JP3494647B2 - Ｉｌ−４および／またはｉｌ−１０ならびにそれらに対する抗体の新規な用途 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、インターロイキン−２（IL−２）−依存性
腫瘍細胞増殖、遅延型過敏（DHT）反応、および炎症性
腸疾患の治療；ならびにＴ細胞によるサイトカイン産生
の阻害の増強、またはガンマインターフェロン（IFN−
γ）産生の増大のための組成物および方法に関するもの
である。これらの組成物および方法は、インターロイキ
ン−４（IL−４）、インターロイキン−10（IL−10）、
もしくはそれらの組み合わせ、またはIL−４およびIL−
10のアンタゴニスト、たとえば中和抗体を使用する。 発明の背景 白血病は造血細胞の悪性トランスフォーメーションに
より生じる一群の不均質な新生物であり、リンパ球また
は骨髄細胞タイプに由来する可能性がある。トランスフ
ォームした細胞は主として骨髄およびリンパ組織で増殖
し、そこでそれらは正常な造血および免疫を阻害する。
それらは血液中へ遊出し、他の組織に浸潤し、しばしば
異なる細胞タイプの異常な分布をもたらす可能性もあ
る。白血病の例には、急性リンパ球性白血病（ALL）、
急性骨髄性白血病（AML）、慢性骨髄性白血病（CML）、
慢性リンパ球性白血病（CLL）、ヘアリー・セル白血
病、および成人Ｔ細胞白血病（ATL）が含まれる。白血
病は一般に、臨床経過の性質に応じて急性または慢性に
識別される。 リンパ腫は、白血病と異なり主としてリンパ組織内に
滞在する腫瘍性の細胞トランスフォーメーションであ
る。リンパ腫は一般にホジキン病および非ホジキン性リ
ンパ腫に分けられる。ホジキン病の場合、大部分の細胞
はＴ細胞表現型を伴う小型リンパ球である。非ホジキン
性リンパ腫の全症例のうち90％以上はＢ細胞由来であ
る。 これらの疾病の大部分の治療が全く成功しておらず、
先行技術方法は主として化学療法および放射線療法に集
中している。しかしこれまでこれらの療法は一般に長期
的な緩解または治癒の効果を示していない。従ってこれ
らの疾病、特にその腫瘍性細胞増殖がIL−２に依存して
いる疾病の安全かつ信頼性のある治療法が求められてい
る。 IFN−γは、宿主を多様な感染性物質および疾病に対
して防御するのに寄与するマクロファージの有効な活性
化剤として関与している。感染に対する防御におけるIF
N−γの重要な役割のため、IFN−γの産生を増加させう
る組成物および方法が求められている。 免疫系は多数の自然および誘導免疫反応を行い、その
２つの幅広いカテゴリーは体液性免疫反応および細胞性
免疫反応と呼ばれている。体液性免疫は、抗体産生、お
よびプラズマ細胞を含めたＢ細胞による作用を幅広く表
す。細胞性免疫はＴ細胞、単球、マクロファージおよび
組織球を含めた細胞により仲介される。 Ｔ細胞は、種々の機能またはマーカーに従ってさらに
分類しうる。たとえばＴ細胞は、Ｔヘルパー細胞または
Ｔサプレッサー細胞として分類しうる。さらにＴ細胞
は、活性化して細胞毒性となるか、または他の、より特
殊な機能を行うことができる。正常な場合は、Ｔ細胞と
Ｂ細胞は互いの活性をある程度制御しうる相互作用を示
す。たとえばパウル（Paul）（編者）Fundamentals of
Immunology（第２版）ラバン・プレス、ニューヨーク
（1989）を参照されたい。 種々の抗原に対して、一般に互いに排他的様式で細胞
性反応または体液性反応のいずれかが優位となる。ある
重症の疾病、たとえば癩病、リーシュマニア症、および
あるタイプの自己免疫は、一方のクラスの反応が他方よ
り不適正に優位となったことに起因すると思われる。モ
スマン（Mossmann）ら,Immunol.Today 8:223（1987）；
モスマン（Mossmann）ら,Ann.Rev.Immunol.7:145（198
9）；パリッシュ（Parish）,Transplant.Rev 13:35（19
72）；およびリュー（Liew）,Immunol.Today 10:40（19
89）。 免疫系を制御するメカニズムの１つは、サイトカイン
と呼ばれる蛋白質の産生を伴う。リンホカインはＴ細胞
およびあるＢ細胞により産生されるサイトカインであ
り、モノカインは単球により産生されるサイトカインで
ある。サイトカイン（グリコシル化される場合がある）
は多数の免疫反応を仲介する。 IL−４は抗体産生Ｂ細胞の産生を刺激しうるサイトカ
インであり、これはキラーＴ細胞または細胞毒性Ｔ細胞
の増殖をも促進する。IL−４はＴヘルパー細胞タイプ１
（Th1）の活性をも阻害しうる。一方、IL−４はそれ以
上のＢ細胞の産生、またはそれ以上のＢ細胞による抗体
産生を阻害する。従ってIL−４は内部制御メカニズムの
一部である。 IL−10は多数の作用または効果を仲介しうるサイトカ
インである。IL−10はマウスおよびヒト双方の細胞から
単離されており、種々のクラスまたはサブセットのＴヘ
ルパー（Th）細胞の免疫反応の調節に関与する。Th細胞
は、それらのサイトカイン産生プロフィールにより区別
される異なるサブセットに分類することができる。 一般に抗原またはマイトジェン性レクチンによる活性
化に伴い、Th1 Ｔ細胞クローンはインターロイキン−
２（IL−２）およびIFN−γを産生し、これに対しTh2細
胞クローンはIL−10、IL−４およびインターロイキン−
５（IL−５）を分泌する。両クラスのTh細胞クローンと
も、サイトカイン、たとえば腫瘍壊死因子−α（TNF−
α）、インターロイキン−３（IL−３）、および顆粒球
マクロファージコロニー刺激因子（GM−CSF）を産生す
る。第３カテゴリーのTh細胞（Th0）は、IL−２、IFN−
γ、IL−４、IL−５、TNF−α、IL−３、およびGM−CSF
を同時に産生する。 Th1およびTh2細胞の異なるサイトカイン産生パターン
は、それらのヘルパー機能を反映している。Th1細胞は
主として遅延型過敏反応に関与し、これに対しTh2細胞
は抗体産生に付随する。抗体反応（Th2経路）および遅
延型過敏反応（Th1経路）は、しばしば互いに排他的で
あり、Th1細胞とTh2細胞は交差制御効果をもつと考えら
れる。Th1細胞により産生されたIFN−γはTh2細胞の増
殖を阻害し、Th2細胞により産生されたIL−10はTh1細胞
クローンによるサイトカイン合成、特にIFN−γおよびI
L−２の産生を阻害する。 遅延型過敏症（DHT）は一般にＴ細胞および単球およ
び／またはマクロファージによる水腫（浮腫）および組
織の細胞浸潤を特色とする細胞仲介免疫反応である。遅
延型過敏反応および体液性免疫反応には、いくつかの組
のサイトカインが別個に付随する。シェール（Cher）
ら,J.Immunol.138:3688（1987）；およびモスマン（Mos
smann）ら（1987および1989、前掲）。これらのクラス
の反応に付随する疾病は、付随するサイトカインの組の
不適性な産生により起こる可能性がある。 炎症性腸疾患（IBD）は、胃腸管の一部の慢性的な非
特異的炎症を特色とする一群の胃腸障害を表す。ヒトに
おける最も顕著なIBDの例である潰瘍性結腸炎およびク
ローン病は多数の症状および合併症を伴い、これには子
供の成長遅延、直腸脱、大便中の血液（たとえばメレナ
および／または血便排泄）、るいそう、鉄欠乏症、なら
びに貧血、たとえば鉄欠乏性貧血および慢性疾患または
慢性炎症の貧血が含まれる。 IBDの病因は不明である。ワインガールデンおよびス
ミス（Wyngaarden,Smith）（編者）（Cecil's Textbook
of Medicine（W.B.サウンダーズ・コーポレーション、
1985）、ベルコウ（Berkow）（編者）The Merck Manual
of Diagnosis and Therapy（メルク・シャープ・アン
ド・デーメ・リサーチ・ラボラトリーズ、1982）、なら
びにHarrison's Principles of Internal Medicine,第1
2版，マグローヒル・インコーポーテッド（1991）を参
照されたい。 潰瘍性結腸炎は、主として結腸粘膜に発現する慢性
的、非特異的、炎症性の潰瘍性疾患である。それはしば
しば、出血性下痢、腹部痙攣、大便中の血液および粘
液、倦怠感、発熱、貧血、食欲不振、体重減少、白血球
増加症、低アルブミン血症、ならびに赤血球沈降速度上
昇（ESR）を特色とする。合併症には、出血、中毒性結
腸炎、中毒性巨大結腸、時に直腸膣瘻、および結腸癌の
発生の危険度の増大が含まれる可能性がある。 潰瘍性結腸炎は結腸から離れた部位の合併症、たとえ
ば関節炎、強直性脊椎炎、仙腸骨炎、後部ブドウ膜炎、
結節性紅斑、壊疽性膿皮症、および上強膜炎をも伴う。
治療法は疾病の程度および持続期間に応じてかなり異な
る。たとえば脱水症および電解質不均衡を防止するため
の液体療法が、重症の発作に際してしばしば指示され
る。さらに、特別な食事療法が時には有用である。投薬
には、各種のコルチコステロイド、スルファサラジンお
よびその幾つかの誘導体、ならびに恐らく免疫抑制薬が
含まれる． クローン病は潰瘍性結腸炎と共通の多数の特色を伴
う。クローン病は、かなり広範性である潰瘍性結腸炎の
病変と異なり、病変が隣接する正常な結腸と明確に境界
を定める傾向があるという点で区別しうる。さらにクロ
ーン病は、主として回腸（回腸炎）および回腸と結腸
（回結腸炎）を冒す。場合により結腸のみが罹患し（肉
芽種性結腸炎）、時には小腸全体が影響を受ける（空回
腸炎）。稀な場合には、胃、十二指腸または食道が影響
される。病変には、臨床例のほぼ半数においてサルコイ
ド型上皮様肉芽種が含まれる。 クローン病の病変は経壁性であり、深部潰瘍、水腫
（浮腫）および線維症を含み、これらは閉塞および瘻形
成ならびに膿腫形成をもたらす可能性がある。これは通
常ははるかに浅い病変を生じる潰瘍性結腸炎と対照的で
ある。ただし場合により線維症、閉塞、瘻形成および膿
腫形成の合併症は、潰瘍性結腸炎においても見られる。
現在の治療法は両方の疾病において類似しており、ステ
ロイド、スルファサラジンおよびその誘導体、ならびに
免疫抑制薬、たとえばサイクロスポリンＡ、メルカプト
プリンおよびアザチオプリンの使用を含む。これらはす
べて強い不都合な副作用を生じる可能性がある。 遅延型過敏症および炎症性腸疾患が医学的に重要であ
るため、これらの状態を治療するための改良された組成
物および方法が要望されている。 発明の概要 本発明は、前記の状態を治療するための組成物および
方法を提供することにより、上記の要望を満たすもので
ある。 より詳細には本発明は、IL−２依存性腫瘍細胞増殖に
苦しむ哺乳動物に有効量のIL−10を投与することを含
む、IL−２依存性腫瘍細胞増殖の阻害方法を提供する。 本発明はさらに、患者のINF−γ産生を増大させるの
に有効な量の、IL−４およびIL−10に対する抗体を患者
に共投与することを含む、患者のINF−γレベルを高め
る方法を提供する。 本発明はさらにまた、炎症性腸疾患に苦しむ哺乳動物
に有効量のIL−10を投与することを含む、哺乳動物にお
ける炎症性腸疾患を治療する方法を提供する。 本発明はさらにまた、哺乳動物に有効量のIL−４およ
びIL−10を同時投与することを含む、哺乳動物における
Ｔ細胞によるサイトカイン産生の阻害を増強する方法を
提供する。これにより治療される哺乳動物は、好ましく
はヒトである。 本発明はさらにまた、有効量のIL−10を投与すること
を含む、哺乳動物における遅延型過敏反応を阻害する方
法を提供する。好ましい態様においては、有効量のIL−
４がIL−10と共投与される。 好ましくは以上の方法においてヒトIL−４およびIL−
10がヒトの治療のために用いられる。 発明の説明 本明細書に引用したすべての参考文献の全体を参考と
してここに採用する。記載する核酸配列はすべて、左か
ら右へ読まれる普通の５′−３′の取り決めに従う。配
列中のヌクレオチド塩基については標準的な１文字略号
を使用する（37 C.F.R.§1.822）。 サイトカインおよび抗体の供給源 本明細書において用いる“インターロイキン−4"また
は“IL−4"は、（ａ）国際特許出願公開WO 87/02990号
明細書の図1Cに示された成熟ヒトIL−４の配列と実質的
に等しいアミノ酸配列をもち、かつ（ｂ）天然IL−４に
一般的な生物学的活性をもつ蛋白質を意味する。実質的
に等しいアミノ酸配列とは、前記の特許出願公開明細書
に示された配列と比較して他のIL−４の配列が等しい
か、または生物学的活性を実質的に損なわない１または
２以上のアミノ酸の変更（欠失、付加、置換）により異
なることを意味する。 IL−４は種々の業者、たとえばジェンザイム・コーポ
レーション、マサチュセッツ州ケンブリッジから市販さ
れているか、または天然源もしくは組換えDNA法を用い
て既知の方法により製造することができる［シーハン
（Sheehan）ら,J.Immunol.142:884（1989）およびスタ
ーンズ（Starnes）,J.Immunol.145:4185（1990）］。 あるいは既知のIL−４ヌクレオチド配列に基づくオリ
ゴヌクレオチドプローブ混合物を用いて、標準法により
調製されたゲノムまたはcDNAライブラリー中の、IL−４
をコードするDNAを同定することができる。こうして同
定されたDNAはライブラリーから制限エンドヌクレアー
ゼ開裂により切り取るか、または適宜なプライマーおよ
びポリメラーゼ連鎖反応（PCR）法を用いて製造し［サ
イキ（Saiki）,Science 239:487（1988）］、配列決定
し、そして真核発現系において、または（必要に応じて
標準法によりイントロン欠失後に）原核発現系もしくは
真核発現系において発現させることができる。もちろん
オリゴヌクレオチドプローブまたはPCRを用いる代わり
に標準的な発現クローニング法を適用して、cDNAおよび
ゲノムDNAライブラリーをスクリーニングすることがで
きる。こうして製造されたIL−４は既知の方法、たとえ
ば免疫化学的方法またはバイオアッセイ法を用いて検出
することができる。 用いられるIL−４は、好ましくはヒト組換えIL−４で
ある。グリコシル化IL−４（たとえば真核発現系におい
て産生された組換えIL−４）および非グリコシル化蛋白
質（たとえば化学的に合成されたもの、または細菌性発
現系において産生したもの）が用いられる。 本明細書において用いる“インターロイキン−10"ま
たは“IL−10"は、（ａ）実質的に国際特許出願公開WO
91/00349号明細書に示された成熟（たとえば分泌リー
ダー配列を欠如する）IL−10のアミノ酸配列をもち、か
つ（ｂ）天然IL−10に一般的な生物学的活性をもつ蛋白
質を意味する。グリコシル化IL−10（たとえば真核細
胞、たとえばCHO細胞において産生されたもの）および
非グリコシル化IL−10（たとえば標準法により化学的に
合成されたもの、または大腸菌において産生されたも
の）を使用しうる。IL−10の生物学的活性を備えた突然
変異蛋白質および他の類似体も包含され、これにはBCRF
1（エプスタイン・バールウイルスIL−10;単にウイルス
IL−10とも呼ばれる）蛋白質が含まれる。国際特許出願
公開WO 91/00349号明細書にはIL−10活性の測定に適し
た多数のインビトロアッセイ法が記載されている。この
出願明細書にはIL−10の多数の好ましい修飾法が記載さ
れている。 本発明に用いるのに適したIL−10は、多数の供給源か
ら得られる。たとえばそれはこの蛋白質を分泌しうる活
性Ｔ細胞の培養液から単離しうる。さらにIL−10または
その活性フラグメントは、当技術分野で知られている標
準法により化学的に合成することができる。たとえばメ
リフィールド（Merrifield）,Science 233:341−47（19
86）およびアサートン（Atherton）ら,Solid Phase Pep
tide Synthesis,A Practical Approach,1989,I.R.L.プ
レス、オックスフォード、を参照されたい。 組換えヒトIL−10も市販品であり、たとえばペプト・
テク・インコーポレーテッド（ニュージャージー州ロッ
キー・ヒル）から購入される。 あるいは組換えIL−10は前記にIL−４に関して記載し
たものに従って、既知のヒトIL−10またはウイルスIL−
10配列情報を利用して製造することができる。組換えヒ
トIL−10の製法はたとえば国際特許出願公開WO 91/003
49号明細書に記載されている。ヒトIL−10をコードする
配列を含むクローンは、アメリカン・タイプ・カルチャ
ー・コレクション（ATCC）、マリーランド州ロックビル
に1989年12月20日に寄託され、受託番号68191および681
92と認定された。エプスタイン・バールウイルスからの
ウイルスIL−10（BCRF1蛋白質）のクローニングおよび
発現についてはムーア（Moor）ら［Science 248:1230
（1990）］に示されている。 好ましくはヒトIL−10がヒトの治療に用いられるが、
ウイルスIL−10、または他のいずれかの哺乳動物種から
のIL−10を代わりに用いることもできる。極めて好まし
くは、用いられるIL−10は組換えヒトIL−10である。 IL−４およびIL−10は、いかなる供給源からのもので
あっても、標準法により精製することができ、これには
酸析もしくは塩析、イオン交換クロマトグラフィー、金
属キレートクロマトグラフィー、ゲル濾過、高速蛋白質
液体クロマトグラフィー（FPLC）、高性能液体クロマト
グラフィー（HPLC）、調製用ディスクゲルもしくはカー
テン電気泳動、等電点電気泳動、低温有機溶剤分画、向
流分配、およびイムノアフィニティークロマトグラフィ
ーが含まれるが、これらに限定されない。 IL−４およびIL−10に対して標準法により抗体を産生
することができる。本明細書において用いる“抗体”と
いう語は、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗
体（McAb）の双方を意味する。それは免疫グロブリン全
体およびその抗原結合フラグメントをも包含する。 ポリクローナル抗体は宿主動物、たとえばウサギ、ラ
ット、ヤギ、ヒツジ、マウスなどをIL−４またはIL−10
で免疫することにより産生しうる。好ましくは抗体力価
を高めるために、初期注射後に１回または２回以上の追
加免疫注射を行う。次いで動物から採血し、血清を調製
し、標準法、たとえばELISA法によりポリペプチドを抗
原として用いてスクリーニングする。免疫グロブリン画
分は標準法により調製しうる。 好ましくはIL−４またはIL−10の免疫原性は、多数の
既知アジュバントの１つと組み合わせることにより、お
よび／または免疫前に標準法で架橋することによってよ
り大型の形態に変換することによって高められる。 こうして免疫された動物から調製された血清は、その
まま使用しうる。あるいは標準法により、たとえばプラ
ズマフォレシス、またはIgG特異性吸着剤、たとえば固
定化プロテインＡを用いる吸着クロマトグラフィーによ
り、血清からIgG画分を分離することができる。 本発明において使用するための好ましいモノクローナ
ル抗体は、たとえばコーラー（Kohler）ら［Nature 25
6:495（1975）;Eur.J.Immunol.6:511（1976）］に記載
される標準法により調製しうる。要約すると、動物を前
記に従って免疫して、抗体分泌性の体細胞を形成する。
次いで免疫された動物から骨髄腫細胞に融合させるため
にこれらの細胞を分離する。 抗体を産生する能力をもつ体細胞、特にＢ細胞が骨髄
腫細胞系との融合に適している。これらの体細胞は感作
動物のリンパ節、脾臓および末梢血から得られる。ラッ
ト脾臓細胞がしばしば用いられる。それは一部は、これ
らの細胞が比較的高い割合でマウス骨髄腫細胞系と安定
な融合体を形成するからである。しかしその代わりにヒ
ト、マウス、ウサギ、ヒツジ、ヤギその他の細胞を用い
ることもできる。 リンパ腫から、ハイブリドーマ産生融合法に用いるた
めの特殊な骨髄腫細胞系が開発された［コーラーおよび
ミルスタイン（Kohler,Milstein）,Eur.J.Immunol.6:51
1（1976）；シェルマン（Shulman）ら,Nature 276:269
（1978）；フォーク（Volk）ら,J.Virol.42:220（198
2）］。抗体産生脾臓細胞またはリンパ節細胞と骨髄腫
細胞とのハイブリッドを形成する方法は、通常は体細胞
と骨髄腫細胞をそれぞれ10:1の比率で（ただしこの比率
は約20:1−約1:1に変化させうる）、細胞膜の融合を促
進する物質（１または２以上）（化学物質、ウイルスま
たは電気）の存在下に混合することを含む。融合法はコ
ーラーおよびミルスタイン（Kohler,Milstein），前
掲；ゲフター（Gefter）ら，［Somatic Cell Genet.3:2
31（1977）］，およびフォーク（Volk）ら［J.Virol.4
2:220（1982）］に記載されている。これらの研究者ら
が用いた融合促進剤は、センダイウイルスおよびポリエ
チレングリコール（PEG）であった。 融合法では、生存できるハイブリッドが非常に低頻度
でしか得られない（例えば、体細胞源として脾臓を用い
た場合、およそ１×10⁵個の脾臓細胞に対してただ１個
のハイブリッドが得られるにすぎない）ため、融合した
ハイブリッドを残りの融合していない細胞、特に融合し
ていない骨髄腫細胞から選択することが必須である。目
的の抗体産生ハイブリドーマを、他の融合細胞ハイブリ
ッドから検出する方法も必要である。 一般に、融合細胞ハイブリッドの選択は、ハイブリド
ーマの増殖は支持するが、融合していない骨髄腫細胞
（通常は無期限に分裂し続ける）の増殖は阻害する培地
で細胞を培養することによって行なわれる。融合に用い
られる体細胞は試験管内の培養では長期の生存を維持で
きないことから、問題となることはない。例えば、ヒポ
キサンチンフォスフォリボシルトランスフェラーゼのな
い骨髄腫細胞（HPRT−陰性）が利用できる。これらの細
胞に対する選択は、ヒポキサンチン／アミノプテリン／
チミジン（HAT）培地、すなわち融合細胞ハイブリッド
は脾臓細胞のHPRT−陽性の遺伝子型のために生き残る培
地中で行なわれる。遺伝子型が要求にかなうハイブリッ
ドの増殖を支持する培地中で選択できる様々な遺伝的欠
損（薬物感受性等）を有する骨髄腫細胞の利用も可能で
ある。 融合細胞ハイブリッドを選択的に培養するためには数
週間を必要とする。この期間の初期に、後にクローニン
グ及び増殖をさせることができるように、必要な抗体を
産生するハイブリッドを同定することが必要である。一
般に、得られたハイブリッドの約10％が目的の抗体を産
生するが、約１％から約30％までの範囲であることは珍
しくない。 抗体産生ハイブリッドの検出は、文献に記載された酵
素結合イムノアッセイやラジオイムノアッセイを含む数
種の標準的な検定法のいずれによっても行なうことがで
きる［例えばKennet et al.（編集者）,Monoclonal Ant
ibodies and Hybridomas:A New Dimension in Biologic
al Analyses,pp.376−384,Plenum Press,New York（198
0）］。 必要な融合細胞ハイブリッドを選択し、個々の抗体産
生細胞系にクローン化した後は、それぞれの細胞系は２
種の標準的な方法のいずれかで増殖させることができ
る。ハイブリドーマ細胞の懸濁液を組織適合性の一致し
た動物に注射することができる。注射された動物には、
融合細胞ハイブリッドによって産生される特異的なモノ
クローナル抗体を分泌する腫瘍が現れる。血清や腹水の
ような動物の体液を採取してモノクローナル抗体を後濃
度に得ることができる。あるいは、個々の細胞系を実験
室の培養試験管内で増殖させることができる。１種の特
異的なモノクローナル抗体を高濃度に含有する培養液を
デカンテーション、濾過、または遠心分離によって集
め、続いて精製することができる。 一旦必要なモノクローナル抗体を産生するハイブリド
ーマを得ると、１つの種の結合領域をもう１つの種の抗
体の非結合領域と結合させた種間（interspecific）モ
ノクローナル抗体を作る技術を用いることができる［Li
u et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:3439（198
7）］。例えば、齧歯動物のモノクローナル抗体のCDR
（相補性決定領域）をヒト抗体のフレームワーク領域に
移植し、それによって齧歯動物の抗体を“ヒト化”する
ことができる［Riechmann et al.,Nature 332:323（198
8）］。更には、ヒトの定常領域の有無によらず、CDRを
ヒト抗体の可変領域に移植することができる。このよう
な方法論は、例えば、ヒトのインターロイキン−２受容
体のp55（Tac）サブユニットに対するマウスのモノクロ
ーナル抗体をヒト化するのに用いられた［Queen et a
l.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:10029（1989）］。 あるいはまた、IL−４またはIL−10を用い、Banchere
auらの方法でヒトのモノクローナル抗体を調製すること
ができる［Science 251:70（1991）］。 本発明はまた、Fab、Ｆ（ab'）_２、Fvフラグメント等
のような抗体結合フラグメントを包含する。抗体のフラ
グメントの利用及び産生はよく知られている。例えば、
Fabフラグメント［Tijssen,Practice and Theory of En
zyme Immunoassays（Elsevier,Amsterdam,1985）］、Fv
フラグメント［Hochman et al.,Biochemistry 12:1130
（1973）;Sharon et al.,Biochemistry 15:1591（197
6）;Ehrlich et al.,米国特許No.4,355,023］及び抗体
半分子（Auditore−Hargreaves,米国特許No.4,470,92
5）である。 好ましくは、本発明に用いられる抗体及び抗体フラグ
メントは、それらが調製されたIL−４またはIL−10に特
異的に結合してその生物学的活性を中和する。 IL−２依存性腫瘍細胞増殖阻害 下記の実施例に示すように、ヒト及びウイルスのIL−
10はヒトＴ細胞に対して直接の効果を有する。FcγR II
（CD32）をトランスフェクトされたＬ細胞を抗CD3モノ
クローナル抗体あるいは抗CD2モノクローナル抗体のマ
イトジェニックペアと組み合わせて用いた場合、ヒトTh
0−、Th1−、Th2−様細胞の増殖反応はすべてIL−10に
よって阻害されることが見いだされた。更に、ヒトＴ細
胞クローンの抗原特異的な増殖反応は、適切なクラスII
のMHC分子をトランスフェクトされたマウスＬ細胞をAPC
として用いた場合、IL−10によって阻害された。トラン
スフェクトされたクラスII MHC遺伝子の本質的な発現は
SV40プロモーターの支配下にあるため、IL−10はこの系
でのクラスII MHCの発現に影響しない。IL−10の阻害効
果は、主にmRNAレベルでのIL−２産生の阻害を介したＴ
細胞クローンへのIL−10の直接の効果による。IL−10は
IFN−γ、IL−４、IL−５及びGM−CSFの産生に影響しな
かった為、阻害効果はIL−２に特異的であった。IL−10
とIL−10受容体との相互作用は、見かけ上IL−２合成を
特異的に阻害する情報伝達経路の引き金を引く。 本発明の組成物の有効性を証明するために他の検定法
を用いることもできる。例えば、ヌードマウスの異種移
植モデルを用いることができる。このモデルは、広範囲
の化学療法剤をテストするために用いられてきた［Hawa
rd et al.,Cancer Res.51:3274（1991）及びMcLemore e
t al.,Cancer Res.47:5132（1987）参照］。 このような細胞増殖は、Ｂ細胞CLL等の白血病と関連
しているかも知れない。本発明の方法で治療される哺乳
動物として好ましいのは、IL−２−依存性の腫瘍細胞の
増殖に苦しむヒトの患者である。 IL−２−依存性の腫瘍細胞の増殖を阻害する為の本発
明の方法は、腫瘍細胞の増殖に苦しむ哺乳動物、好まし
くはヒトに、治療に有効な投与量のIL−10を投与するこ
とを含む。治療に有効な投与量の生物学的に活性のある
第２の薬剤もまた投与される。 IL−10及び生理学的に許容し得る担体を含有する薬学
的組成物は、典型的には静脈内に投与される。IL−10は
またリポソームに包埋することもできる。 本明細書で用いる“IL−２依存性の腫瘍細胞の増殖”
の語は、増殖がコントロールされず、進行性であり、継
続的な増殖をIL−２に依存するような、あらゆる新規
な、または異常な組織の増殖として定義される。増殖は
良性または悪性のいずれでも良い。悪性の増殖は、典型
的には腫瘍細胞の退形成（脱分化）の度合がより大きい
ことで特徴づけられる。IL−２依存性の腫瘍細胞は典型
的にはリンパ性または骨髄性の細胞系から得られる。 IL−２はＴ細胞によって産生され、Ｔ細胞、NK細胞及
びＢ細胞を含むさまざまな細胞に対して多くの活性を有
する。IL−２はＴ細胞成長因子として作用し、またIL−
２の存在下で刺激するとＴ細胞によるサイトカインの産
生を高めることが示された。IL−２はナチュラルキラー
（NK）細胞を活性化してMHC非特異的な方法で標的細胞
を殺す。更に、IL−２は関係した細胞の拡大に関与し、
それによってそれらの細胞による抗体産生を高める。 IL−２のこれらの活性に基づけば、IL−10によるIL−
２産生の阻害は、いくつかの疾患において重要である。
例えば、自己免疫甲状腺炎のような自己免疫病、インシ
ュリン依存性の糖尿病、リウマチ様関節炎、全身性紅斑
性狼瘡及び多発性硬化症のような、Ｔ細胞の増殖が望ま
しくない状況で、IL−２によって促進されるＴ細胞の増
殖を抑える手段として使うことができる。 更に、IL−10が、IL−２によって促進されるＴ細胞の
拡大を抑制できるということは、急性対宿主移植片疾患
の治療や、炎症性腸疾患、類肉腫及び肺性線維症等の慢
性炎症疾患の治療において、潜在的な臨床的有用性を持
つことを示している。更に、IL−４やIL−５の強力な産
生細胞であるアレルゲン特異的Ｔ細胞のIL−２によって
促進される増殖を阻害することにより、IL−10は喘息や
アトピー性皮膚炎等のアレルギー性疾患の治療にも使用
できる。 本発明の医薬組成物により治療される腫瘍増殖を伴う
疾患には、Ｂ細胞CLLやATLのようなIL−２依存性として
知られる白血病がある。本発明の医薬組成物は種々のド
ラッグデリバリーシステムでの使用に適している。ドラ
ッグデリバリーの現在の方法についての短い総説は、La
nger,Science 249:1527（1990）を参照のこと。投与可
能な化合物を調製する方法はこの分野での熟練者には知
られているか、または明らかであろう。より詳細には、
例えばRemington's Pharmaceutical Science,17th ed.,
Mack Publishing Company,Easton,PA（1985）に記載さ
れている。 本発明で使用されるIL−10は、例えば生理食塩水、生
理的リン酸緩衝液（PBS）、リンゲル液、デキストロー
ス／生理食塩水、ハンクス液、及びグルコース等の薬理
学的に許容される媒体中に、処方に従って調製する。こ
の組成物は、緩衝剤、浸透圧調整剤、湿潤剤、界面活性
剤等のように、適当な生理的条件の薬理学的に許容され
る補助物質を含んでもよい。添加物として、殺菌剤、安
定化剤等の、活性のある内容物をさらに含んでいてもよ
い。患者への投与量は、何を投与するか、予防または治
療を目的とするのか、宿主の状態、投与方法等によって
変化する。 薬理学的組成物は、典型的には経皮または静脈内、皮
下、もしくは筋肉内等の非経口投与を意図している。経
口投与できる形態も望ましいが、胃の環境を通り抜ける
為に組成物を修飾して供与される。組成物は予防または
治療に使用できる。好ましくは、医薬組成物は静脈内に
投与される。したがって、本発明は好ましくは水系の担
体であるが、許容される担体に溶解または懸濁したIL−
10を含む組成物を提供する。これらの組成物は、従来の
滅菌方法または濾過滅菌により滅菌される。 こうして得られる水溶液は、そのまま、または凍結乾
燥して使用できるように包装される。凍結乾燥品の場
合、投与前に滅菌水系担体と混合する。IL−10を、標準
的な化学療法剤等の、生物活性を有する第２の化合物と
共に投与してもよい。そのような化合物として、ビンク
リスチン、ダウノルビシン、Ｌ−アスパラギナーゼ、ミ
トキサントロン及びアムサクリンがあるが、これに限る
ものではない。 治療に使用する場合、IL−２依存性の腫瘍細胞の増殖
を阻害するのに十分な量の医薬組成物を投与する。望ま
しい効果を生むための適当な量を“治療上の有効量”と
呼ぶ。IL−10の治療上の有効量は、例えば、治療が行な
われた特定の用法、投与の方法、患者の健康状態や担当
医の判断によって変化する。例えば、持続注入の用量
は、典型的には70kgの患者１日あたり約500ngから約800
μｇの範囲、好ましくは約10μｇから約300μｇの範囲
内である。典型的な用量は、700ng/kg/日から16μg/kg/
日である。 薬理学的な処方におけるIL−10の濃度は広範で、例え
ば約10μｇから約5mg/ml、好ましくは約100μｇから2mg
/mlである。濃度は、投与方法に合うように、主に液
量、粘度等により決められる。このようにして、静脈内
注入用の典型的な医薬組成物は、2.5mgのIL−10と250ml
のデキストロース／生理食塩水を含むように定められ
る。 固形の組成物においては、例えば薬理学的なグレード
のマンニトール、ラクトース、澱粉、ステアリン酸マグ
ネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロー
ス、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウム等を含
む通常の無毒の固形担体を使用してもよい。経口投与の
ためには、前述したこれらの担体等の通常よく使う賦形
剤に、一般に10−95％の、好ましくは25−75％の活性成
分、つまり本発明のIL−10ポリペプチドを加えて薬理学
的に許容される無毒の組成物を作る。 エアロゾルでの投与には、IL−10は界面活性剤や抛射
薬と共に細かく分離した形で供与されるのが好ましい。
IL−10の典型的な百分率は、重量比で0.01％から20％、
好ましくは１％−10％である。界面活性剤は言うまでも
なく無毒でなければならず、抛射薬に溶けるものが好ま
しい。そのような化合物の代表例として、カプロン酸、
オクタン酸、ラウリン酸、パルミチン酸、ステアリン
酸、リノール酸、リノレン酸、オレステリン酸及びオレ
イン酸のような６から22個の炭素原子を含有する脂肪酸
と、例えばエチレングリコール、グリセロール、エリス
リトール、アルビトール、マンニトール、ソルビトー
ル、及びソルビトールから得られるヘキシトール無水物
のような脂肪族多価アルコールまたはその環状無水物と
のエステルあるいは部分エステル、及びこれらのエステ
ルのポリオキシエチレン及びポリオキシプロピレン誘導
体がある。天然または混合物のグリセリド等のエステル
混合物も使用できる。 界面活性剤は、組成物の重量の0.1％−20％、好まし
くは0.25％−５％を占める。組成物の残りの部分は通常
は抛射薬である。液化した抛射薬は、大気中では典型的
には気体であり、高圧により濃縮する。適当な液化抛射
薬として、ブタン、プロパンのような炭素原子５個まで
の低級アルカン、そして好ましくはフッ素置換またはフ
ッ素塩素置換されたアルカンがある。上記の化合物の混
合物も使用できる。エアロゾルを発生するには、適当な
バルブを取り付けた容器に、細かく分離したペプチド及
び界面活性剤を含む適当な抛射薬を入れる。従って、内
容物はバルブの動きによって放出されるまで高圧の状態
に維持される。 血清中での半減期を延長するために、カプセルに入れ
たり、リポソームのルーメン側に導入したり、コロイド
として調製したり、その他、ペプチドの残存期間を延長
するような通常の技術を使うこともできる。例えば具体
例として、IL−10をリポソーム内に包埋することができ
る。リポソームの調製方法は、例えばSzoka et al.,An
n.Rev.Biophys.Bioeng.9:467（1980），米国特許No.4,2
35,871,No.4,501,728,及びNo.4,837,028に記載されてい
るように、いろいろな方法が使用できる。 調製後、望ましい範囲の大きさにする為、またリポソ
ームの大きさの分布を比較的狭くする為に、リポソーム
を大きさによって分別する。リポソームを大きさで分別
するには、いくつかの方法が使用でき、そのうちの１つ
は米国特許No.4,737,323に記載されている。 最も効率良い包埋方法でも、大きさをそろえた初期の
リポソーム懸濁液には50％またはそれ以上の自由形（包
埋されていない）薬剤が存在する。リポソーム懸濁液か
ら包埋されていない物質を除く為にいくつかの方法が使
用できる。１つの方法では、懸濁液中のリポソームを高
速の遠心分離により沈澱し、上清中に自由形の化合物と
非常に小さなリポソームを残す。別の方法では、懸濁液
を限外濾過により濃縮し、次に濃縮したリポソームを置
換媒体に再懸濁する。あるいは、大きなリポソーム粒子
を溶質分子から分けるためにゲル濾過を使用することも
できる。 上記の処理をした後、リポソーム懸濁液を静脈内投与
の使用に望ましい濃度に合わせる。これには、例えば遠
心分離や限外濾過によりリポソームが濃縮された場合に
は、適当な容量の注射用媒体に再懸濁し、薬剤除去の過
程で懸濁液の総体積が増えた場合には懸濁液を濃縮して
もよい。次に懸濁液を上記のように濾過により滅菌す
る。本発明のペプチドを含有するリポソームは、上記の
ように非経口的に投与する。 IFN−γ産生の増強 本発明の方法は、患者の免疫系がIL−４やIL−10の産
生によりIFN−γの産生を阻害するような感染性の病気
に苦しむ患者において特に有用である。代表的な疾患と
して、内臓レーシュマニア症、癩腫性癩、カビ感染症が
挙げられる。代表的なカビ感染にはカンジダ、パラコク
シジオミコーゼ、ブラストミセスやクリプトスピロイデ
ウム群のカビ属がある。 多くの感染性細菌は、IFN−γの量が低いことによ
り、直接または間接的に利益を得ている。これらの感染
はしばしば慢性であり、感染性のものに対するTh2とTh1
反応の不均衡により特徴づけられる。この不均衡の結
果、Th2細胞からIL−４、IL−10が産生されるため、Th1
細胞からのIFN−γの産生が阻害される。本発明に用い
られる抗体は、好ましくは患者個人に由来するものであ
る。同種の細胞に由来する非自己の抗体も有用である。
別の動物種に由来する抗体も利用可能であるが、不利な
免疫反応（HAMA（抗マウス−ヒト抗体））が起こるのを
制御する方法が必要となるかも知れない。例えば、ヒト
化したラット抗体は、種々の抗原結合性フラグメントと
同じように、ヒト患者の免疫反応を最小にすることがで
きる。この抗体は、IL−４やIL−10の天然の受容体への
結合親和性と同程度もしくはそれ以上の親和性を示す結
合定数をもつことが好ましい。 これらのサイトカインの、対応する受容体への結合と
比べ、1/100より強い結合定数をもつ抗体が好ましい。
結合の比較は、標準的な平衡法を用いて調べられる。そ
の基本的な技術は、Chpt 25 of Vol.1:Immunochemistr
y,Ed.D.M.Weir,4th Ed.1986,Blackwell Scientific Pub
l.25.1−25.30に記載されている。あるいは、標準的な
インビトロでの生物試験で、一定量のIL−４またはIL−
10を中和するのに必要な抗体のモル過剰量を決める試験
法を使うこともできる。そのような試験法の例がMosman
n et al.,J.Immunol.Methods 116:151（1989）（IL−
４）及びFiorentino et al.,J.Exp.Med.170:2081（198
9）に見られる。ある一定量のIL−４やIL−10を中和す
るこれらの抗体の合理的な範囲は10倍から1000倍の過剰
量である。 本明細書において用いる“共投与される”という語
は、抗−IL−４抗体と抗−IL−10抗体が患者の体内に一
緒に存在するように、十分に短い間隔で一緒に投与され
るという意味である。投与の特定の順序は重要ではな
く、抗体は予め混合して同時に投与しても、また別々に
投与しても良い。 投与の方法は、典型的には非経口、好ましくは静脈内
投与である。標準的な静脈内投与方法を使って抗体を患
者に投与しても良い。抗体は、まず、生理的リン酸緩衝
液のような、滅菌した生物学的に適合した媒体に懸濁す
る。レシチン、グルコース、デキストロース、抗生物質
のような、薬理学的に許容される添加物を抗体と共に含
んでもよい。 共投与される抗体の量は、１つの抗体につき、体重1k
gあたり１−10mgの範囲である。それぞれの抗体につい
て、血清中の濃度が１−150μg/ml、好ましくは10−100
μg/mlとなる量の抗体を投与することが望ましい。抗体
の半減期は、典型的には２−７日であり、どちらかの抗
体濃度が望ましいレベル以下に低下した場合には繰り返
し投与することが適当である。血清試料中の抗体レベル
は伝統的なイムノアッセイ、好ましくはELISAアッセイ
を用いて測定できる。 本発明の具体例を説明するために、IL−４及びIL−10
に対するモノクローナル抗体を使用するが、他のアンタ
ゴニストも同様に使用できる。例えば、IL−４またはIL
−10の受容体に特異的に結合して、サイトカインの結合
を阻害する抗体を使用することができる。同様に膜貫通
ドメインを欠失した可溶型のIL−４、IL−10受容体を使
用することができる。最後に、IL−４及びIL−10の変異
型アンタゴニストであって、対応する受容体には強く結
合するが、生物学的活性を本質的に欠いたものも使用で
きる。そのようなIL−４変異型アンタゴニストの１つで
あって、野生型のヒトIL−４の124位のチロシン残基が
アスパラギン酸残基に置換されたものがKruseらによっ
て記載されている［EMBO J.11:3237（1992）］。 これらのアンタゴニストは、好ましくは滅菌した水系
の混合物を使って静脈内に共投与する。この混合物は、
滅菌緩衝液、生理食塩水、抗生物質等の、薬理学的に許
容されるどのような賦形剤を含んでいても良い。 治療は、典型的には、患者の臨床反応からみて、感染
が抑制されたときに終了する。従来の抗生物質による治
療を本発明と共に使用することもできる。 炎症性腸疾患 “炎症性腸疾患”または略して“IBD"の語は、本明細
書では潰瘍性大腸炎及びクローン病を含む病気に対して
使われる。IBDの治療にIL−10を投与する場合、静脈内
投与のような非経口投与が好ましい。最も好ましくは、
投与方法は静脈内投与であり、治療を受ける哺乳動物は
ヒトである。 IL−10投与量は、一般には体重1kgあたり約１μｇか
ら約100mgの範囲である。しばしばこの範囲は体重1kgあ
たり約10μｇから約1000μｇである。最も好ましくは、
体重1kgあたり約50μｇから約100μｇの量が投与され
る。 IL−10は単独で投与しても良いし、１つまたはそれ以
上の治療剤と一緒に共投与しても良い。そのような、腸
組織の散発性の炎症を制御するのに有用な化合物の例と
して、コルチコステロイド、サルファサラジン、サルフ
ァサラジンの誘導体、シクロスポリンＡのような免疫抑
制剤、メルカプトプリン、アザチオプリン、及びその他
のサイトカインがある。共投与は、一般に、複数（２つ
またはそれ以上）の薬剤が特定の期間中、患者（受容
者）の体内に存在することを意味する。典型的には、第
２の薬剤が第１の薬剤の半減期以内に投与されれば、こ
の２つの化合物は共投与されたとみなされる。 本発明は更に、哺乳動物から採ったサンプルのIL−10
を測定することにより、至適以下の量のIL−10により特
徴づけられる、ある哺乳動物の炎症状態の進展しやすい
素質を予見する方法をも供与する。至適以下の量とは、
検出できない量を含む。検出できる量であれば、既知の
正常なIL−10レベルと比較できる。あるいは、商品化さ
れて入手可能な診断キットを使って、IL−１、IL−６、
TNF及びIFN−γのような炎症性メディエーターを測定す
ることもできる。 これらのメディエーターのうち１つでも過剰に産生さ
れていれば、不十分な量のIL−10しかないことを示して
いる可能性がある。サンプル源としては血液が好まし
い。この方法により、IBDや貧血、関節炎、皮膚炎ある
いはIBDと関連する他の症状のような多くの炎症性状態
の傾向を予見することができる。 医薬組成物もまた提供される。潰瘍性大腸炎やクロー
ン病のようなIBDを患う哺乳動物に投与するための組成
物は、その哺乳動物において少なくとも１つのIBDの症
状や所見を改善する効果のある量のIL−10と、上記のよ
うな薬理学的に許容される担体を含む。 一般に、“症状”という語は、疾病または患者の状態
の主観的な事実全てを意味する。これは患者に知覚され
る事実を含む。IBDの症状の例として、下痢、腹痛、発
熱、メレナ、血便、体重減少がある。一般に“所見”と
いう語は、通常診察している医者に知覚される疾病また
は患者の状態の客観的事実、あるいは実験室での検査
や、超音波検査やラジオグラフィー試験等の他の試験に
より、それ自体明らかとなる特徴といった客観的事実全
てを意味する。 IBDの所見のいくつかの例として、腹部腫脹、舌炎、
アフタ性潰瘍、肛門裂創、肛門周囲瘻、貧血、吸収不良
や鉄欠乏がある。時折、所見と症状は重なり合う。例え
ば、患者が血便を訴え（症状）、研究室での試験で便の
検体が血液陽性であること（所見）等である。 本発明のこの態様の医薬組成物は、好ましくは非経口
投与に適した形のものである。好ましくは、効果的な量
を１単位の量とし、アンプルに入れて提供される。ある
いは、効果的な量の数倍の量を含むバイアルや、その他
の形態で提供される。薬理学的に許容される添加物の例
として、水溶性賦形薬、緩衝液、希釈液、殺菌剤及び防
腐剤がある。 IL−10活性を決定する為に、サイトカイン自体の生物
学的アッセイを用いることもできる。ヒトリンホカイン
の生物学的アッセイはAggarwal,Methods in Enzymology
116:441（1985）及びMatthews,et al.,（Clemens,et a
l.,eds.）,Cytokines and Interferons;A Partical App
roach:pp.221−225（IRI Press,Washington,D.C.1987）
に開示されている。ヒトIL−２及びGM−CSFは、これら
の因子依存的な細胞系CTLL−２及びKG−１でそれぞれア
ッセイでき、この細胞はATCCからTIB214及びCCL246の番
号で手に入れることができる。ヒトIL−３は、例えばMe
tclaf,“The Hemopoietic Colony Stimulating Factor
s"（Elsvier,Amsterdam,1984）に記載されたように、軟
寒天培地における広範囲の造血細胞コロニー形成に対す
る刺激能でアッセイできる。IFN−γは、例えばMeager
in Clemens,et al.（eds.）at pp.129−147のように抗
−ウイルスアッセイで定量できる。これらのサイトカイ
ンをモニターすることによって、有効量のIL−10をいつ
投与すべきかについて、有効な情報を得ることができ
る。ELISAのような免疫化学的アッセイも利用できる。 IL−10は水、生理食塩水または緩衝液のような水性担
体中で様々な添加剤及び／または希釈剤と共にまたはな
しに投与することができる。あるいは、亜鉛懸濁液のよ
うな懸濁液をIL−10を含有させて調製することができ
る。このような懸濁液は皮下（SQ）または筋肉内（IM）
注射に利用できる。IL−10と添加剤の比率は、これらが
共に有効量で存在する限り広い範囲で変えることができ
る。１回の用量としては、IL−10の量は約１マイクログ
ラム（μｇ）から約100ミリグラム（mg）までで用いる
ことができる。 １日の総投与量は、典型的には体重1kgあたり約１μ
ｇから約100mgの範囲である。好ましくは、投与量は体
重1kgあたり約10μｇから約1000μｇの範囲で選択され
る。より好ましくは、投与量は体重1kgあたり約50μｇ
から約100μｇの範囲で選択される。投与は、必要な治
療効果をあげるようなスケジュールで行なわれ、短期間
またはより長期間の定期的な投与でも、あるいは炎症が
散発的である場合には不定期な投与でも良い。 組成物は、経口的に投与しても注射によっても良い。
経口投与の処方では、消化管に存在する蛋白分解酵素か
らポリペプチドを保護する化合物が含まれる。注射は通
常筋肉内、皮下、皮内または静脈内である。あるいはま
た、適当な状況においては関節内注射または他の経路を
使うことができる。更に、IL−10を含有する組成物を患
者に埋め込むかまたはドラッグデリバリーシステムを用
いて注射しても良い。例えばUrquhart,et al.,Ann.Rev.
Pharmacol.Toxicol.24:199（1984）;Lewis,ed.“Contro
lled Release of Pesticides and Pharmaceuticals"（P
lenum Press,New York,1981）；米国特許No.3,773,919
及びNo.3,270,960を参照。 ペプチドは非経口的に投与するのが好ましく、１回の
投与量を注射可能な形で投与するのが好ましい。注射可
能な形の例としては、溶液、懸濁液及びエマルジョンが
ある。より好ましいのは、IL−10の有効量を静脈内に投
与するものである。 “有効量”の語は、本明細書においては、自己免疫の
状態または望ましくないもしくは適当でない炎症性もし
くは免疫系の応答の症状あるいは所見を改善するのに十
分な量を意味するものと定義する。典型的な哺乳動物の
宿主としては、マウス、ラット、ネコ、イヌ、及びヒト
を含む霊長動物がある。特定の患者に対する有効量は治
療すべき状態；患者の総体的な健康状態；投与の方法、
経路及び投与量、及び副作用の重さのような因子に依存
して変化する。 適当な投与量の決定は、この分野で知られるパラメー
ターを用いて臨床医が行なう。一般に、投与は最適投与
量よりやや少ない量から始め、その後、要求される、ま
たは最適の効果が達成されるまで少しずつ増加させる。
The Merck Manual § 269“Pharmacokinetics and Drug
Administration"参照。TNFα、IFN−γ、IL−１、及び
IL−６のレベルは有効な投与量が到達された時の重要な
指標となり得る。好ましくは、治療される哺乳動物由来
のIL−10を用いる。 典型的には、IL−10は生理食塩水、リンゲル液、デキ
ストロース溶液、及びこの分野で知られる他の水性担体
と共に注射される。適当な非水性担体も使用することが
でき、こうした例としては不揮発油及びエチルオレエー
トが挙げられる。好ましい担体は５％デキストロース含
有生理食塩水である。等張性及び化学的安定性を高める
ために、担体中に緩衝剤、防腐剤あるいは他の物質のよ
うな添加物を含むことがしばしば望まれる。 １日の総投与量は、１回の注射または持続注入として
与えられる。あるいはまた、静脈内ボーラス（bolus）
投与または筋肉内注射のような他の経路による投与の為
に、数回のより小さい投与量に分けても良い。好ましく
は、IL−10は静脈内ボーラスとして投与される。 IL−10は単独でも、また他の治療剤と組み合わせて投
与しても良い。炎症性腸疾患に適用するこうした薬剤の
例として、コルチコステロイド、サルファサラジン、サ
ルファサラジンの誘導体、及びシクロスポリンＡ、メル
カプトプリン、アザチオプリンのような細胞毒性を有す
る薬剤がある。典型的には、複数の薬剤の投与は、別個
に注入するか、続けて注射して行なう。適当な条件下で
は、複数の薬剤、例えば、IL−10と他のサイトカイン、
ステロイド、または他の治療剤を混合して同時に注入あ
るいは注射する。 IBD症状は散発的であり、従って効果的な治療は適切
な時期に少量を投与することで達成し得ることに留意す
べきである。あるいは、少量を持続的に投与することに
よって、患者である標的動物が長期間症状のない健康状
態を得ることができる。 共投与は、同時でも連続的でも良い。一般に、“共投
与”とは、（複数の）サイトカインが特定の期間中共に
患者（受容者）の体内に存在することを意味する。典型
的には、第２のサイトカインが、投与されるべき第１の
サイトカインの半減期以内に投与されれば、２つのサイ
トカインは共投与されたことになる。共投与は非経口的
であることが好ましく、更に好ましくは静脈内投与であ
る。有効量は、哺乳動物の体重1kgあたり約15μｇから
約1500μｇの範囲から選択される。 遅延型過敏症反応の阻害 本発明のこの態様は、有効量のIL−10を哺乳動物に投
与することを含む、哺乳動物における遅延型過敏症の反
応をインビボで阻害する方法を提供する。哺乳動物には
IL−10と共に有効量のIL−４を投与することができ、ま
た哺乳動物は典型的にはヒトである。IL−４とIL−10の
共投与は同時でも連続的でも良い。通常投与は非経口的
であり、好ましくは静脈内投与である。 更に、哺乳動物の体内の炎症部位への細胞の移動を阻
害する方法が本発明によって提供される。細胞の移動と
は、リンパ球、単球、及びマクロファージを含む哺乳動
物の細胞性免疫応答を炎症部位へ動員または誘引するこ
とである。また、哺乳動物組織の腫脹を阻害する方法が
提供される。 上記の方法は、IL−４及び／またはIL−10の、静脈内
投与のような非経口的、または局所的炎症部位付近への
投与を含むことができる。IL−４またはIL−10の有効量
は、通常哺乳動物の体重1kgあたり約15μｇから約1500
μｇの範囲から選択される。 本発明は更に、それぞれの有効量のIL−４及びIL−10
を哺乳動物に共投与することを含む、哺乳動物における
遅延型過敏症の反応をインビボで制限する方法を提供す
る。ここで共投与は非経口的であり、有効量は、哺乳動
物の体重1kgあたり約15μｇから約1500μｇの範囲から
選択される。有効量は約100μｇから約1000μｇの範囲
から選択することができる。 更に、本発明は哺乳動物におけるＴ細胞によるサイト
カイン産生の、IL−10による阻害を増強するキットを含
む。キットはIL−４とIL−10の混合物の１回の投与量を
含有するアンプルを含む。アンプルの代わりに他の容器
を使用することもできる。この例としては、バイアル、
プラスティックバッグ、ガラス製の試験管等がある。好
ましくは、IL−４とIL−10の混合物を非経口投与に適し
た形にする。１回の投与量は典型的には哺乳動物の体重
1kgあたりIL−４またはIL−10それぞれ約15μｇから約1
500μｇの範囲から選択される。 本発明の基礎となる概念は、Ｔ細胞活性に対するIL−
４とIL−10の協調的な効果である。本発明により、この
協調はＴ細胞に特異的に関連して確認されたことが初め
て示された。これまでのデータから、マクロファージま
たは単球に対する効果及びマクロファージのエフェクタ
ーとしての役割が示されてきた。Ｔ細胞活性に対するIL
−４とIL−10の追加的な効果は驚くべきものであり、特
に細胞性免疫に関する他の治療に利用できる。IL−４と
IL−10の組み合わせによってＴ細胞のサイトカイン産生
のIL−10介在性の阻害が増強される為、本発明は、サイ
トカイン産生に関連するＴ細胞の応答をコントロールす
ることが必要とされる場合に有用である。こうした例と
しては、遅延型過敏症、細胞性炎症及びＴ細胞の増殖と
活性化に対する効果がある。 例えば、自己免疫疾患である糖尿病メリタス（mellit
us）１型は、リンパ球、マクロファージ及び形質細胞に
よる島細胞浸潤によって特徴づけられる。Ｔ細胞からの
サイトカイン産生の抑制によって、糖尿病の症状及び島
細胞の破壊を改善できる。更に、本発明は、臓器移植及
び移植片に対する細胞性免疫応答を治療するのに有用な
役割を果たすことができる。 移植腎拒絶反応は、細胞性免疫が関与することが知ら
れている。移植された腎臓の領域において、サイトカイ
ンは細胞の活性化、増殖、凝集、線維化、増殖の阻害及
び細胞毒性を引き起こす。同様に、本発明は、GVHDの治
療に有用な役割を果たすことができる。更に、リンパ増
殖症である類肉腫症はDTHの減少及びＴ細胞またはヘル
パー細胞の活性化、引き続いて肉芽腫の形成という事実
と関連している。 実施例 本発明は、次の非限定的な実施例によって説明するこ
とができる。別に示さない限り、下記の固体混合物中の
固体、液体中の液体、及び液体中の固体に対して与えら
れた百分率は、それぞれwt/wt、vol/vol、wt/volであ
る。 IL−２依存性細胞増殖の阻害 実施例１‥IL−10は、CD32をトランスフェクトしたマウ
スＬ細胞で架橋された抗−CD3モノクローナル抗体によ
る活性化に続くヒトTh0、Th1、Th2“様”クローンの増
殖を阻害する。 細胞及び細胞系 使用したＴ細胞系はCD2⁺、CD3⁺、CD4⁺、及びCD8^-であ
った。クローンHY−06、827及び837は前に記載された
［Yssel,et al.,Eur.J.Immunol.16:1187（1986）及びHa
anen,et al.,J.Exp.Med.174:583（1991）］。Ｔ細胞ク
ローン827はHLA−DR3によって破傷風毒素（TT）を認識
し、Ｔ細胞クローンHY−06はMycobacterium lepraeの65
kD熱ショックタンパク質のペプチド２−12を認識する。
Ｔ細胞クローン837の抗原特異性は知られていない。 Ｔ細胞クローンSP−B21及びSP−A3は、胎児胸線及び
胎児肝臓の移植によってうまく再構成された重症複合免
疫不全（SCID）の患者から得た（Roncarolo,et al.,J.E
xp.Med.168:2139（1988））。Ｔ細胞クローンNP12、NP1
4及びNP44はアトピー性の患者のPBMCから樹立されたも
のであり、ハウスダスト中のダニの主要なアレルゲンで
あるDer p I分子のp89−117ペプチドに応答して特異的
に増殖する（Yssel,et al.,J.Immunol.148:738（199
2））。Ｔ細胞クローンCR253、CR378、CR380、AP74、及
びAP75は、慢性ライム関節炎の患者のPBMCから単離され
たものであり、Borrelia burgdorferiの60kD熱ショック
タンパク質ホモログ（HSP60）に対して反応性がある［S
hanafelt,et al.,J.Immunol.146:3985（1991）］。 これらのＴ細胞クローンを、そのリンホカイン産生の
プロフィールに基づいてＴヘルパーサブセットに割り当
てた（表１）。Ｔ細胞クローン（２×10⁵cells/ml）
は、前に記載されたように、24ウェルのリンブロ（Linb
ro）プレート（Flow,Mc Lean,VA）を用い、1mlあたり10
⁶個の放射線照射（4000rad）された同種異系の末梢血白
血球（PBL）、1mlあたり10⁵個の放射線照射（5000rad）
されたエプスタイン・バールウイルス感染Ｂ細胞系（EB
V−LCL）JY、及び0.1mg/mlの精製PHA（Wellcome Diagno
stics,Beckenham,Kent,UK）を含有する支持細胞混合液
中で２週間刺激した［Spits,et al.,J.Immunol.128:95
（1982）］。刺激後３から４日後に、培養液を分け、20
U/mlのrIL−２を含有する培地中で更に培養した。全て
のクローン化Ｔ細胞系及びEBV−LCLは、１％のヒトAB⁺
血清を添加したYssel培地（Yssel,et al.,J.Immunol.Me
thods 72:219（1984））で培養した。 CD32（FcγR II）（16.2CG7）をトランスフェクトさ
れたマウスＬ細胞はPeltz,J.Immunol.141:1891（1988）
（参考としてここに引用する）に記載された方法で調製
した。簡単にいえば、ヒト単球細胞系U937の突然変異体
から単離されたFcγR IIのcDNAクローン16.2を用いた
（Stuart et al.,J.Exp.Med.166:1668（1987）参照）。
標準的な部位特異的突然変異誘発法を用いて、細胞質ド
メインの最初のアミノ酸（アルギニン）の次の２個のリ
ジンのコドンを終止コドンに変える突然変異を起こすこ
とによって、細胞質領域を欠損した突然変異体を作成し
た。マウスＬ細胞の一過性のトランスフェクションは標
準的な方法で行った。 試薬 組換えIL−10はE.coliで発現させ、de Malefytらの方
法（J.Exp.Med.174:915（1991）及びWO/91/00349）に従
って精製した。 増殖アッセイ クローン化Ｔ細胞は支持細胞で刺激後10から12日で用
いた。この段階でＴ細胞クローンは小さく、“静止”状
態にある。Ｔ細胞クローン（２×10⁴cells/well）をCD3
2をトランスフェクトされたＬ細胞（２×10⁴cells/wel
l）と共に抗−CD3モノクローナル抗体（SPV−T3b）（１
μg/ml）（Spits,et al.,Hybridoma 2:423（1983））の
存在下、200μｌの平底プレート（Falcon,Becton Dicki
nson,Lincoln Park,NJ）でインキュベートした。Ｌ細胞
は、Ｔ細胞を添加する前にIL−10（100U/ml）の存在
下、あるいは非存在下でモノクローナル抗体（１μg/m
l）と１時間プレインキュベートし、その後72時間培養
した。Ｌ細胞は使用前にマイトマイシンＣ（50mg/ml）
（Sigma Chemical Co.St.Louis,MO）で37℃、45分間処
理し、続いて４回洗浄した。細胞は37℃及び５％CO₂中
で72時間インキュベートし、［³H］TdRで４時間パルス
標識し、Ysselらの方法（Eur.J.Immunol.16:1187（198
6））で回収した。結果は［³H］TdRの取り込みのcpmで
表し、３重で行なった培養の平均値を示す。 IL−10のＴ細胞クローンの増殖に対する効果は、Ｔ細
胞のリンホカイン産生パターンによって変化しなかっ
た。Ｔ細胞クローン837、SP−B21、及び827は活性化に
よりIL−２、IL−４、IFN−γを産生し、したがってこ
れらはヒトTh0クローンに相当すると考えられる。HY−0
6、CR253、CR378、CR380、AP74、及びAP75は高レベルの
IFN−γを産生し、IL−４及びIL−５は検出不能あるい
は低レベルである。これらのクローンはヒトTh1様クロ
ーンに相当すると考えられる。一方NP12及びNP44は、特
異的抗原による活性化に従って、高レベルのIL−４及び
IL−５を産生し、IFN−γは検出不能あるいは低レベル
であることから、ヒトTH2様クローンに相当する。Ｔ細
胞クローンSP−A3は活性化によってIL−２、IL−５、IF
N−γ、及びGM−CSFを産生するが、IL−４は産生しなか
った。 表１に示すように、IL−10は活性化されたＴ細胞クロ
ーン837、SP−B21、SP−A3、827、HY−06、CR253、CR37
8、CR380、AP74、AP75、NP12及びNP44の増殖を阻害し
た。このように、IL−10は全てのＴヘルパーサブセット
に属するＴ細胞クローンの増殖を阻害することができ
た。概して、IL−10は本発明の実験条件においてＴ細胞
クローンの増殖を20−50％阻害した。この阻害は用量依
存的であり、また抗−IL−10モノクローナル中和抗体19
F1で抑えられることから特異的であった。 齧歯動物のIL−10は種特異的であり、これらのヒトＴ
細胞クローンの増殖に効果がなかった。このことから、
IL−10はＴ細胞クローンに直接作用しているのであり、
抗−CD3モノクローナル抗体を架橋するのに用いられるC
D32をトランスフェクトされたマウスＬ細胞を介してい
るのではないことが示唆される。これらの結果から、IL
−10は、CD32をトランスフェクトされたＬ細胞上で架橋
された抗−CD3モノクローナル抗体により形成された、T
CR/CD3複合体を介した活性化に続くヒトTh0、Th1及びTh
2クローンの増殖を直接阻害することが示された。 実施例２‥IL−10はICAM−１、LFA−３、あるいはB7に
よって出される刺激性のシグナルに依存することなくCD
4⁺T細胞クローンの増殖を阻害する。ヒトＴ細胞クロー
ンの活性化はＴ細胞のアクセサリー分子と、抗原提示細
胞（APC）のこれらに相補的な構造との相互作用によっ
て調節することができる。LFA−１とICAM1、CD2とLFA
3、CD28とB7あるいはCTLA−４とB7との相互作用によ
り、Ｔ細胞の増殖及びエフェクター機能を高める刺激性
のシグナルが出されることが示されている。IL−10がこ
れらのアクセサリー分子の刺激性の作用に影響すること
によりＴ細胞の増殖を阻害しているのかどうかを決定す
るために、CD32と共にICAM−１、LFA−３、またはB7を
発現するＬ細胞を作成した。 pCD−SRα−LFA−3HYG、pCDM8−ICAM−1HYG及びpBJ−B7
HYGの作成 LFA−３のcDNAは、LFA−３特異的プライマーを用いた
PCR増幅によってRaji細胞のcDNAライブラリーから得
た。Raji細胞のcDNAライブラリーは前に記載されたよう
にpCD−SRaベクターで作成した。（Matsui et al.,Scie
nce 154:1788（1991））。膜貫通型のLFA−３のクロー
ニングの為に次のプライマーを用いた。 増幅生産物をサブクローニングするのに便利なよう
に、LFA−３センスプライマーはPst−１部位を持ち、LF
A−３アンチセンスプライマーKpn−１部位を持つように
設計した。増幅は、以下の条件で行なった:Raji細胞ラ
イブラリーのHind−III切断プラスミドDNA1μｇを、そ
れぞれのプライマー25nmole、dGTP、dATP、dCTP及びdTT
P（Pharmacia,Uppsala,Sweden）をそれぞれ125mM、50mM
KCl、10mMTris−HCl、pH8.3、1.5mM MgCl₂、1mg/ml
ゼラチン、及び５ユニットのTaqポリメラーゼ（IBI,New
Haven,CT）を含有する50μｌの反応液中で増幅させ
た。 混合液は、Perkin−Elmer/Cetus DNA Thermal cycler
で20サイクル（変性30秒 94℃、アニーリング30秒 55
℃、伸長60秒 72℃）インキュベートした。反応液の１
部５μｌを取り出し、同じ条件で２回目の増幅を行なっ
た。反応液をクロロホルムで抽出処理し、１％のアガロ
ースゲルにのせた。785bpと予想される増幅生成物を分
離ゲルから切り取り、Geneclean kit（Bio 101,La Joll
a,CA）を用いてシリカに吸着させることによって単離
し、Pst−１及びKpn−１で切断し、Bluescript II KS
（＋）にサブクローン化した（Stratagene,La Jolla,C
A）。 LFA−３を含有するいくつかのクローンを標準法で単
離し、４個のクローンについてシーケナーゼDNA seque
ncing kit（USB,Cleveland,OH）を用いたジデオキシ終
止法によって塩基配列を決定した。４個のクローンは全
て発表された配列に100％同じであった。これらのクロ
ーンの１つのPst−１−Kpn−１フラグメントを単離し、
pCD−SRa296発現ベクターにサブクローニングした（Mat
sui et al.,supra）。 pCDM8−ICAM−１［Blanchard et al.,J.Immunol.,13
8:2417（1987）］はBrian Seed博士に頂いた（Massachu
setts General Hospital,Boston,MA）。ハイグロマイシ
ン−Ｂ耐性をコードするアミノシクリトールホスホトラ
ンスフェラーゼ遺伝子をSV−40プロモーター及びポリア
デニル化シグナルの支配下におき、標準的な方法でpCD
−SRα−LFA−３及びpCDM8−ICAM−１のSfi−Ｉ部位に
挿入し、それぞれpCD−SRα−LFA−3HYG及びpCDM8−ICA
M−1HYGを生成した。pB7−B7HYGはSRαプロモーターの
支配下のヒトB7を含有しており（Makgoba et al.,Natur
e 331:86（1988））、L.Lanier博士に頂いた（DNAX Res
earch Insutitute）。 HLA−DR3またはCD32を発現するＬ細胞を、リポフェク
チン（BRL,Gaithersburg,MD）によって、メーカーの手
法に従ってpCD−SRα−LFA−３−HYG、pCDM8−ICAM−１
−HYGまたはpBJ−B7−HYGでトランスフェクトした。ト
ランスフェクションの48時間後に細胞を分け、200μg/m
lのハイグロマイシン−Ｂ（Lilly,Indianapolis,IN）を
含有する培地を添加し、培地は３日間毎に交換した。 12日後、個々のハイグロマイシン−Ｂ耐性コロニーが
見られるようになった。これらの細胞を集め、間接免疫
蛍光法でLFA−３、ICAM−１またはB7の発現を染色し、F
ACS−Star Plusで２回連続してポジティブソーティング
を行ない、精製した。共トランスフェクトされた細胞系
は、200μg/mlのハイグロマイシン−Ｂ及び10％FCSを添
加したRPMI−1640中で維持した。 FACS分析の為に、細胞をＶ−底ミクロタイタープレー
ト（Flow Laboratories,McLean,VA）で精製モノクロー
ナル抗体（10μg/ml）と共に30分間４℃でインキュベー
トした。0.02mMのアジ化ナトリウム及び１％BSA（Sigm
a,St.Louis,MO）を含有するPBSで２回洗浄後、細胞をヤ
ギ抗−マウス抗体（TAGO,Inc.,Burlingame,CA）のFITC
標識Ｆ（ab'）２フラグメントの1/40希釈液と共に30分
間４℃でインキュベートした。更に３回洗浄した後、標
識細胞サンプルをFACScan（Becton Dickinson,Sunnyval
e,CA）でフローミクロフルオリメトリー（FMF）によっ
て分析した。Krenskyらによって記載された抗−LFA−３
モノクローナル抗体TS 2/9を用いた（J.Immunol.132:2
180（1984））。Azumaらによって記載された抗−ICAM−
１モノクローナル抗体LB2及び抗−B7モノクローナル抗
体L307を用いた（J.Exp.Med.175:353（1992））。 Ｔ細胞クローンは、IL−10の存在下または非存在下
で、CD32と、ICAM−１、LFA−３またはB7を共に発現し
ているＬ細胞に架橋された抗−CD3または抗−CD2モノク
ローナル抗体によって活性化した。Ｔ細胞クローンSP−
B21及びNP12の増殖は、ICAM−１及びLFA−３を共に発現
しているCD32導入Ｌ細胞によって提示された抗−CD3モ
ノクローナル抗体でクローンを刺激した場合に促進され
ることが見いだされた。LFA−３の共発現はICAM−１あ
るいはB7と比較してＴ細胞クローンの増殖促進に対して
より有効であり、増殖が一貫して２から４倍に増加し
た。ICAM−１の共発現によっては、中位の増殖促進が観
察された。B7は概してＴ細胞クローンの増殖に影響しな
かった。 IL−10は、ICAM−１、LFA−３及びB7の存在下におい
ても、CD32をトランスフェクトしたＬ細胞に架橋された
抗−CD3モノクローナル抗体による活性化に伴うＴ細胞
クローンの増殖応答を阻害した。しかしながら、LFA−
３を発現するＬ CD32細胞によって活性化したＴ細胞ク
ローンの増殖のIL−10による阻害の程度はより低かっ
た。 Ｔ細胞クローンの増殖はまた、Ｔ細胞クローンSP−B2
1及びNP−12については、Ｌ CD32細胞に架橋した抗−C
D2モノクローナル抗体のマイトジェニックな組み合せに
よっても誘発された。Ｔ細胞クローン（２×10⁴cells/w
ell）を、前記したように、200μｌの丸底プレート（Li
nbro,Flow Laboratories,Mc.Lean,VA）中で抗−CD2モノ
クローナル抗体X11−１（0.5mg/ml）及びD66（0.5mg/m
l）で刺激した。これらの抗体の作成はBrottier,J.Immu
nol.135:1624（1985）に記載されている。 ICAM−１またはLFA−３を共発現した場合、Ｔ細胞の
増殖は影響されなかった。しかしながら、CD32とB7を共
発現するＬ細胞を用いた場合、中位の増殖促進が観察さ
れた。CD32と、ICAM−１、LFA−３またはB7を共発現し
ているＬ細胞を用いた場合、抗−CD2によって誘発され
るＴ細胞クローンの増殖はまた、IL−10の存在下で30−
50％阻害された。IL−10はＴ細胞クローンによるLFA−
１、CD2、またはCD28の発現には影響しなかった。まと
めていえば、これらの結果より、IL−10のＴ細胞増殖に
対する直接の阻害効果は、ICAM−１、LFA−３、またはB
7によって出される刺激性のシグナルの変化によるもの
ではないことが示された。 実施例３‥IL−２はIL−10によるＴ細胞増殖の阻害を抑
制することができるが、IL−４はできない。 IL−10によって誘発されるＴ細胞増殖の阻害をIL−２
あるいはIL−４の添加によって抑制できるかどうかを決
定するために、IL−２またはIL−４の存在下で、CD32
と、ICAM−１、LFA−３またはB7を発現しているＬ細胞
上に架橋された抗−CD3または抗−CD2モノクローナル抗
体によってＴ細胞クローンを活性化した。IL−２は20U/
ml、IL−４は200U/mlで添加した。精製ヒトｒ−IL−４
（比活性２×10⁷U/mg）はSchering−Plough Research
（Bloomfield,NJ）より得た。 低濃度のIL−２の添加によって、Ｔ細胞クローンSP−
B21及びNP−12の増殖に対するIL−10の阻害効果を完全
に抑制することが見いだされた。しかしながら、IL−４
は200U/mlの濃度まで添加しても、Ｔ細胞増殖に対するI
L−10の阻害効果を抑制することができなかった。IL−1
0の存在下でＴ細胞クローンを72時間まで培養しても、I
L−２受容体のα鎖またはβ鎖の発現のダウンレギュレ
ーションには至らなかった。更に、IL−10の存在下でＴ
細胞クローンをPHAで活性化しても、IL−２受容体のα
鎖及びβ鎖の発現の誘導には効果がなかった。Herve,et
al.,Blood 75:1017（1990）に記載された抗−IL−2Rα
モノクローナル抗体BB10を用いた。Takeshita,J.Exp.Me
d.169:1323（1989）に記載された抗−IL−2Rβモノクロ
ーナル抗体Tu27も用いた。まとめていえば、これらの結
果より、Ｔ細胞増殖のIL−10による阻害はIL−２によっ
て抑制し得るがIL−４によっては抑制されず、これはIL
−２産生の阻害に起因するであろうことが示された。 実施例４‥IL−10はヒトＴ細胞クローンによるIL−２産
生を阻害するが、IL−４、IL−５、IFN−γ及びGM−CSF
の産生は阻害しない。 Ｔ細胞クローンの増殖に対するIL−10の直接的な阻害
効果がIL−２産生の阻害によるものであるかどうかを決
定するために、IL−10の存在または非存在下、Ｔ細胞ク
ローン837、SP−B21、827、HY−06、CR253、NP12、及び
NP44を、CD32と、ICAM−１、LFA−３またはB7をトラン
スフェクトされたＬ細胞上に架橋された抗−CD3モノク
ローナル抗体によって24時間活性化し、IL−２、IL−
４、IL−５、IFN−γ及びGM−CSFの産生をサイトカイン
−特異的ELISAによって測定した。これらのELISAの感受
性は:IL−２、10pg/ml;IL−４、50pg/ml;IL−５、50pg/
ml;IFN−γ、300pg/ml;及びGM−CSF、50pg/mlであっ
た。 前記した様に、支持細胞で刺激後10−12日にＴ細胞ク
ローンをリンホカイン産生の定量の為に集めた。細胞を
５％CO₂の湿潤条件下で37℃で24時間インキュベート
し、培養上清を集め、250×ｇで遠心し、分割して試験
まで−20℃に保存した。Ｔ細胞クローンの活性化によ
り、そのTh細胞サブセットのサイトカイン産生プロフィ
ールに従って、IL−２、IL−４、IL−５、GM−CSF及びI
FN−γが産生された。一般に、サイトカイン産生の最高
量は、Ｔ細胞クローンをCD32とLFA−３あるいはB7を発
現したＬ細胞によって活性化した時に測定された。実
際、IL−２の産生は、Ｌ CD32−LFA−３及びＬ CD32
−B7トランスフェクタント上の抗−CD3モノクローナル
抗体で活性化されたＴ細胞クローンの上清に多く検出さ
れた。IL−10はＴ細胞クローンによるIL−２の産生を強
く阻害した。IL−４の産生はIL−10によって影響され
ず、一方、IL−５、GM−CSF、及びIFN−γの産生はIL−
10によってわずかに阻害されたに過ぎなかった。このよ
うに、IL−10は活性化ヒトＴ細胞クローンによるIL−２
の産生を特異的に阻害した。 実施例５‥IL−10は、ポリクローナルな活性化後のヒト
Ｔ細胞クローンによるIL−２産生を阻害する。 IL−10がヒトＴ細胞クローンに直接作用してリンホカ
イン産生を阻害することができるかどうかを更に決定す
る為に、Ｔ細胞クローン827、SP−B21及びNP44を、アク
セサリー細胞の非存在下、テトラデカノイルホルボール
アセテート（TPA）（Calbiochem）、抗−CD3モノクロー
ナル抗体、及びTPA、PHA及びTPA、あるいは抗−CD2モノ
クローナル抗体のマイトジェニックな組み合せによって
活性化した。Ｔ細胞クローンは１×10⁶cells/mlの濃
度、PHA（100ng/ml）、抗−CD3モノクローナル抗体SPV
−T3b（１μg/ml）及びTPA（1ng/ml）で刺激した。 表２に示すように、Ｔ細胞クローン827、SP−B21及び
NP44のポリクローナルな活性化により、そのリンホカイ
ン産生プロフィールに従って高レベルのリンホカイン産
生が起きた。IL−10は、調べた全ての活性化の方法でこ
れらのクローンによるIL−２の産生を強く阻害したが、
IL−４、IL−５、IFN−γ、及びGM−CSFの産生は影響を
受けなかった。IL−10は、抗−CD3モノクローナル抗体
＋TPA及びCa⁺⁺イオノフォア＋TPAによる活性化に伴なう
これらのＴ細胞クローンによるIL−２の産生を阻害する
ことができたことから、阻害のメカニズムはＴ細胞受容
体/CD3情報伝達経路には関与せず、タンパク質キナーゼ
Ｃ活性化の下流に作用することが示された。 実施例６‥IL−10は、ヒトＴ細胞クローンによるIL−２
生成をmRNAレベルで阻害する。 IL−10がどのレベルでIL−２の産生を阻害するかを決
定する為に、IL−10の存在または非存在下、抗−CD3モ
ノクローナル抗体及びTPAによる活性化後のＴ細胞クロ
ーンNP−12、HY−06、827、SP−A3、837、及びSP−B21
において、IL−２、IL−４、IL−５、及びIFN−γのmRN
Aの発現をノーザンブロットによって分析した。全RNAは
Chirgwinらの方法（Biochem.18:5294（1979））で単離
した。ノーザン分析はde Waal Malefyt,J.Immunol.142:
3634（1989）に記載されたように行なった。 次のプローブをノーザン分析に用いた:Yokota,et al.
In Lymphokines 13（1987）に記載されたpCD−hIL−２
の285bpのPst−Ｉ−Xba−Ｉフラグメント（nt1−285）;
Yokota,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:5894（198
6）に記載されたpCD−hIL−４の318bpのNhe−Ｉ−EcoR
Iフラグメント（nt106−424）;Yokota,supraのpCD−hIF
N−γの1100bpのPst−Ｉ−Hinc−IIフラグメント（nt5
−1106）；及びde Waal Malefyt,et al.,J.Immunol.14
5:2297（1990）に記載されたpALの1200bpのPst−Ｉフラ
グメント。 IL−10はこれらのクローンで発現されるIL−2mRNAの
レベルを強く阻害したが、Th0−及びTh2−様クローンに
よるIL−４及びIL−５の発現、あるいはTh0−及びTh1−
様クローンによるIFN−γの発現には影響しなかった。
これらの結果から、IL−10はヒトＴ細胞クローンによる
IL−２の産生をmRNAレベルで特異的に阻害することが示
された。 実施例７‥IL−10は、末梢血細胞から単離されたヒトＴ
細胞によるIL−２産生を阻害する。 IL−10が静止状態のＴ細胞の増殖及びIL−２産生を阻
害できるかどうかを決定した。Ｔ細胞を末梢血から単離
し、CD32導入Ｌ細胞上で、あるいはICAM−１、LFA−３
またはB7が共発現したCD32細胞上で架橋された抗−CD3
または抗−CD2モノクローナル抗体で活性化した。総PBM
NCは、Boyum,A.,Scan.J.Clin.Lab.Invest.21（Suppl 9
7）:77（1968）に記載されたフィコールハイパーク（Fi
coll−Hypaque,Sigma Diagnostics,St.Louis,MO）密度
勾配上で遠心分離することにより健康なドナーのバフィ
ーコートから単離した。 Ｔ細胞は、プラスチックへの吸着、ナイロンウールカ
ラム通過、磁石を利用した涸渇によるネガティブ選択に
従ってPBMNCから精製した。簡単にいえば、100×10⁶個
のPBMNCを100mmの組織培養皿（Becton Dickinson,Linco
ln Park,NJ）中で、１％のヒトAB型の血清を添加したYs
sel's培地で37℃で30分間培養した。非吸着細胞を取
り、ナイロンウール（Robbins Scientific,Sunnyvale,C
A）カラムを通した［Julius,et al.Eur.J.Immunol.3:64
5（1973）］。続いて細胞を飽和濃度の抗−CD14（Leu M
3）、CD16（Leu 11a）、CD19（Leu 12）、及びCD56（Le
u 19）モノクローナル抗体で４℃で30分間インキュベー
トし、洗浄し、ヒツジ−抗−マウスIgGでコートしたマ
グネティックビーズ（Dynabeads M450,Dyal A.S.,Oslo,
Norway）と、ビーズ対細胞の比率が40:1になるようにし
てインキュベートした。 混合液を４℃で30分間ゆっくり振とうしながらインキ
ュベートし、ロゼット形成細胞をメーカーの説明に従っ
て磁気粒子収集機で除去した。Ｔ細胞集団は97−99％が
CD2⁺、CD3⁺であった。抗−CD14（Leu M3）、CD16（Leu
11a）、CD19（Leu 12）、及びCD56（Leu 19）モノクロ
ーナル抗体、及び適当なアイソタイプの対照モノクロー
ナル抗体はBecton Dickinson,Mountain View,CAから購
入した。 PBMNC Ｔ細胞（２×10⁵cells/well）は、前記したよ
うにLFcγR II細胞のトランスフェクタントに架橋した
抗−CD3または抗−CD2モノクローナル抗体で刺激した。
37℃でのインキュベーション24時間後に培養上清を採取
した。 静止Ｔ細胞の活性化はCD32 Ｌ細胞上にB7抗原が存在
することに完全に依存することが見いだされた。CD32
Ｌ細胞に架橋された抗−CD3または抗−CD2モノクローナ
ル抗体は共にＴ細胞の増殖及びリンホカイン産生の誘導
に無効であった。更に、これらの細胞にICAM−１または
LFA−３をトランスフェクションしても無効であった。
しかしながら、B7をトランスフェクトしたCD32 Ｌ細胞
上に架橋された抗−CD2または抗−CD3モノクローナル抗
体は、Ｔ細胞の強い増殖と、高レベルのIL−２、IFN−
γ及びGM−CSFの産生を引き起こした。IL−10はこれら
の条件では静止Ｔ細胞の増殖を有意に阻害しなかった。
一方、IL−10はIL−２の産生を阻害したが、これらの細
胞によるIFN−γ及びGM−CSFの産生を阻害しなかった。 しかしながら、IL−10の存在下で産生したIL−２のレ
ベルはポイントテストの時点（３日目）で最大の増殖を
引き起こすのになお十分であった。これらの結果を総合
すると、アクセサリー細胞上でのB7との相互作用による
Ｔ細胞でのCD28またはCTLA−４の会合（engagement）
が、静止Ｔ細胞による増殖とリンホカイン産生の誘導に
絶対的に必要であること、及びIL−10がこれらの条件下
においてもなおIL−２産生を阻害することができること
が示された。 実施例８‥IL−10は、ヒトHLA分子をトランスフェクト
したマウスＬ細胞を抗原提示細胞として用いた場合、抗
原特異的なＴ細胞増殖を阻害する。 HLA−DR3あるいはHLA−DR3とICAM−１、LFA3またはB7
をトランスフェクトしたマウスのＬ細胞を上記したよう
に抗原提示細胞として用いた場合の、破傷風毒素（TT）
特異的Ｔ細胞クローン827及びM.Leprae 65kD hsp pt
［２−12］特異的Ｔ細胞クローンHY−06の抗原特異的増
殖に対するIL−10の効果を調べた。Ｌ細胞トランスフェ
クタントによるHLA−DR、ICAM−１、LFA3及びB7の発現
のFACSプロフィールより、IL−10はこれらの細胞でのク
ラスII MHCの本質的な発現に効果がないことが示され
た。 破傷風毒素はB.Bizzini博士（Institute Pasteur,Par
is,France）より提供されたものであり、最終濃度１μg
/mlで用いた。Hsp pt［２−12］はペプチドの固相合成
法で作成し、分析用逆相HPLC及びアミノ酸分析を用いて
チェックした。ペプチドは最終濃度0.5μg/mlで用い
た。 Ｔ細胞クローン827及びHY−06の刺激、増殖アッセイ
及びサイトカインの測定は前記したように行なった。HL
A−DR3をトランスフェクトしたＬ細胞を抗原提示細胞
（APC）として用いた場合、IL−10がHY−06と827の抗原
特異的な増殖を用量依存的に阻害することが見いだされ
た。10U/mlで添加したIL−10は阻害活性を有し、100U/m
l及び500U/mlでは30−50％までの増殖阻害がみられた。 この結果は、APCとしてHLA−DR及びICAM−１、LFA3ま
たはB7をトランスフェクトしたＬ細胞を用いた場合にも
認められた。Ｔ細胞クローン827及びHY−06の増殖反応
は、LFA3を共トランスフェクトしたＬ細胞を用いた場合
に増大し、IL−10の阻害効果は低くなった。827及びHY
−06の増殖応答のIL−10による阻害は、抗−IL−10モノ
クローナル中和抗体19F1によって完全に抑制され、阻害
が特異的であることを示した。これらの結果より、HLA
−DR導入マウスＬ細胞をAPCとして用いた場合、IL−10
が827及びHY−06の抗原特異的な増殖応答を阻害するこ
とが示された。 IL−10による抗原特異的な増殖の阻害はＴ細胞レベル
であることが見いだされた。これを決定する為に、ヒト
またはマウスのIL−10の存在下で、Ｔ細胞クローン827
及びHY−06をTT及びpt［２−12］で活性化し、IL−10が
抗原提示Ｌ細胞に作用しているのか、あるいは直接Ｔ細
胞クローンに作用しているのかを調べた。既に述べたよ
うに、ヒトIL−10はヒト及びマウスの細胞に作用する
が、マウスのIL−10はマウスの細胞にのみ作用する。 HLA−DRのみをトランスフェクト、またはICAM−１、L
FA3またはB7と共に共トランスフェクトしたＬ細胞をAPC
として用いた場合、マウスのIL−10は827及びHY−06の
抗原特異的な増殖を阻害することができないことが見い
だされた。これらの結果より、IL−10はヒトＴ細胞クロ
ーンの増殖に対して直接的な効果を有することが示され
た。 Ｔ細胞クローン827及びHY−06を、IL−10及びIL−２
の存在下または非存在下、HLA−DRのみ、またはICAM−
１、LFA3またはB7と組み合わせて発現しているＬ細胞及
びTTまたはpt［２−12］で活性化し、外からのIL−２の
添加によってIL−10の阻害効果を抑制できるかどうかを
調べた。低濃度のIL−２によってIL−10のＴ細胞クロー
ン827及びHY−06の抗原特異的増殖に対する阻害効果が
抑制された。 IL−10の存在下または非存在下、HLA−DRのみ、また
はICAM−１、LFA3またはB7と組み合わせて発現している
Ｌ細胞及びpt［２−12］でＴ細胞クローンHY−06を活性
化し、24時間後に採取した培養上清中のIL−２及びIFN
−γの産生を決定した。IL−10は抗原特異的な活性化後
のＴ細胞クローンHY−06によるIL−２の産生を阻害した
が、IFN−γの産生は阻害しなかった。まとめていえ
ば、これらの結果より、IL−10はIL−２の生成の特異的
な阻害によって抗原特異的なＴ細胞の増殖を阻害するこ
とが示された。 炎症性腸疾患 IBD（炎症性腸疾患）のマウスのモデルが確立されて
いる。このモデルは、IBDの病因及びメカニズムの解明
に役立つ。更に、様々な治療薬のための実験的フォーラ
ムを提供する。このモデルを確立するために、IL−10遺
伝子を除去するか、無効にするか、あるいは実験動物で
発現できないようにする。この動物は“ノックアウトさ
れた"IL−10遺伝子を有する、または“ノックアウト”
（KO）動物であると呼ばれる。KOはこの分野で知られた
数種の手段のいずれによっても行なうことができる。 例えば、IL−10遺伝子が不活化された形質転換動物を
作ることができる。Goodnow,C.,“Transgenic Animal
s,"1502−1504,Encyclopedia of Immunology,Roitt（e
d.）,Academic Press,San Diego（1992）参照。簡単に
いえば、授精した卵母細胞の前核に精製DNAを顕微注射
する。その後、卵母細胞を養母の輪卵管に外科的に移植
する。あるいは、ホモ接合の突然変異動物を単離するた
めに、標準的な遺伝的飼育法を用いることができる。 更に、マウスの生殖細胞の特定の遺伝子を不活化する
方法がある。この場合、突然変異体の遺伝子（transgen
e）が相同的組み換えによって野生型の遺伝子の代わり
に導入される。受精幹（ES）細胞は“マウスの未分化胚
芽細胞から単離してインビトロで培養し、その後別の未
分化胚芽細胞に再移植して、移植されたマウスの体細胞
及び生殖細胞の組織を別々にコロニー形成することがで
きる”。Goodnow at 1503。 培養中のES細胞にDNAを導入して未分化胚芽細胞を養
母に外科的に移植する。互いに対になったヘテロ接合の
突然変異体の子孫が生まれ、ついには２個の突然変異を
有する対立遺伝子を持った子孫、例えばホモ接合の突然
変異体が作られる。これらの子孫は目的となる遺伝子に
おいて機能的な対立遺伝子を持たないことになり、特定
の遺伝子を取り除く為の“遺伝的切開”ができるように
なる。生まれた子孫の分析により、KOマウスにおける標
的遺伝子の、結果として生じる表現型を生む為の役割を
洞察することができる。 特定の遺伝子の欠損を有する実験動物を作る更に別の
方法としては、McMahon,et al.,“The Midbrain−Hindb
rain Phenotype of Wnt−1^-/Wnt−1^- Mice Results fro
m Stepwise Depletion of engrailed−Expressing Cell
s by 9.5 Days Postcoitum,"Cell 69:581（1992）及びT
ravis,“Scoring a Technical Knockout in Mice,"Scie
nce 256:1392（1992）を参照せよ。更に適用できる技術
としては突然変異誘発及びアンチセンスの技術がある。
Goodnow,C.（1992,supra）参照。 実施例９‥マウスの炎症性腸疾患モデル IL−10遺伝子を欠いたマウスを飼育した。一般的な技
術の記載及び特定の遺伝子を欠損したマウスの作成方法
については、以下を参照すること。Kuhn et al.Science
254:707（1991）;Capecchi,Science 244:1288（198
9）;Robertson（ed.）Teratocarcinomas and embryonic
stem cells:A Practical Approach,I.R.L.Press,Oxfor
d（1987）；及びZijestra,et al.Nature 336:348（198
9）。IL−10遺伝子を欠いたマウスは、以下IL−10Tマウ
ス、あるいはノックアウト（KO）マウスと呼ぶ。 第１群 ４匹のマウスを骨髄のアッセイの為に犠牲にし
た。骨髄の１部を、骨髄性及び赤血球の前駆細胞の生成
能を決定する為に解析し（表３参照）、また幹細胞の生
成を評価する為に分析した（表４参照）。骨髄の残り
は、正常な血液産生を支持する微小環境細胞の能力を評
価する為の長期骨髄培養に用いた。胸腺及び脾臓は正常
な数のＴ細胞及び正常な数のＢ細胞を有していた。前駆
細胞及び幹細胞の短期のアッセイ法は下記の表に記載し
た。対照マウス及びノックアウトマウスの細胞は別々に
保存した。 IL−10Tマウスは骨髄球、赤血球及び幹細胞の産生に
おいては明らかな欠陥は示さなかった。同時に、長期の
培養により、IL−10Tマウス由来の培養を含む全ての培
養中で支持的な間質の層が形成された。これらの培養
は、２つの段階で生じた：まず、細胞を、継続的な血液
産生を支持する為に必要な間質層の複合体を形成するよ
うに培養中に入れた。次に、間質細胞と関わる実際の前
駆体となる細胞を提供する為に、培養を、同じ型のドナ
ーから得た別の骨髄細胞と共に再度まいた。この第２段
階は、第２群及び第３群のマウスが利用可能になった時
に行なった。 第２群及び第３群 これらの動物から得た骨髄細胞は、
長期骨髄培養実験を完了する為に必要であった。この目
的にこれらの骨髄を用いた上、他の実験を行なった（表
５−９参照）。IL−10T動物は貧血であるが、骨髄の前
駆体は正常なレベルを有しているように思われた。従っ
て、これらの貧血を評価し、臓器を組織学的に観察し
た。 RBC形態学 全ての対照動物は正常な外観の赤血球（RB
C's）を有していた。IL−10Tマウスでは様々な形態を示
した。IL−10T ＃１は小赤血球を有していた：＃２及
び＃３は小赤血球の他、いくつかの大赤血球、色素形成
過多の細胞及び時に有核赤血球（NRBC's）を有してい
た。赤血球スメアをニューメチレンブルーで染色し、リ
ボソームの染色を示した細胞を調べた。非常に若い赤血
球（網状赤血球）において染色が陽性となり、これは造
血器官からの未熟な細胞の放出を意味している。これは
網状赤血球数として示される。 IL−10Tマウスの臓器組織学 心臓、肺、腎臓、及び胸
腺の切片を観察したところ正常な外観を呈した。肝臓は
時折単球及び好中性顆粒球が集中している他は正常に見
えた。脾臓は著しく異常であった。濾胞が存在したが、
赤色髄領域は造血細胞に満ちており、ほとんどはNRBC's
及び芽球型（未熟な細胞）であった。成熟RBC'sはほと
んどまたは全くなく、マクロファージにおける鉄の貯蔵
はなかった。 以下のデータはコロニー形成アッセイの結果である。
アッセイは骨髄細胞と同様に脾臓細胞で行なった。IL−
３＋IL−６の代わりにIL−３＋ｃ−kitリガンドをコロ
ニー形成細胞を刺激する為に用いた。最初のアッセイ
（上段）で得られたBFU−ｅの数を次のアッセイで得ら
れたBFU−ｅの数と比較することによって証明されるよ
うに、IL−３＋ｃ−kitリガンドの組み合せは赤血球前
駆体を刺激するのにより効果的である。 糞便試験 IL−10Tマウスの糞便試験は寄生虫感染を示
す卵の存在を明らかにはしなかった。上部または下部腸
管に住む成熟寄生虫を示す証拠は得られなかった。 動物は僅かにから顕著な貧血の間まで様々であった。
貧血は赤血球を製造できないということでは説明できな
い。IL−10Tマウスは貧血を補償しようとする徴候を示
した。最初に、彼らはその脾臓中でRBC前駆体を正常の
数より多く産生した。マウスにおいては、通常脾臓がRB
C欠損を補償しようとするであろう。マウス脾臓は正常
のマウスより二倍大きく、RBCを発生しようと過剰活性
であった。 何匹かのマウスはうまく補償した。それらはその血液
中に正常に近い数のRBCを持っており、また網状赤血球
数が比較的正常であったので多くの非成熟細胞は血流中
に放出されていなかった。しかしながら、その他のマウ
スはうまくいかなかったので早熟のまま細胞を血流中に
押し出し、そのために網状赤血球数が非常に高かった
（すなわち、17％）。それらはまた、いくつかの循環す
る有核のRBCも持っていた。 これらのマウスはまた、正常より高い血小板数を持
ち、ならびにその脾臓中の巨核球の数が上昇していた。
この事はそれらが出血したことの徴候である。血液の損
失は鉄貯蔵の涸渇による慢性貧血の理由を説明するであ
ろう（この鉄涸渇は脾臓および骨髄の両方で明らかであ
った）。剖検により内部出血がないのは明らかであっ
た。しかしながら、IL−10Tマウスのほとんどはその糞
便に血液が存在し、また、直腸脱を示した。マウスは詳
細に検討され、蟯虫、条虫類またはその他の寄生虫感染
は陰性であることが観察された。糞便中の陽性出血およ
び貧血の重症度の間に直接の関連があった。 貧血および出血の問題に加えて、IL−10Tマウスは血
液中にリンパ球より多くの好中球性顆粒球を持ってい
た。これはマウスの正常時と反対である。末梢血分化を
参照されたい（表６）。この観察結果はまた脾臓コロニ
ー形成アッセイで観察された骨髄球様前駆体の非常な増
加（表９）と一致している。したがって、これらのマウ
スは”慢性炎症の貧血”症候群を罹患している。 剖検において、IL−10Tマウスおよび同腹子対照から
の組織断片が比べられた。対照からのすべての検体は正
常に見えた。IL−10Tマウスでは胸腺および脊髄組織は
正常に見えた。脾臓では赤芽球および骨髄芽球に巨核球
を加えたものが僅かから顕著に増加していた。RBCプー
ルは小さいかまたは本質的に存在していなかった。プル
シアンブルー染色は鉄貯蔵の涸渇を示し、骨髄外造血が
増加した証拠があった。 鉄貯蔵の涸渇は血液損失と一致しており、異常な赤血
球生成を生じる。全体の実験では、脾臓は正常の1.5か
ら３倍の大きさであった。腸間膜リンパ節は正常に比べ
て非常に大きく、ほとんど正常の脾臓の大きさであっ
た。ＢおよびＴ−細胞小胞は同様に拡大されており、こ
の様子は炎症応答と一致している。 小腸はよく形成された粘膜および粘膜下組織を示し
た。いくつかの切片では多形核白血球（PMN）および単
核細胞がわずかに増加していた。大腸および直腸では結
腸の下部を含む所から広がった直腸の著しい炎症を示し
た。著しい量の浮腫および湿潤細胞が明らかであった。
PMNが主たる細胞型であったが、好酸球、リンパ球、形
質細胞および上皮様細胞（上皮に似ている細胞）も存在
した。粘膜、陰窩および粘膜下組織に炎症があった。し
ばしば炎症が筋層（特に、内部括約筋領域）に観察され
た。多くの領域において、上皮は失われていたかまたは
存在しなかった。多発性病変はRBCおよびPMNと凝集した
繊維性物質を示した。いくつかの血管はRBCでうっ血し
ていた。上皮細胞の凝集は肉芽腫の初期形成（しかし完
全に形成された肉芽腫ではない）が明らかであることを
示唆している。慢性的炎症を起こすことが可能な寄生
虫、卵または細胞内細菌は見あたらなかった。多発性病
変および出血は便潜血試験の陽性結果と一致している。
全体像は二次的貧血およびるいそうを持つIBDと一致し
ている。 実施例10 外因性IL−10処置に応答するIL−10 KOマウ
ス IL−10遺伝子を欠く４匹のマウス（IL−10 KO）およ
び３匹の正常対照マウスが試験された。対照マウスは正
常の身体的外見を持っていた。対照マウスの３匹すべて
が陰性潜血便試料を示し、正常に見える直腸を持ってい
た。IL−10 KOマウスの何匹かは対照より有意に小さ
く、不健康な徴候を示していた。それらは正常対照と比
較してしわくちゃの毛を持ち、元気が悪かった。４匹の
IL−10 KOマウスの１匹は背が曲がっており、異常な足
どりで歩いていた。IL−10 KOマウスの４匹すべてが腫
張した直腸および紅班性直腸組織または明確な直腸脱を
持っていた。 実験KOマウスの２匹は二つの別々の場合に明確に陽性
である潜血便試料を示し、一方、第三のマウスはある場
合には陰性であったが二回目はあいまいであった。４匹
すべてのKOマウスで直腸スメアが実施され、３匹が多量
の好中球性顆粒球を含む化膿性滲出液を示した。動物の
個々のスメア中に赤血球もまた存在し、それらは試料採
取時の直腸の出血に由来する。IL−10 KOマウスは時間
によるるいそうを示したので、IL−10 KOマウスおよび
正常対照の体重を本試験の一部として記録した。 IL−10マウスの３匹に２週間毎日35マイクログラムの
IL−10が注射された。これら３匹のマウスは一貫して化
膿性滲出液を示した（３匹の内２匹のみが出血の徴候も
示し、３匹の内１匹は背が曲がっており歩行が異常であ
った）。１匹のIL−10 KOマウス（出血および化膿性滲
出液が陰性）および正常対照には２週間毎日トロメタミ
ン（TRIS）緩衝液が注射された。一般的健康度、身体的
外観、直腸滲出液、潜血および体重がモニターされた。 IL−10注入２週後、３匹のIL−10 KOマウスすべてが
元気を増し、毛がなめらかになり、姿勢および歩行が正
常になった。３匹すべてに炎症の徴候がまだ存在してい
るが直腸の腫脹は減少を示した。３匹すべてで潜血の結
果が陰性であり、直腸スメアでの赤血球は見られなかっ
た。滲出液の量が減少した；しかしながら、好中球性顆
粒球はまだ直腸スメアで観察された。１匹の動物のスメ
アではこの時点で好中球性顆粒球より上皮およびリンパ
球細胞の方が多かった。１匹の動物は体重を約16グラム
に維持した。他の２匹はその体重が16から17.8グラム
に、および11.4から14グラムに増加した。 TRIS緩衝液を２週間受けたIL−10 KOマウスはいまだ
陰性の潜血便試料を示した。そのマウスは多量の好中球
性顆粒球を含む多くの滲出液があった。直腸はまだ腫張
し、脱出しやすかった。この動物は背が曲がっており歩
行が異常であった。また、るいそうの明らかな徴候を示
し、体重が16.6から14グラムに減少した。TRIS緩衝液を
注射された正常対照は直腸を含む正常の健康外観を維持
していた。その潜血便試料はいまだ陰性であり、直腸滲
出液は検出されなかった。体重は17.1から19グラムおよ
び17.4から18.7グラムへ増加した。数週間後でも、それ
らの動物の体重は増加し続けた。 実施例11 炎症性腸疾患に起因する徴候または症状の改
善 IBDを罹患しているヒト患者は以下のごとく本発明に
従ったIL−10で処置できる。そのような患者は典型的に
は下痢、腹痛、熱、メレナ、血便排泄および体重減少を
含む症状、および腹部塊、舌炎、アフタ性潰瘍、肛門裂
傷、肛門周囲フィステル、貧血、吸収不良および鉄欠乏
を含む徴候を持っている。患者は最初１日当たり体重キ
ログラム当たり５μｇのIL−10で処置される。患者の体
重が70kgであれば、最初の開始用量は１日当たり350μ
ｇのIL−10である。この用量は静脈内ボーラスとして投
与される。患者の耐性および応答に依存して１日当たり
約50から150μｇ増量する。１日当たり約700μｇの最適
用量が（１日当たり、キログラム当たり10μｇ）数日後
に達成される。 最初の処置の前、およびその後最終処置後の数日まで
毎日、患者を臨床的におよび検査パラメーターでモニタ
ーする。検査パラメーターには血球数（特に全白血球細
胞数およびその分化に注意を払って）が含まれている。
特に興味が持たれるのは白血球の数が正常に維持されて
いるか、または患者の処置前から有意に変化していない
かどうかである。白血球分化に関しては、末梢血に未成
熟形が現れていないか、および白血球細胞の分化型の正
常比が一定であるかまたは変化しているかについて特別
の注意が払われた。末梢血のリンパ球と単球の比に特別
の注意が払われた。 モニターできるその他のパラメーターには赤血球沈降
速度（ESR）、化学的プロフィール、IL−６、TNFおよび
IFN−γの血中濃度が含まれる。最後に、患者の便の血
液および化膿性滲出液の規則的（毎日）評価で治療に対
する患者の応答を示すことができる。治療により腸炎症
の一つまたはそれ以上の症状または徴候の改善が得られ
た。 遅延型過敏症反応の阻害 実施例12 マウスにおける影響の減少 BALB/cマウスが抗CD4モノクローナル抗体（MoAb）で
前処理され、４週間後森林型熱帯リーシュマニアに感染
させた。BALB/cはSimonsen Laboratories（Gilroy,Cali
fornia）から得られた商業的に入手可能なマウスの純系
株である。使用されたマウスは８から12の週令であっ
た。森林型熱帯リーシュマニア（WHOM/−/173と称され
るWHO株）は30％ウシ胎児血清（FCS）（J.R.Scientifi
c,Woodland,CAから入手可能）、2mML−グルタミンおよ
び各々100U/mlのペニシリンおよびストレプトマイシン
を含むM199（GIBCO,Grand island,NYから入手可能）中
でプロマスティゴートとして培養された。プロマスティ
ゴートは定常期培養物から採取し、リン酸緩衝化塩溶液
（PBS）で洗浄した。1.5x10⁷の生存可能なプロマスティ
ゴートを左後足蹠内に皮下に注射してマウスを感染させ
た。森林型熱帯リーシュマニア抗原は寄生虫を４サイク
ルの凍結融解、続いての遠心分離により調製した。抗原
調製液は培養ウェルに2x10⁶生物体/ml相当で加えた。 以下のモノクローナル抗体（McAb）がインビボアッセ
イで使用された：抗マウスIL−４ McAb中和抗体（ATCC
番号HB188）、抗マウスIL−10 McAb中和抗体［Chatela
in,et.al.,J.Immunol.148:1182（1992）により記載され
ている抗IL−４の方法により調製］、および抗マウスCD
4（ATCC番号TIB207）。すべての抗体調製液は組織培養
上清からイオン交換クロマトグラフィーおよびゲル濾過
により精製し、リムラス凝集アッセイにより測定して３
内毒素単位（EU）/mgより少ない蛋白質が含まれてい
た。 細胞精製において、以下の精製McAbが使用された：ビ
オチニル化RM−４−５およびRM−４−４、抗マウスCD4
およびAMS−32.1、抗マウスMac−１（ATCC番号TIB12
8）、RA3−6B2、および抗マウスB220［Coffman,Immunol
ogical Reviews 69:5（1982）］。組換え体マウスIL−
４およびIL−10は大腸菌で発現され前記のごとくアフィ
ニティーで精製された。 森林型熱帯リーシュマニア感染部位の膿を出す膝窩リ
ンパ節（LN）を感染後４から６週間でBALB/cまたは抗CD
4前処理BALB/cマウスから除去し、0.25％ウシ血清アル
ブミン（BSA）を含むPBS中で掻き裂いて単一細胞懸濁液
とした。CD4＋Ｔ細胞の精製においては、全ての操作を
４℃で行った。約4x10⁸LN細胞が各々12μg/mlの抗B22
0、抗Mac−１、抗CD8および抗−クラスII Ｉ−A^dを含
む2mlのPBS/BSA溶液で30分間標識された。McAb標識細胞
懸濁液はPBS/BSA中で洗浄後、ヒツジ抗ラット被覆ダイ
ナビーズ（Dynabeads,Robbins Scientific,Mountain Vi
ew,Calf.から入手可能）と細胞１個当たり３ビーズの割
合で回転培養機上30分間インキュベートされた。陰性細
胞は磁気的分離により得られた。 CD4＋Ｔ細胞は得られた細胞懸濁液からさらに濃縮さ
れ、磁気活性化細胞ソーター（MACS、Miltenyi Dusseld
olf,Germany）を用いた陽性選択によると85％CG4＋であ
った。簡単に記すと、細胞はPBS/BSA中（約50ml/10⁸細
胞）12μg/mlビオチニル化抗CD4で15分間標識された。
細胞をPBSで洗い、ストレプトアビジン マイクロビー
ズ（Becton Dickinson,Sunnyvale,Calf.）とともに約50
μl/10⁸細胞でインキュベートした。15分後、ストレプ
トアビジン−PE（Becton Dickinson）を最終濃度1/50で
加えた。さらに５分間インキュベーションした後、細胞
懸濁液を洗浄し、使用説明書に従って磁気カラム（MAC
S、Miltenyi Dusseldolf,Germany）を通過させた。磁気
化カラムに保持された細胞はマグネットからカラムを除
きPBS/BSAでよく洗浄することにより溶出した。得られ
た細胞集団は96％CD4＋以上であった。 Ｔ細胞除去脾臓細胞は、上記LN細胞についての記載と
全く同じに、ヒツジ抗ラットDynabeadsを用いる陰性選
択により抗CD4および抗CD8染色細胞が除去されている正
常ドナーの脾臓から調製された。調製物は日常的にFACS
分析により99％CD4およびCD8陰性であった。 未分離リンパ節細胞または精製CD4＋Ｔ細胞は、96穴
丸底プレートの250μｌ容量に指定された量で、５％FCS
含有cRPMI中で二重に培養するように準備され、精製CD4
＋Ｔ細胞の場合は森林型熱帯リーシュマニア抗原の存在
下または非存在下、5x10⁵細胞除去正常脾臓細胞ととも
に加えられた。cRPMIはRPMI−1640（J.R.H.Bioscience
s,Lenexa,Kansasから入手可能）、10％FCS、2mM Ｌ−
グルタミン、0.05mM ２−MEおよび各々100U/mlのペニ
シリンおよびストレプトマイシンを含んでいる完全培養
培地を意味している。 抗原提示細胞（APC）は森林型熱帯リーシュマニア抗
原（2x10⁶生物体/mlに相当）または培地単独で４時間パ
ルスラベルされた。次にＴ細胞除去脾臓細胞は培養に先
だって1000ラドのγ−照射がなされた。ある場合には、
組換え体IL−10（rIL−10）（50μg/ml）、組換え体IL
−４（rIL−４）（100μg/ml）、および／またはこれら
のサイトカインの中和McAbが培養ウェルに加えられた。
サイトカイン合成検出のため、72時間後に上清液を集め
た。 上清液中のサイトカイン濃度はIFN−γ（Chatelain e
t al.1992,上記文献を参照されたい）、IL−４（Chatel
ain et al.1992,上記文献）、IL−10およびIL−３につ
いて上述されるような２部位サンドイッチELISAにより
検出された。試料は精製組換え体または天然サイトカイ
ンの標準曲線と比較して定量した。 抗CD4 MoAbによる前処理は最初に動物の利用可能な
Ｔ細胞を抑えたが、最終的には森林型熱帯リーシュマニ
アによる寄生虫侵入に対する動物の抵抗性を増強させ
た。この現象は反直覚的でありその機構は不明瞭である
が、広く観察されている。DTHは寄生虫感染への動物の
抵抗性と強く相関している。 感染４週間後、リーシュマニア凍結融解抗原を動物の
反対の側方の足蹠に注入した。次の48時間にわたり、足
蹠腫脹をメートルカリパスでモニターした。各々の動物
は腹腔内に５回量のサイトカインを受けている。一つの
群はIL−４の５回量を受けており、別の群はIL−10の５
回量を受けており、第三の群はIL−４およびIL−10の組
み合わせの５回量を受けている。５回量の各々は12時間
ごとに与えられ、最初の用量は抗原投与12時間前であ
る。 表11はリーシュマニア抗原注入24時間後のマウス足蹠
の大きさを示している。PBSのみを注入された対照動物
の応答と、指示された用量のIL−４、IL−10または両方
の組み合わせを受けた動物の応答が比較されている。サ
イトカインは抗原注入に先だった12時間前から開始し
て、48時間の間12時間毎に腹腔内（IP）に投与された。
各々の群は動物５匹であった。 IL−４単独で処理したマウスはPBSで処理したマウス
と大体同程度であったことをデータは示している。IL−
10単独で処理したマウスの腫脹は対照より小さかった。 IL−４およびIL−10の組み合わせで処理された動物は
最も小さな腫脹応答であった（特に20μｇの各々のサイ
トカイン処理群）。 表12は第二の独立した実験からのデータを示してい
る。実験形式は上記のものと同じであるが、足蹠データ
はリーシュマニア抗原注入48時間後に取られた。 各々の群は動物５匹であった。IL−４およびIL−10の
阻害効果はIL−４に対するモノクローナル抗体2mgおよ
びIL−10に対するモノクローナル抗体5mgの投与により
阻止された。IL−４およびIL−10に対するモノクローナ
ル抗体（陽性対照として使用された）はサイトカインの
最初の投与12時間前にIPで与えられた。5mgのイソ型対
照モノクローナル抗体（ICA）は（陰性対照として加え
られた）、阻害に何等の影響も与えなかった。ICAはCha
telain et al.1992（前に引用）により記載されている
ごとく調製された。 IL−４およびIL−10に対する抗体が投与されるとIL−
４およびIL−10に対して拮抗し、サイトカインの有効性
を減少させた。また、これらの抗体は組換え的に産生さ
れたサイトカインのさらなる対照となった。 データは、動物のDTH反応の減少において、IL−４お
よびIL−10の組み合わせが個々のサイトカイン単独より
も一層効果的であることを示している。IL−10単独はIL
−４単独よりもより効果的であったが、組み合わせより
は効果がより小さかった。サイトカインの組み合わせを
各々のサイトカインに対して産生されたモノクローナル
抗体とともに投与すると、サイトカイン処理の有効性が
打ち消された。 表13のデータは、抗原投与12時間前に開始して、抗原
投与後24時間まで12時間毎にサイトカインを投与して得
られたものである。リーシュマニア抗原注入部位の膿を
出すリンパ節（LN）の細胞は、サイトカインおよび抗原
を受けた動物から抗原投与５日後に除去された。表13の
“処置”と付けた欄は動物がLN細胞を取る処置を受けた
ことを意味している。リンパ節はインビトロにおいて森
林型熱帯リーシュマニア凍結融解抗原により刺激され
た。72時間後上清液のINF−γ含量が試験された。示さ
れているデータは３匹の別々の動物から得られたもので
ある（ｎ＝３±標準誤差）。 このデータはサイトカインで処理された動物は、PBS
で処理された対照よりもINF−γが少ないことを示して
いる。さらに、IL−４およびIL−10の組み合わせで処理
された動物は、単一のサイトカインを受けた実験動物の
いかなる対照よりもかなりINF−γが少なかったことを
明らかにした。 表14のデータを得るために、４週間前に森林型熱帯リ
ーシュマニアに感染させた抗CD4前処理マウスからCD4＋
Ｔ細胞が単離された（3.5x10⁵/ウェル）。細胞はインビ
トロで森林型熱帯リーシュマニア凍結融解抗原ならびに
APC源としてＴ細胞除去脾臓細胞（5x10⁵/ウェル）と一
緒に刺激した。72時間後ELISAによりINF−γ含量が決定
された。“添加”と付けた欄はTh1細胞が培養された培
地に添加された物質を意味している。 表14のデータは、IL−４およびIL−10はいずれも単独
で投与されると、PBSで処理された対照と比較してTh1細
胞により産生されるINF−γの量を著しく減少させたこ
とを示している。さらに、培地へのIL−４およびIL−10
の組み合わせの添加は、どちらのサイトカイン単独での
添加よりも約50％INF−γを減少させた。 前記のデータは、IL−10は対照と比較すると、DTH応
答、腫脹および一般的にはリンパ節からの、特異的には
Th1細胞からのINF−γ産生を堅実に減少させたことを示
す。さらに、IL−４とIL−10との組み合わせは、同一の
用量範囲において、IL−４単独またはIL−10単独のいず
れよりも優れていた。20μｇの各々のサイトカインの組
み合わせ療法は、IL−４およびIL−10各々の２倍以上の
用量（50μｇ）の単一療法よりも優れた結果を示した。
したがって、組み合わせ療法として与えられた各々20μ
ｇのIL−４およびIL−10は、単一療法剤として与えられ
た50μｇのどちらか一方のIL−４またはIL−10よりも優
れた利点を示した。 実施例13 タイプＩ糖尿病を持つ患者の処置 National Diabetes Data GroupまたはWorld Health O
rganizationにより開発された範疇を用いて診断された
タイプＩ糖尿病（またはインシュリン依存性糖尿病）を
持つ患者が治療のために選択された。患者は最初は１日
当たり、体重キログラム当たり各々20μｇのIL−４およ
びIL−10で処置された。患者の体重が70kgであれば、初
期開始用量は各々のサイトカインについて1400μｇであ
る。この用量は静脈内ボーラス注射として投与される。
用量は患者の耐性および応答に応じて１日当たり約250
から1000μｇ増加させる。１日当たり約7000μｇ（１日
当たり、キログラム当たり100μｇ）の最適用量は数日
後に達成される。 最初の処置に先だって、およびその後最後の処置数日
後までの毎日、患者を臨床的および検査パラメーターで
モニターする。検査パラメーターには、血液グルコース
および血球数が含まれ、特に全白血球細胞数およびその
分化に注意が払われる。血液グルコースモニタリングは
糖尿病の処置においてよく知られている。さらに興味が
持たれるのは、白血球の数が正常に維持されているか、
または患者の処置前から有意に変化していないかどうか
である。白血球分化に関しては、末梢血に未成熟形が現
れていないか、および白血球細胞の分化型の正常比が一
定であるかまたは変化しているかについて特別の注意が
払われた。末梢血のリンパ球と単球の比に特別の注意が
払われた。 当業者には明らかになるごとく、本発明の多くの変更
および変形を本発明の精神および範囲から離れることな
くなすことができるであろう。ここに記載した特定の実
施態様は例示の為のみに与えられており、本発明は付随
する請求の範囲の項目によってのみ制限されるべきであ
る。

【配列表】

配列番号:1 配列の長さ:160アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列の種類：蛋白質 配列： 配列番号:2 配列の長さ:147アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列の種類：蛋白質 配列： 配列番号:3 配列の長さ:38塩基 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類:Genomic DNA 配列： 配列番号:4 配列の長さ:35塩基 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類:Genomic DNA 配列：

フロントページの続き (31)優先権主張番号 ０７／９３３，４６２ (32)優先日 平成４年８月21日(1992．8．21) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０７／９３３，９５０ (32)優先日 平成４年８月21日(1992．8．21) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (72)発明者 デ・ワール，マレフィット・レーネ アメリカ合衆国カリフォルニア州94086, サニーヴェイル，ムエンダー・アベニュ ー 891 (72)発明者 パウリー，フィオーナ アメリカ合衆国カリフォルニア州94040, マウンテン・ヴュー，デル・メディオ・ アベニュー 541，ナンバー 204 (72)発明者 レニック，ドナ アメリカ合衆国カリフォルニア州94022, ロス・アルトス，アーマンド・アベニュ ー 601 (56)参考文献 Ｋｕｈｎ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌ ｌ，1993年，Ｖｏｌ．75，ｐ．263−279 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) A61K 38/00 A61P 1/00 ＣＡ（ＳＴＮ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＥＭＢＡＳＥ（ＳＴＮ) ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ)

Claims (4)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】IL−10を有効成分として含む炎症性腸疾患
   を治療するための医薬組成物。
2. 【請求項２】炎症性腸疾患が潰瘍性大腸炎である、請求
   項１記載の医薬組成物。
3. 【請求項３】炎症性腸疾患がクローン病である、請求項
   １記載の医薬組成物。
4. 【請求項４】IL−10がヒトIL−10である、請求項１〜３
   のいずれか１項に記載の医薬組成物。