JP3447010B2 - 抗Ｆｄ抗体を用いたリウマチ因子干渉の排除 - Google Patents
抗Ｆｄ抗体を用いたリウマチ因子干渉の排除Info
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、免疫化学的方法においてリウマチ因子によ
って引き起こされる干渉を減少させるための試薬として
の、数個の異なる抗体または／および抗体フラグメント
からなる組成物の使用に関する。
って引き起こされる干渉を減少させるための試薬として
の、数個の異なる抗体または／および抗体フラグメント
からなる組成物の使用に関する。
哺乳動物は、抗原から防御するために免疫系のＢ細胞
によって形成される種々のクラスの抗体を含む。抗体分
子は、４本のポリペプチド鎖、すなわちジスルフィド架
橋により連結されている２本のＨ鎖および２本のＬ鎖の
１または数セットからなる。
によって形成される種々のクラスの抗体を含む。抗体分
子は、４本のポリペプチド鎖、すなわちジスルフィド架
橋により連結されている２本のＨ鎖および２本のＬ鎖の
１または数セットからなる。
抗体は、一般にＧ、Ｍ、Ａ、ＤおよびＥクラスに分け
られる。これら５つの免疫グロブリンクラスは、γ、
μ、α、δおよびε鎖と称されるＨ鎖において異なって
いる。さらに、IgG、IgA、およびIgMの場合には免疫グ
ロブリンサブクラスも存在する。
られる。これら５つの免疫グロブリンクラスは、γ、
μ、α、δおよびε鎖と称されるＨ鎖において異なって
いる。さらに、IgG、IgA、およびIgMの場合には免疫グ
ロブリンサブクラスも存在する。
IgGクラスの抗体は、正常なヒト血清において全免疫
グロブリンの70〜75％を構成する（８〜16mg/mlに相
当）。これらは主として生物の感染に対する二次免疫応
答として形成される。
グロブリンの70〜75％を構成する（８〜16mg/mlに相
当）。これらは主として生物の感染に対する二次免疫応
答として形成される。
IgMクラスの抗体はヒト血清中に存在する免疫グロブ
リンの約10％を構成し、五量体構造を有する。これらの
抗体は感染の直後に現れるので、これらの測定は疾患の
早期検出に重要である。
リンの約10％を構成し、五量体構造を有する。これらの
抗体は感染の直後に現れるので、これらの測定は疾患の
早期検出に重要である。
IgAクラスの免疫グロブリンは、ヒト血清中に存在す
る免疫グロブリンの約15から20％を形成し、唾液、乳お
よび尿生殖器領域の分泌物において最も重要な分泌免疫
グロブリンである。
る免疫グロブリンの約15から20％を形成し、唾液、乳お
よび尿生殖器領域の分泌物において最も重要な分泌免疫
グロブリンである。
IgDクラスの抗体は、循環するＢ細胞の膜上に位置
し、自己免疫疾患においてある役割を果たすと推定され
る。
し、自己免疫疾患においてある役割を果たすと推定され
る。
IgEクラスの抗体は、血清中に非常に少量存在するの
みであるが、それらは喘息および枯草熱等のアレルギー
性反応において重要な役割を果たす。
みであるが、それらは喘息および枯草熱等のアレルギー
性反応において重要な役割を果たす。
免疫グロブリンのクラス特異的測定、すなわち特定の
抗原に対する１つ又は幾つかの選択された免疫グロブリ
ンクラスまたはサブクラスの抗体の、同一抗原に対する
他の免疫グロブリンクラスまたはサブクラスの抗体の存
在下における選択的測定は、特定の疾患の検出にとって
（例えば、感染の早期診断にとって）急性感染と治癒し
た感染を区別し、そして正確な予後を予測するために特
に重要である。
抗原に対する１つ又は幾つかの選択された免疫グロブリ
ンクラスまたはサブクラスの抗体の、同一抗原に対する
他の免疫グロブリンクラスまたはサブクラスの抗体の存
在下における選択的測定は、特定の疾患の検出にとって
（例えば、感染の早期診断にとって）急性感染と治癒し
た感染を区別し、そして正確な予後を予測するために特
に重要である。
免疫グロブリンのクラス特異的測定法は公知である。
この測定法のためには、選択された抗体クラス（例え
ば、ヒトIgMのμ鎖に対する抗体）に特異的な免疫成分
を固体キャリアーに結合し、そして直接的または間接的
に標識した抗原との反応により抗原特異的免疫グロブリ
ン成分を検出することができる。この種類の方法及び他
の免疫学的試験系においては、リウマチ因子、すなわち
抗IgG自己抗体が、分析物の測定に干渉する可能性があ
る。これは結果の歪曲をもたらす場合があり、特に、間
違った陽性反応が起こりうる。
この測定法のためには、選択された抗体クラス（例え
ば、ヒトIgMのμ鎖に対する抗体）に特異的な免疫成分
を固体キャリアーに結合し、そして直接的または間接的
に標識した抗原との反応により抗原特異的免疫グロブリ
ン成分を検出することができる。この種類の方法及び他
の免疫学的試験系においては、リウマチ因子、すなわち
抗IgG自己抗体が、分析物の測定に干渉する可能性があ
る。これは結果の歪曲をもたらす場合があり、特に、間
違った陽性反応が起こりうる。
EP−Ａ−0 163 312には、平均粒径が≦0.2μｍで、干
渉排除物質で被覆されている粒子を、非特異的免疫反応
を抑制するために用いる免疫学的試験手順が開示されて
いる。干渉排除物質としてヒトまたは動物由来の免疫グ
ロブリンが挙げられている。
渉排除物質で被覆されている粒子を、非特異的免疫反応
を抑制するために用いる免疫学的試験手順が開示されて
いる。干渉排除物質としてヒトまたは動物由来の免疫グ
ロブリンが挙げられている。
Henleら（Clin.Exp.Immunol.36（1979）,415−422）
は、エプスタイン・バーウイルスに特異的な免疫グロブ
リンに関する試験における間違った陽性反応の原因とし
てのリウマチ因子を記述している。IgGで被覆したラテ
ックス粒子を用いることにより、ある場合にはその干渉
を排除することが可能であった。Hoら（J.Clin.Microbi
ol.27（1989）,952−958）もまた、ヒトIgGで被覆した
ラテックス粒子を加えることによる、特異的抗エプスタ
イン・バーウイルス抗体に関する間接的ELISAにおける
干渉の排除を記述している。
は、エプスタイン・バーウイルスに特異的な免疫グロブ
リンに関する試験における間違った陽性反応の原因とし
てのリウマチ因子を記述している。IgGで被覆したラテ
ックス粒子を用いることにより、ある場合にはその干渉
を排除することが可能であった。Hoら（J.Clin.Microbi
ol.27（1989）,952−958）もまた、ヒトIgGで被覆した
ラテックス粒子を加えることによる、特異的抗エプスタ
イン・バーウイルス抗体に関する間接的ELISAにおける
干渉の排除を記述している。
TorfasonおよびDiderholm（J.Med.Virol.10（1982）,
157−170）は、単純ヘルペスウイルスおよびサイトメガ
ロウイルスに対するIgM免疫グロブリンの測定におい
て、リウマチ因子が誤った結果をもたらしうるという事
実を開示している。プロテインＡ−Sepharoseと、ヒトI
gGで飽和したプロテインＡ−Sepharoseとの混合物が、
干渉排除試薬として挙げられている。
157−170）は、単純ヘルペスウイルスおよびサイトメガ
ロウイルスに対するIgM免疫グロブリンの測定におい
て、リウマチ因子が誤った結果をもたらしうるという事
実を開示している。プロテインＡ−Sepharoseと、ヒトI
gGで飽和したプロテインＡ−Sepharoseとの混合物が、
干渉排除試薬として挙げられている。
IgM、IgAおよびIgGクラスのリウマチ因子による干渉
のジチオトレイトール（DTT）添加による排除が、Esper
senらによって記述されている（Scand J.Rheumatology
75（1988）,40−45）。
のジチオトレイトール（DTT）添加による排除が、Esper
senらによって記述されている（Scand J.Rheumatology
75（1988）,40−45）。
EP−Ｂ−0 292 810には、液体サンプル中の、免疫グ
ロブリンＭ、Ａ、ＤおよびＥのうち１つに由来する抗原
特異的抗体の測定方法が開示されている。この方法で
は、IgGクラスの抗体による干渉を避けるために、抗ヒ
トIgG、凝集したヒト若しくは動物IgG、またはγ−Fcフ
ラグメントから選択される干渉排除試薬が添加される。
この干渉排除試薬は、サンプル中に存在する特異的IgG
抗体との抗原の結合を排除し、そしてリウマチ因子の活
性を抑制すると考えられる。
ロブリンＭ、Ａ、ＤおよびＥのうち１つに由来する抗原
特異的抗体の測定方法が開示されている。この方法で
は、IgGクラスの抗体による干渉を避けるために、抗ヒ
トIgG、凝集したヒト若しくは動物IgG、またはγ−Fcフ
ラグメントから選択される干渉排除試薬が添加される。
この干渉排除試薬は、サンプル中に存在する特異的IgG
抗体との抗原の結合を排除し、そしてリウマチ因子の活
性を抑制すると考えられる。
DE−OS 42 02 923には、非特異的免疫複合体を添加す
ることによる、リウマチ因子による干渉の排除を記述し
ている。これらの免疫複合体は、分析物ではない抗原に
対して産生された、免疫感作した動物由来の抗体を含有
する。
ることによる、リウマチ因子による干渉の排除を記述し
ている。これらの免疫複合体は、分析物ではない抗原に
対して産生された、免疫感作した動物由来の抗体を含有
する。
リウマチ因子による干渉の無いIgM抗体の測定による
急性感染の診断方法がR.Ziegelmaierらによって記述さ
れている（“Larboratoriumsblatter"33（1983）,19−2
5）。干渉排除試薬として、凝集γグロブリン、IgG被覆
ポリスチレン粒子、ブドウ球菌プロテインＡおよび抗ヒ
トIgGγ鎖が挙げられている。
急性感染の診断方法がR.Ziegelmaierらによって記述さ
れている（“Larboratoriumsblatter"33（1983）,19−2
5）。干渉排除試薬として、凝集γグロブリン、IgG被覆
ポリスチレン粒子、ブドウ球菌プロテインＡおよび抗ヒ
トIgGγ鎖が挙げられている。
Martinsら（Clin.Diagnost.Laboratory Immunol.2（1
995）,98−103）は、IgM免疫グロブリンのクラス特異的
検出のため、免疫グロブリンＧを除去する３つの方法に
ついてその効果の評価を記述している。抗ヒトIgG抗体
は組換えタンパク質Ｇよりも効果的であることが判明し
た。
995）,98−103）は、IgM免疫グロブリンのクラス特異的
検出のため、免疫グロブリンＧを除去する３つの方法に
ついてその効果の評価を記述している。抗ヒトIgG抗体
は組換えタンパク質Ｇよりも効果的であることが判明し
た。
しかしながら、干渉を排除するための先行技術の試薬
は、幾つか不利な点を有する。すなわち、サンプルの混
濁をもたらす可能性を有するとともに測定に干渉しうる
不溶性免疫複合体が生成するのである。さらに重要なこ
とに、開示された試薬はリウマチ因子による干渉を完全
に排除することはできず、したがって沈降が起こった場
合でさえ試験が誤っている可能性がある。さらに、抗ヒ
トIgG抗体を用いる場合は、試薬濃度を正確に調節しな
ければならない。なぜなら、過剰は沈殿物の溶解をもた
らしうるからである。
は、幾つか不利な点を有する。すなわち、サンプルの混
濁をもたらす可能性を有するとともに測定に干渉しうる
不溶性免疫複合体が生成するのである。さらに重要なこ
とに、開示された試薬はリウマチ因子による干渉を完全
に排除することはできず、したがって沈降が起こった場
合でさえ試験が誤っている可能性がある。さらに、抗ヒ
トIgG抗体を用いる場合は、試薬濃度を正確に調節しな
ければならない。なぜなら、過剰は沈殿物の溶解をもた
らしうるからである。
ドイツ国特許出願P 44 39 452.7には、免疫グロブリ
ンクラスＧ、Ｍ、Ａ、ＤおよびＥの１つ又は幾つかのク
ラス由来の抗体のクラス特異的検出のための免疫化学的
方法における干渉を排除する試薬として適切な、数個の
異なる抗体または／および抗体フラグメントからなる組
成物が記述されている。これらの抗体または／および抗
体フラグメントは、免疫グロブリンのＨ鎖のFdセクショ
ンに特異的である。さらに、他のクラスの抗体による干
渉を抑制するため、IgG、IgM、IgA、IgDまたは／および
IgEクラスの抗体の選択的クラス特異的測定のためのイ
ムノアッセイにおける上記組成物の使用が提案されてい
る。リウマチ因子による干渉の排除を示す実施例は記載
されていない。
ンクラスＧ、Ｍ、Ａ、ＤおよびＥの１つ又は幾つかのク
ラス由来の抗体のクラス特異的検出のための免疫化学的
方法における干渉を排除する試薬として適切な、数個の
異なる抗体または／および抗体フラグメントからなる組
成物が記述されている。これらの抗体または／および抗
体フラグメントは、免疫グロブリンのＨ鎖のFdセクショ
ンに特異的である。さらに、他のクラスの抗体による干
渉を抑制するため、IgG、IgM、IgA、IgDまたは／および
IgEクラスの抗体の選択的クラス特異的測定のためのイ
ムノアッセイにおける上記組成物の使用が提案されてい
る。リウマチ因子による干渉の排除を示す実施例は記載
されていない。
本発明の目的は、先行技術の不利な点を少なくとも実
質的に回避することができるる、リウマチ因子による干
渉を排除するための方法を提供することである。
質的に回避することができるる、リウマチ因子による干
渉を排除するための方法を提供することである。
上記目的は、分析物の測定のための免疫化学的方法に
おいてリウマチ因子によって引き起こされる干渉を減少
させるための試薬として、IgG、IgM、IgA、IgDおよびIg
Eクラスのうち１つ又は幾つかのクラスの免疫グロブリ
ンのＨ鎖のFdセクションに特異的であって、かつこれら
の免疫グロブリンが抗原に結合する能力を少なくとも実
質的にマスクする、数個の異なる抗体または／および抗
体フラグメントから本質的になる組成物の使用により達
成される。
おいてリウマチ因子によって引き起こされる干渉を減少
させるための試薬として、IgG、IgM、IgA、IgDおよびIg
Eクラスのうち１つ又は幾つかのクラスの免疫グロブリ
ンのＨ鎖のFdセクションに特異的であって、かつこれら
の免疫グロブリンが抗原に結合する能力を少なくとも実
質的にマスクする、数個の異なる抗体または／および抗
体フラグメントから本質的になる組成物の使用により達
成される。
免疫化学的方法における本発明による抗Fd抗体または
／および抗体フラグメント組成物の使用は、驚くべきこ
とに、リウマチ因子による干渉の実質的な又は完全な排
除をもたらす。その使用は、非特異的にIgG抗体に向け
られ、そして特にヒトIgG抗体に向けられたリウマチ因
子（通常IgMクラスのリウマチ因子）が先行技術の方法
において相当な問題を引き起こしていたIgM抗体測定の
ための試験手順の場合において、特に好ましい。
／および抗体フラグメント組成物の使用は、驚くべきこ
とに、リウマチ因子による干渉の実質的な又は完全な排
除をもたらす。その使用は、非特異的にIgG抗体に向け
られ、そして特にヒトIgG抗体に向けられたリウマチ因
子（通常IgMクラスのリウマチ因子）が先行技術の方法
において相当な問題を引き起こしていたIgM抗体測定の
ための試験手順の場合において、特に好ましい。
先行技術における公知の干渉排除方法に較べ、多数の
利点が達成される。本発明による方法においては、サン
プルの前処理は必要とされない。すなわち、抗Fd組成物
を他の試験成分と同時に加えることができる。さらに、
抗Fd組成物の添加は、沈殿物の形成または付随的な試験
の干渉を引き起こさない。これは、より単純な、したが
ってより信頼できる試薬の制御、およびロット間のより
良い不変性を可能とする。さらに、自動化された分析機
を用いた測定においては、キャリオーバー（carry−ove
r）の危険の相当な低下が見られる。
利点が達成される。本発明による方法においては、サン
プルの前処理は必要とされない。すなわち、抗Fd組成物
を他の試験成分と同時に加えることができる。さらに、
抗Fd組成物の添加は、沈殿物の形成または付随的な試験
の干渉を引き起こさない。これは、より単純な、したが
ってより信頼できる試薬の制御、およびロット間のより
良い不変性を可能とする。さらに、自動化された分析機
を用いた測定においては、キャリオーバー（carry−ove
r）の危険の相当な低下が見られる。
上記抗Fd試薬は、抗原結合部位とヒンジ部との間にあ
る免疫グロブリンのＨ鎖の領域に結合する（VHおよびCH
1ドメインの領域内；図１参照）。この結合部位は好ま
しくは免疫グロブリンのCH 1ドメインの定常部、すなわ
ち領域に位置する（“Kurzes Lehrbuch der Immunologi
e",I.M.Roitt;Thieme Verlag,Stuttgart,New York（198
7），第５章：“Antikorper:Struktur und Funktion",
p.49参照）。これらのドメインのアミノ酸配列は、例え
ばKabatら,Sequences of Proteins of Immunological I
nterest,第５版，（1992）,US Department of Health a
nd Human Services,USAに記載されている。
る免疫グロブリンのＨ鎖の領域に結合する（VHおよびCH
1ドメインの領域内；図１参照）。この結合部位は好ま
しくは免疫グロブリンのCH 1ドメインの定常部、すなわ
ち領域に位置する（“Kurzes Lehrbuch der Immunologi
e",I.M.Roitt;Thieme Verlag,Stuttgart,New York（198
7），第５章：“Antikorper:Struktur und Funktion",
p.49参照）。これらのドメインのアミノ酸配列は、例え
ばKabatら,Sequences of Proteins of Immunological I
nterest,第５版，（1992）,US Department of Health a
nd Human Services,USAに記載されている。
抗Fd試薬の使用によるリウマチ因子による干渉の排除
は、任意の所望の分析物、例えば、ペプチド、ポリペプ
チド、糖タンパク質、ホルモン、仲介物質、神経伝達物
質、代謝物、細胞またはウイルスの表面構造物、等の抗
原の免疫化学的測定、及び抗体の特異的測定のために利
用できる。ウイルス、細菌、若しくは他の微生物等の病
原体に対する抗体の測定、または自己免疫抗体の測定が
好ましい。測定は好ましくは体液、特に血清、血液、血
漿、唾液および尿等のリウマチ因子が存在する可能性の
あるヒト体液を使用して実施される。
は、任意の所望の分析物、例えば、ペプチド、ポリペプ
チド、糖タンパク質、ホルモン、仲介物質、神経伝達物
質、代謝物、細胞またはウイルスの表面構造物、等の抗
原の免疫化学的測定、及び抗体の特異的測定のために利
用できる。ウイルス、細菌、若しくは他の微生物等の病
原体に対する抗体の測定、または自己免疫抗体の測定が
好ましい。測定は好ましくは体液、特に血清、血液、血
漿、唾液および尿等のリウマチ因子が存在する可能性の
あるヒト体液を使用して実施される。
前記組成物はＨ鎖のFdセクションに特異的である。す
なわち、この組成物はＬ鎖（つまりκまたはλ鎖）のFd
セクションと反応しうる成分を本質的に含まない。免疫
グロブリンＬ鎖との最大交差反応性は、Ｈ鎖との反応性
に較べて好ましくは10-1であり、特に好ましくは10-2で
ある。
なわち、この組成物はＬ鎖（つまりκまたはλ鎖）のFd
セクションと反応しうる成分を本質的に含まない。免疫
グロブリンＬ鎖との最大交差反応性は、Ｈ鎖との反応性
に較べて好ましくは10-1であり、特に好ましくは10-2で
ある。
上記抗体または／および抗体フラグメント組成物は、
干渉効果が好ましくは少なくとも50％、特に好ましくは
少なくとも90％、そして最も好ましくは少なくとも99％
抑制される、マスクされるべきリウマチ因子に比較して
５倍モル過剰で添加することができる。
干渉効果が好ましくは少なくとも50％、特に好ましくは
少なくとも90％、そして最も好ましくは少なくとも99％
抑制される、マスクされるべきリウマチ因子に比較して
５倍モル過剰で添加することができる。
本発明にしたがって使用される組成物は、IgG、IgM、
IgA、IgDおよびIgEから選択される第１の免疫グロブリ
ンクラスに好ましくは特異的で、そして他の免疫グロブ
リンクラスとの最大交差反応性は第１の免疫グロブリン
クラスとの反応性に較べて10-2、特に好ましくは10-3で
ある。
IgA、IgDおよびIgEから選択される第１の免疫グロブリ
ンクラスに好ましくは特異的で、そして他の免疫グロブ
リンクラスとの最大交差反応性は第１の免疫グロブリン
クラスとの反応性に較べて10-2、特に好ましくは10-3で
ある。
本発明の好ましい実施態様において、抗体または／お
よび抗体フラグメント組成物は免疫グロブリンＧ、特に
ヒト免疫グロブリンＧのＨ鎖のFdセクションに特異的で
ある。この組成物は、リウマチ因子（すなわち抗IgG抗
体）および場合によりIgGクラスの競合する抗体の存在
下における、IgM、IgA、IgDおよびIgEクラスのうち１つ
又は幾つかのクラス由来の抗体のクラス特異的測定に特
に適している。このような組成物は、IgM等の別の免疫
グロブリンクラスとの最大交差反応性がIgGとの反応性
に較べて好ましくは10-2、特に好ましくは10-3である。
よび抗体フラグメント組成物は免疫グロブリンＧ、特に
ヒト免疫グロブリンＧのＨ鎖のFdセクションに特異的で
ある。この組成物は、リウマチ因子（すなわち抗IgG抗
体）および場合によりIgGクラスの競合する抗体の存在
下における、IgM、IgA、IgDおよびIgEクラスのうち１つ
又は幾つかのクラス由来の抗体のクラス特異的測定に特
に適している。このような組成物は、IgM等の別の免疫
グロブリンクラスとの最大交差反応性がIgGとの反応性
に較べて好ましくは10-2、特に好ましくは10-3である。
幾つかの適用のためには、上記組成物がヒト免疫グロ
ブリンに対して種特異的であるとともに、非ヒト免疫グ
ロブリンとの最大交差反応性がヒト免疫グロブリンとの
反応性に較べて10-2、特に好ましくは10-3であることが
好ましい。
ブリンに対して種特異的であるとともに、非ヒト免疫グ
ロブリンとの最大交差反応性がヒト免疫グロブリンとの
反応性に較べて10-2、特に好ましくは10-3であることが
好ましい。
本発明にしたがって使用される組成物は、複数の抗体
または／および抗体フラグメントからなる。この組成物
は、好ましくは一価の抗体フラグメント、例えば、パパ
インを用いて抗体を酵素的に開裂し、次いで開裂産物を
分画することにより得られるFabフラグメントからな
る。一価の抗体フラグメントからなる組成物が用いられ
るならば、これはマスクされた抗体の沈降を回避する。
または／および抗体フラグメントからなる。この組成物
は、好ましくは一価の抗体フラグメント、例えば、パパ
インを用いて抗体を酵素的に開裂し、次いで開裂産物を
分画することにより得られるFabフラグメントからな
る。一価の抗体フラグメントからなる組成物が用いられ
るならば、これはマスクされた抗体の沈降を回避する。
本発明による組成物は、免疫グロブリンＨ鎖のFdセク
ションの異なる領域にそれぞれ特異的な幾つかの異なる
抗体または／および抗体フラグメントからなる。この組
成物は好ましくはポリクローナル抗体または／および抗
体フラグメントからなるが、少なくとも２つ、好ましく
は少なくとも３つ、そして特に好ましくは少なくとも４
つの異なるモノクローナル抗体または／および抗体フラ
グメントからなることも可能である。
ションの異なる領域にそれぞれ特異的な幾つかの異なる
抗体または／および抗体フラグメントからなる。この組
成物は好ましくはポリクローナル抗体または／および抗
体フラグメントからなるが、少なくとも２つ、好ましく
は少なくとも３つ、そして特に好ましくは少なくとも４
つの異なるモノクローナル抗体または／および抗体フラ
グメントからなることも可能である。
本発明にしたがって使用されるポリクローナル抗体ま
たは／および抗体フラグメント組成物は、以下のプロセ
スにより得ることができる。すなわち、 （ａ）第１の免疫グロブリンクラス由来の免疫グロブリ
ンのＨ鎖のFdセクションを含有する免疫原を用いて実験
動物を免疫感作する； （ｂ）上記実験動物よりポリクローナル抗血清を得る； （ｃ）上記ポリクローナル抗血清を場合により開裂によ
って一価の抗体フラグメントに変換する； （ｄ）上記抗血清または一価の抗体フラグメントを、第
１の免疫グロブリンクラスのＨ鎖のFdセクションに特異
的な抗体または／および抗体フラグメントの選択を可能
とする、１つ又は幾つかの免疫収着（immunosorption）
工程にかける；そして （ｅ）第１の免疫グロブリンクラスのFdセクションに対
して特異性を有する抗体または抗体フラグメント組成物
を単離する。
たは／および抗体フラグメント組成物は、以下のプロセ
スにより得ることができる。すなわち、 （ａ）第１の免疫グロブリンクラス由来の免疫グロブリ
ンのＨ鎖のFdセクションを含有する免疫原を用いて実験
動物を免疫感作する； （ｂ）上記実験動物よりポリクローナル抗血清を得る； （ｃ）上記ポリクローナル抗血清を場合により開裂によ
って一価の抗体フラグメントに変換する； （ｄ）上記抗血清または一価の抗体フラグメントを、第
１の免疫グロブリンクラスのＨ鎖のFdセクションに特異
的な抗体または／および抗体フラグメントの選択を可能
とする、１つ又は幾つかの免疫収着（immunosorption）
工程にかける；そして （ｅ）第１の免疫グロブリンクラスのFdセクションに対
して特異性を有する抗体または抗体フラグメント組成物
を単離する。
適切な免疫収着工程の実施と組み合わせた適切な免疫
原の使用は、１つまたは数個の選択された免疫グロブリ
ンクラスのＨ鎖のFdセクションに特異的であり、かつ好
ましくは他の免疫グロブリンクラスまたは上記選択され
たクラスの種とは異なる種由来の免疫グロブリンとは本
質的に交差反応性をもたない、抗体または抗体フラグメ
ント組成物の単離を可能とする。例えば、完全な抗体、
Fab、Fab'若しくはＦ（ab）'2等の酵素的開裂により生
成される抗体フラグメント、または組換え抗体フラグメ
ント、等の抗体フラグメント、ペプチドエピトープ、あ
るいはそれらの混合物を免疫原として使用できる。抗原
Fc成分を含まない免疫原の使用が好ましい。このように
して、実験動物、例えばヒツジ、ウサギまたはマウスに
おける抗Fc抗体の形成を実質的に回避することができ
る。
原の使用は、１つまたは数個の選択された免疫グロブリ
ンクラスのＨ鎖のFdセクションに特異的であり、かつ好
ましくは他の免疫グロブリンクラスまたは上記選択され
たクラスの種とは異なる種由来の免疫グロブリンとは本
質的に交差反応性をもたない、抗体または抗体フラグメ
ント組成物の単離を可能とする。例えば、完全な抗体、
Fab、Fab'若しくはＦ（ab）'2等の酵素的開裂により生
成される抗体フラグメント、または組換え抗体フラグメ
ント、等の抗体フラグメント、ペプチドエピトープ、あ
るいはそれらの混合物を免疫原として使用できる。抗原
Fc成分を含まない免疫原の使用が好ましい。このように
して、実験動物、例えばヒツジ、ウサギまたはマウスに
おける抗Fc抗体の形成を実質的に回避することができ
る。
本発明によるプロセスの免疫収着工程は、好ましくは
（ｉ）第１の免疫グロブリンクラスのＨ鎖のFdセクショ
ンを含有する抗原に対する少なくとも１つの陽性免疫収
着、および第１の免疫グロブリンクラスのＨ鎖のFdセク
ションを特異的に認識する組成物の結合成分の単離を含
む。免疫グロブリンＧのＨ鎖のFdセクションを含有する
免疫原（例えばFabフラグメント）を用いる場合、抗血
清または抗体フラグメントはFdセクションを含有する免
疫グロブリンＧまたはその断片に対する陽性免疫収着に
付される。免疫原として完全な免疫グロブリンを用いた
場合は、Fcを含まない抗原（例えばFabフラグメント）
の使用が陽性免疫収着において推奨される。
（ｉ）第１の免疫グロブリンクラスのＨ鎖のFdセクショ
ンを含有する抗原に対する少なくとも１つの陽性免疫収
着、および第１の免疫グロブリンクラスのＨ鎖のFdセク
ションを特異的に認識する組成物の結合成分の単離を含
む。免疫グロブリンＧのＨ鎖のFdセクションを含有する
免疫原（例えばFabフラグメント）を用いる場合、抗血
清または抗体フラグメントはFdセクションを含有する免
疫グロブリンＧまたはその断片に対する陽性免疫収着に
付される。免疫原として完全な免疫グロブリンを用いた
場合は、Fcを含まない抗原（例えばFabフラグメント）
の使用が陽性免疫収着において推奨される。
免疫収着工程は、好ましくはさらに（ii）第１の免疫
グロブリンクラスとは異なる免疫グロブリンから選択さ
れた抗原またはその成分に対する少なくとも１つの陰性
免疫収着、および組成物の非結合成分の単離を含む。こ
の陰性免疫収着は組成物とＬ鎖のFdセクション、および
組成物と他の免疫グロブリンクラスのＨ鎖のFdセクショ
ンとの交差反応性を低下させる。免疫グロブリンＧのFd
セクションに特異的な組成物を作製するため、IgM、Ig
D、IgEまたは／およびIgAまたはそれらの成分に対して
陰性免疫収着を実施することができる。
グロブリンクラスとは異なる免疫グロブリンから選択さ
れた抗原またはその成分に対する少なくとも１つの陰性
免疫収着、および組成物の非結合成分の単離を含む。こ
の陰性免疫収着は組成物とＬ鎖のFdセクション、および
組成物と他の免疫グロブリンクラスのＨ鎖のFdセクショ
ンとの交差反応性を低下させる。免疫グロブリンＧのFd
セクションに特異的な組成物を作製するため、IgM、Ig
D、IgEまたは／およびIgAまたはそれらの成分に対して
陰性免疫収着を実施することができる。
場合により、免疫収着工程はさらに、（iii）上記陽
性免疫収着工程（ｉ）における免疫グロブリンの種と異
なる種の第１の免疫グロブリンクラスから選択された抗
原またはその成分に対する、少なくとも１つの陰性免疫
収着、および組成物の非結合成分の単離を含むことがで
きる。上記組成物が後で同一免疫グロブリンクラスであ
るが別の種由来の検出抗体を用いるイムノアッセイに使
用される場合は、この工程を実施することが好ましい。
好ましくは陽性免疫収着（ｉ）はヒト免疫グロブリンを
用いて、そして陰性免疫収着（iii）は非ヒト種（例え
ばマウス）の免疫グロブリンを用いて実施される。ヒト
免疫グロブリンＧのFdセクションに特異的な組成物が作
製される場合は、非ヒト種の免疫グロブリンＧに対して
陰性免疫収着工程（iii）が実施される。
性免疫収着工程（ｉ）における免疫グロブリンの種と異
なる種の第１の免疫グロブリンクラスから選択された抗
原またはその成分に対する、少なくとも１つの陰性免疫
収着、および組成物の非結合成分の単離を含むことがで
きる。上記組成物が後で同一免疫グロブリンクラスであ
るが別の種由来の検出抗体を用いるイムノアッセイに使
用される場合は、この工程を実施することが好ましい。
好ましくは陽性免疫収着（ｉ）はヒト免疫グロブリンを
用いて、そして陰性免疫収着（iii）は非ヒト種（例え
ばマウス）の免疫グロブリンを用いて実施される。ヒト
免疫グロブリンＧのFdセクションに特異的な組成物が作
製される場合は、非ヒト種の免疫グロブリンＧに対して
陰性免疫収着工程（iii）が実施される。
免疫収着工程は、好ましくは、各場合において固定化
された形態で使用される抗原を含有するカラムを用いた
吸着クロマトグラフィーにより実施される。精製抗原調
製物を得る手順、およびキャリアー物質上に抗体または
抗体フラグメントを固定化する手順は当業者に周知であ
る（例えば、EP−Ａ−0 394 819の特に実施例７参
照）。
された形態で使用される抗原を含有するカラムを用いた
吸着クロマトグラフィーにより実施される。精製抗原調
製物を得る手順、およびキャリアー物質上に抗体または
抗体フラグメントを固定化する手順は当業者に周知であ
る（例えば、EP−Ａ−0 394 819の特に実施例７参
照）。
上記抗体または／および抗体フラグメント組成物を、
IgM、IgA、IgDまたは／およびIgEクラスの抗体の選択的
クラス特異的測定のためのイムノアッセイにおいて、リ
ウマチ因子による干渉を抑制するために好ましく使用す
ることができる。このためには、特定の（例えばウイル
スまたは細菌）抗原に対する特定免疫グロブリンクラス
（例えばIgM）の抗体のクラス特異的定量の実施が意図
されている測定すべきヒト血清または血漿サンプルを、
該サンプル中に存在するリウマチ因子による干渉の排除
が達成されるように、例えば本発明によるIgG特異的組
成物と好ましくは前希釈工程の後に混合する。その後の
免疫学的検出において、サンプル中の非特異的抗IgGリ
ウマチ因子ではなく特異的IgM抗体のみが検出される。
これは、リウマチ因子の存在による干渉の無い、特定の
抗体クラスの特異的含有量の示差的定量を可能とする。
本発明による組成物の使用は、洗浄プロセスを含まな
い、１段階（one−step）試験手順を可能とする。
IgM、IgA、IgDまたは／およびIgEクラスの抗体の選択的
クラス特異的測定のためのイムノアッセイにおいて、リ
ウマチ因子による干渉を抑制するために好ましく使用す
ることができる。このためには、特定の（例えばウイル
スまたは細菌）抗原に対する特定免疫グロブリンクラス
（例えばIgM）の抗体のクラス特異的定量の実施が意図
されている測定すべきヒト血清または血漿サンプルを、
該サンプル中に存在するリウマチ因子による干渉の排除
が達成されるように、例えば本発明によるIgG特異的組
成物と好ましくは前希釈工程の後に混合する。その後の
免疫学的検出において、サンプル中の非特異的抗IgGリ
ウマチ因子ではなく特異的IgM抗体のみが検出される。
これは、リウマチ因子の存在による干渉の無い、特定の
抗体クラスの特異的含有量の示差的定量を可能とする。
本発明による組成物の使用は、洗浄プロセスを含まな
い、１段階（one−step）試験手順を可能とする。
したがって本発明の主題は、先に定義した抗Fd組成物
の存在下で測定を実施することを特徴とする、リウマチ
因子をも含有する液体サンプル中の分析物（例えば、選
択された１つ又は幾つかの免疫グロブリンクラス由来の
特異的抗体）の免疫化学的測定方法でもある。上記組成
物は、好ましくは、液体サンプル中に存在するリウマチ
因子と比較して活性成分の少なくとも５倍モル過剰に相
当する量で添加される。上記組成物は、好ましくは10か
ら1000倍モル過剰で添加される。場合により、プレイン
キュベーションが好ましくは５〜60分間、特に好ましく
は10〜30分間実施される。
の存在下で測定を実施することを特徴とする、リウマチ
因子をも含有する液体サンプル中の分析物（例えば、選
択された１つ又は幾つかの免疫グロブリンクラス由来の
特異的抗体）の免疫化学的測定方法でもある。上記組成
物は、好ましくは、液体サンプル中に存在するリウマチ
因子と比較して活性成分の少なくとも５倍モル過剰に相
当する量で添加される。上記組成物は、好ましくは10か
ら1000倍モル過剰で添加される。場合により、プレイン
キュベーションが好ましくは５〜60分間、特に好ましく
は10〜30分間実施される。
特異的抗体の測定を、異種イムノアッセイの原理にし
たがって、反応性固相並びに検出すべき抗体に結合可能
な２つの受容体R1およびR2の存在下で実施することが特
に好ましい。ここで、R1は上記固相に結合しているか又
は上記固相に結合可能であり、R2は直接的又は間接的に
標識されている。そして検出すべき抗体は、場合により
固相及びインキュベーション液を分離した後、固相中ま
たは／およびインキュベーション液中の標識を測定する
ことにより、測定することができる。
たがって、反応性固相並びに検出すべき抗体に結合可能
な２つの受容体R1およびR2の存在下で実施することが特
に好ましい。ここで、R1は上記固相に結合しているか又
は上記固相に結合可能であり、R2は直接的又は間接的に
標識されている。そして検出すべき抗体は、場合により
固相及びインキュベーション液を分離した後、固相中ま
たは／およびインキュベーション液中の標識を測定する
ことにより、測定することができる。
固相受容体R1として、検出すべき抗体と特異的に反応
する抗原と固相結合基との結合体を使用することができ
る。この場合、受容体R2は検出すべき抗体と特異的に反
応する抗原であっても、選択された抗体クラスを認識す
る抗体（例えば抗IgM抗体）または適切な抗体フラグメ
ントであってもよい。受容体R2は直接的または間接的に
標識することができる。すなわち、受容体R2を標識基に
結合させることができる。または、受容体R2は標識基を
担持するさらなる受容体に結合することができる。
する抗原と固相結合基との結合体を使用することができ
る。この場合、受容体R2は検出すべき抗体と特異的に反
応する抗原であっても、選択された抗体クラスを認識す
る抗体（例えば抗IgM抗体）または適切な抗体フラグメ
ントであってもよい。受容体R2は直接的または間接的に
標識することができる。すなわち、受容体R2を標識基に
結合させることができる。または、受容体R2は標識基を
担持するさらなる受容体に結合することができる。
固相受容体R1として、選択された抗体クラスを認識す
る抗体または適切な抗体フラグメントと固相結合基との
結合体を使用することもできる。この場合、検出すべき
抗体と特異的に反応する抗原が、標識化受容体R2として
用いられる。
る抗体または適切な抗体フラグメントと固相結合基との
結合体を使用することもできる。この場合、検出すべき
抗体と特異的に反応する抗原が、標識化受容体R2として
用いられる。
ストレプトアビジンまたはアビジンで被覆した固相、
およびこの固相に結合可能なビオチニル化受容体R1が好
ましく用いられる。標識としては、発色団物質、放射性
同位体、酵素、NMR標識または当該技術分野で公知の他
の全ての標識が使用できる。電気化学発光により標識を
測定することができる発光金属複合体が好ましく使用さ
れる。発光金属複合体の例ならびに電気化学発光の測定
方法および装置は、ここでその開示に言及するEP−Ａ−
0 199 804、EP−Ａ−0 580 979、WO87/06706、WO90/053
01、WO90/11511およびWO92/14138に記載されている。そ
れぞれの酵素反応の検出によって標識を測定することが
できる酵素（例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリホス
ファターゼ、またはβ−ガラクトシダーゼ）は、さらに
好ましい標識である。
およびこの固相に結合可能なビオチニル化受容体R1が好
ましく用いられる。標識としては、発色団物質、放射性
同位体、酵素、NMR標識または当該技術分野で公知の他
の全ての標識が使用できる。電気化学発光により標識を
測定することができる発光金属複合体が好ましく使用さ
れる。発光金属複合体の例ならびに電気化学発光の測定
方法および装置は、ここでその開示に言及するEP−Ａ−
0 199 804、EP−Ａ−0 580 979、WO87/06706、WO90/053
01、WO90/11511およびWO92/14138に記載されている。そ
れぞれの酵素反応の検出によって標識を測定することが
できる酵素（例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリホス
ファターゼ、またはβ−ガラクトシダーゼ）は、さらに
好ましい標識である。
本発明は以下の実施例および図によってさらに説明さ
れる。
れる。
図１は、Ｈ鎖のFdセクションに向けられたFabフラグ
メント（＜ｈ−Fdγ＞Fab）のヒトIgG（ｈ−IgG）への
結合を示し、 図２は、実施例３で実施される電気化学発光による抗
HBc IgMのクラス特異的検出の試験原理を示し、そして 図３は、電気化学発光による抗HBc IgMのクラス特異
的検出のさらに別の試験原理を示す。
メント（＜ｈ−Fdγ＞Fab）のヒトIgG（ｈ−IgG）への
結合を示し、 図２は、実施例３で実施される電気化学発光による抗
HBc IgMのクラス特異的検出の試験原理を示し、そして 図３は、電気化学発光による抗HBc IgMのクラス特異
的検出のさらに別の試験原理を示す。
実施例１
本発明による試薬の作製
1.1 免疫原の作製
従来の標準的方法により、ヒト血清より免疫グロブリ
ンＧ画分を精製する。この精製は、例えばエーロシル
（aerosil）脱脂、硫酸アンモニウムを用いた沈澱、DEA
E−Sepharose FFを用いたクロマトグラフィー、および
場合により固定化IgG特異的ポリクローナル抗体を用い
た免疫収着により実施することができる。
ンＧ画分を精製する。この精製は、例えばエーロシル
（aerosil）脱脂、硫酸アンモニウムを用いた沈澱、DEA
E−Sepharose FFを用いたクロマトグラフィー、および
場合により固定化IgG特異的ポリクローナル抗体を用い
た免疫収着により実施することができる。
このようにして精製した免疫グロブリン画分をパパイ
ンで切断し、FabおよびFcフラグメントにする。この切
断は好ましくはpH7、37℃、IgG濃度10mg/ml、パパイン
濃度40mU/ml、システイン濃度７および10mmol/lのもと
で実施される。Fab部分をDEAE−Sepharose FFクロマト
グラフィー及びゲルクロマトグラフィー（例えば、Seph
acryl TSK S200およびS300）によりFc部分から精製す
る。免疫反応を増大させるため、Fabフラグメントを好
ましくはキャリアータンパク質、例えばマレイミド活性
化スカシ貝ヘモシアニン（Boehringer Mannheim,Bioche
micaカタログ，注文番号1376438）に結合させる。この
ためには、FabフラグメントをまずＮ−スクシンイミジ
ル−Ｓ−アセチルチオプロピオネート（SATP）を1:6の
モル比で用いて活性化する。そして、キャリアータンパ
ク質を活性化Fabフラグメントに1:1のモル比で結合す
る。
ンで切断し、FabおよびFcフラグメントにする。この切
断は好ましくはpH7、37℃、IgG濃度10mg/ml、パパイン
濃度40mU/ml、システイン濃度７および10mmol/lのもと
で実施される。Fab部分をDEAE−Sepharose FFクロマト
グラフィー及びゲルクロマトグラフィー（例えば、Seph
acryl TSK S200およびS300）によりFc部分から精製す
る。免疫反応を増大させるため、Fabフラグメントを好
ましくはキャリアータンパク質、例えばマレイミド活性
化スカシ貝ヘモシアニン（Boehringer Mannheim,Bioche
micaカタログ，注文番号1376438）に結合させる。この
ためには、FabフラグメントをまずＮ−スクシンイミジ
ル−Ｓ−アセチルチオプロピオネート（SATP）を1:6の
モル比で用いて活性化する。そして、キャリアータンパ
ク質を活性化Fabフラグメントに1:1のモル比で結合す
る。
他の免疫グロブリンクラスのFabフラグメント（例え
ばFabμ）も同様の方法で作製することができる。
ばFabμ）も同様の方法で作製することができる。
1.2 ヒツジの免疫感作
実施例１で作製した免疫原を用いて、標準的方法によ
りヒツジを免疫感作する。免疫反応において、これらの
ヒツジはヒトFabのＬ鎖部分およびＨ鎖部分に向けられ
た、ヒトFabに対するポリクローナル抗体を形成する。
りヒツジを免疫感作する。免疫反応において、これらの
ヒツジはヒトFabのＬ鎖部分およびＨ鎖部分に向けられ
た、ヒトFabに対するポリクローナル抗体を形成する。
免疫感作したヒツジから粗血清を回収し、これから前
述の方法によりIgG画分を単離する。
述の方法によりIgG画分を単離する。
1.3 Fd特異的試薬の作製
パパインを用いてヒツジ免疫グロブリンＧ画分をタン
パク質分解的に切断する。DEAEアニオン交換クロマトグ
ラフィーにより、Fabフラグメントを他の切断産物から
分離する。
パク質分解的に切断する。DEAEアニオン交換クロマトグ
ラフィーにより、Fabフラグメントを他の切断産物から
分離する。
幾つかの免疫収着工程により、全ヒツジFab画分から
Ｈ鎖のFdセクションに向けられた成分を精製する。
Ｈ鎖のFdセクションに向けられた成分を精製する。
ヒトIgGのＬ鎖（κまたはλ）に特異的に向けられた
成分を、IgMを固定した免疫吸着剤に任意に数回通すこ
とにより除去することができる。なぜなら、IgGおよびI
gMのＬ鎖の定常部は相同的だからである。Ｌ鎖に向けら
れた成分がカラムに吸着するのに対し、Ｈ鎖のFdセクシ
ョンに向けられた成分はカラム溶離液中に存在する。カ
ラムとしてポリクローナルIgGと結合させたSpherosilカ
ラムが用いられる。適用緩衝液は例えばPBS/アジ化物
（50mmol/lリン酸カリウムpH7.5;150mmol/NaCl;0.1％ア
ジ化ナトリウム）である。
成分を、IgMを固定した免疫吸着剤に任意に数回通すこ
とにより除去することができる。なぜなら、IgGおよびI
gMのＬ鎖の定常部は相同的だからである。Ｌ鎖に向けら
れた成分がカラムに吸着するのに対し、Ｈ鎖のFdセクシ
ョンに向けられた成分はカラム溶離液中に存在する。カ
ラムとしてポリクローナルIgGと結合させたSpherosilカ
ラムが用いられる。適用緩衝液は例えばPBS/アジ化物
（50mmol/lリン酸カリウムpH7.5;150mmol/NaCl;0.1％ア
ジ化ナトリウム）である。
IgGカラム由来の非結合画分をプールし、ヒトIgGを固
定した別の免疫吸着剤を通過させる。これは場合により
数回繰り返してもよい。抗FdヒツジFabの特異的画分を
非特異的ヒツジFab画分からこのカラムを用いて分離す
ることが可能である。Fd特異的ヒツジFabはこのカラム
に結合し、これを溶離緩衝液（例えば1mol/lプロピオン
酸）を用いて溶出することができる。他の成分は結合せ
ず、適切な緩衝液（例えばPBS/アジ化物）でカラムを洗
浄することにより除去される。
定した別の免疫吸着剤を通過させる。これは場合により
数回繰り返してもよい。抗FdヒツジFabの特異的画分を
非特異的ヒツジFab画分からこのカラムを用いて分離す
ることが可能である。Fd特異的ヒツジFabはこのカラム
に結合し、これを溶離緩衝液（例えば1mol/lプロピオン
酸）を用いて溶出することができる。他の成分は結合せ
ず、適切な緩衝液（例えばPBS/アジ化物）でカラムを洗
浄することにより除去される。
さらに、免疫学的試験において通常結合パートナーと
して使用されるマウス抗体との干渉性の交差反応性を、
固定化マウスIgGを含有する免疫吸着剤をさらに通過さ
せることにより除去することができる。調製物の所望の
成分は、カラム溶離液中に存在する。
して使用されるマウス抗体との干渉性の交差反応性を、
固定化マウスIgGを含有する免疫吸着剤をさらに通過さ
せることにより除去することができる。調製物の所望の
成分は、カラム溶離液中に存在する。
ヒトFdγに特異的なFabフラグメント（＜ｈ−Fdγ＞F
ab）のヒトIgG（ｈ−IgG）への結合を図１に図式的に示
す。ｈ−IgGの抗原結合部位はいずれも矢印で示されて
いる。
ab）のヒトIgG（ｈ−IgG）への結合を図１に図式的に示
す。ｈ−IgGの抗原結合部位はいずれも矢印で示されて
いる。
実施例２
試薬の純度の検査
Nunc Co.製のマイクロタイタープレート（MTP）を固
相または捕獲抗体としてヒツジFab特異的ウサギIgGで被
覆した（10μg/mlウサギIgG、炭酸ナトリウム緩衝液pH
9.6;PBS緩衝液に溶解した１％ウシ血清アルブミンを用
いて再被覆）。分析すべき試薬はサンプルとして、各場
合において徐々に増加する濃度（例えば、０から10μg/
ml）の精製ヒトFabγフラグメント調製物またはヒトFab
μフラグメント調製物と共にプレインキュベートし、そ
の後被覆したMTPに移す（サンプル容量200μｌ、室温で
２時間インキュベーション、緩衝液は１％ウシ血清アル
ブミンを含有するPBS）。
相または捕獲抗体としてヒツジFab特異的ウサギIgGで被
覆した（10μg/mlウサギIgG、炭酸ナトリウム緩衝液pH
9.6;PBS緩衝液に溶解した１％ウシ血清アルブミンを用
いて再被覆）。分析すべき試薬はサンプルとして、各場
合において徐々に増加する濃度（例えば、０から10μg/
ml）の精製ヒトFabγフラグメント調製物またはヒトFab
μフラグメント調製物と共にプレインキュベートし、そ
の後被覆したMTPに移す（サンプル容量200μｌ、室温で
２時間インキュベーション、緩衝液は１％ウシ血清アル
ブミンを含有するPBS）。
免疫グロブリンＬ鎖に向けられた、そして精製の間に
完全に分離されなかったかもしれない、存在する可能性
のある不純物が固相に結合するように、ヒトFdγに特異
的なサンプル中のヒツジFab成分もまた固相に結合す
る。非結合成分は、PBS緩衝液で３回洗浄することによ
り除去される。
完全に分離されなかったかもしれない、存在する可能性
のある不純物が固相に結合するように、ヒトFdγに特異
的なサンプル中のヒツジFab成分もまた固相に結合す
る。非結合成分は、PBS緩衝液で３回洗浄することによ
り除去される。
検出試薬としてヒトFabγに結合した西洋ワサビペル
オキシダーゼ（200μl,50mU/ml）を用いる。PBS緩衝液
で３回洗浄した後、基質ABTSTMと共に室温で１時間イン
キュベートすることにより結合したペルオキシダーゼ結
合体の酵素活性を発生させ、次いで405nmで測光的に測
定する。前もって固相に結合させたサンプルのヒツジFa
b成分のうち、ヒトFabに向けられた成分のみが上記の酵
素マーカー結合体によって検出される。その結果、1000
から3000mAの陽性シグナルがFabμおよびFabγを添加し
ない対照中に生成される。これは検査すべき調製物中に
存在する、ヒトFabに向けられたヒツジFabの全量に対応
する。ヒトFabγを徐々に増大させて添加したサンプル
において、Fdγ特異的ヒツジFabのマスキングは、結合
体の置換の増加をもたらし、したがって測定されたシグ
ナル曲線はゼルまたはブランク値に向かう。対照的に、
ヒトFabμを徐々に増大させて混合したサンプルにおい
ては、Ｌ鎖に向けられたヒツジFab成分のみがマスクさ
れ、この場合シグナルの低下はヒツジFab調製物中にそ
のような望ましくない成分がなお存在する場合にのみ起
こる。２つの置換曲線の差は、後者の場合、調製物中の
Fdγ特異的ヒツジFabの実際の量に対応する。
オキシダーゼ（200μl,50mU/ml）を用いる。PBS緩衝液
で３回洗浄した後、基質ABTSTMと共に室温で１時間イン
キュベートすることにより結合したペルオキシダーゼ結
合体の酵素活性を発生させ、次いで405nmで測光的に測
定する。前もって固相に結合させたサンプルのヒツジFa
b成分のうち、ヒトFabに向けられた成分のみが上記の酵
素マーカー結合体によって検出される。その結果、1000
から3000mAの陽性シグナルがFabμおよびFabγを添加し
ない対照中に生成される。これは検査すべき調製物中に
存在する、ヒトFabに向けられたヒツジFabの全量に対応
する。ヒトFabγを徐々に増大させて添加したサンプル
において、Fdγ特異的ヒツジFabのマスキングは、結合
体の置換の増加をもたらし、したがって測定されたシグ
ナル曲線はゼルまたはブランク値に向かう。対照的に、
ヒトFabμを徐々に増大させて混合したサンプルにおい
ては、Ｌ鎖に向けられたヒツジFab成分のみがマスクさ
れ、この場合シグナルの低下はヒツジFab調製物中にそ
のような望ましくない成分がなお存在する場合にのみ起
こる。２つの置換曲線の差は、後者の場合、調製物中の
Fdγ特異的ヒツジFabの実際の量に対応する。
ヒトFabμまたはFabγを添加しないサンプルの測定
は、吸光度1600mAという結果をもたらす。サンプル＋Fa
bμは、吸光度1500mAという結果をもたらす。サンプル
＋Fabγは、吸光度150mAという結果をもたらす。
は、吸光度1600mAという結果をもたらす。サンプル＋Fa
bμは、吸光度1500mAという結果をもたらす。サンプル
＋Fabγは、吸光度150mAという結果をもたらす。
実施例３
リウマチ因子の存在下における電気化学発光による抗HB
c−IgMの検出 WO90/05302に記載のように、測定のために装置を使用
した。試験原理を図２に示す。これは、ヒトIgMに特異
的なビオチニル化抗体（＜Ｈ−IgM＞Bi）およびルテニ
ウム複合体を用いて直接標識したHBc抗原（HBc−Ru）の
使用に基づいている。または、（ルテニル化抗HBc抗体
を結合することにより）間接的に標識したHBc抗原を用
いることも可能である。ルテニウム複合体、およびHBc
抗原または抗体への結合のための技法は、EP−Ａ−0 19
9 804に記述されている。
c−IgMの検出 WO90/05302に記載のように、測定のために装置を使用
した。試験原理を図２に示す。これは、ヒトIgMに特異
的なビオチニル化抗体（＜Ｈ−IgM＞Bi）およびルテニ
ウム複合体を用いて直接標識したHBc抗原（HBc−Ru）の
使用に基づいている。または、（ルテニル化抗HBc抗体
を結合することにより）間接的に標識したHBc抗原を用
いることも可能である。ルテニウム複合体、およびHBc
抗原または抗体への結合のための技法は、EP−Ａ−0 19
9 804に記述されている。
さらに別の試験原理を図３に示す。これは、ビオチニ
ル化HBc抗原（HBc−Bi）およびルテニウム標識HBc抗原
（HBc−Ru）の使用に基づいている。
ル化HBc抗原（HBc−Bi）およびルテニウム標識HBc抗原
（HBc−Ru）の使用に基づいている。
手順は以下の通りである：
凝集IgG（0.5mg/ml）または抗Fdγ試薬（2mg/ml）を含
む、または含まない90μｌの非特異的ヒトIgM（11μg/m
l）溶液を、10μｌの前もって1:100に希釈したサンプル
または標準物質と混合し、37℃で10分間インキュベート
した。
む、または含まない90μｌの非特異的ヒトIgM（11μg/m
l）溶液を、10μｌの前もって1:100に希釈したサンプル
または標準物質と混合し、37℃で10分間インキュベート
した。
次に、ルテニウム標識HBc抗原（0.5μg/ml）およびビ
オチニル化抗ヒトIgM抗体（２μg/ml）を含む溶液100μ
ｌ、並びにストレプトアビジン被覆磁気ビーズ（Dynal
Co.,720μg/ml）40μｌを添加し、この混合物を37℃で
さらに10分間インキュベートした。次に、この混合物を
アッセイ緩衝液（200mmol/lリン酸塩、pH6.8、0.1％ポ
リドカノール、0.1％Oxaban A、160mmol/lトリプロピル
アミン）と共に28℃に調温した計測用セルに移し、そこ
で測定した。
オチニル化抗ヒトIgM抗体（２μg/ml）を含む溶液100μ
ｌ、並びにストレプトアビジン被覆磁気ビーズ（Dynal
Co.,720μg/ml）40μｌを添加し、この混合物を37℃で
さらに10分間インキュベートした。次に、この混合物を
アッセイ緩衝液（200mmol/lリン酸塩、pH6.8、0.1％ポ
リドカノール、0.1％Oxaban A、160mmol/lトリプロピル
アミン）と共に28℃に調温した計測用セルに移し、そこ
で測定した。
次に、サンプル中の抗HBc IgM濃度を検量線に基づい
て測定した。濃度に関する結果を表１に示す。
て測定した。濃度に関する結果を表１に示す。
４個のサンプル（１、３、４および５）は明らかに、
干渉排除試薬を添加しない場合、または凝集IgGが添加
された場合のみに陽性反応を示すことが分かる。抗Fd試
薬の存在下では、サンプル１のみが陽性反応を示す。し
たがって、抗Fd試薬の不存在下におけるサンプル３〜５
の陽性シグナルは誤った陽性シグナルであって、これは
高濃度のリウマチ因子（RF）の存在にのみ起因する。
干渉排除試薬を添加しない場合、または凝集IgGが添加
された場合のみに陽性反応を示すことが分かる。抗Fd試
薬の存在下では、サンプル１のみが陽性反応を示す。し
たがって、抗Fd試薬の不存在下におけるサンプル３〜５
の陽性シグナルは誤った陽性シグナルであって、これは
高濃度のリウマチ因子（RF）の存在にのみ起因する。
この表から分かるように、抗Fd試薬（＜Fdγ＞）の添
加は、先行技術による凝集IgGの添加とは対照的に、リ
ウマチ血清の干渉の完全な排除をもたらす。この結果
は、先行技術で公知の非特異的IgGに較べ、抗Fd試薬が
有意に改善された干渉排除を有することを示す。
加は、先行技術による凝集IgGの添加とは対照的に、リ
ウマチ血清の干渉の完全な排除をもたらす。この結果
は、先行技術で公知の非特異的IgGに較べ、抗Fd試薬が
有意に改善された干渉排除を有することを示す。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 シュミット，ウルバン
ドイツ連邦共和国 ディー82386 オバ
ーハウセン ワルドシュトラーセ 36
(72)発明者 ウィードマン，ミッシェル
ドイツ連邦共和国 ディー82377 ペン
ツバーグ イン デル オー 11
(56)参考文献 特開 平１−118769（ＪＰ，Ａ)
特開 昭57−9723（ＪＰ，Ａ)
特開 平５−281229（ＪＰ，Ａ)
国際公開96／14337（ＷＯ，Ａ１)
Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｒｅ
ｕｍａｔｏｌｏｇｙ，1985年，Ｖｏｌ.
12 Ｎｏ．３，ｐ427−431
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C07K 16/42
G01N 33/53 - 33/577
Claims (27)
- 【請求項１】分析物を測定する免疫化学的方法において
リウマチ因子によって引き起こされる干渉を減少させる
ための試薬として、IgG、IgM、IgA、IgDおよびIgEクラ
スのうち１つ又は幾つかのクラスの免疫グロブリンのＨ
鎖のFdセクションに特異的な数個の異なる抗体または／
および抗体フラグメントから本質的になる組成物であっ
て、これらの免疫グロブリンが抗原に結合する能力を実
質的にマスクする組成物の使用。 - 【請求項２】前記組成物が免疫グロブリンＧのＨ鎖のFd
セクションに特異的である、請求項１に記載の使用。 - 【請求項３】リウマチ因子と比較して５倍モル過剰の前
記組成物がリウマチ因子の干渉効果を少なくとも50％妨
げる、請求項１または２に記載の使用。 - 【請求項４】リウマチ因子と比較して５倍モル過剰の前
記組成物がリウマチ因子の干渉効果を少なくとも90％妨
げる、請求項３に記載の使用。 - 【請求項５】前記組成物がIgGに特異的であるととも
に、IgGへの反応性と比較して10-2の別の免疫グロブリ
ンクラスとの最大交差反応性を有する、上記請求項のい
ずれか１項に記載の使用。 - 【請求項６】前記組成物がIgGに特異的であるととも
に、IgGへの反応性と比較して10-2のIgMとの最大交差反
応性を有する、請求項５に記載の使用。 - 【請求項７】前記組成物が10-3の最大交差反応性を有す
る、請求項６に記載の使用。 - 【請求項８】前記組成物が複数の一価の抗体フラグメン
トからなる、上記請求項のいずれか１項に記載の使用。 - 【請求項９】前記組成物が複数のFabフラグメントから
なる、上記請求項のいずれか１項に記載の使用。 - 【請求項１０】前記組成物がヒト免疫グロブリンに特異
的であるとともに、ヒト免疫グロブリンへの反応性と比
較して10-2の非ヒト免疫グロブリンクラスとの最大交差
反応性を有する、上記請求項のいずれか１項に記載の使
用。 - 【請求項１１】前記組成物が複数のポリクローナル抗体
または／および抗体フラグメントからなる、上記請求項
のいずれか１項に記載の使用。 - 【請求項１２】リウマチ因子を含有するサンプル中のIg
M、IgA、IgDまたは／およびIgEクラスの抗体の選択的ク
ラス特異的測定のためのイムノアッセイにおける、請求
項１〜11のいずれか１項に記載の使用。 - 【請求項１３】IgMクラスの抗体の測定のための、請求
項12に記載の使用。 - 【請求項１４】一段階（one−step）イムノアッセイに
おける、請求項１〜13のいずれか１項に記載の使用。 - 【請求項１５】リウマチ因子をも含有する液体サンプル
中の分析物を免疫化学的に測定する方法であって、Ig
G、IgM、IgA、IgDおよびIgEクラスのうち１つ又は幾つ
かのクラスの免疫グロブリンのＨ鎖のFdセクションに特
異的な数個の異なる抗体または／および抗体フラグメン
トから本質的になる組成物の存在下で測定が行われ、こ
れらの免疫グロブリンの抗原に結合する能力が少なくと
も大部分にマスクされている、前記方法。 - 【請求項１６】IgM、IgA、IgDまたは／およびIgEクラス
の抗体が分析物として測定される、請求項15に記載の方
法。 - 【請求項１７】IgMクラスの抗体が測定される、請求項1
6に記載の方法。 - 【請求項１８】前記組成物が、液体サンプル中に存在す
るリウマチ因子と比較して活性成分の少なくとも５倍モ
ル過剰に相当する量で添加される、請求項15〜17のいず
れか１項に記載の方法。 - 【請求項１９】前記組成物が10倍から1000倍モル過剰で
添加される、請求項18に記載の方法。 - 【請求項２０】液体サンプルが前記組成物と共に好まし
くは５から60分間あらかじめインキュベートされる、請
求項15〜19のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項２１】測定が異種イムノアッセイの原理にした
がって反応性固相並びに検出すべき分析物に結合可能な
２つの受容体R1およびR2の存在下で行われ、ここでR1は
前記固相に結合しているか又は前記固相に結合可能であ
り、R2は直接的又は間接的に標識されており、そして検
出すべき分析物は前記固相中または／およびインキュベ
ーション液中の標識を測定することにより測定される、
請求項15〜20のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項２２】検出すべき抗体と特異的に反応する抗原
と固相結合基との結合体を受容体R1として用い、そして
検出すべき抗体と特異的に反応する抗原であって直接的
又は間接的に標識されている抗原を受容体R2として用い
る、請求項21に記載の抗体の検出方法。 - 【請求項２３】検出すべき抗体と特異的に反応する抗原
と固相結合基との結合体を受容体R1として用い、そして
選択された抗体クラスを認識するとともに直接的又は間
接的に標識されている抗体又は適切な抗体フラグメント
を受容体R2として用いる、請求項21に記載の抗体の検出
方法。 - 【請求項２４】選択された抗体クラスを認識する抗体ま
たは適切な抗体フラグメントと固相結合基との結合体を
受容体R1として用い、そして直接的又は間接的に標識さ
れているとともに検出すべき抗体と特異的に反応する抗
原を受容体R2として用いる、請求項21に記載の抗体の検
出方法。 - 【請求項２５】ストレプトアビジンまたはアビジンで被
覆した反応性固相およびビオチニル化受容体R1を用い
る、請求項21〜24のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項２６】前記標識として発光金属複合体が用いら
れ、該標識が電気化学発光により測定される、請求項21
〜25のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項２７】前記標識として酵素が用いられ、該標識
が酵素反応の検出により測定される、請求項21〜25のい
ずれか１項に記載の方法。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4439452A DE4439452A1 (de) | 1994-11-04 | 1994-11-04 | Antikörperklassenspezifisches Entstörungsreagenz |
| DE4439452.7 | 1994-11-04 | ||
| PCT/EP1995/004308 WO1996014338A1 (de) | 1994-11-04 | 1995-11-02 | RHEUMAFAKTOR-ENTSTÖRUNG MIT ANTI-Fd-ANTIKÖRPERN |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10508692A JPH10508692A (ja) | 1998-08-25 |
| JP3447010B2 true JP3447010B2 (ja) | 2003-09-16 |
Family
ID=6532500
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP51504596A Expired - Lifetime JP3447010B2 (ja) | 1994-11-04 | 1995-11-02 | 抗Ｆｄ抗体を用いたリウマチ因子干渉の排除 |
| JP51504496A Expired - Fee Related JP3602135B2 (ja) | 1994-11-04 | 1995-11-02 | 抗体クラス特異的干渉除去剤 |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP51504496A Expired - Fee Related JP3602135B2 (ja) | 1994-11-04 | 1995-11-02 | 抗体クラス特異的干渉除去剤 |
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|---|---|
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| EP (2) | EP0782585B1 (ja) |
| JP (2) | JP3447010B2 (ja) |
| KR (1) | KR100249752B1 (ja) |
| AT (1) | ATE202116T1 (ja) |
| AU (1) | AU691995B2 (ja) |
| DE (3) | DE4439452A1 (ja) |
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| FI (1) | FI971883L (ja) |
| NO (1) | NO971873D0 (ja) |
| NZ (1) | NZ296087A (ja) |
| WO (2) | WO1996014337A1 (ja) |
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| DE19649390A1 (de) | 1996-11-29 | 1998-06-04 | Boehringer Mannheim Gmbh | Antigenspezifischer IgG-Nachweis |
| DE19731465A1 (de) * | 1997-07-22 | 1999-01-28 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verwendung von Kontrollflächen zur Detektion von Störproben in einem Nachweisverfahren |
| ES2180241T3 (es) | 1998-05-06 | 2003-02-01 | Roche Diagnostics Gmbh | Eliminacion de interferencias causadas por factores reumaticos. |
| US6228400B1 (en) * | 1999-09-28 | 2001-05-08 | Carlsbad Technology, Inc. | Orally administered pharmaceutical formulations of benzimidazole derivatives and the method of preparing the same |
| DE10006432A1 (de) * | 2000-02-14 | 2001-08-16 | Ganzimmun Inst Fuer Ganzheitli | Verfahren zum Nachweis von Helicobacter pylori in Stuhl- und Speichelproben |
| US20040018576A1 (en) * | 2002-07-24 | 2004-01-29 | Dematteo Todd M. | Bence Jones protein testing cassette |
| US20050112586A1 (en) * | 2003-11-24 | 2005-05-26 | Roland Janzen | Method and composition for stabilizing liquid reagents |
| FR2864624A1 (fr) * | 2003-12-24 | 2005-07-01 | Inodiag | Methode de diagnostic serologique des maladies infectieuses par immunodetection d'antigene microbien comprenant le controle de reaction faussement positive ou negative |
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| CN108445242B (zh) | 2013-03-15 | 2022-03-04 | Hycor生物医学有限责任公司 | 进行样本的冷光和荧光测量的装置和相关方法 |
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