JP3746081B2

JP3746081B2 - Animal skin disease treatment

Info

Publication number: JP3746081B2
Application number: JP02704994A
Authority: JP
Inventors: 義久山根
Original assignee: Morinaga Milk Industry Co Ltd
Current assignee: Morinaga Milk Industry Co Ltd
Priority date: 1994-02-24
Filing date: 1994-02-24
Publication date: 2006-02-15
Anticipated expiration: 2021-02-15
Also published as: JPH07233086A

Description

【０００１】
【産業上の利用分野】
この発明は、動物皮膚治療剤に関するものである。さらに詳しくは、この発明は、愛玩哺乳動物、家畜等の皮膚に発生する疾病に対して安全かつ有効な外用治療剤に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ラクトフェリンは、生体内では、涙、唾液、末梢血、乳汁（牛乳では約２００ｍｇ／ｌ）等に含まれ、分子量約８０，０００の天然の鉄結合蛋白質であり、大腸菌、カンジダ菌、クロストリジウム菌等の有害微生物に対して抗菌作用を示すこと（引用文献１８）、およびブドウ球菌及び腸球菌に対して、０．５〜３０ｍｇ／ｍｌの濃度で抗菌作用を有することが知られている（引用文献１９）。
【０００３】
更に、ラクトフェリンは、抗菌作用の他、細胞増殖促進、過酸化脂質生成抑制、免疫関連細胞の機能調節、鉄吸収促進、ヒスタミン遊離抑制、抗炎症、大腸菌の腸管付着阻止及び抗ウイルスの各作用（引用文献２０）及び抗酸化作用（引用文献２１）を有することが知られている。
また、各種の生理的効果を有するペプチドが知られており、微生物に対する抗菌作用を有するペプチドも、多数報告されている（引用文献２３〜３９）。
【０００４】
この発明の発明者等も、ラクトフェリンを蛋白分解酵素で加水分解物した分解物、この分解物から単離したペプチド、およびこれらのペプチドと同一のアミノ酸配列を有する合成されたペプチドが、各種微生物に対する抗菌活性を有することを見出し、既に特許出願している（引用文献４０〜４５）。
一方、過酸化水素から１個の酸素原子をその受容体分子へと受け渡す反応を触媒する酵素であるパーオキシダーゼは、ワサビ、イチジクの液汁、哺乳動物の白血球、乳汁等に含まれているが、とくに乳中（牛乳では約３０ｍｇ／ｌ）に存在するものは、ラクトパーオキシダーゼと呼ばれている。ラクトパーオキシダーゼは、ポルフィリン様構造を有する分子量約８２，０００のヘム蛋白質であり、チオシアン酸イオンおよび過酸化水素（またはその前駆物質）の存在下で抗菌作用を示すことが公知であり（引用文献２２）、ＬＰ系またはＬＰＯシステムと呼ばれている。
【０００５】
以上のような抗菌性等の作用により、ラクトフェリンは、飲食品、化粧品、飼料等に利用されている（引用文献４〜１２）。同様に、ラクトパーオキシダーゼも、飲食品、飼料等に利用されている（引用文献１３〜１６）。
さらに、前記ラクトパーオキシダーゼは、ラクトフェリンにより酵素活性を増強することが見出されており（引用文献１７）、特開昭６１−８３１３１号公報にはラクトフェリンとＬＰ系を同時に含有してなり、胃腸管内において抗バクテリヤ作用を示す飲食品または飼料が開示されており、特開平５−９２９２７号公報にはラクトフェリンとラクトパーオキシダーゼを養殖水生動物の病原菌感染予防および治療に使用できることが開示されている。
【０００６】
しかしながら、ラクトフェリンとラクトパーオキシダーゼの混合物が動物の皮膚病の治療に有効であることは従来知られておらず、またそのような事実を記載した刊行物も皆無である。
動物の皮膚に発生する疾病には、湿疹、じん麻疹、アレルギー性皮膚炎、掻痒性皮膚炎、化膿性皮膚炎、皮膚糸状菌症、疥癬、外耳炎、耳介皮膚炎、毛のう虫症、寄生性皮膚疾患などがあげられるが、従来これらの疾病の治療には、次のような薬剤が用いられている。
▲１▼サリチル酸、フェノール、塩化ベンザルコニウム等を有効成分とする外皮用殺菌消毒剤（引用文献１，２）。
▲２▼ジフェンヒドラミン類等を有効成分とする抗ヒスタミン製剤（引用文献１）。
▲３▼デキサメタゾン、プレドニゾロン類、フルオシノロンアセトニド等有効成分とする外用ステロイドホルモン剤（引用文献１）。
▲４▼カンフル、塩酸ジブカイン、アミノ安息香酸エチル、酸化亜鉛等を有効成分とする鎮痛、鎮痒、収斂、消炎剤（引用文献１）。
▲５▼ビチオノール、ヘキサクロロフェン、マラチオン、ニトロフラゾン、イオウ等を有効成分とする寄生性皮膚疾患用剤（引用文献１）。
▲６▼γ−リノレン酸を有効成分とする皮膚病犬用塗布薬剤（引用文献３）。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、動物の皮膚に発生する疾病を治療するための前記従来技術には、次のような問題があった。すなわち、非ステロイド系皮膚外用剤のものではその治療効果が非常に低く、またステロイド系皮膚外用剤のものは、その薬理効果は高いが、適用部位に、易感染性の亢進、皮膚の菲薄化、血管壁の脆弱化、毛包脂腺系の異常活性化といった副作用が惹起される場合があり、また、経皮吸収された薬剤によって全身的副作用が認められる可能性もある。
【０００８】
このような従来技術の現状から、動物の皮膚に発生する疾病を効果的にかつ安全に治療するための薬剤が待望されていた。
この発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであり、動物の皮膚に発生する疾病に対して安全かつ有効な外用治療剤を提供することを目的としている。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
この発明の発明者等は、ラクトフェリンおよびラクトパーオキシダーゼの用途について鋭意研究を行っていたが、これらの物質が、動物の皮膚に発生する疾病の治療に極めて有効であることを見出し、この発明を完成した。
すなわち、この発明は、上記の課題を解決するものとして、少なくとも３％（重量）のラクトフェリン類、ラクトフェリン類の加水分解物、この加水分解物から分離されたペプチド、これらのペプチドと同一のアミノ酸配列を有する合成されたペプチド、これらのペプチドの誘導体、またはこれらの２以上の混合物、および少なくとも１％（重量）のラクトパーオキシダーゼを有効成分として含有する動物皮膚病治療剤を提供する。
【００１０】
また、この発明動物皮膚病治療剤においては、ラクトフェリン類、ラクトフェリン類の加水分解物、この加水分解物から分離されたペプチド、これらのペプチドと同一のアミノ酸配列を有する合成されたペプチド、これらのペプチドの誘導体、またはこれらの２以上の混合物を４〜１０％（重量）含有すること、および／または上記のラクトパーオキシダーゼを２〜５％（重量）含有することを好ましい態様としている。
【００１１】
さらに、ペプチドについては、配列番号１〜配列番号３１に記載の配列を有するペプチドを例示してもいる。
以下、この発明について詳しく説明する。
この発明の治療剤を適用することのできる動物としては、イヌ、ネコ等の愛玩動物、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ブタ等の家畜類などを例示することができる。また、この発明の治療剤が有効に作用する皮膚病は、たとえば皮膚糸状菌症、アトピー性皮膚炎、膿皮症、アレルギー性皮膚炎、接触性皮膚炎、化膿性外傷性皮膚炎、耳疥癬症、外耳炎などである。
【００１２】
この発明に使用するラクトフェリン類は、市販のラクトフェリン、哺乳動物（例えば、ヒト、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ウマ等）の初乳、移行乳、常乳、末期乳等、またはこれらの乳の処理物である脱脂乳、ホエー等から常法（例えば、イオン交換クロマトグラフィー等）により分離したラクトフェリン、それらを塩酸、クエン酸等により脱鉄したアポラクトフェリン、それらを鉄、銅、亜鉛、マンガン等の金属でキレートさせた金属飽和ラクトフェリン、各種飽和度で金属を飽和したラクトフェリンまたはそれらの２種以上の任意の混合物（以下これらをまとめてラクトフェリン類と記載することがある）のいずれであってもよいが、牛乳から分離された市販のラクトフェリンが、最も安価に得られるので好適である。この発明において使用するラクトフェリン類の加水分解物は、ラクトフェリン類をプロテアーゼまたは酸を用いて加水分解して得られるペプチドの混合物であり、例えば特開平５−３２００６８号公報の発明により次のように製造することができる。
【００１３】
酸により加水分解を行う場合は、ラクトフェリン類を水溶液とし、これに無機酸または有機酸を添加し、所定温度に所定時間加熱して加水分解する。酵素により加水分解を行う場合は、ラクトフェリン類を水溶液とし、使用する酵素の至適ｐＨに調整し、これにペプシン、トリプシン等の酵素を加え、所定温度に所定時間保持して加水分解する。加水分解後は酵素を常法により失活させる。酸または酵素による加水分解で得られた分解物は、抗菌性を有するペプチドを含有する、種々の分子量を有する分解物の混合物であり、次のようにして算出した分解度は、６〜２０％の範囲が望ましい。
【００１４】
前記分解度は、ケルダ−ル法により測定した全窒素に対するホルモ−ル滴定法により測定したホルモ−ル態窒素から次式
分解度＝（ホルモ−ル態窒素量／全窒素量）×１００
により算出した値である。
前記、酸または酵素によって加水分解して得られた反応液（ラクトフェリン類分解物の溶液）は、常法により冷却し、必要に応じて常法により中和、脱塩、脱色し、更に必要に応じて常法により分画し、得られた溶液をそのまま、または濃縮して液状で、または濃縮後乾燥して粉末状で使用することができる。
【００１５】
この発明において使用するペプチドは、配列表に記載されたラクトフェリン類の加水分解物から分離されるペプチド、これらのペプチドと同一の合成されたペプチドまたはそれらの誘導体であり、例えば特開平７８３９２号公報、特開平９２９９４号公報、特開平１４８２９５号公報、特開平１４８２９６号公報、特開平１４８２９７号公報等により、次のように製造することができる。
【００１６】
ラクトフェリン類を酸または酵素を用いて加水分解し、分解物混合物から液体クロマトグラフィ−等の分離手段によってペプチドを含む画分を得る方法、または前記のようにして得たペプチドのアミノ酸配列を公知の方法（例えば、気相シ−クェンサ−を用いる方法等）によって決定し、前記のアミノ酸配列のペプチドを含むペプチドを公知の方法（例えば、ペプチド自動合成装置を用いる方法）によって合成して目的とするペプチドを得る方法等によって調製することができる。これらのペプチドは、例えば配列表に記載されたアミノ酸配列を有するペプチドであり、具体的には、配列番号１、２、および２７のアミノ酸配列を有するペプチド（特開平５−７８３９２号公報）、配列番号３、４、５および６のアミノ酸配列を有するペプチド（特開平５−１４８２９７号公報）、配列番号７、８、９および３１のアミノ酸配列を有するペプチド（特開平５−１４８２９６号公報）、配列番号１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０および２１のアミノ酸配列を有するペプチド（特開平５−１４８２９５号公報）、配列番号２２、２３、２４、２５、２６、２８、２９および３０のアミノ酸配列を有するペプチド（特開平５−９２９９４号公報）である。
【００１７】
この発明に使用するラクトパーオキシダーゼは、市販のラクトパーオキシダーゼ、哺乳動物（例えば、ヒト、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ウマ等）の初乳、移行乳、常乳、末期乳等、またはこれらの乳の処理物である脱脂乳、ホエー等から常法（例えば、イオン交換クロマトグラフィー等）により分離したラクトパーオキシダーゼ、またはそれらの２種以上の任意の混合物のいずれであってもよいが、牛乳から分離された市販のラクトパーオキシダーゼが、最も安価に得られるので好適である。
【００１８】
前記ラクトフェリン類を少なくとも３％、望ましくは４〜１０％、前記ラクトパーオキシダーゼを少なくとも１％、望ましくは２〜５％を配合し、以下公知の方法によりこの発明の動物皮膚病治療剤を得ることができる。
また、この発明の動物皮膚病治療剤の剤型は、特に限定されるものではなく、担体または賦形剤として例えば、白色ワセリン、ミツロウ、流動パラフィン、グリセリン、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、軟膏基剤（プラスチベース）、シリコン、ベントナイト、アルコール、水、オリーブ油など、単独でまたは２種以上の組合わせで適宜用い、クリーム、ペースト、ゲル、軟膏、乳液、ローションまたは溶液など各種形態に常法により製剤化され得る。
【００１９】
以上のようにして製造されたこの発明の動物皮膚病治療剤は、疾患の程度にもよるが、１日１〜数回患部に塗布して使用される。またこの発明の動物皮膚病治療剤は、主成分が乳成分であるため、動物が患部を嘗めても副作用などがなく安全であり、使用者にとっても安全である。
次に試験例を示してこの発明をさらに詳しく説明する。
試験例１
この試験は、愛玩用のイヌの皮膚病に対する効果を調べるために行った。
１）試験対象
各種の皮膚病に羅患している６７匹のイヌを用いた。
２）試験方法
前記のイヌに対して、ラクトフェリン（森永乳業社製）を５０ｍｇ／ｍｌおよびラクトパーオキシダーゼ（森永乳業社製）を３０ｍｇ／ｍｌの割合で水に溶解した治療用溶液を、綿棒、脱脂綿などに吸収させ、患部に塗布した。
３）試験結果
この試験の結果は、表１に示すとおりである。表１から明らかなように、アトピー性皮膚炎では１６例中１１例が、膿皮症では１５例中１０例が、皮膚糸状菌症では１３例中１１例が、ノミアレルギー性皮膚炎では７例中５例が、外耳炎では全例が、それぞれ治癒した。また例数は少ないが、アレルギー性接触性皮膚炎では３例中２例が、化膿性外傷性皮膚炎では全例が、脂漏性皮膚炎では２例中１例が、湿疹では２例中１例が、脱毛・発赤では全例が、それぞれ治癒した。
【００２０】
この発明の動物皮膚病治療剤を投与した全例の７０％が治癒し、２０％が改善したことが明らかであり、この発明の動物皮膚病治療剤が動物の皮膚病に著効を有することが認められた。なお、他のラクトフェリン類、ペプチドを使用した場合もほぼ同様の結果が得られた。
【００２１】
【表１】

【００２２】
試験例２
この試験は、愛玩用のネコの皮膚病に対する効果を調べるために行った。
１）試験対象
各種の皮膚病に羅患している１６匹のネコを用いた。
２）試験方法
前記のネコに対して、試験例１と同一のラクトフェリンを５０ｍｇ／ｍｌおよびラクトパーオキシダーゼを３０ｍｇ／ｍｌの割合で水に溶解した治療用溶液を、綿棒、脱脂綿などに吸収させ、患部に塗布した。
３）試験結果
この試験の結果は、表２に示すとおりである。表２から明らかなように、皮膚糸状菌症では５例中４例が、耳疥癬症では３例中２例が、ノミアレルギー性皮膚炎では３例中２例が、それぞれ治癒した。
【００２３】
この発明の動物皮膚病治療剤を投与した全例の６９％が治癒し、１９％が改善したことが明らかであり、この発明の動物皮膚病治療剤が動物の皮膚病に著効を有することが認められた。なお、他のラクトフェリン類、ペプチドを使用した場合もほぼ同様の結果が得られた。
【００２４】
【表２】

【００２５】
試験例３
この試験は、ラクトフェリン加水分解物またはペプチド類とラクトパーオキシダーゼとの混合物による治療効果を調べるために行った。
１）試験対象
皮膚病に羅患している２０匹のイヌを用いた。
２）試験方法
前記のイヌを無作為に１０匹ずつ２群に分け、１方の群には参考例２と同一の方法により製造したラクトフェリン加水分解物を５０ｍｇ／ｍｌおよび試験例１と同一のラクトパーオキシダーゼを３０ｍｇ／ｍｌの割合で水に溶解した治療用溶液を、他方の群には配列番号２６のペプチド（前記分離例と同一の方法によりラクトフェリン加水分解物から分離した）を５０ｍｇ／ｍｌおよびラクトパーオキシダーゼを３０ｍｇ／ｍｌの割合で水に溶解した治療用溶液を、それぞれ綿棒、脱脂綿などに吸収させ、患部に塗布した。
３）試験結果
この試験の結果は、表３に示すとおりである。表３から明らかなように、ラクトフェリン加水分解物を用いた場合１０例中８例が、またペプチド類を用いた場合も１０例中７例が治癒したことが明らかであり、この発明の動物皮膚病治療剤が動物の皮膚病に著効を有することが認められた。なお、他のラクトフェリン加水分解物またはペプチド類を使用した場合もほぼ同様の結果が得られた。
【００２６】
【表３】

【００２７】
試験例４
この試験は、ラクトフェリンの有効量を調べるために行った。
１）試験対象
皮膚病に羅患している７０匹のイヌを用いた。
２）試験方法
前記のイヌを１０匹ずつ７群に分け、試験例１と同一のラクトパーオキシダーゼを３０ｍｇ／ｌおよび次の割合で試験例１と同一のラクトフェリンを含有する治療用溶液を、それぞれ綿棒、脱脂綿などに吸収させ、患部に塗布した。
第１群：ラクトフェリン２０ｍｇ／ｍｌ
第２群：ラクトフェリン３０ｍｇ／ｍｌ
第３群：ラクトフェリン４０ｍｇ／ｍｌ
第４群：ラクトフェリン５０ｍｇ／ｍｌ
第５群：ラクトフェリン１００ｍｇ／ｍｌ
第６群：ラクトフェリン２００ｍｇ／ｍｌ
第７群：ラクトフェリン３００ｍｇ／ｍｌ
３）試験結果
この試験の結果は、表４に示すとおりである。表４から明らかなように、第１群では１０例中改善が４例であったのに対して、第２群では１０例中治癒および改善がそれぞれ３例、第３群〜第５群ではそれぞれ１０例中８例以上が治癒または改善した。また第６群および第７群でも１０例中７例が治癒または改善したが、ラクトフェリン含量の増加による治癒効果の上昇は認められなかった。
【００２８】
この結果から、ラクトフェリンを３％以上、望ましくは４〜１０％含有する動物皮膚病治療剤が動物の皮膚病に著効を有することが認められた。なお、ラクトフェリン類の加水分解物またはペプチドを変更した場合、ラクトパーオキシダーゼ含量を変更した場合も、ほぼ同様の結果が得られた。
【００２９】
【表４】

【００３０】
試験例５
この試験は、ラクトパーオキシダーゼの有効量を調べるために行った。
１）試験対象
皮膚病に羅患している７０匹のイヌを用いた。
２）試験方法
前記のイヌを１０匹ずつ７群に分け、試験例１と同一のラクトフェリンを５０ｍｇ／ｍｌおよび次の割合で試験例１と同一のラクトパーオキシダーゼを含有する治療用溶液を、それぞれ綿棒、脱脂綿などに吸収させ、患部に塗布した。
第１群：ラクトパーオキシダーゼ５ｍｇ／ｍｌ
第２群：ラクトパーオキシダーゼ１０ｍｇ／ｍｌ
第３群：ラクトパーオキシダーゼ２０ｍｇ／ｍｌ
第４群：ラクトパーオキシダーゼ３０ｍｇ／ｍｌ
第５群：ラクトパーオキシダーゼ５０ｍｇ／ｍｌ
第６群：ラクトパーオキシダーゼ１００ｍｇ／ｍｌ
第７群：ラクトパーオキシダーゼ２００ｍｇ／ｍｌ
３）試験結果
この試験の結果は、表５に示すとおりである。表５から明らかなように、第１群では１０例中改善が２例であったのに対し、第２群では１０例中治癒が５例および改善が１例、第３群では１０例中治癒が６例および改善が２例、第４群および第５群ではそれぞれ１０例中９例が治癒または改善した。また、第６群および第７群でも１０例中８例が治癒または改善したが、ラクトパーオキシダーゼ含量の増加による治癒効果の増加は認められなかった。
【００３１】
この結果から、ラクトパーオキシダーゼを１％以上、望ましくは２〜５％含有する動物皮膚病治療剤が動物の皮膚病に著効を有することが認められた。なお、ラクトフェリン類の加水分解物またはペプチドを使用した場合、ラクトフェリン含量を変更した場合も、ほぼ同様の結果が得られた。
【００３２】
【表５】

【００３３】
参考例１
ラクトフェリン（森永乳業社製）１ｋｇを２０リットルの脱イオン水に溶解し、チューブに入れ、４００リットルの０．１Ｍクエン酸溶液（ｐＨ２．２）に対して、４℃で３６時間透析し、更にクエン酸を除去するため、２０倍量の脱イオン水に対して、４℃で２４時間透析（途中、２回脱イオン水を交換）し、透析内液を凍結乾燥し、アポラクトフェリン約９５０ｇを得た。
参考例２
牛乳から分離したままの市販のラクトフェリン（ベルギ−のオレオフィナ社製）５０ｇを精製水９５０ｇに溶解し、得られた溶液に１規定の塩酸を添加してｐＨを２に調整し、１２０℃で１５分間加熱し、冷却して、ラクトフェリン分解物溶液（ラクトフェリン分解物濃度：５％）約１０００ｇを得た。このラクトフェリン分解物の分解度は９％であった。
【００３４】
上記のラクトフェリン分解物溶液を減圧濃縮し、凍結乾燥し、ラクトフェリン分解物の粉末約４９ｇを得た。
参考例３
牛乳から分離したままの市販のラクトフェリン（ベルギ−のオレオフィナ社製）１ｋｇを精製水９ｋｇに溶解し、２モル濃度のクエン酸を添加してｐＨを２．５に調整し、市販のブタペプシン（１：１０，０００。和光純薬工業社製）３０ｇを添加し、均一に混合し、３７℃に１８０分間保持し、８５℃で１０分間加熱して酵素を失活させ、のち冷却し、ラクトフェリン加水分解物約１０ｋｇを得た。このラクトフェリン加水分解物の分解度は、１１．３％であった。
【００３５】
前記ラクトフェリン加水分解物を濃縮し、凍結乾燥し、粉末のラクトフェリン加水分解物約９６０ｇを得た。
参考例４
市販のウシラクトフェリン（シグマ社製）５０ｍｇを精製水０．９ｍｌに溶解し、０．１規定の塩酸でｐＨを２．５に調整し、のち市販のブタペプシン（シグマ社製）１ｍｇを添加し、３７℃で６時間加水分解した。次いで０．１規定の水酸化ナトリウムでｐＨを７．０に調整し、８０℃で１０分間加熱して酵素を失活させ、室温に冷却し、１５，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、透明な上清を得た。この上清１００μｌをＴＳＫゲルＯＤＳ−１２０Ｔ（東ソ−社製）を用いた高速液体クロマトグラフィ−にかけ、０．８ｍｌ／分の流速で試料注入後１０分間０．０５％ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）を含む２０％アセトニトリルで溶出し、のち３０分間０．０５％ＴＦＡを含む２０〜６０％のアセトニトリルのグラジエントで溶出し、２４〜２５分の間に溶出する画分を集め、真空乾燥した。この乾燥物を２％（Ｗ／Ｖ）の濃度で精製水に溶解し、再度ＴＳＫゲルＯＤＳ−１２０Ｔ（東ソ−社製）を用いた高速液体クロマトグラフィ−にかけ、０．８ｍｌ／分の流速で試料注入後１０分間０．０５％ＴＦＡを含む２４％アセトニトリルで溶出し、のち３０分間０．０５％ＴＦＡを含む２４〜３２％のアセトニトリルのグラジエントで溶出し、３３．５〜３５．５分の間に溶出する画分を集めた。上記の操作を２５回反復し、真空乾燥し、ペプチド約１．５ｍｇを得た。
【００３６】
前記ペプチドを６Ｎ塩酸で加水分解し、アミノ酸分析計を用いて常法によりアミノ酸組成を分析した。同一の試料を気相シ−クェンサ−（アプライド・バイオシステムズ社製）を用いて２５回のエドマン分解を行ない、２５個のアミノ酸残基の配列を決定した。またＤＴＮＢ（５，５−ジチオ−ビス（２−ニトロベンゾイック・アシド））を用いたジスルフィド結合分析法［アナリティカル・バイオケミストリ−（Analytical Biochemistry ）、第６７巻、第４９３頁、１９７５年］によりジスルフィド結合が存在することを確認した。
【００３７】
その結果、このペプチドは、２５個のアミノ酸残基からなり、３番目と２０番目のシステイン残基がジスルフィド結合し、３番目のシステイン残基からＮ−末端側に２個のアミノ酸残基が、２０番目のシステイン残基からＣ−末端側に５個のアミノ酸が、それぞれ結合した、配列番号２６のアミノ酸配列を有していることが確認された。
参考例５
ペプチド自動合成装置（ファルマシアＬＫＢバイオテクノロジ−社製。ＬＫＢＢｉｏｌｙｎｘ４１７０）を用い、シェパ−ド等［ジャ−ナル・オブ・ケミカル・ソサイエティ−・パ−キンＩ（Journal of Chemical Society PerkinＩ）、第５３８頁、１９８１年］による固相ペプチド合成法に基づいて次のようにして合成した。
【００３８】
アミン官能基を９−フルオレニルメトキシカルボニル基で保護したアミノ酸に、Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミドを添加して所望のアミノ酸の無水物を生成させ、このFmoc−アミノ酸無水物を合成に用いた。ペプチド鎖を製造するためにＣ−末端のリジン残基に相当するFmoc−リジン無水物を、そのカルボキシル基を介し、ジメチルアミノピリジンを触媒としてウルトロシンＡ樹脂（ファルマシアＬＫＢバイオテクノロジ−社製）に固定する。次いでこの樹脂をピペリジンを含むジメチルホルムアミドで洗浄し、Ｃ−末端アミノ酸のアミン官能基の保護基を除去する。のちアミノ酸配列のＣ−末端から２番目に相当するFmoc−リジン無水物を前記Ｃ−末端アミノ酸残基を介して樹脂に固定されたリジンの脱保護アミン官能基にカップリングさせた。以下同様にして順次メチオニン、アルギニン、トリプトファン、グルタミン、トリプトファン、アルギニン、アルギニン、スレオニン、およびリジンを固定した。全部のアミノ酸のカップリングが終了し、所望のアミノ酸配列のペプチド鎖が形成された後、９４％ＴＦＡ、５％フェノ−ル、および１％エタンジオ−ルからなる溶媒でアセトアミドメチル以外の保護基の除去およびペプチドの脱離を行ない、高速液体クロマトグラフイ−によりペプチドを精製し、この溶液を濃縮し、乾燥して、ペプチド粉末を得た。
【００３９】
ここに得られたペプチドを前記参考例４と同一の方法により分析し、配列番号２７のアミノ酸配列を有することを確認した。
次に実施例を示してこの発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、この発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００４０】
【実施例】
実施例１
精製水１０ｌに、ラクトフェリン（森永乳業社製）５００ｇおよびラクトパーオキシダーゼ（森永乳業社製）３００ｇを溶解し、除菌フィルター（日本ミリポア工業社製）で瀘過し、１００ｍｌずつ無菌的に容器に充填し、動物皮膚病治療剤９８本を得た。
実施例２
親水性軟膏基剤（吉田製薬社製）８４０ｇに、ラクトフェリン（森永乳業社製）１００ｇおよびラクトパーオキシダーゼ（森永乳業社製）６０ｇを添加し、均一に混練し、動物皮膚病治療剤約１ｋｇを得た。
実施例３
参考例１と同一の方法により得たアポラクトフェリンを用いたことを除き、実施例１と同一の方法により、動物皮膚病治療剤９８本を得た。
実施例４
親水性軟膏基剤（吉田製薬社製）８４０ｇに、参考例３と同一の方法により製造したラクトフェリン加水分解物（森永乳業社製）１００ｇおよびラクトパーオキシダーゼ（森永乳業社製）６０ｇを添加し、均一に混練し、動物皮膚病治療剤約１ｋｇを得た。
実施例５
親水性軟膏基剤（吉田製薬社製）４６ｇに、参考例４と同一の方法により製造した配列番号２６のペプチド２ｇおよびラクトパーオキシダーゼ（森永乳業社製）２ｇを添加し、均一に混練し、動物皮膚病治療剤約５０ｇを得た。
実施例６
参考例５と同一の方法により製造した配列番号２７のペプチドを用いたことを除き、実施例５と同一の方法により動物皮膚病治療剤約５０ｇを得た。
【００４１】
【発明の効果】
以上詳しく説明したとおり、この発明によって、動物の皮膚病を効果的にかつ副作用を生じさせることなく治療することができ、しかも使用者も安全に取り扱うことのできる動物皮膚病治療剤が提供される。
【００４２】
＜引用文献＞
１）沢田実ら編、「１９９１年度版動物用医薬品用具要覧」、社団法人日本動物薬事協会、１９９１年
２）特開昭６２−１０６０２２号公報
３）特開平４−２９０８２０号公報
４）特開平３−３３０１３０号公報
５）特開昭６１−８３１３１号公報
６）ジャパン・フード・サイエンス、第２７巻、第１号、第２５ページ〜第３４ページ、１９８８年
７）サイエンス(Science) 、第１９７巻、第２６３ページ〜第２６５ページ、１９７７年
８）エー・エフ・ウイリアムス及びジェー・ディー・バウム(A. F. Williams & J. D. Baum) 編、「ヒューマンミルク・バンキング」(Human Milk Bank ing)、ネッスル・ニュートリション・ワークショップ・シリーズ、第５巻 (Nestle(ウ) Nutrition Workshop Series Volume 5)、第１３３ページ〜第１４３ページ、レーベン・プレス・ブックス社(Reven Press Books Ltd.)、１９８４年
９）デアリー・サイエンス・アブストラクツ(Dairy Science Abstracts) 、第３０巻、第９号、第５００ページ［３２１０］、１９６８年
１０）日本小児科学会雑誌、第８８巻、第７号、第１５８１ページ〜第１５８２ページ、「Ａ−４３」、１９８４年
１１）ザ・ジャーナル・オブ・インフェクシャス・ディージージス(The Journal of Infectious Diseases)、第１５３巻、第２号、第２３２ページ〜第２３７ページ、１９８６年
１２）フランス国特許第２，５９６，９８６号明細書、１９８７年
１３）ジャーナル・オブ・フード・プロテクション(Journal of Food Protectio n)、第５１巻、第７号、第５５８ページ〜第５６１ページ、１９８８年
１４）ミルヒビッセンシャフト(Milchwissenschaft) 、第３８巻、第４号、第２０３ページ〜第２０６ページ、１９８３年
１５）乳技協資料、第３１巻、第５号、第２ページ〜第１０ページ、１９８２年１６）特開平４−８１４１７号公報
１７）ザ・ジャーナル・オブ・イムノロジー(The Journal of Immunology) 、第１２８巻、第２号、第７２６ページ〜第７３１ページ、１９８２年
１８）ジャ−ナル・オブ・ペディアトリクス（Journal of Pediatrics ）、第９４巻、第１ページ、１９７９年
１９）ジャ−ナル・オブ・デアリ−・サイエンス（Journal of Dairy Science) 第６７巻、第６０６ページ、１９８４年
２０）酪農科学・食品の研究、第３８巻、第Ａ２７７ページ、１９８９年
２１）食品工業、第３５巻、第６号、第３９ページ、１９９２年
２２）プロタイズ・オブ・ザ・バイオロジカル・フルッズ、プロシーディングス・オブ・ザ・コロキウム（Protides of the Biological Fluids, Proceed ings of the Colloquium）、第３２巻、第１１１〜１１４ページ、１９８５年
２３）特開昭５７−１０６６８９号公報
２４）特開昭５８−１３５９４号公報
２５）特開昭５８−２１３７４４号公報
２６）特開昭５９−５１２４７号公報
２７）特開昭６０−１３０５９９号公報
２８）特開昭６０−１７２９９８号公報
２９）特開昭６１−２５１６９９号公報
３０）特開昭６３−４４５９８号公報
３１）特開昭６２−２２７９８号公報
３２）特開昭６２−５１６９７号公報
３３）特開昭６３−１７８９７号公報
３４）特開平２−５３７９９号公報
３５）特表平２−５０００８４号公報
３６）特開平３−２６１７１７号公報
３７）プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナルアカデミー・オブ・ザ・サイエンス・オブ・ユナイテッド・ステーツ・オブ・アメリカ(Proceedings of the National Academy of the Science of United States of America ) 、第８４巻、第５４４９ページ〜第５４５３ページ、１９８７年
３８）フィミヤ・プリロードヌフ・ソエジェニェーニ(Khimiya Prirodnykh Soed inenij) 、第１号、第１３０ページ〜第１３３ページ、１９７８年
３９）特開平２−５３７９９号公報
４０）特開平２−２３４６８４号公報
４１）特開平５−９２９９４号公報
４２）特開平５−７８３９２号公報
４３）特開平５−１４８２９５号公報
４４）特開平５−１４８２９６号公報
４５）特開平５−１４８２９７号公報
【００４３】
【配列表】

【００４４】

【００４５】

【００４６】

【００４７】

【００４８】

【００４９】

【００５０】

【００５１】

【００５２】

【００５３】

【００５４】

【００５５】

【００５６】

【００５７】

【００５８】

【００５９】

【００６０】

【００６１】

【００６２】

【００６３】

【００６４】

【００６５】

【００６６】

【００６７】

[0001]
[Industrial application fields]
The present invention relates to an animal skin therapeutic agent. More specifically, the present invention relates to a safe and effective external therapeutic agent for diseases occurring in the skin of companion mammals, domestic animals and the like.
[0002]
[Prior art]
In the living body, lactoferrin is a natural iron-binding protein contained in tears, saliva, peripheral blood, milk (about 200 mg / l in milk), and having a molecular weight of about 80,000, such as Escherichia coli, Candida, Clostridium, etc. It is known that it exhibits antibacterial action against harmful microorganisms (cited document 18) and has antibacterial action against staphylococci and enterococci at a concentration of 0.5 to 30 mg / ml (cited document). 19).
[0003]
Furthermore, lactoferrin has antibacterial effects, cell growth promotion, lipid peroxide production inhibition, immune-related cell function regulation, iron absorption promotion, histamine release inhibition, anti-inflammatory, E. coli intestinal adhesion prevention and antiviral action ( It is known to have a cited document 20) and an antioxidant action (cited document 21).
In addition, peptides having various physiological effects are known, and many peptides having antibacterial action against microorganisms have been reported (cited references 23 to 39).
[0004]
The inventors of the present invention have also disclosed that a degradation product obtained by hydrolyzing lactoferrin with a proteolytic enzyme, a peptide isolated from this degradation product, and a synthesized peptide having the same amino acid sequence as these peptides are against various microorganisms. It has been found that it has antibacterial activity and has already filed a patent application (cited documents 40-45).
On the other hand, peroxidase, an enzyme that catalyzes the reaction of transferring one oxygen atom from hydrogen peroxide to its receptor molecule, is contained in horseradish, fig juice, mammalian leukocytes, milk, and the like. In particular, what is present in milk (about 30 mg / l for milk) is called lactoperoxidase. Lactoperoxidase is a heme protein having a porphyrin-like structure and a molecular weight of about 82,000, and is known to exhibit antibacterial action in the presence of thiocyanate ion and hydrogen peroxide (or a precursor thereof) (references) 22), called LP system or LPO system.
[0005]
Lactoferrin is used for foods and drinks, cosmetics, feeds and the like due to the above-described action such as antibacterial properties (Cited documents 4 to 12). Similarly, lactoperoxidase is also used in foods and drinks, feeds and the like (cited documents 13 to 16).
Furthermore, the lactoperoxidase has been found to enhance the enzyme activity by lactoferrin (Cited document 17), and JP-A 61-83131 contains lactoferrin and LP system at the same time. Foods and beverages or feeds exhibiting antibacterial action in the tube are disclosed, and Japanese Patent Application Laid-Open No. 5-92927 discloses that lactoferrin and lactoperoxidase can be used for the prevention and treatment of pathogenic bacteria in cultured aquatic animals.
[0006]
However, it has not been known so far that a mixture of lactoferrin and lactoperoxidase is effective in the treatment of animal skin diseases, and there are no publications describing such facts.
Diseases that occur in animal skin include eczema, urticaria, allergic dermatitis, pruritic dermatitis, purulent dermatitis, dermatophytosis, scabies, otitis externa, ear dermatitis, hairy worm Parasitic skin diseases and the like can be mentioned, and the following drugs are conventionally used for the treatment of these diseases.
(1) Disinfectant for outer skin containing salicylic acid, phenol, benzalkonium chloride and the like as active ingredients (Cited documents 1, 2).
(2) An antihistamine preparation containing diphenhydramine or the like as an active ingredient (Cited document 1).
(3) An external steroid hormone agent which is an active ingredient such as dexamethasone, prednisolones, fluocinolone acetonide (cited document 1).
(4) An analgesic, antipruritic, astringent, anti-inflammatory agent containing camphor, dibucaine hydrochloride, ethyl aminobenzoate, zinc oxide and the like as active ingredients (Cited document 1).
(5) A parasitic skin disease preparation containing bithionol, hexachlorophene, malathion, nitrofurazone, sulfur and the like as an active ingredient (Cited document 1).
(6) A drug for skin disease dogs containing γ-linolenic acid as an active ingredient (Cited document 3).
[0007]
[Problems to be solved by the invention]
However, the prior art for treating diseases occurring in the skin of animals has the following problems. In other words, non-steroidal skin external preparations have a very low therapeutic effect, and steroidal skin external preparations have a high pharmacological effect, but are more susceptible to infectivity and thin skin. Side effects such as weakening of the blood vessel wall and abnormal activation of the sebaceous gland system may be caused, and systemic side effects may be observed due to the percutaneously absorbed drug.
[0008]
From the current state of the prior art, there has been a long-awaited drug for effectively and safely treating diseases occurring on the skin of animals.
The present invention has been made in view of the circumstances as described above, and an object thereof is to provide a safe and effective external therapeutic agent for diseases occurring in animal skin.
[0009]
[Means for Solving the Problems]
The inventors of the present invention have conducted intensive research on the uses of lactoferrin and lactoperoxidase, but have found that these substances are extremely effective in the treatment of diseases occurring in the skin of animals. completed.
That is, the present invention provides at least 3% (by weight) of lactoferrin, a hydrolyzate of lactoferrin, a peptide separated from the hydrolyzate, and an amino acid sequence identical to these peptides. An animal skin disease therapeutic agent comprising, as an active ingredient, a synthesized peptide having a derivative thereof, a derivative of these peptides, or a mixture of two or more thereof, and at least 1% (by weight) lactoperoxidase is provided.
[0010]
Further, in the therapeutic agent for animal skin diseases of the present invention, lactoferrins, hydrolysates of lactoferrin, peptides separated from the hydrolysates, synthesized peptides having the same amino acid sequence as these peptides, these peptides It is preferable to contain 4 to 10% (by weight) of these derivatives or a mixture of two or more of these and / or 2 to 5% (by weight) of the above-mentioned lactoperoxidase.
[0011]
Furthermore, about the peptide, the peptide which has a sequence of sequence number 1-sequence number 31 is illustrated.
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
Examples of animals to which the therapeutic agent of the present invention can be applied include pets such as dogs and cats, and livestock such as cows, horses, goats, sheep and pigs. Examples of dermatoses to which the therapeutic agent of the present invention effectively works include dermatophytosis, atopic dermatitis, pyoderma, allergic dermatitis, contact dermatitis, suppurative traumatic dermatitis, ear scab Symptoms, otitis externa, etc.
[0012]
The lactoferrins used in the present invention are commercially available lactoferrin, mammals (eg, humans, cows, goats, sheep, horses, etc.) colostrum, transitional milk, regular milk, end milk, etc., or processed products of these milks Lactoferrin separated from non-fat milk, whey, etc. by conventional methods (for example, ion exchange chromatography), apolactoferrin obtained by removing iron from them using hydrochloric acid, citric acid, etc., and metals such as iron, copper, zinc, manganese Metal saturated lactoferrin chelated with, lactoferrin saturated with metal at various degrees of saturation, or any mixture of two or more thereof (hereinafter these may be collectively referred to as lactoferrins) Commercially available lactoferrin isolated from milk is preferred because it is most inexpensive. The lactoferrin hydrolyzate used in the present invention is a mixture of peptides obtained by hydrolyzing lactoferrins using protease or acid. For example, it is produced as follows according to the invention of JP-A-5-320068. can do.
[0013]
When hydrolyzing with an acid, lactoferrins are made into an aqueous solution, an inorganic acid or an organic acid is added thereto, and the mixture is heated to a predetermined temperature for a predetermined time for hydrolysis. When hydrolyzing with an enzyme, lactoferrins are made into an aqueous solution, adjusted to an optimum pH of the enzyme to be used, and an enzyme such as pepsin or trypsin is added thereto, and the mixture is kept at a predetermined temperature for a predetermined time for hydrolysis. After hydrolysis, the enzyme is inactivated by a conventional method. The degradation product obtained by hydrolysis with acid or enzyme is a mixture of degradation products having various molecular weights and containing peptides having antibacterial properties, and the degradation degree calculated as follows is 6 to 20%. A range of is desirable.
[0014]
The degree of decomposition is calculated from the formol nitrogen measured by the formol titration method with respect to the total nitrogen measured by the Kjeldahl method.
Decomposition degree = (formol nitrogen amount / total nitrogen amount) × 100
The value calculated by
The reaction solution obtained by hydrolysis with an acid or an enzyme (solution of lactoferrin degradation products) is cooled by a conventional method, and neutralized, desalted, and decolorized by a conventional method as necessary. Accordingly, fractionation can be carried out by a conventional method, and the resulting solution can be used as it is, or concentrated to be liquid, or concentrated and dried to be used in powder form.
[0015]
The peptide used in the present invention is a peptide separated from a lactoferrin hydrolyzate described in the sequence listing, a synthesized peptide identical to these peptides, or a derivative thereof, such as JP-A-78392, According to Japanese Patent Application Laid-Open No. 92994, Japanese Patent Application Laid-Open No. 148295, Japanese Patent Application Laid-Open No. 148296, Japanese Patent Application Laid-Open No. 148297, etc., it can be manufactured as follows.
[0016]
A method in which lactoferrins are hydrolyzed using an acid or an enzyme, and a fraction containing the peptide is obtained from the mixture of degradation products by separation means such as liquid chromatography, or the amino acid sequence of the peptide obtained as described above is a known method (For example, a method using a gas phase sequencer, etc.), and a peptide containing the peptide having the amino acid sequence described above is synthesized by a known method (for example, a method using an automatic peptide synthesizer) and the target peptide It can be prepared by a method for obtaining These peptides are, for example, peptides having the amino acid sequences described in the sequence listing. Specifically, peptides having the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1, 2, and 27 (Japanese Patent Laid-Open No. 5-78392), sequences Peptides having amino acid sequences of Nos. 3, 4, 5 and 6 (Japanese Patent Laid-Open No. 5-148297), peptides having amino acid sequences of SEQ ID Nos. 7, 8, 9 and 31 (Japanese Patent Laid-Open No. 5-148296), sequences Peptides having amino acid sequences of Nos. 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 and 21 (Japanese Patent Laid-Open No. 5-148295), SEQ ID Nos. 22, 23, 24, 25, It is a peptide having an amino acid sequence of 26, 28, 29 and 30 (Japanese Patent Laid-Open No. 5-92994).
[0017]
The lactoperoxidase used in the present invention is commercially available lactoperoxidase, mammals (for example, human, cow, goat, sheep, horse, etc.) colostrum, transitional milk, normal milk, end milk, etc., or these milks It may be any one of lactoperoxidase separated from non-fat milk, whey, etc., which is a processed product of the above by conventional methods (for example, ion exchange chromatography, etc.), or any mixture of two or more thereof. Separated commercially available lactoperoxidase is preferable because it can be obtained at the lowest cost.
[0018]
At least 3% of the lactoferrins, desirably 4 to 10%, and at least 1%, desirably 2 to 5% of the lactoperoxidase are blended, and the animal skin disease therapeutic agent of the present invention is obtained by a known method below. Can do.
The dosage form of the animal skin disease therapeutic agent of the present invention is not particularly limited, and examples of carriers or excipients include white petrolatum, beeswax, liquid paraffin, glycerin, cellulose derivatives, polyethylene glycol, and ointment bases. (Plastibase), silicone, bentonite, alcohol, water, olive oil, etc., used alone or in combination of two or more, and formulated into various forms such as creams, pastes, gels, ointments, emulsions, lotions or solutions by conventional methods Can be done.
[0019]
The therapeutic agent for animal dermatosis of the present invention produced as described above is applied to the affected area once to several times a day, depending on the degree of the disease. In addition, since the animal skin disease therapeutic agent of the present invention is a milk component as a main component, even if the animal gives up the affected area, it is safe with no side effects and safe for the user.
Next, the present invention will be described in more detail with reference to test examples.
Test example 1
This test was conducted to examine the effect of pet dogs on skin diseases.
1) Test target
67 dogs suffering from various skin diseases were used.
2) Test method
For the above dog, a treatment solution in which lactoferrin (manufactured by Morinaga Milk Industry Co., Ltd.) is dissolved in water at a rate of 50 mg / ml and lactoperoxidase (manufactured by Morinaga Milk Industry Co., Ltd.) is absorbed into a cotton swab, absorbent cotton, etc. And applied to the affected area.
3) Test results
The results of this test are as shown in Table 1. As is clear from Table 1, 11 out of 16 cases in atopic dermatitis, 10 out of 15 cases in pyoderma, 11 out of 13 cases in dermatophytosis, 7 in flea allergic dermatitis Five of the cases were cured, and all cases of otitis externa were cured. The number of cases is small, but 2 out of 3 cases in allergic contact dermatitis, all cases in purulent traumatic dermatitis, 1 out of 2 cases in seborrheic dermatitis, 2 out of 2 cases in eczema. One case was all cured by hair loss and redness.
[0020]
It is clear that 70% of all cases treated with the animal skin disease treatment agent of the present invention were cured and 20% improved, and the animal skin disease treatment agent of this invention has a significant effect on animal skin disease. Was recognized. Similar results were obtained when other lactoferrins and peptides were used.
[0021]
[Table 1]

[0022]
Test example 2
This test was conducted to examine the effect of pet cats on skin diseases.
1) Test target
Sixteen cats suffering from various skin diseases were used.
2) Test method
For the cat, a therapeutic solution in which 50 mg / ml of the same lactoferrin as in Test Example 1 and lactoperoxidase was dissolved in water at a ratio of 30 mg / ml was absorbed into a cotton swab or absorbent cotton and applied to the affected area. .
3) Test results
The results of this test are as shown in Table 2. As is apparent from Table 2, 4 out of 5 cases were cured in dermatophytosis, 2 out of 3 cases in otosis, and 2 out of 3 cases in flea allergic dermatitis.
[0023]
It is clear that 69% of all cases administered with the animal skin disease treatment agent of the present invention were cured and 19% improved, and the animal skin disease treatment agent of this invention has a significant effect on animal skin disease. Was recognized. Similar results were obtained when other lactoferrins and peptides were used.
[0024]
[Table 2]

[0025]
Test example 3
This test was conducted to examine the therapeutic effect of a mixture of lactoferrin hydrolyzate or peptides and lactoperoxidase.
1) Test target
Twenty dogs suffering from skin diseases were used.
2) Test method
The dogs were randomly divided into two groups of 10 animals, and one group had 50 mg / ml of lactoferrin hydrolyzate prepared by the same method as in Reference Example 2 and the same lactoperoxidase as in Test Example 1. A therapeutic solution dissolved in water at a rate of 30 mg / ml, 50 mg / ml of the peptide of SEQ ID NO: 26 (separated from lactoferrin hydrolyzate by the same method as in the above separation example) and lactoperoxidase in the other group Was treated with a cotton swab or absorbent cotton and applied to the affected area.
3) Test results
The results of this test are as shown in Table 3. As is apparent from Table 3, it was clear that 8 out of 10 cases were cured using lactoferrin hydrolyzate, and 7 out of 10 cases were also cured using peptides. It was found that the disease treatment agent has a significant effect on animal skin diseases. Similar results were obtained when other lactoferrin hydrolysates or peptides were used.
[0026]
[Table 3]

[0027]
Test example 4
This test was conducted to determine the effective amount of lactoferrin.
1) Test target
Seventy dogs suffering from skin diseases were used.
2) Test method
The dogs are divided into 7 groups of 10 animals each, and the therapeutic solution containing 30 mg / l of the same lactoperoxidase as in Test Example 1 and the same lactoferrin as in Test Example 1 in the following proportions, respectively, with a cotton swab, absorbent cotton, etc. Was absorbed and applied to the affected area.
Group 1: lactoferrin 20 mg / ml
Group 2: lactoferrin 30 mg / ml
Group 3: lactoferrin 40 mg / ml
Group 4: lactoferrin 50 mg / ml
Group 5: lactoferrin 100 mg / ml
Group 6: lactoferrin 200 mg / ml
Group 7: lactoferrin 300 mg / ml
3) Test results
The results of this test are as shown in Table 4. As can be seen from Table 4, 4 out of 10 cases were improved in the first group, while 3 cases of healing and improvement were in 3 cases in the second group, and in the third to fifth groups. 8 or more of 10 cases each healed or improved. Moreover, in the 6th group and the 7th group, 7 out of 10 cases were cured or improved, but an increase in the healing effect due to an increase in the lactoferrin content was not observed.
[0028]
From this result, it was confirmed that an animal skin disease therapeutic agent containing 3% or more, preferably 4 to 10%, of lactoferrin has a significant effect on animal skin diseases. In addition, when the hydrolyzate or peptide of lactoferrin was changed and the lactoperoxidase content was changed, almost the same result was obtained.
[0029]
[Table 4]

[0030]
Test Example 5
This test was conducted to determine the effective amount of lactoperoxidase.
1) Test target
Seventy dogs suffering from skin diseases were used.
2) Test method
The dogs are divided into 7 groups of 10 animals each, and the therapeutic solution containing 50 mg / ml of the same lactoferrin as in Test Example 1 and the same lactoperoxidase as in Test Example 1 in the following proportions is used as a cotton swab, absorbent cotton, etc. Was absorbed and applied to the affected area.
Group 1: lactoperoxidase 5 mg / ml
Group 2: Lactoperoxidase 10 mg / ml
Group 3: lactoperoxidase 20 mg / ml
Group 4: lactoperoxidase 30 mg / ml
Group 5: lactoperoxidase 50 mg / ml
Group 6: lactoperoxidase 100 mg / ml
Group 7: lactoperoxidase 200 mg / ml
3) Test results
The results of this test are as shown in Table 5. As is apparent from Table 5, 2 out of 10 cases were improved in the first group, while 5 cases and 10 cases were improved in the second group, and 10 cases were improved in the third group. Healing was 6 cases and improvement was 2 cases, and 9 out of 10 cases were healed or improved in Group 4 and Group 5, respectively. Further, 8 out of 10 cases in the 6th group and the 7th group were cured or improved, but an increase in the healing effect due to an increase in the content of lactoperoxidase was not observed.
[0031]
From this result, it was confirmed that an animal skin disease therapeutic agent containing lactoperoxidase of 1% or more, desirably 2 to 5%, has a significant effect on animal skin diseases. In addition, when the hydrolyzate or peptide of lactoferrin was used and the lactoferrin content was changed, the substantially same result was obtained.
[0032]
[Table 5]

[0033]
Reference example 1
1 kg of lactoferrin (manufactured by Morinaga Milk Industry Co., Ltd.) is dissolved in 20 liters of deionized water, placed in a tube, dialyzed against 400 liters of 0.1 M citric acid solution (pH 2.2) at 4 ° C. for 36 hours, To remove citric acid, dialyze against 20 times the amount of deionized water at 4 ° C for 24 hours (change the deionized water twice in the middle), freeze-dry the dialyzed solution, and add about 950 g of apolactoferrin. Obtained.
Reference example 2
50 g of commercially available lactoferrin (manufactured by Olefina of Bergie) as it was separated from the milk was dissolved in 950 g of purified water, 1N hydrochloric acid was added to the resulting solution to adjust the pH to 2, and 15 ° C. at 15 ° C. The mixture was heated for minutes and cooled to obtain about 1000 g of a lactoferrin degradation product solution (lactoferrin degradation product concentration: 5%). The degree of degradation of this lactoferrin degradation product was 9%.
[0034]
The lactoferrin degradation product solution was concentrated under reduced pressure and lyophilized to obtain about 49 g of lactoferrin degradation product powder.
Reference example 3
1 kg of commercially available lactoferrin (manufactured by Olefina of Bergi) as it is separated from the milk is dissolved in 9 kg of purified water, pH is adjusted to 2.5 by adding 2 molar citric acid, and commercially available porcine pepsin (1 : 10,000 (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) is added, mixed uniformly, held at 37 ° C. for 180 minutes, heated at 85 ° C. for 10 minutes to deactivate the enzyme, then cooled, and lactoferrin hydrolyzed About 10 kg of decomposition product was obtained. The degree of degradation of this lactoferrin hydrolyzate was 11.3%.
[0035]
The lactoferrin hydrolyzate was concentrated and lyophilized to obtain about 960 g of powdered lactoferrin hydrolyzate.
Reference example 4
50 mg of commercially available bovine lactoferrin (manufactured by Sigma) is dissolved in 0.9 ml of purified water, pH is adjusted to 2.5 with 0.1 N hydrochloric acid, and then 1 mg of commercially available pig pepsin (manufactured by Sigma) is added. Hydrolyzed at 37 ° C. for 6 hours. The pH is then adjusted to 7.0 with 0.1 normal sodium hydroxide, heated at 80 ° C. for 10 minutes to inactivate the enzyme, cooled to room temperature, centrifuged at 15,000 rpm for 30 minutes, and clear. A supernatant was obtained. 100 μl of this supernatant was subjected to high performance liquid chromatography using TSK gel ODS-120T (manufactured by Tosoh Corporation), and 0.05% TFA (trifluoroacetic acid) was added for 10 minutes after sample injection at a flow rate of 0.8 ml / min. Elution with 20% acetonitrile containing, followed by elution with a gradient of 20-60% acetonitrile containing 0.05% TFA for 30 minutes, fractions eluting between 24-25 minutes were collected and dried in vacuo. This dried product was dissolved in purified water at a concentration of 2% (W / V) and again subjected to high performance liquid chromatography using TSK gel ODS-120T (manufactured by Tosoh Corporation) at a flow rate of 0.8 ml / min. Elute with 24% acetonitrile containing 0.05% TFA for 10 minutes after sample injection, then elute with a gradient of 24-32% acetonitrile containing 0.05% TFA for 30 minutes, 33.5-35.5 minutes Fractions eluting in between were collected. The above operation was repeated 25 times and vacuum-dried to obtain about 1.5 mg of peptide.
[0036]
The peptide was hydrolyzed with 6N hydrochloric acid, and the amino acid composition was analyzed by an ordinary method using an amino acid analyzer. The same sample was subjected to Edman degradation 25 times using a gas phase sequencer (Applied Biosystems), and the sequence of 25 amino acid residues was determined. Also, a disulfide bond analysis method using DTNB (5,5-dithio-bis (2-nitrobenzoic acid)) [Analytical Biochemistry, Vol. 67, p. 493, 1975] Thus, it was confirmed that a disulfide bond was present.
[0037]
As a result, this peptide consists of 25 amino acid residues, the 3rd and 20th cysteine residues are disulfide bonded, and 2 amino acid residues from the 3rd cysteine residue to the N-terminal side, It was confirmed that the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26 was obtained by binding 5 amino acids from the 20th cysteine residue to the C-terminal side.
Reference Example 5
Using an automatic peptide synthesizer (Pharmacia LKB Biotechnology, LKBBiolynx 4170), Shepard et al. (Journal of Chemical Society Perkin I), page 538, 1981] and was synthesized as follows.
[0038]
N, N-dicyclohexylcarbodiimide was added to an amino acid whose amine functional group was protected with a 9-fluorenylmethoxycarbonyl group to produce an anhydride of the desired amino acid, and this Fmoc-amino acid anhydride was used in the synthesis. In order to produce a peptide chain, Fmoc-lysine anhydride corresponding to the C-terminal lysine residue was immobilized on Ultrocin A resin (Pharmacia LKB Biotechnology) through carboxyamino group and dimethylaminopyridine as a catalyst. To do. The resin is then washed with dimethylformamide containing piperidine to remove the protecting group on the amine function of the C-terminal amino acid. Thereafter, the Fmoc-lysine anhydride corresponding to the second from the C-terminal of the amino acid sequence was coupled to the deprotected amine functional group of lysine immobilized on the resin via the C-terminal amino acid residue. Subsequently, methionine, arginine, tryptophan, glutamine, tryptophan, arginine, arginine, threonine, and lysine were immobilized in the same manner. After the coupling of all amino acids is completed and a peptide chain of the desired amino acid sequence is formed, a protecting group other than acetamidomethyl is removed with a solvent consisting of 94% TFA, 5% phenol, and 1% ethanol. Removal and desorption of the peptide were performed, and the peptide was purified by high performance liquid chromatography. The solution was concentrated and dried to obtain peptide powder.
[0039]
The peptide obtained here was analyzed by the same method as in Reference Example 4 and confirmed to have the amino acid sequence of SEQ ID NO: 27.
EXAMPLES Next, the present invention will be described in more detail and specifically with reference to examples, but the present invention is not limited to the following examples.
[0040]
【Example】
Example 1
In 10 l of purified water, 500 g of lactoferrin (manufactured by Morinaga Milk Industry Co., Ltd.) and 300 g of lactoperoxidase (manufactured by Morinaga Milk Industry Co., Ltd.) are dissolved, filtered through a sterilization filter (manufactured by Nihon Millipore Kogyo Co., Ltd.) and aseptically 100 ml each in a container. Filled to obtain 98 animal skin disease therapeutic agents.
Example 2
100 g of lactoferrin (manufactured by Morinaga Milk Industry Co., Ltd.) and 60 g of lactoperoxidase (manufactured by Morinaga Milk Industry Co., Ltd.) are added to 840 g of hydrophilic ointment base (manufactured by Yoshida Pharmaceutical Co., Ltd.), kneaded uniformly, and about 1 kg of animal skin disease treatment agent is added. Obtained.
Example 3
98 animal skin disease therapeutic agents were obtained by the same method as in Example 1 except that apolactoferrin obtained by the same method as in Reference Example 1 was used.
Example 4
100 g of lactoferrin hydrolyzate (manufactured by Morinaga Milk Industry Co., Ltd.) and 60 g of lactoperoxidase (manufactured by Morinaga Milk Industry Co., Ltd.) produced by the same method as in Reference Example 3 were added to 840 g of hydrophilic ointment base (manufactured by Yoshida Pharmaceutical Co., Ltd.) It knead | mixed uniformly and obtained about 1 kg of animal skin disease therapeutic agents.
Example 5
46 g of hydrophilic ointment base (manufactured by Yoshida Pharmaceutical Co., Ltd.) was added 2 g of the peptide of SEQ ID NO: 26 produced by the same method as in Reference Example 4 and 2 g of lactoperoxidase (manufactured by Morinaga Milk Industry Co., Ltd.), and kneaded uniformly. About 50 g of animal skin disease therapeutic agent was obtained.
Example 6
About 50 g of an animal skin disease therapeutic agent was obtained by the same method as in Example 5 except that the peptide of SEQ ID NO: 27 produced by the same method as in Reference Example 5 was used.
[0041]
【The invention's effect】
As described above in detail, according to the present invention, there is provided an animal skin disease therapeutic agent that can effectively treat an animal skin disease without causing side effects and that can be handled safely by the user. .
[0042]
<Reference documents>
1) Edited by Minoru Sawada et al., "1991 Veterinary Drug Device Manual", Japan Animal Health Association, 1991
2) Japanese Patent Laid-Open No. 62-106022
3) Japanese Patent Laid-Open No. 4-290820
4) Japanese Patent Laid-Open No. 3-330130
5) JP 61-83131 A
6) Japan Food Science, Vol. 27, No. 1, pages 25-34, 1988
7) Science, 197, 263-265, 1977
8) Edited by AF Williams & JD Baum, “Human Milk Banking”, Nessl Nutrition Workshop Series, Volume 5 (Nestle ( C) Nutrition Workshop Series Volume 5), pages 133-143, Reven Press Books Ltd., 1984
9) Dairy Science Abstracts, Vol. 30, No. 9, p. 500 [3210], 1968
10) The Journal of the Japan Pediatric Society, Vol. 88, No. 7, pages 1581 to 1582, “A-43”, 1984
11) The Journal of Infectious Diseases, Volume 153, No. 2, pages 232 to 237, 1986
12) French Patent No. 2,596,986, 1987
13) Journal of Food Protection, Vol. 51, No. 7, pp. 558-561, 1988
14) Milchwissenschaft, Vol. 38, No. 4, pages 203-206, 1983
15) Daikkyo Kyokai, Vol. 31, No. 5, page 2 to page 10, 1982 16) Japanese Patent Laid-Open No. 4-81417
17) The Journal of Immunology, Vol. 128, No. 2, pages 726-731, 1982
18) Journal of Pediatrics, volume 94, page 1, 1979
19) Journal of Dairy Science Vol. 67, p. 606, 1984
20) Dairy Science and Food Research, Volume 38, A277, 1989
21) Food industry, Vol. 35, No. 6, p. 39, 1992
22) Protides of the Biological Fluids, Proceedings of the Colloquium, 32, 111-114, 1985
23) Japanese Patent Laid-Open No. 57-106869
24) Japanese Patent Laid-Open No. 58-13594
25) Japanese Patent Laid-Open No. 58-213744
26) JP 59-51247 A
27) Japanese Patent Laid-Open No. 60-130599
28) Japanese Patent Laid-Open No. 60-172998
29) Japanese Patent Laid-Open No. 61-251699
30) JP 63-44598 A
31) Japanese Patent Laid-Open No. 62-22798
32) Japanese Patent Laid-Open No. 62-51697
33) JP 63-17897 A
34) JP-A-2-53799
35) Japanese National Patent Publication No. 2-500084
36) Japanese Patent Laid-Open No. 3-261717
37) Proceedings of the National Academy of the Science of United States of America, 84, 5449 ~ Page 5453, 1987
38) Khimiya Prirodnykh Soed inenij, No. 1, pages 130-133, 1978
39) Japanese Patent Laid-Open No. 2-53799
40) JP-A-2-234684
41) Japanese Patent Laid-Open No. 5-92994
42) Japanese Patent Laid-Open No. 5-78392
43) Japanese Patent Laid-Open No. 5-148295
44) Japanese Patent Laid-Open No. 5-148296
45) JP-A-5-148297
[0043]
[Sequence Listing]

[0044]

[0045]

[0046]

[0047]

[0048]

[0049]

[0050]

[0051]

[0052]

[0053]

[0054]

[0055]

[0056]

[0057]

[0058]

[0059]

[0060]

[0061]

[0062]

[0063]

[0064]

[0065]

[0066]

[0067]

Claims

A therapeutic agent for atopic dermatitis in dogs containing at least 3% (by weight) lactoferrin and at least 1% (by weight) lactoperoxidase as active ingredients.

The canine atopic dermatitis therapeutic agent of Claim 1 containing 4-10% (weight) of lactoferrin .

The therapeutic agent for atopic dermatitis in dogs according to claim 1 or 2, which contains 2 to 5% (by weight) of lactoperoxidase.