JP3510880B6

JP3510880B6 - 電気泳動用ろ紙及びこれを用いた装置

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Publication number: JP3510880B6
Application number: JP2002338346A
Authority: JP
Inventors: 實佐藤; 昌昭竹内
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1998-07-23
Filing date: 2002-11-21
Publication date: 2006-10-25
Anticipated expiration: 2019-07-19

Description

【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明は、電気泳動用ろ紙、これを用いた電気泳動装置及び電気泳動測定方法の改良に関する。
【０００２】
【従来の技術】
例えば、ヒスタミンの定量にあたっては、ヒスチジン、カルノシン等のイミダゾール環を有する類縁化合物が妨害して正確な数値が得られず、前処理が必要であった。前処理としては、ヒスチジンやカルノシン等の妨害物質を除去するために、カラムを用いて予め妨害物質を除去する方法などが用いられ、到底現場で使用できる方法ではなかった。また、高速液体クロマトグラフィーでは２０分で結果が得られるが、次の分析の前にカラムの再生・平衡化が必要で、結果的には１検体の分析に１時間を要している。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
全ての操作を含めて２０分〜３０分以内で一度に数検体以上の分析ができ、魚肉や畜肉の浸出液や魚粉、飼料などの試料を、前処理することなく直接試験を行い、妨害物質と分離してヒスタミンのみの正確な含有量が得られる測定法が望まれていた。
【０００４】
更に電気泳動法による測定は、泳動用ろ紙にスポットし、移動液で湿潤させて通電し、泳動させ、その後発色させて発色の濃度と広さを比較するものである。スポットは毛管現象によりヨコ方向（泳動方向と直角方向）に拡散するため、スリットとスポットの位置が近過ぎと発色させた時には発色部位が隣接するスポットの発色部位と接触して正確な測定を阻害するおそれがある。したがって、スポットとスポットは互いに緩衝しない距離を保って並べるため１回の試験でスポットできる、すなわち試験できる検体の数は限られていた。更に、試験液の濃度が薄い場合には充分に発色せず、試験できない場合があった。本発明はこのような電気泳動法に関し、薄い試料液であっても鮮明に発色させ、スポットの拡散を防止して１枚の泳動用ろ紙で多数の検体を同時に測定できる電気泳動方法を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明は上記課題を解決することを目的とし、その構成は、試料液を吸収させた吸収用ろ紙片を、電気泳動用枠にセットされ移動液で湿潤された泳動用ろ紙上に、被測定物質の内部標準液を吸収させた吸収用ろ紙片と共に、互いに緩衝しない距離を保って並べて通電し、通電後に泳動用ろ紙を乾燥し、発色剤により発色させ、内部標準液と同一地点における発色部位の大きさ及び濃さを内部標準液の大きさ及び濃さと対比して内部標準液との比率から試料の被測定物質の含有量を算出するものであり、泳動用ろ紙が、試料液をスポットすべき位置に、２本の泳動方向スリット対を設け、泳動方向スリット対を結ぶ連結スリットを介して２本の泳動方向スリット対が連結しているＨ字型スリットを少なくとも２個穿設したろ紙であることを特徴とする。
【０００６】
すなわち、本発明においては泳動用ろ紙の試料液をスポットすべき位置に、２本の泳動方向スリット対を設け、泳動方向スリット対を結ぶ連結スリットを介して２本の泳動方向スリット対が連結しているＨ字型スリットを少なくとも２個穿設し、Ｈ字型スリット上に吸収用ろ紙片を乗せる。吸収用ろ紙片は泳動方向スリット対の幅より狭いため泳動方向と直交する方向への拡散を防止できる。吸収用ろ紙片は連結スリットの幅よりも大きいため、両端が泳動用ろ紙に接触しながら連結スリットを跨ぐことになる。印加された電流は泳動用ろ紙を流れるが、Ｈ字型スリットの部位では泳動用ろ紙が切断されているため積極的に吸収用ろ紙片を通過する。その結果、吸収用ろ紙片に吸収された試料液は積極的に泳動方向に拡散され、少量の試料でも鮮明に発色し、効果的に測定することができる。
【０００７】
また、ろ紙電気泳動法は発色に依存するため、試料濃度が希薄な場合には検出できない。このような希薄な試料を濃縮する作業は多くの手間を要する。本発明においては吸収用ろ紙片にマイクロピペットを用いて一定量吸収させた後、ドライヤー等で乾燥させ、しかる後前回と同量の試料液をマイクロピペットを用いて吸収させ、乾燥させる操作を繰返すことができる。吸収用ろ紙片に試料液を吸収させる操作を２回繰返すことにより試料濃度を２倍にすることができ、１０回繰返せば１０倍に濃縮することができ、希薄な試料もきわめて容易に測定可能になった。
【０００８】
【発明の実施の形態】
電気泳動枠は、泳動用ろ紙を緊張状態に張設できる一対の保持具を両端に有し、該保持具は泳動用ろ紙に通電できる電極にもなり得るものである。泳動用ろ紙に試料を吸収させた吸収用ろ紙片を載せて移動液で湿潤させ、両端の保持具に直流電圧を一定時間印加することにより、被測定物質は固有の距離だけ移動する。したがって、試料のみでなく、被測定物質の内部標準液を試料と緩衝しない程度に離して吸収用ろ紙片に吸収させて載せることにより、内部標準と同一の距離だけ移動した部分が測定しようとする被測定物質であり、他の妨害物質は異なる位置に移動しているため、確実に分離することができる。
【０００９】
泳動用ろ紙は通常のろ紙も使用できるが、図１に示すようなＨ字型スリット１を試料液をスポットすべき部位に並べて穿設したろ紙が好ましい。２は泳動用ろ紙であり、ろ紙端部から仮想線３までの部位は電極兼泳動用ろ紙保持具に挟着される部位である。Ｈ字型スリット１は互いに接触しない泳動方向スリット対４と連結スリット５とからなる。６は吸収用ろ紙片であり、マイクロピペットにより一定量の試料液を吸収させた後、連結スリット５を跨がせて載置する。泳動用ろ紙を移動液で湿潤させた後、電圧を印加することにより図１の矢印に示す方向に試料液中の被測定物質が移動する。
【００１０】
Ｈ字型スリットの形状は図１（ａ）に示すように、泳動方向スリット対１が互いに平行な直線であり、連結スリットが中央部に設けられている形状が好ましいが、これに限定されるものではない。図２（ａ）に示すように、泳動方向スリット対４が互いに外方向を向いた曲線であってもよく、図２（ｂ）に示すように泳動方向スリット対４が互いに内方向を向いた曲線であってもよく、図２（ｃ）に示すように連結スリット５は中央部でなく一方に偏っていてもよい。更に、図２（ｄ）に示すように、泳動方向スリット対４が互いに同一方向を向いた直線であってもよく、図２（ｅ）に示すように泳動方向スリット対４が直線と折れ曲がった直線との組合わせであってもよい。また、泳動方向スリット対の長さが多少異なっていても本発明の目的を達成する限り差支えない。
【００１１】
吸収用ろ紙片６の形状は図１（ｂ）に示すような円形、図１（ｃ）及び（ｄ）に示すような正方形でもよい。吸収用ろ紙片を置く部位は連結スリット５の上であり、図１（ｂ）に示すような円形の場合には方向は問題にならないが、四角形の場合には連結スリット５に対して斜めに置く（ｃ）の場合や、連結スリット５と平行に置く（ｄ）の場合もある。いずれの置き方であってもよいが、同一の泳動用ろ紙２を用いる場合には同一形状の吸収用ろ紙片を同一の位置に同一の方向で置く必要がある。吸収用ろ紙の形状はこの他、菱形、長方形、台形、楕円形等限定しないが、連結スリット４上に置いた場合に、連結スリット４の幅より大きく、泳動方向スリット対の幅より狭いことを要する。すなわち、泳動方向スリット対４を越えて外側の泳動用ろ紙素材に接触しない大きさである。
【００１２】
本発明における試料液は、吸収用ろ紙片に吸収させて泳動用ろ紙上に置く方法が最も簡便である。吸収用ろ紙片は一定の重量、形状、大きさ、厚みを有する均質なろ紙片であればよい。この吸収用ろ紙片に試料液の一定量をマイクロピペットで吸収させる方法が好ましい。更に吸収用ろ紙片を肉片などの固形試料に直接接触させることにより、試料筋肉中の浸出液を吸収用ろ紙片が吸収し、これを電気泳動用の泳動用ろ紙上に置くことにより測定できる。或いは乾燥状態の魚粉や飼料の場合には、過塩素酸、三塩化酢酸、８０％エタノール等の除蛋白剤を加えて飼料を磨り潰して得られた抽出液の一定量を吸収用ろ紙片にスポットする。
【００１３】
希薄な試料液の場合、発色が不十分で測定できない場合があるが、このような場合には吸収用ろ紙片６に一定量の試料液をマイクロピペットで吸収させ、ピンセット等で挟んでドライヤー等を用いて乾燥させ、更に前回と同量の試料液をマイクロピペットを用いて吸収させる。２回吸収させる操作により２倍の濃度の試料液を吸収用ろ紙片に吸収させたことになり、２倍濃度と同様に発色させることができる。この操作は必要に応じて乾燥をはさんで何回でも繰返すことが可能であり、従来試料の濃縮に要していた多大な手間をきわめて簡易な方法で省略することができる。試料がドライヤーによる加熱により分解或いは変質するおそれのある物質を測定する場合には、常温送風により乾燥させればよい。
【００１４】
移動液としては、ピリジンと酢酸と水を含有するピリジン−酢酸緩衝液（ｐＨ３．７）が好ましいが、これに限定するものではなく、ギ酸、酢酸、ピリジン、アンモニア、コリジン等の少なくとも１種を含有し、ｐＨ３．０から９．０の緩衝液が使用可能である。通電して電気泳動を行った後の泳動用ろ紙は乾燥する。市販のドライヤー等の熱風乾燥機により充分に乾燥できる。例えば、被測定物質がヒスタミンの場合には、乾燥した泳動用ろ紙をジアゾカップリング剤と還元剤を加えて発色させる。ジアゾカップリング剤としては、スルファニル酸、ｏ−、ｍ−、ｐ−ニトロアニリン、３−ニトロ−４−アミノトルエン、２−ニトロ−４−メトキシアニリン、２，４−ジニトロアニリン、テフチオン酸、１−ナフチラミン等を挙げることができる。中でもスルファニル酸が好ましく使用されるが、ｐ−ニトロアニリン、３−ニトロ−４−アミノトルエンも感度よく発色する。
【００１５】
定量は内部標準のヒスタミンの位置にある発色部位の面積と濃さをＣＣＤカメラ付きデンシトメーターで測定し、内部標準との比率から測定値が瞬時に得られる。すなわち、オレンジ色の発色の濃さと面積を測定し、積分し、数値で表現するソフトを内蔵したコンピューターであり、画像解析・写真撮影保存装置等、電気泳動イメージング機器として市販されている。簡易に測定する場合には予め用意した濃度を変えて発色させたスポットのカラー写真、カラーコピー或いはカラー印刷等からなる発色図と照合させながら肉眼で判別することも可能である。
【００１６】
本発明の電気泳動用ろ紙及び吸収用ろ紙片に試料液の吸収と乾燥を繰返す方法はヒスタミンの定量や測定に限らず、他の種々の物質の電気泳動法による分離、定性、定量に応用できる。
【００１７】
【実施例】
実施例１
電気泳動枠にろ紙（東洋ろ紙社製、Ｎｏ．５０）を固定した。ろ紙は幅１５ｃｍ、長さ３０ｃｍのものを使用した。このろ紙全体を電気泳動枠に固定した後、移動液のピリジン−酢酸緩衝液（ピリジン：酢酸：水＝１：１０：２８９の割合に混合した液）を全体にスプレーした。場合によってはろ紙全体を移動液に浸漬してもよい。吸収用ろ紙片として抗生物質検定用のペーパーディスクを魚肉に接触させ、浸出液を充分に吸収させた。別にヒスタミン標準液を内部標準としてペーパーディスクに吸収させた。これらのペーパーディスクを電気泳動用ろ紙の陽極側に電極と平行に互いに接触しない位置に並べた。
【００１８】
８００Ｖで１０分間直流電流を通電して電気泳動を行った。次いでろ紙を熱風乾燥機で乾燥し、発色剤Ｉ（２０ｍＭスルファニル酸の１Ｍ塩酸溶液と、２００ｍＭ亜硝酸溶液の等量混合物）をスプレーした後、引続き発色剤II（１０％無水炭酸ナトリウムの５％エチルアルコール溶液）をスプレーしたところ、ヒスタミンがオレンジ色に発色した。ヒスチジンやカルノシンも発色したが、電気泳動による移動距離がヒスタミンの約半分程度であったため、明らかに判別できる別のスポットであり、全く妨害されていなかった。
【００１９】
発色させたスポットの面積と色の濃さを測定するにあたってはＣＣＤデンシトメーター（TAITEC社製の Gel-Pro Analizer 又は FOTODYNE 社製の画像解析装置）を使用した。すなわち、スポットをコンピューターに画像としてＣＣＤカメラで取込み、画像の大きさと色の濃さを判定するコンピューターソフトからなる装置である。画像として取込むにあたってはスキャナーとして取込むことも可能である。実施例１の方法で得られたヒスタミンの検量線を図３に示した。
【００２０】
実施例２
試料として飼料用魚粉を用いた。試料Ａはタラ等の白身の魚のみから製造した魚粉であり、試料Ｂ〜Ｄは赤身魚から製造した魚粉である。一定重量の魚粉を一定量の８０％エタノールと共に磨り潰して得られた抽出液を用いた。泳動用ろ紙としては、図１に示すような、Ｈ字型スリット１を幅１５ｃｍのろ紙に１ｃｍ間隔で７個設けた。１個は内部標準液用であるため一挙に６検体を測定することができた。泳動方向スリット対４の間隔は６ｍｍ、幅は各２ｍｍであり、連結スリット５の幅は３ｍｍであった。吸収用ろ紙片６は直径６ｍｍの円形であり、ピンセットで一端を挟んで一定量の試料液をマイクロピペットで吸収させた後、ドライヤーで半乾燥させた。更に同量をマイクロピペットで吸収させて図１（ｂ）に示すように連結スリット５の中央部に置いた。内部標準として一定量のヒスタミンの８０％エタノール溶液の一定量を吸収用ろ紙片に吸収させ、一番端のＨ字型スリット１の連結スリット５の中央部に置いた。１０００Ｖで７．５分通電した。上記以外は実施例１と同様にして試験を行った。その結果を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法による結果と比較して表１に示した。
【００２１】
【表１】

【００２２】
以上の実施例においては、発色させたヒスタミンの濃さと大きさをデンシトメーターによって測定したが、予め濃度を変えて発色させたカラー印刷、写真、コピー等を基準として肉眼で観察してもよい。また、１５ｃｍ幅の泳動用ろ紙を使用した実施例１及び２では一挙に最大６試料まで測定することが可能であった。発色させたスポットは互いに緩衝していないので同一泳動用ろ紙でより多くの検体を測定することも可能である。また、現場に応じてより小型の電気泳動枠と泳動用ろ紙を使用することも可能である。更に泳動用ろ紙を予めセットした電気泳動枠を使用すれば測定は一層短時間で行われる。
【００２３】
【発明の効果】
本発明により、試料中のヒスタミン含有量を簡単な手段で比較的信頼度高く測定することが可能になった。その結果、小さな水産加工場、食品工場、養殖場、小売店等で用意に測定することができ、更には漁船の上で漁獲物の検査も可能である。更に、電気泳動法による測定が効率的に行われ、薄い試料液であっても鮮明に発色させ、スポットの拡散を防止して１枚の泳動用ろ紙で多数の検体を同時に測定できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は電気泳動用ろ紙の平面図であり、（ｂ）から（ｄ）は各種形状の吸収用ろ紙片を置いた状態を例示した。
【図２】図２（ａ）から（ｅ）はＨ字型スリットの形状を例示した拡大図である。
【図３】図３は電気泳動法によるヒスタミンの検量線である。
【符号の説明】
１Ｈ字型スリット
２泳動用ろ紙
３仮想線
４泳動方向スリット対
５連結スリット
６吸収用ろ紙片

Claims

試料液をスポットすべき位置に、２本の泳動方向スリット対を設け、泳動方向スリット対を結ぶ連結スリットを介して２本の泳動方向スリット対が連結しているＨ字型スリットを少なくとも２個穿設したことを特徴とする電気泳動用ろ紙。
電気泳動用ろ紙と、該電気泳動用ろ紙の両端を挟着できる一対の電極と、該電極に直流電圧を印加できる電源と、試料液を吸収させる吸収用ろ紙片とからなり、
電気泳動用ろ紙が、試料液をスポットすべき位置に、２本の泳動方向スリット対を有し、
泳動方向スリット対を結ぶ連結スリットを介して２本の泳動方向スリット対が連結しているＨ字型スリットを少なくとも２個穿設された泳動用ろ紙であることを特徴とする電気泳動装置。
吸収用ろ紙片が、Ｈ字型スリット上に置いた状態で、連結スリットの幅より広く、泳動方向スリット対の幅より狭いことを特徴とする請求項２記載の電気泳動装置。
吸収用ろ紙片に一定量の試料液を吸収させて乾燥し、乾燥後更に一定量の試料液を吸収させて乾燥させる操作を繰返し、試料液を吸収用ろ紙片に吸収させる操作を２回以上繰返すことを特徴とする請求項２又は３記載の電気泳動装置を用いた電気泳動測定方法。