の重量により決定する。磁性体は超音波により拡散させ、事前に180゜Ｃで４時間乾燥させ重量を計測しておいた5mＬのチューブに0.5mＬづつ分注する。各分注磁性体は、超音波槽内で、クロロホルムとメタノールおよびヘキサンの1：1：1濃度溶液にて複数回洗浄する。
磁性体は磁気により溶液から分離し、溶剤を取り除く。収集した磁性体は、１５分間の真空乾燥により残存溶媒を取り除いた後、180゜Ｃで4時間乾燥させる。
【００１７】
（２）以上のようにして得られたバクテリア由来の磁性体の表面にシラン修飾を施す。磁性体溶液は全体で100mg/mLの濃度になるよう分注し、その後Nd-B磁石により磁性体を回収し、溶液を取り除く。磁性体は磁気により分離し、溶媒を取り除く。収集されたバクテリア由来の磁性体は真空中で15分間乾燥させ、残存溶媒を取り除いた後、元の溶液量と同量の99％エタノールの中に浮遊させておく。
【００１８】
アミノシラン重合（AEEAという）は、99％エタノール中で1mM酢酸1％溶液により加水分解させたのち、生体由来の磁性体表面に直接共有結合させている。そして、磁性体を超音波槽内で軽く拡散させたのち、20mLのメタノールで3回洗浄し、元の分量で再浮遊させておいた。
【００１９】
（３）次に、以上のようにアミノシラン処理を施した磁性体表面に、多重分岐ポリアミドアミンデンドリマーを積層させる。
デンドリマー合成は、AEEA被覆された50mgのバクテリア由来の磁性体から始める（なお、比較のために、20mLのメチルアクリレート中の50mgの人工磁性体からも始めた）。
【００２０】
懸濁状態を分散させるため、密閉されたロータリーエバポレーターを用いてナスフラスコを超音波水槽内で25℃、３時間浸ける。
磁性体を磁気により収集し、メタノールで洗浄する。洗浄後、4mLのメタノールとエチレンジアミンの1：1で反応させ、生成アミドアミンをデンドロユニットとして重合させる。以後同じ状態を保ちながら進める。
【００２１】
メチルアクリレートとエチレンジアミンの繰返し反応により重合を進行し、目的とする世代まで行う（図1は２層までを示す）。
その後磁性体は25mLのメタノールにて３回洗浄し、次に25mLの水で洗浄する。なお、洗浄から洗浄の間は磁気により収集する。
【００２２】
（４）次に、表面アミンを決定する。
修飾された磁性体１（250μg）を超音波槽内で200μL10mM、スルホスクシンイミジル6-[3'(2-ピリジルジチオ)-プロピオンアミド]ヘキサノエート（sulfo-LC-SPDP）溶液中に30分間浸し、成長伸長させる。処理された磁性体を蒸留水にて3回洗浄し、磁性体を磁気により収集する。
【００２３】
磁性体とsulfo-LC-SPDPの重合体は200μL 20mM ジチオスレイトール（dithiothreitol）の中で成長反応した後、スペクトラム分光器の波長343nmにより、量的にも計測を行なう。データは修飾していない磁性体と性能比較し、濃度決定に関しては5mMのsulfo-LC-SPDPと20mM dithiothreitolによって得られる標準カーブに基づいて決定する。
【００２４】
このようにして修飾された磁性体（AEEA200μgを第３世代のデンドリマーと、AEEA100μgを第5、第6世代のデンドリマー）を、子牛の胸腺のDNA25μgと混合し、20mMのトリス塩酸緩衝液（Tris-HCl）（pH7.0）中で1mLとなるようにし、上下に反転させた後、6000 rpmのマイクロ遠心を掛けてみると、次のような結果が得られた。
【００２５】
上澄みの吸光度は260nmで観測され、DNAの濃度はcalf thymus DNAの標準カーブから算定された。DNAは1mL2MのNaCl中で激しく攪拌することにより磁性体より剥離できた。DNAの存在はエタノール沈澱後アガロースゲル電気泳動により、確認することができた。
なお、本発明は、ルシフェラーゼ遺伝子が含まれる4.8kbp pGEM-Tプラスミドの抽出にも適用可能である。
【００２６】
また、直接PCR分析のための大腸菌および全血からのDNA抽出も試みた。pGEM-Tプラスミドにルシフェラーゼ遺伝子を挿入した大腸菌を、50μgアンピシリンを含む培養液中で細胞濃度106／mLに達するまで培養した。細胞は遠心分離により単離した。
【００２７】
細胞を、75μgのプロテナーゼKを含む10％Triton-X溶媒中に、50゜Ｃで30分間浸けておくことにより溶解させる。溶解物に対し、第6世代まで成長させたバクテリア磁性体100μgを加え、手早くチューブを攪拌する。磁性体は磁気により集められ、上澄液は取り除かれる。
【００２８】
磁性体は20mMのTris-HCl(pH7.0)により6回洗浄し、毎回チューブを上下に振り浮遊物を磁気により集める。DNAは1mL2MのNaCl中で十分攪拌し、磁性体から剥離させる。磁性体はマイクロ遠心器にて6000 rpmで遠心分離する。
【００２９】
剥離したDNAは吸光分光光度計にて測定し、2M NaCl中でのDNA溶液の標準検定曲線と比較した。260：280という比率を分光光度計にて決定する。一方で同様の抽出を行ったロット分について、PCR増幅用として、磁性体からDNAの剥離は行わず、そのまま100μL 蒸留水（Mill-Q）水中に浮遊させた。そして、磁性体に超音波をかけながらMill-Q水にて希釈し、プラスミドをPCR増幅した。
【００３０】
順方向プライマーとしては、配列番号１に示す
5'GGGATGCATATGGAAGACGCCAAAAACATA3'
を用い、逆方向プライマーとしては、配列番号２に示す
5'GGGATGCATACTTGATTACAATTTGGACTTTCC3'
を使用し、プラスミド中で発見された1.65kbpのルシフェラーゼ遺伝子を増幅した。
【００３１】
PCR産物はゲル電気泳動にて可視化できる。ヒト全血1μLから抽出したDNAについても、同様のPCRによる手順に従って分析した。サンプルは新規のものを使用し、凝固防止剤は使用しなかった。
【００３２】
全血のPCRに用いた順方向プライマーとしては、配列番号３に示す
5'GGCCTCCCACACCAG3'
を使用し、逆方向プライマーとしては、配列番号４に示す
5'GCGGGCCAGGCGTCAGCACCAGTA3'
を使用した。
【００３３】
以上の点をまとめると、次の通りである。
バクテリア由来磁性体表面のアミン数は、デンドリマー層の数が1から6に増えるに連れて増えた。アミン数は、図１に示すように、理論的にはスタートラインのアミノシラン層から世代数が増えるに従い2倍づつ増えることになる。
【００３４】
表１は各世代でのバクテリア由来磁性体（BMP）のアミン数を表わす。表１に示すように、各層でアミンが倍化するということは、デンドリマーが理想的なカスケード構造を保っていることを意味している。バクテリア由来磁性体１個の表面積は、50×50×100ｎｍの矩形と仮定すると、2.5×104ｎｍ2である。第6世代表面ではアミン数が1.7×106であったので、68アミン／ｎｍ2という数字が得られた。
【００３５】
表１
【００３６】
図２はバクテリア由来磁性体の修飾していないものと、修飾したものとの電子顕微鏡写真である。図２（ａ）に示すように、修飾していない磁性体は相互の斥力が弱く、凝集しているのが分かる。第３世代のデンドリマーは同図（ｂ）に示すように鎖状に連なり、部分的に凝集している。第６世代のデンドリマーは、同図（ｃ）のように明らかに分散している。そして図２（ｄ）に示すように、磁性体表面を被覆している約4nmの層が観察された。
【００３７】
デンドリマーで修飾されたバクテリア由来磁性体は超音波を掛けた後でも極端な劣化は認められなかった。そして、非常によく分散していて、大きな凝集を作ることも無く、超音波を当てなくても十分良く分散浮遊した。
【００３８】
一方、人工磁性体では、表２に示すように、世代数の増大と共に、超音波を当てた際徐々に破砕され易くなることが確認できた。表２は、生成された磁性体のサイズと分布の表である。
第6世代まで人工磁性体をデンドリマー伸長させた場合、約14ｎｍの多量の断片が溶液中に拡散されていた。さらに、サイズが小さくなったことと、構造が不完全になったことで凝集は大幅に減り、常磁性体の断片が生じた。
【００３９】
表２
【００４０】
バクテリア由来の磁性体に連続的にデンドリマーを生育させていくと、表３に示すようにDNAを効率よく絡めとる能力があることが分かった。この場合、修飾した磁性体を25μgのcalf thymus DNAに混ぜた。デンドリマーを第６世代まで伸長させた磁性体には過剰濃度のDNA（50μg）に混ぜた。
【００４１】
表３
【００４２】
デンドリマー修飾した磁性体では、デンドリマー層が増えるに従い、DNAを絡めとる量が増え、第6世代では100μgの磁性体当たり24.83±1.61μgのDNAを絡めとることができた。
【００４３】
なお、人工磁性体では、第０世代であるAEEA層の回収量とデンドリマー伸長層とでDNAを絡めとる量は変わらない。これは超音波により、磁性体にひび、破砕等の劣化が生じたためと考えられる。
【００４４】
第６世代までデンドリマー修飾したバクテリア由来の磁性体において、2MのNaClを加えただけではDNA回収は十分ではなく、24％しか回収できなかった（表４参照）。回収率を上げるために、DNA重合体を50℃で30分間恒温槽内で保持したことにより、回収率は87％にまで上昇した（21.7±1.59μg）。
【００４５】
表４
【００４６】
小さなDNA断片の捕捉能力についても検討した。ルシフェラーゼ遺伝子を含むプラスミドpGEM-Tを抽出し、大体3kbpと1.6kbpの2種類の産物を作成した。プラスミドDNAの捕捉・回収量は各々23.80±3.01および19.22±1.61μgであった。この結果をゲル電気泳動で調べた結果、サイズの違いによる差異は認められなかった。図３（ａ）に示すように、回収されたDNAは事前に磁気回収されたDNAと一致した。
【００４７】
大腸菌から抽出したDNA量の測定は、2M NaClを用いて磁性体から剥離回収した後に行った。回収したDNAは、RNA分解酵素（RNase）で処理した後測定した結果、第６世代デンドリマー修飾磁性体100μg当たり30.25±7.74μg回収できた。
260：280ｎｍの比は1.92であり、多少のプロテインが混入を起こしていることを示している。前述のゲル電気泳動の結果も、多少のRNA汚染を起こしていることを示している。
【００４８】
この結果、次に細胞溶解後、3μLのRＮaseを加え、37゜Ｃ、20分インキュベーションした後測定すると、DNAの回収率は22.35±1.76μgまで減少した。PCRは、磁性体およびDNAの複合体を事前に塩もしくはRＮaseでの溶解処理を行わず、サンプルを100−1000倍の希釈率で、直接行った［図３（ｂ）参照］。
同様に、ヒト全血から抽出したDNAについても同じプロセスで、10−100倍の希釈率で、直接PCRを行うことができた。
【００４９】
このような結果に基づき次のように結言できる。
アミノシランがデンドリマー成長の重合開始剤としてバクテリア由来の磁性体に共有結合することによりデンドリマー修飾が層状に伸長できること、および磁性細菌AMB-1から得られたバクテリア由来磁性体にアミノシランの共役結合を用い安定的な架橋が形成できるということは周知である。
【００５０】
バクテリア由来の磁性体上にデンドリマーがうまく形成されていることは、表面上のアミン基の数を調べればよい。表面上のアミン基の数は第６世代まで各世代毎に直線的に倍増することが認められた。しかし、第6世代以降は正確にアミン基の数は数えられなかった。
【００５１】
何故ならば、大きな環状のsulfo-LC-SPDPヘキサマーが立体障害となるためと見られる。そして以前より、世代が増えれば、それだけインキュベーションのための時間を多くとる必要があることが分かっていた。
【００５２】
これは、分子が成長する際の立体障害を避けるために、時間を掛けて成長する必要があると考えられていた。第5世代から第6世代へ伸長させる際、試薬を投入しそれ以上アミン基が増えないことを確認できるまでには、インキュベーション時間を6時間まで延長する必要があった。
【００５３】
したがって、第6世代を超えてさらに世代を重ねることは可能ではあろうが、物理的には容易に決められない。さらに、TEM画像から類推すると、世代が増えるとイオン間の斥力が増す。第1世代だけであればバクテリア由来の磁性体は硬く凝集する。第3世代まであると、バクテリア由来の磁性体はチェーンのように列を作る。この現象は、図４に示すように磁力の強弱は磁極方向の磁束密度に比例することからも示唆される。
【００５４】
イオン斥力の存在は磁性体の局配列を減殺する方向となる。これは、バクテリア由来の磁性体が生体膜で覆われているケースでも同じである。すなわち、第6世代のデンドリマーの斥力は非常に大きく、磁力を上回ることになり、凝集せず実際に個々が浮遊することになる。
【００５５】
人工的に磁性体を合成することは可能であるが、形が揃わず、結晶化も十分でなく、構造上も均一でないので、物性としての動特性や化学動態が一定でない。もし、人工磁性体を用いて、バクテリア由来の磁性体と同じ大きさのデンドリマーを作成した場合、人工磁性体重合物には凝集や破砕が起き、表面上のアミン基の増加はリニアとはならなくなる。
生体由来の磁性体は結晶化しているので、デンドリマー生成過程においても欠損することなく、オリジナルの形状及び磁気を保持している。
【００５６】
デンドリマー修飾した生体由来の磁性体は、修飾していない磁性体に比べDNAの回収率が大幅に増える。DNAは磁性体の表面を覆う強固なシランカチオンの規則正しい構造の中に凝縮され、デンドリマーとの相互作用により同じような形体をとる。デンドリマー修飾した生体由来の磁性体により増加した陽イオンは負に帯電されているDNAを絡めとる力を増加するのに大いに役立っている。陽イオン試薬を追加するとDNAの濃度が上がることからも分かる。
【００５７】
しかし、陽イオン試薬を追加することは不要なコンタミネーションを惹起することにもなりかねない。デンドリマー修飾した生体由来磁性体を用いれば、陽イオン試薬を追加することなくDNA回収率を上げることができる。さらに、周知のように、表面上のアミノ基の数を調節することにより、溶液中の分散度や複合濃度を制御することができる。
【００５８】
本発明のように磁性体を使うことは、従来法に比べ処理時間の面、試薬使用量の面、分離回収の面そして自動化の容易さにおいて優っている。プロセスは洗浄工程の前に溶解工程が求められるだけで、極めてシンプルである。さらに、PCRを少ないサンプル量から行わなければならないという制限がある場合、少量のサンプルから十分なDNAを抽出するのに最適な方法であり、この方法は小型化にも応用できる。
【００５９】
なお、本発明は、上記実施例に限定されることなく、その本質から逸脱しない範囲で更に多くの変更、変形をも含むものである。
【００６０】
例えば、デンドリマー表面に抗体を結合し、抗原抗体反応によりタンパク質を抽出することも可能である。
【００６１】
【発明の効果】
以上説明したように本発明によれば次のような効果がある。
（１）生体由来の微粒子の表面にデンドリマーを多重分岐し、アミノ末端基で被覆することにより、容易に核酸あるいはタンパク質の抽出率を増やすことができる。
（２）微粒子を包含するデンドリマーを用いることは、処理時間の面、試薬使用量の面、分離回収の面そして自動化の容易さにおいて従来の磁気ビーズ法より優る。
【００６２】
（３）微粒子表面にデンドリマー修飾をするときは凝集しないように強力な超音波をかけて十分拡散させておく必要があるが、微粒子として生体由来の磁性体を用いた場合は超音波によりクラッキングを起こすこともなく容易に十分なデンドリマーを形成することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明におけるデンドリマーの概念的構成図である。
【図２】バクテリア由来磁性体の電子顕微鏡写真である。
【図３】 DNAの電気泳動結果を示す図である。
【図４】バクテリア磁性体の磁界を説明する図である。
【符号の説明】
１ 磁性体
【発明の属する技術分野】
本発明は、核酸またはタンパク質を抽出する方法に関し、詳しくは、微粒子を用いたデンドリマーによって核酸またはタンパク質を抽出する方法および組成物に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
近年、DNA抽出の自動化は医療および実験現場で強く求められている。市販されている核酸またはタンパク質の抽出用の前処理装置としては、磁気ビーズ方式（磁気ビーズは、例えば非特許文献１参照。なお、磁気ビーズに限らず、磁性粒子、磁性体もある。磁性粒子については、例えば特許文献１参照。磁性体については、例えば特許文献２参照。）のものと遠心分離方式のものに大別される。
【０００３】
【非特許文献１】
松永是監修、「DNAチップ応用技術」、株式会社シーエムシー、２０００年７月発行、第７章 磁気ビーズ利用DNAチップ 竹山春子，松永是
【特許文献１】
特開平８−１７６２１２号公報
【特許文献２】
特開平１１−３１３６７０号公報
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
上記磁気ビーズ方式は、遠心分離方式に比べて小型であり利便性がある。しかし、磁気ビーズの表面に形成した、核酸またはタンパク質を絡めとるための突起構造物が疎であるため、核酸またはタンパク質を絡めとる割合が少なく収率においては必ずしも満足のいく結果が得られないという問題があった。
【０００５】
本発明の目的は、上記の課題を解決するもので、微粒子を内包したデンドリマーを構築し、核酸またはタンパク質を捕獲するためのアミノ末端基で被覆して、核酸またはタンパク質の回収率を大幅に増やすことのできる、デンドリマーによる核酸またはタンパク質の抽出方法およびデンドリマー組成物を実現することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
このような目的を達成するために、請求項１の発明では、
微粒子の表面に多層のデンドリマーを生成し、このデンドリマーの表面にアミノ基を生成して、このアミノ基により核酸またはタンパク質を抽出もしくは回収することを特徴とする。
微粒子の表面に複数世代のデンドリマーを生育させ、その表面にアミノ基を生成すると、核酸またはタンパク質を効率よく絡め取る能力がある。本発明はこの能力を巧みに用いた核酸またはタンパク質の抽出方法である。
【０００７】
この場合、微粒子としては、請求項２のように、バクテリア由来の磁性体、人工磁性体、金属、プラスチックビーズ、ガラスビーズ、ゲル状物質などの微粒子を用いることができる。また、前記デンドリマーは、請求項３のように微粒子の表面にシリル化剤やシランカップリング剤を用いてシラン処理を施した上に積層される。
また、デンドリマーは、請求項４のように２層以上であるのが望ましい。
【０００８】
また、請求項５のように、デンドリマー表面に抗体を結合し、抗原抗体反応によりタンパク質を抽出することもできる。
【０００９】
請求項６の発明は、微粒子と、この微粒子の表面に繰返し合成される多層のデンドリマーと、このデンドリマー表面を被覆するアミノ基から成り、このアミノ基により核酸またはタンパク質を捕捉することができるように構成されたことを特徴とする。
【００１０】
この場合、微粒子としては、請求項７のように、バクテリア由来の磁性体、人工磁性体、金属、プラスチックビーズ、ガラスビーズ、ゲル状物質などの微粒子を用いることができる。また、前記デンドリマーは、請求項８のように微粒子の表面にアミノシラン処理を施した上に積層する。また、デンドリマーは、請求項９のように２層以上であるのが望ましい。
また、請求項１０のように、デンドリマー表面に抗体を結合し、抗原抗体反応によりタンパク質を抽出することもできる。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明は、微粒子の表面にポリアミドアミンデンドリマーによる多重分岐修飾を合成させることにより、液体試料中から効率よく核酸またはタンパク質（以下DNAを例にとる）を抽出する方法およびデンドリマー組成物である。
なお、本発明における微粒子としては、バクテリア由来の磁性体、人工磁性体、金属、プラスチックビーズ、ガラスビーズ、ゲル状物質などの微粒子が使用可能である。ただし、本実施例においては説明を簡潔にするためその一例であるバクテリア由来の磁性体を例に採って説明する。
【００１２】
固相磁性体は細胞質の夾雑物からDNAを抽出する際に非常に有効な手段である。従来方法に比べ、磁性体による抽出方法は時間が短縮でき、試薬使用量も少なく、また分離する際に自動化し易い。磁性体としてバクテリア由来の磁性体を用いた場合、その磁性体は大きさが50-60nmの酸化鉄で構成され単磁区構造を有しており、DNA抽出に適した大きさである。
【００１３】
以下図面を用いて本発明の一実施例を詳しく説明する。本発明では、微粒子、例えば生物由来の磁性体、の表面にシリル化剤やシランカップリング剤を用いてシラン処理を施し、その上にアクリル酸メチルとエチレンジアミンの反応により生成するアミドアミンをデンドロユニットとして積層させることにより多重分岐ポリアミドアミンデンドリマーを得る。
図１はこのような方法により作成されるデンドリマーの概念的構成図である。
【００１４】
（１）図１に示す磁性体１として、例えばバクテリア由来の磁性体が用いられる。バクテリア由来の磁性体は、バクテリアの細胞に圧力を加えて破壊した後、磁石を用いて回収し、これに適宜の処理を施すことにより得ることができる。
【００１５】
さらに詳述すれば次の通りである。集めたバクテリアの細胞を1100ｋｇ/ｃｍ2の圧力で５段階のステップを経て破壊する。破壊した細胞に均一磁場（表面磁場は0.37T）を与えた後、Nd-B磁石（10ｍｍ×10ｍｍ×6ｍｍ）により磁性体を取り出す。集めた磁性体は、超音波洗浄による減菌処理を３回行い、その後バッファ液中に４゜Ｃで保存する。
【００１６】
磁性体濃度は乾燥時の重量により決定する。磁性体は超音波により拡散させ、事前に180゜Ｃで４時間乾燥させ重量を計測しておいた5mＬのチューブに0.5mＬづつ分注する。各分注磁性体は、超音波槽内で、クロロホルムとメタノールおよびヘキサンの1：1：1濃度溶液にて複数回洗浄する。
磁性体は磁気により溶液から分離し、溶剤を取り除く。収集した磁性体は、１５分間の真空乾燥により残存溶媒を取り除いた後、180゜Ｃで4時間乾燥させる。
【００１７】
（２）以上のようにして得られたバクテリア由来の磁性体の表面にシラン修飾を施す。磁性体溶液は全体で100mg/mLの濃度になるよう分注し、その後Nd-B磁石により磁性体を回収し、溶液を取り除く。磁性体は磁気により分離し、溶媒を取り除く。収集されたバクテリア由来の磁性体は真空中で15分間乾燥させ、残存溶媒を取り除いた後、元の溶液量と同量の99％エタノールの中に浮遊させておく。
【００１８】
アミノシラン重合（AEEAという）は、99％エタノール中で1mM酢酸1％溶液により加水分解させたのち、生体由来の磁性体表面に直接共有結合させている。そして、磁性体を超音波槽内で軽く拡散させたのち、20mLのメタノールで3回洗浄し、元の分量で再浮遊させておいた。
【００１９】
（３）次に、以上のようにアミノシラン処理を施した磁性体表面に、多重分岐ポリアミドアミンデンドリマーを積層させる。
デンドリマー合成は、AEEA被覆された50mgのバクテリア由来の磁性体から始める（なお、比較のために、20mLのメチルアクリレート中の50mgの人工磁性体からも始めた）。
【００２０】
懸濁状態を分散させるため、密閉されたロータリーエバポレーターを用いてナスフラスコを超音波水槽内で25℃、３時間浸ける。
磁性体を磁気により収集し、メタノールで洗浄する。洗浄後、4mLのメタノールとエチレンジアミンの1：1で反応させ、生成アミドアミンをデンドロユニットとして重合させる。以後同じ状態を保ちながら進める。
【００２１】
メチルアクリレートとエチレンジアミンの繰返し反応により重合を進行し、目的とする世代まで行う（図1は２層までを示す）。
その後磁性体は25mLのメタノールにて３回洗浄し、次に25mLの水で洗浄する。なお、洗浄から洗浄の間は磁気により収集する。
【００２２】
（４）次に、表面アミンを決定する。
修飾された磁性体１（250μg）を超音波槽内で200μL10mM、スルホスクシンイミジル6-[3'(2-ピリジルジチオ)-プロピオンアミド]ヘキサノエート（sulfo-LC-SPDP）溶液中に30分間浸し、成長伸長させる。処理された磁性体を蒸留水にて3回洗浄し、磁性体を磁気により収集する。
【００２３】
磁性体とsulfo-LC-SPDPの重合体は200μL 20mM ジチオスレイトール（dithiothreitol）の中で成長反応した後、スペクトラム分光器の波長343nmにより、量的にも計測を行なう。データは修飾していない磁性体と性能比較し、濃度決定に関しては5mMのsulfo-LC-SPDPと20mM dithiothreitolによって得られる標準カーブに基づいて決定する。
【００２４】
このようにして修飾された磁性体（AEEA200μgを第３世代のデンドリマーと、AEEA100μgを第5、第6世代のデンドリマー）を、子牛の胸腺のDNA25μgと混合し、20mMのトリス塩酸緩衝液（Tris-HCl）（pH7.0）中で1mLとなるようにし、上下に反転させた後、6000 rpmのマイクロ遠心を掛けてみると、次のような結果が得られた。
【００２５】
上澄みの吸光度は260nmで観測され、DNAの濃度はcalf thymus DNAの標準カーブから算定された。DNAは1mL2MのNaCl中で激しく攪拌することにより磁性体より剥離できた。DNAの存在はエタノール沈澱後アガロースゲル電気泳動により、確認することができた。
なお、本発明は、ルシフェラーゼ遺伝子が含まれる4.8kbp pGEM-Tプラスミドの抽出にも適用可能である。
【００２６】
また、直接PCR分析のための大腸菌および全血からのDNA抽出も試みた。pGEM-Tプラスミドにルシフェラーゼ遺伝子を挿入した大腸菌を、50μgアンピシリンを含む培養液中で細胞濃度106／mLに達するまで培養した。細胞は遠心分離により単離した。
【００２７】
細胞を、75μgのプロテナーゼKを含む10％Triton-X溶媒中に、50゜Ｃで30分間浸けておくことにより溶解させる。溶解物に対し、第6世代まで成長させたバクテリア磁性体100μgを加え、手早くチューブを攪拌する。磁性体は磁気により集められ、上澄液は取り除かれる。
【００２８】
磁性体は20mMのTris-HCl(pH7.0)により6回洗浄し、毎回チューブを上下に振り浮遊物を磁気により集める。DNAは1mL2MのNaCl中で十分攪拌し、磁性体から剥離させる。磁性体はマイクロ遠心器にて6000 rpmで遠心分離する。
【００２９】
剥離したDNAは吸光分光光度計にて測定し、2M NaCl中でのDNA溶液の標準検定曲線と比較した。260：280という比率を分光光度計にて決定する。一方で同様の抽出を行ったロット分について、PCR増幅用として、磁性体からDNAの剥離は行わず、そのまま100μL 蒸留水（Mill-Q）水中に浮遊させた。そして、磁性体に超音波をかけながらMill-Q水にて希釈し、プラスミドをPCR増幅した。
【００３０】
順方向プライマーとしては、配列番号１に示す
5'GGGATGCATATGGAAGACGCCAAAAACATA3'
を用い、逆方向プライマーとしては、配列番号２に示す
5'GGGATGCATACTTGATTACAATTTGGACTTTCC3'
を使用し、プラスミド中で発見された1.65kbpのルシフェラーゼ遺伝子を増幅した。
【００３１】
PCR産物はゲル電気泳動にて可視化できる。ヒト全血1μLから抽出したDNAについても、同様のPCRによる手順に従って分析した。サンプルは新規のものを使用し、凝固防止剤は使用しなかった。
【００３２】
全血のPCRに用いた順方向プライマーとしては、配列番号３に示す
5'GGCCTCCCACACCAG3'
を使用し、逆方向プライマーとしては、配列番号４に示す
5'GCGGGCCAGGCGTCAGCACCAGTA3'
を使用した。
【００３３】
以上の点をまとめると、次の通りである。
バクテリア由来磁性体表面のアミン数は、デンドリマー層の数が1から6に増えるに連れて増えた。アミン数は、図１に示すように、理論的にはスタートラインのアミノシラン層から世代数が増えるに従い2倍づつ増えることになる。
【００３４】
表１は各世代でのバクテリア由来磁性体（BMP）のアミン数を表わす。表１に示すように、各層でアミンが倍化するということは、デンドリマーが理想的なカスケード構造を保っていることを意味している。バクテリア由来磁性体１個の表面積は、50×50×100ｎｍの矩形と仮定すると、2.5×104ｎｍ2である。第6世代表面ではアミン数が1.7×106であったので、68アミン／ｎｍ2という数字が得られた。
【００３５】
表１
図２はバクテリア由来磁性体の修飾していないものと、修飾したものとの電子顕微鏡写真である。図２（ａ）に示すように、修飾していない磁性体は相互の斥力が弱く、凝集しているのが分かる。第３世代のデンドリマーは同図（ｂ）に示すように鎖状に連なり、部分的に凝集している。第６世代のデンドリマーは、同図（ｃ）のように明らかに分散している。そして図２（ｄ）に示すように、磁性体表面を被覆している約4nmの層が観察された。
【００３７】
デンドリマーで修飾されたバクテリア由来磁性体は超音波を掛けた後でも極端な劣化は認められなかった。そして、非常によく分散していて、大きな凝集を作ることも無く、超音波を当てなくても十分良く分散浮遊した。
【００３８】
一方、人工磁性体では、表２に示すように、世代数の増大と共に、超音波を当てた際徐々に破砕され易くなることが確認できた。表２は、生成された磁性体のサイズと分布の表である。
第6世代まで人工磁性体をデンドリマー伸長させた場合、約14ｎｍの多量の断片が溶液中に拡散されていた。さらに、サイズが小さくなったことと、構造が不完全になったことで凝集は大幅に減り、常磁性体の断片が生じた。
【００３９】
表２
バクテリア由来の磁性体に連続的にデンドリマーを生育させていくと、表３に示すようにDNAを効率よく絡めとる能力があることが分かった。この場合、修飾した磁性体を25μgのcalf thymus DNAに混ぜた。デンドリマーを第６世代まで伸長させた磁性体には過剰濃度のDNA（50μg）に混ぜた。
【００４１】
表３
デンドリマー修飾した磁性体では、デンドリマー層が増えるに従い、DNAを絡めとる量が増え、第6世代では100μgの磁性体当たり24.83±1.61μgのDNAを絡めとることができた。
【００４３】
なお、人工磁性体では、第０世代であるAEEA層の回収量とデンドリマー伸長層とでDNAを絡めとる量は変わらない。これは超音波により、磁性体にひび、破砕等の劣化が生じたためと考えられる。
【００４４】
第６世代までデンドリマー修飾したバクテリア由来の磁性体において、2MのNaClを加えただけではDNA回収は十分ではなく、24％しか回収できなかった（表４参照）。回収率を上げるために、DNA重合体を50℃で30分間恒温槽内で保持したことにより、回収率は87％にまで上昇した（21.7±1.59μg）。
【００４５】
表４
小さなDNA断片の捕捉能力についても検討した。ルシフェラーゼ遺伝子を含むプラスミドpGEM-Tを抽出し、大体3kbpと1.6kbpの2種類の産物を作成した。プラスミドDNAの捕捉・回収量は各々23.80±3.01および19.22±1.61μgであった。この結果をゲル電気泳動で調べた結果、サイズの違いによる差異は認められなかった。図３（ａ）に示すように、回収されたDNAは事前に磁気回収されたDNAと一致した。
【００４７】
大腸菌から抽出したDNA量の測定は、2M NaClを用いて磁性体から剥離回収した後に行った。回収したDNAは、RNA分解酵素（RNase）で処理した後測定した結果、第６世代デンドリマー修飾磁性体100μg当たり30.25±7.74μg回収できた。
260：280ｎｍの比は1.92であり、多少のプロテインが混入を起こしていることを示している。前述のゲル電気泳動の結果も、多少のRNA汚染を起こしていることを示している。
【００４８】
この結果、次に細胞溶解後、3μLのRＮaseを加え、37゜Ｃ、20分インキュベーションした後測定すると、DNAの回収率は22.35±1.76μgまで減少した。PCRは、磁性体およびDNAの複合体を事前に塩もしくはRＮaseでの溶解処理を行わず、サンプルを100−1000倍の希釈率で、直接行った［図３（ｂ）参照］。
同様に、ヒト全血から抽出したDNAについても同じプロセスで、10−100倍の希釈率で、直接PCRを行うことができた。
【００４９】
このような結果に基づき次のように結言できる。
アミノシランがデンドリマー成長の重合開始剤としてバクテリア由来の磁性体に共有結合することによりデンドリマー修飾が層状に伸長できること、および磁性細菌AMB-1から得られたバクテリア由来磁性体にアミノシランの共役結合を用い安定的な架橋が形成できるということは周知である。
【００５０】
バクテリア由来の磁性体上にデンドリマーがうまく形成されていることは、表面上のアミン基の数を調べればよい。表面上のアミン基の数は第６世代まで各世代毎に直線的に倍増することが認められた。しかし、第6世代以降は正確にアミン基の数は数えられなかった。
【００５１】
何故ならば、大きな環状のsulfo-LC-SPDPヘキサマーが立体障害となるためと見られる。そして以前より、世代が増えれば、それだけインキュベーションのための時間を多くとる必要があることが分かっていた。
【００５２】
これは、分子が成長する際の立体障害を避けるために、時間を掛けて成長する必要があると考えられていた。第5世代から第6世代へ伸長させる際、試薬を投入しそれ以上アミン基が増えないことを確認できるまでには、インキュベーション時間を6時間まで延長する必要があった。
【００５３】
したがって、第6世代を超えてさらに世代を重ねることは可能ではあろうが、物理的には容易に決められない。さらに、TEM画像から類推すると、世代が増えるとイオン間の斥力が増す。第1世代だけであればバクテリア由来の磁性体は硬く凝集する。第3世代まであると、バクテリア由来の磁性体はチェーンのように列を作る。この現象は、図４に示すように磁力の強弱は磁極方向の磁束密度に比例することからも示唆される。
【００５４】
イオン斥力の存在は磁性体の局配列を減殺する方向となる。これは、バクテリア由来の磁性体が生体膜で覆われているケースでも同じである。すなわち、第6世代のデンドリマーの斥力は非常に大きく、磁力を上回ることになり、凝集せず実際に個々が浮遊することになる。
【００５５】
人工的に磁性体を合成することは可能であるが、形が揃わず、結晶化も十分でなく、構造上も均一でないので、物性としての動特性や化学動態が一定でない。もし、人工磁性体を用いて、バクテリア由来の磁性体と同じ大きさのデンドリマーを作成した場合、人工磁性体重合物には凝集や破砕が起き、表面上のアミン基の増加はリニアとはならなくなる。
生体由来の磁性体は結晶化しているので、デンドリマー生成過程においても欠損することなく、オリジナルの形状及び磁気を保持している。
【００５６】
デンドリマー修飾した生体由来の磁性体は、修飾していない磁性体に比べDNAの回収率が大幅に増える。DNAは磁性体の表面を覆う強固なシランカチオンの規則正しい構造の中に凝縮され、デンドリマーとの相互作用により同じような形体をとる。デンドリマー修飾した生体由来の磁性体により増加した陽イオンは負に帯電されているDNAを絡めとる力を増加するのに大いに役立っている。陽イオン試薬を追加するとDNAの濃度が上がることからも分かる。
【００５７】
しかし、陽イオン試薬を追加することは不要なコンタミネーションを惹起することにもなりかねない。デンドリマー修飾した生体由来磁性体を用いれば、陽イオン試薬を追加することなくDNA回収率を上げることができる。さらに、周知のように、表面上のアミノ基の数を調節することにより、溶液中の分散度や複合濃度を制御することができる。
【００５８】
本発明のように磁性体を使うことは、従来法に比べ処理時間の面、試薬使用量の面、分離回収の面そして自動化の容易さにおいて優っている。プロセスは洗浄工程の前に溶解工程が求められるだけで、極めてシンプルである。さらに、PCRを少ないサンプル量から行わなければならないという制限がある場合、少量のサンプルから十分なDNAを抽出するのに最適な方法であり、この方法は小型化にも応用できる。
【００５９】
なお、本発明は、上記実施例に限定されることなく、その本質から逸脱しない範囲で更に多くの変更、変形をも含むものである。
【００６０】
例えば、デンドリマー表面に抗体を結合し、抗原抗体反応によりタンパク質を抽出することも可能である。
【００６１】
【発明の効果】
以上説明したように本発明によれば次のような効果がある。
（１）生体由来の微粒子の表面にデンドリマーを多重分岐し、アミノ末端基で被覆することにより、容易に核酸あるいはタンパク質の抽出率を増やすことができる。
（２）微粒子を包含するデンドリマーを用いることは、処理時間の面、試薬使用量の面、分離回収の面そして自動化の容易さにおいて従来の磁気ビーズ法より優る。
【００６２】
（３）微粒子表面にデンドリマー修飾をするときは凝集しないように強力な超音波をかけて十分拡散させておく必要があるが、微粒子として生体由来の磁性体を用いた場合は超音波によりクラッキングを起こすこともなく容易に十分なデンドリマーを形成することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明におけるデンドリマーの概念的構成図である。
【図２】バクテリア由来磁性体の電子顕微鏡写真である。
【図３】 DNAの電気泳動結果を示す図である。
【図４】バクテリア磁性体の磁界を説明する図である。
【符号の説明】
１ 磁性体
Claims (10)
- 微粒子の表面に多層のデンドリマーを生成し、このデンドリマーの表面にアミノ基を生成して、このアミノ基により核酸またはタンパク質を抽出もしくは回収する、デンドリマーによる核酸またはタンパク質の抽出方法。
- 前記微粒子は、バクテリア由来の磁性体または人工磁性体または金属またはプラスチックビーズまたはガラスビーズまたはゲル状物質の微粒子であることを特徴とする請求項１記載のデンドリマーによる核酸またはタンパク質の抽出方法。
- 前記デンドリマーは、前記微粒子の表面にシリル化剤やシランカップリング剤を用いてシラン処理を施した上に積層されたことを特徴とする請求項１または２記載のデンドリマーによる核酸またはタンパク質の抽出方法。
- 前記デンドリマーは第２世代以上であることを特徴とする請求項１ないし３のいずれかに記載のデンドリマーによる核酸またはタンパク質の抽出方法。
- 微粒子の表面に多層のデンドリマーを生成し、このデンドリマーの表面に抗体を結合し、抗原抗体反応によりタンパク質を抽出することを特徴とするデンドリマーによるタンパク質の抽出方法。
- 微粒子と、この微粒子の表面に繰返し合成される多層のデンドリマーと、このデンドリマー表面を被覆するアミノ基から成り、このアミノ基により核酸またはタンパク質を捕捉することができるように構成されたことを特徴とするデンドリマー組成物。
- 前記微粒子は、バクテリア由来の磁性体または人工磁性体または金属またはプラスチックビーズまたはガラスビーズまたはゲル状物質の微粒子であることを特徴とする請求項６記載のデンドリマー組成物。
- 前記デンドリマーは、前記微粒子の表面にシリル化剤やシランカップリング剤を用いてシラン処理を施した上に積層されたことを特徴とする請求項６または７記載のデンドリマー組成物。
- 前記デンドリマーは第２世代以上であることを特徴とする請求項６ないし８のいずれかに記載のデンドリマー組成物。
- 微粒子と、この微粒子の表面に繰返し合成される多層のデンドリマーと、このデンドリマー表面に結合された抗体から成り、抗原抗体反応によりタンパク質を捕捉するように構成されたことを特徴とするデンドリマー組成物。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002269867A JP3756477B2 (ja) | 2002-09-17 | 2002-09-17 | デンドリマーによる核酸またはタンパク質の抽出方法およびデンドリマー組成物 |
| US10/647,232 US7405042B2 (en) | 2002-09-17 | 2003-08-26 | Method of extracting nucleic acid or protein using dendrimers and dendrimer-compositional substances |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002269867A JP3756477B2 (ja) | 2002-09-17 | 2002-09-17 | デンドリマーによる核酸またはタンパク質の抽出方法およびデンドリマー組成物 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2004150797A JP2004150797A (ja) | 2004-05-27 |
| JP3756477B2 true JP3756477B2 (ja) | 2006-03-15 |
Family
ID=32449074
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2002269867A Expired - Lifetime JP3756477B2 (ja) | 2002-09-17 | 2002-09-17 | デンドリマーによる核酸またはタンパク質の抽出方法およびデンドリマー組成物 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7405042B2 (ja) |
| JP (1) | JP3756477B2 (ja) |
Families Citing this family (37)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6692700B2 (en) | 2001-02-14 | 2004-02-17 | Handylab, Inc. | Heat-reduction methods and systems related to microfluidic devices |
| US7010391B2 (en) | 2001-03-28 | 2006-03-07 | Handylab, Inc. | Methods and systems for control of microfluidic devices |
| US7829025B2 (en) | 2001-03-28 | 2010-11-09 | Venture Lending & Leasing Iv, Inc. | Systems and methods for thermal actuation of microfluidic devices |
| US8895311B1 (en) | 2001-03-28 | 2014-11-25 | Handylab, Inc. | Methods and systems for control of general purpose microfluidic devices |
| US6852287B2 (en) | 2001-09-12 | 2005-02-08 | Handylab, Inc. | Microfluidic devices having a reduced number of input and output connections |
| WO2005011867A2 (en) | 2003-07-31 | 2005-02-10 | Handylab, Inc. | Processing particle-containing samples |
| JP2005176613A (ja) * | 2003-12-16 | 2005-07-07 | Yokogawa Electric Corp | デンドリマー利用のｄｎａ抽出方法およびバイオチップ |
| EP1715953A1 (en) * | 2004-02-18 | 2006-11-02 | Applera Corporation | Polyelectrolyte-coated size-exclusion ion-exchange particles |
| US8852862B2 (en) | 2004-05-03 | 2014-10-07 | Handylab, Inc. | Method for processing polynucleotide-containing samples |
| JP2006280277A (ja) * | 2005-03-31 | 2006-10-19 | Tokyo Univ Of Agriculture & Technology | 核酸の抽出方法 |
| US10900066B2 (en) | 2006-03-24 | 2021-01-26 | Handylab, Inc. | Microfluidic system for amplifying and detecting polynucleotides in parallel |
| US11806718B2 (en) | 2006-03-24 | 2023-11-07 | Handylab, Inc. | Fluorescence detector for microfluidic diagnostic system |
| US7998708B2 (en) | 2006-03-24 | 2011-08-16 | Handylab, Inc. | Microfluidic system for amplifying and detecting polynucleotides in parallel |
| EP3088083B1 (en) | 2006-03-24 | 2018-08-01 | Handylab, Inc. | Method of performing pcr with a mult-ilane cartridge |
| US8709787B2 (en) | 2006-11-14 | 2014-04-29 | Handylab, Inc. | Microfluidic cartridge and method of using same |
| WO2008060604A2 (en) | 2006-11-14 | 2008-05-22 | Handylab, Inc. | Microfluidic system for amplifying and detecting polynucleotides in parallel |
| US8182763B2 (en) | 2007-07-13 | 2012-05-22 | Handylab, Inc. | Rack for sample tubes and reagent holders |
| US9186677B2 (en) | 2007-07-13 | 2015-11-17 | Handylab, Inc. | Integrated apparatus for performing nucleic acid extraction and diagnostic testing on multiple biological samples |
| US8105783B2 (en) | 2007-07-13 | 2012-01-31 | Handylab, Inc. | Microfluidic cartridge |
| US8287820B2 (en) | 2007-07-13 | 2012-10-16 | Handylab, Inc. | Automated pipetting apparatus having a combined liquid pump and pipette head system |
| US9618139B2 (en) | 2007-07-13 | 2017-04-11 | Handylab, Inc. | Integrated heater and magnetic separator |
| EP2171460B1 (en) * | 2007-07-13 | 2017-08-30 | Handylab, Inc. | Polynucleotide capture materials, and methods of using same |
| US8133671B2 (en) | 2007-07-13 | 2012-03-13 | Handylab, Inc. | Integrated apparatus for performing nucleic acid extraction and diagnostic testing on multiple biological samples |
| USD787087S1 (en) | 2008-07-14 | 2017-05-16 | Handylab, Inc. | Housing |
| JP5622718B2 (ja) * | 2009-03-27 | 2014-11-12 | 国立大学法人岡山大学 | 有機・無機複合材料及びその製造方法 |
| JP4857373B2 (ja) * | 2009-09-09 | 2012-01-18 | 国立大学法人東京農工大学 | デンドリマー被覆磁気微粒子並びにその製造方法及び用途 |
| JP2011055751A (ja) * | 2009-09-09 | 2011-03-24 | Tokyo Univ Of Agriculture & Technology | デンドリマー修飾磁気微粒子の製造方法 |
| JP5669754B2 (ja) | 2009-12-15 | 2015-02-18 | 国立大学法人 岡山大学 | 磁性セラミックス及びその製造方法 |
| JP2014504184A (ja) | 2010-12-01 | 2014-02-20 | スパイナル・モデュレーション・インコーポレイテッド | 神経構造への薬剤の直接送達 |
| AU2012242510B2 (en) | 2011-04-15 | 2015-05-14 | Becton, Dickinson And Company | Scanning real-time microfluidic thermocycler and methods for synchronized thermocycling and scanning optical detection |
| KR101309253B1 (ko) | 2011-06-21 | 2013-09-17 | 한양대학교 산학협력단 | 자성중심 덴드리머 및 이를 이용하여 오염물질을 분리하는 방법 |
| USD692162S1 (en) | 2011-09-30 | 2013-10-22 | Becton, Dickinson And Company | Single piece reagent holder |
| RU2622432C2 (ru) | 2011-09-30 | 2017-06-15 | Бектон, Дикинсон Энд Компани | Унифицированная полоска для реактивов |
| EP2773892B1 (en) | 2011-11-04 | 2020-10-07 | Handylab, Inc. | Polynucleotide sample preparation device |
| CN107881219B (zh) | 2012-02-03 | 2021-09-10 | 贝克顿·迪金森公司 | 用于分子诊断测试分配和测试之间兼容性确定的外部文件 |
| CN104558628B (zh) * | 2013-10-17 | 2017-08-11 | 中国石油化工股份有限公司 | 一种磁性纳米级树脂化合物及其制备方法及应用 |
| JP6867305B2 (ja) * | 2015-05-20 | 2021-04-28 | キヤノン ユー．エス． ライフ サイエンシズ， インコーポレイテッドＣａｎｏｎ Ｕ．Ｓ． Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｉｎｃ． | 磁性キトサン微粒子を使用するポリメラーゼ連鎖反応に対するシングルステップｄｎａ調製 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH08176212A (ja) | 1994-12-21 | 1996-07-09 | Japan Synthetic Rubber Co Ltd | 磁性粒子の表面改質方法 |
| JP4196459B2 (ja) | 1997-12-25 | 2008-12-17 | 東ソー株式会社 | 磁性担体、その製造方法及びこれを用いた核酸抽出方法 |
| KR100377946B1 (ko) * | 2000-07-15 | 2003-03-29 | 한국과학기술원 | 덴드리머를 이용한 단분자막의 제조방법 |
| US20050287560A1 (en) * | 2001-07-13 | 2005-12-29 | Nanosphere, Inc. | Method for preparing substrates having immobilized molecules and substrates |
-
2002
- 2002-09-17 JP JP2002269867A patent/JP3756477B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
2003
- 2003-08-26 US US10/647,232 patent/US7405042B2/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20050260600A1 (en) | 2005-11-24 |
| US7405042B2 (en) | 2008-07-29 |
| JP2004150797A (ja) | 2004-05-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP3756477B2 (ja) | デンドリマーによる核酸またはタンパク質の抽出方法およびデンドリマー組成物 | |
| US9644200B2 (en) | Method and system for sample preparation | |
| JP4324101B2 (ja) | 標的物質の結合 | |
| Rittich et al. | SPE and purification of DNA using magnetic particles | |
| JP6437917B2 (ja) | 試料調製方法及びシステム | |
| JPH11509742A (ja) | シリカ磁気粒子を使用する生物学的目標物質の分離法 | |
| Behra et al. | Magnetic porous sugar-functionalized PEG microgels for efficient isolation and removal of bacteria from solution | |
| EP1748072A1 (en) | Hydroxysilane functionalized magnetic particles and nucleic acid separation method | |
| Tiwari et al. | Magneto-separation of genomic deoxyribose nucleic acid using pH responsive Fe 3 O 4@ silica@ chitosan nanoparticles in biological samples | |
| WO2011019428A2 (en) | Method and system for sample preparation | |
| JP2012510296A (ja) | ユニバーサルな生物学的試料処理 | |
| EP1870449B1 (en) | Method of concentrating and disrupting cells or viruses | |
| CN104437440B (zh) | 一种多氨基硅包磁性纳米粒子的制备与应用 | |
| US20030109618A1 (en) | Magnetic, silanised polyvinylalcohol-basedcarrier materials | |
| CN109771669A (zh) | 一种多巴胺功能化纳米银粒子的dna释放载体及其制备方法 | |
| JP5145526B2 (ja) | 刺激応答性貴金属・磁性微粒子複合体 | |
| WO2010129577A2 (en) | Method for sample preparation | |
| CN109821028A (zh) | 一种多巴胺包埋磁性纳米粒子的dna释放载体及其制备方法 | |
| EP3124608B1 (en) | Method and reagent for extracting nucleic acid | |
| CN116116385A (zh) | 一种血液中外泌体的提取及其蛋白质组学分析方法 | |
| CN109283333A (zh) | 一种基于金壳-上转换手性二聚体对大肠杆菌耐药性定量分析的方法 | |
| WO2009129236A2 (en) | Method for manipulating samples with magnetic nucleation nanoparticles | |
| Taira et al. | Trap and release of oligonucleotide using pH‐responsive amphoteric particle prepared by interfacial polymerization in W/O miniemulsion system | |
| JPWO2010001841A1 (ja) | Ｍｄｐ１による微生物を凝集および／または沈殿させる方法 | |
| CN112717844B (zh) | 用于胞外囊泡富集的磁性纳米材料及其制备方法、应用和胞外囊泡富集材料 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20021016 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20031222 |
|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20040107 |
|
| A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20050401 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20051012 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20051117 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20051215 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20051221 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Ref document number: 3756477 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100106 Year of fee payment: 4 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100106 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110106 Year of fee payment: 5 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120106 Year of fee payment: 6 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130106 Year of fee payment: 7 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20140106 Year of fee payment: 8 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |