JP3424752B2 - Ｍｈｃ−分子のペプチドモチーフの決定 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、主要組織適合遺伝子複合体（MHC）の分子
のペプチドモチーフもしくは−エピトープの決定法、並
びに、これにより決定されたペプチドモチーフ、及び診
断薬又は治療薬を製造するためのその使用に関する。

細胞障害性Ｔリンパ球（CTL）は、MHC−コードされた
分子と結合した抗原ペプチドエピトープを認識する。こ
の現象を、MHC−拘束（MHC−Restriktion）という（文
献;1〜５）。ヒトMHCクラスＩ−分子、HLA−2Aw68の結
晶学は、重鎖のα１−及びα２−ドメインにより形成さ
れるスリット（Spalt）を生じた（文献;3、６）。この
スリットは、抗原ペプチドエピトープに関する結合部位
であると思われる。それというのも、この双方の結晶
は、MHC−配列と適合せずに、このスリットに接して存
在している大きさのペプチドの構造を有するからである
（文献;6）。

これらのペプチドが細胞内タンパク質に由来し、かつ
細胞表面に存在しているので、細胞障害性Ｔリンパ球
が、異常な特徴に関して細胞を試験することができると
考えられている。Ｔ−細胞エピトープを表出する、予め
MHC−会合された（assoziierte）ペプチドを、普通の又
はウイルス感染した細胞から抽出した（文献;2、４、
５、７、８）。相当する方法で、MHCクラスII拘束Ｔ細
胞により認識される抗原も、合成ペプチドにより模倣さ
れ得（文献;9）、MHC−会合された抗原ペプチドが、MHC
クラスII−分子から溶離した（文献;10）。Ｔ−細胞受
容体、ペプチド及びMHC−分子からなる３分子複合体
（文献;11）の真中のその位置に基づいて、Ｔ−細胞エ
ピトープは、特異的免疫系の中心点であり、かつ従っ
て、その発生の法則性の理解並びに決定法に対する多く
の必要性がある（文献;12〜15）。

本発明による課題は、 （ａ）MHC−分子を含有する細胞の溶解により細胞抽出
物を得、 （ｂ）MHC−分子を、その上に存在するペプチド混合物
と共に、免疫沈降により細胞抽出物から分離し、 （ｃ）ペプチド混合物を、MHC−分子及びその他のタン
パク質成分から分離し、 （ｄ）個々のペプチド又は／及びその混合物を配列決定
し、かつ （ｅ）得られた、殊に混合物の配列決定又は一連の個々
のペプチドの配列決定の情報から、対立遺伝子特異性ペ
プチドモチーフ（allelspezifische Peptidmotiv）を引
き出すことを特徴とする、 クラスＩ又はIIの主要組織適合遺伝子複合体（MHC）の
対立遺伝子特異性ペプチドモチーフを決定する方法によ
り解決される。

本発明方法により、MHC−分子がそれに従ってペプチ
ドを選択し、かつ提示する法則性を有しするペプチドモ
チーフが決定される。

本発明の方法は、クラスＩのMHC−分子を用いても、
クラスIIのMHC−分子を用いても実施することができ、
その際、クラスＩのMHC−分子が有利である。Ｈ−2K
^d−、Ｈ−K^b−、Ｈ−2D^b−、Ｈ−2K^k、Ｈ−2K^m′又はHL
A−Ａ＊0201又はＡ＊0205−分子は、殊に有利である。

本発明方法によるMHC−分子の免疫沈降の際に、それ
ぞれ、所望のMHC−分子に関して特異的である適当な抗
体を使用する。本発明の使用のために有利なMHC−クラ
スＩ−分子は、分子A1、A2、A3、A9、A10、A11、A28、A
29、Aw19、B5、B7、B8、B12〜B18、B21、B35及びB37を
包含するが、これらに限定されない。本発明による使用
のために有利なMHC−クラスII−分子は、分子DR1、DR
2、DR3、DR4、DR5、DRw6、DR7、Dw1、Dw2及びDw3を包含
するが、これらに限定されない。Ｈ−2K^d−又はＨ−2D^b
−分子の決定のためには、例えば、K^d−特異性抗体（文
献;25）又はD^b−特異性抗体（文献;26）を使用する。有
利には、モノクローナル抗体を使用するが、相当する精
製したポリクローナル抗血清の使用も可能である。本発
明により使用することができる抗体は、当業者によく知
られた標準技術を用いて、新たに製造することができ
る。本発明で使用することができる抗体の例は、ATCC
（American Type Culture Collection、12301 Parklawn
Drive,Rockville、MD20852）の「カタログ・オブ・セ
ル・ラインズ・ハイブリドーマス（Catalogue of Cell
Lines and Hydridomas）」中に記載されているHLA−抗
原に対する全ての抗体を包含するが、これらに限定され
ない。

有利な例（ATCC−命名法）は、HB82、117、166、54、
122、164、95、120、116、118、94、152、178、56、11
5、157、119、59、105、165、144、180、103、110、10
9、151及び104を包含する。カタログ中に記載されてい
るマウス−Ｈ−２−抗原に対する全ての抗体は、同様
に、本発明で使用することができる。固相結合した抗体
による免疫沈降は、殊に有利に行なわれる。固相結合し
た抗体は、当業者に公知の方法で、例えば抗体と、ブロ
ムシアン活性化されたセファロース4B（ファルマシア
（Pharmacia）LKB）とを結合させることにより製造する
ことができる。本発明で使用するための抗体に結合させ
ることができる他の固相の例は、アガロース、セルロー
ス、セファデックス、プロテインＡ−セファロース及び
プロテイン−Ｇ−セファロースを包含するが、これらに
限定されない。免疫沈降の有利な方法は、臭化シアン活
性化されたセファロース4B（例１参照）から製造された
小球に結合している抗体を用いる、吸着クロマトグラフ
ィーである。

MHC−分子及びその他のタンパク質成分からの、決定
すべきペプチド混合物の分離は、クロマトグラフィー法
により、特に逆相−HPLCにより行なうのが有利である。
その際、トリフルオロ酢酸/H₂O−トリフルオロ酢酸／ア
セトニトリル−勾配で分離を行なうことは、有利である
ことが判明した。MHC−分子からペプチド混合物を分離
するための本発明により使用することができる他の方法
は、イオン交換、ゲル濾過、電気焦点泳動、高性能毛管
電気泳動（HPCE）及びゲル電気泳動を包含するが、これ
らに限定されない。分離を実施するためのもう１つの方
法は、超遠心分離であり、その際、3000Da又は5000Da又
は10000Daの透過性を有する膜を使用する。HPLCを用い
る分離が、有利に実施される。

ペプチド混合物のクロマトグラフィー分離の際に、多
くの場合に、単独のペプチド種を単離することができ
る。従って、本発明方法の工程（ｄ）は、ペプチド混合
物の配列決定（これにより、それぞれのMHC−分子のペ
プチドモチーフに関する共通配列が決定される）又は／
及び明確なペプチドの配列決定よりなる。

ペプチドモチーフの決定に関する出発物質として、正
常細胞、腫瘍細胞も、ウイルス又はこのような病原体に
より感染した細胞も、並びに試験管内で培養したヒト又
は動物の細胞も使用することができる。本発明で使用す
ることができる正常細胞は、新しい細胞、例えば抹消血
液リンパ球、脾臓、肺、胸腺の細胞又はMHC−分子を表
現する他の組織の細胞を包含するが、これらに限定され
るものではない。本発明で使用した腫瘍細胞系には、腫
瘍細胞EL4及びP815を包含するが、同様に、これらに限
定されるものではない。本発明により使用することがで
きるウイルス感染した細胞は、これらに限定されるもの
ではないが、エプスタイン−バール−ウイルス（Epstei
n−Barr−Virus）により形質転換されたヒトＢ−細胞で
あるJY−細胞を包含する。本発明方法により決定された
ペプチドモチーフは、次の基本原理に相当する： ａ）これらは、MHC−クラスＩ−分子の場合には、アミ
ノ酸８、９、10又は11個、並びにMHC−クラスII−分子
の場合には、アミノ酸８〜15個の対立遺伝子特異性ペプ
チドの長さを有する。

ｂ）これらは、２個のアンカー位置（Ankerposition）
（「アンカー位置」なる名称は、位置が単独のアミノ酸
残基の強いシグナルを示すか、又は位置が非常によく類
似した側鎖を有する僅かなアミノ酸残基で占められる場
合に使用する）を有し、そのうち、１個のアンカー位置
は、常にＣ−末端に存在し、かつしばしば脂肪性であ
り、かつ ｃ）ペプチドは、もちろん、正常の、ウイルス感染し
た、他の方法で感染した、又は遺伝子を用いて形質転換
したか、又は抗原を負荷した細胞のMHC−分子上に提示
される。

MHC−クラスＩ−分子H2K^d、H2K^b、H2D^b及びHLA−A2か
らの自己ペプチド混合物の配列決定は、クラスＩ−分子
のそれぞれにより提示される、それぞれ異なる対立遺伝
子特異性ペプチドモチーフを示す。K^d、D^b及びA2により
提示されたペプチドは、９量体である一方、K^b−提示ペ
プチドは８量体であり、その際、相当するペプチドモチ
ーフは、固有のアミノ酸残基又はよく類似した側鎖を有
する僅かな数のアミノ酸残基で占められている、２個の
アンカー位置を含有する。これらのアンカー位置は、異
なるモチーフの場合には、同じ位置に存在せず、これら
は、例えば位置５及び９（D^b）又は位置２及び８（K^d、
A2）又は位置５及び８（K^b）に存在しうる。全てのモチ
ーフのＣ−末端アンカー基は、疎水性アミノ酸である。
アンカー位置に存在しないアミノ酸残基は、かなり可変
性であってよいが、いくつかは特に特定のアミノ酸で占
められ、例えば、K^d−モチーフの位置４にPro、K^b−モ
チーフの位置３にTyrが見られ、かつ疎水性基は、D^b−
モチーフの位置３及びA2モチーフの位置６で優勢であ
る。Ｈ−2L^dのためには、アンカー基は、位置２のプロ
リンであった。

本発明方法により得られた結果は、MHC−クラスＩ−
分子で結晶学的に見られたスリットの構造に非常に良好
に相当する（文献;3、６）。異なるMHC−クラスＩ−対
立遺伝子は、このスリットのところの、異なるポケット
（Taschen）の存在により異なっている。このことは、
おそらく、ポケットが、それぞれ異なるアミノ酸を収容
しうることに起因する。従って、MHC−結晶中の対立遺
伝子特異性ポケットと対立遺伝子特異性アンカー基の側
鎖とは、おそらく相補的構造を示す。

本発明のもう１つの課題は、診断薬又は治療薬の製法
における、本発明によるペプチドモチーフの使用であ
る。このペプチドモチーフの可能な使用範囲は、MHC−
分子の診断学的証明である。MHC−分子は、ペプチドの
その個々の特異な結合により特徴付けられるので、標識
基のペプチドを介しての結合証明を行なうことができ、
その際、標識基として、例えばビオチン基又は蛍光基を
ペプチドと結合させる。当業者に公知の他の標識は、同
様に、本発明で使用することができる。この標識は、こ
れらに限定されるものではないが、例えばペプチドのチ
ロシン基に結合した¹³¹I又は¹²⁵I、又は³H又は¹⁴C（双
方は、合成の間にペプチド中に取り込まれる）のような
放射性標識を包含する。標識のペプチドへの結合は、当
業者に公知の方法により達成することができる。標識
は、非−アンカー位置で行なうのが有利である。このよ
うな方法で分かった、自己免疫患者の発生と、疾病特異
性ペプチドモチーフを有するMHC−分子の表現との間の
相関関係を、診断学的に使用することができる。本発明
のペプチド配列の試験管内での診断学的使用の例は、こ
れらに限定されないが、次のものを包含する;MHC−分子
の結合特異性の測定、MHC−分子の結合特異性と疾病と
の相関関係付け、及び興味深いMHC−分子をペプチド−
バンク（試験したモチーフに合うペプチドの混合物）の
HPLC−フラクションで表現する、適当な細胞のインキュ
ベーションによる未知の起源のＴ−細胞エピトープの配
列の決定、及び天然のＴ−細胞エピトープとＴ−細胞エ
ピトープとして認識された合成ペプチドとのクロマトグ
ラフィー比較により行なわれる、Ｔ−細胞により認識さ
れたペプチドの決定（Nature 348:252〜254（199
0））。

本発明のもう１つの課題は、免疫系の障害又は腫瘍疾
病を治療するための医薬の製法における本発明によるペ
プチドモチーフの使用である。殊に、本発明のペプチド
モチーフは、自己免疫疾患における干渉（予防及び治
療）のために、例えば一定のMHC−分子の遮断並びにＴ
−細胞のペプチド特異的非−反応性の誘導により使用す
ることができる。更に、移植拒絶反応及び移植片対宿主
反応（Graft−versus−Host−Reaktionen）における干
渉が、同様の方法で可能である。更に、本発明によるペ
プチドは、腫瘍細胞に対するＴ−細胞の誘導又は強化も
しくは増強のために、殊に腫瘍疾病に対するワクチン化
及び存在する腫瘍疾病の治療のために、試験管内及び生
体内で使用することができ、その際、殊に、いわゆる移
植片対白血病作用（Graft−versus−Leukaemia−Effek
t）（Sullivan等,N.Engl.J.Med.320:828〜834）を利用
することができる。本発明によるペプチドは、同様に、
感染方法（infektioese Mittel）又は腫瘍に関して特異
的であるMHC−結合ペプチドを生体内で使用することに
より、感染性又は悪性疾病に対するＴ−細胞応答を強化
するために使用することができる。二者選択的に、Ｔ−
細胞は、動物から得ることができ、その数を、試験管内
で、ペプチドの使用及びサイトカイン、例えばインター
ロイキン２、インターロイキン４又はインターロイキン
６を包含する適当な成長条件の使用により増加させ、か
つ引き続き、患者に戻すことができる。本発明によるペ
プチドは、更に、Ｔ−細胞により攻撃可能な抗原を発現
する、次のものを包含するがこれらに限定されない全て
の腫瘍；黒色腫、乳癌、ウイルス起源の腫瘍、例えばバ
ーキットリンパ腫（Burkittslymphom）、及びヒト乳頭
腫ウイルスによるような腫瘍、例えば頸部ガン腫及び他
の生殖器（anogenitale）腫瘍を治療するために使用す
ることができる。Ｔ−細胞受容体−分子又は抗体分子に
起因するペプチドは、更に、免疫調節的機構の、目的と
する処置のために、殊に、自己免疫疾病及び移植拒絶反
応並びに移植片対宿主反応の治療のために使用すること
ができる。予防のための、本発明によるタンパク質の生
体内使用において、その使用は、これらに限定されるも
のではないが、次のものを包含する；感染性又は悪性疾
病に対するペプチドワクチンとして、及び組換え接種物
質（ウイルス、例えばワクシニア菌又はバクテリア、例
えばサルモネラ又はマイコバクテリアを含む）及び組換
えバクテリア（例えばE.コリ）又は他の細胞（酵母−、
昆虫−、マウス−又はヒト細胞を含む）の使用により製
造されたタンパク質を含む他の全ての種類の接種物質中
への本発明によるタンパク質の導入のための適当なＴ−
細胞エピトープに関する本発明で集められた情報の使
用。

本発明のペプチドの用量又は濃度は、当業者により常
法で決めることができる。これらは、生体内で、10μｇ
〜1gの範囲で予想することができる。試験管内濃度は、
１フェムトモル〜１マイクロモルの範囲で予想すること
ができる。生体内投与は、これらに限定されないが、皮
下、筋肉、静脈内、腸管内及び経口法を包含する。

治療的使用において、本発明によるペプチドモチーフ
に相当し、Ｎ−又は／及びＣ−末端が親油性もしくは両
親媒性基、殊に親油性ペプチド−ヘリックスと共有結合
するペプチドが有利である。このような基の例は、トリ
パルミトイル−Ｓ−グリセリルシステイニル−セリルセ
リンである。

本発明を、次の例により、図１と結び付けて、明らか
にする。

次のものを示す； 図1aは、P815ライゼート（Lyssat）からの抗−K^d−抗体
を用いて分離した物質のHPLC−特徴、 図1bは、1aからのクロマトグラムの１部拡大部分（フラ
クション15〜35）、 図1cは、1b中の矢印を付した部分の自己ペプチドの再ク
ロマトグラフィー。

例１ P815−腫瘍細胞（Ｈ−2K^d）10〜20×10⁹をペレット化
し、かつ0.5％ノニデット（Nonidet）P40 250mlと共
に、フェニルメチルスルホニルフルオリド（PMSF）0.1
ミリモル/lを有するリン酸塩緩衝された塩溶液（PBS）
中で、30分間、４℃で撹拌した。上澄を、250gで５分間
及び150000g及び４℃で30分間で遠心分離し、次いで、
吸着クロマトグラフィー装置に導いた。この吸着クロマ
トグラフィー装置は、それぞれ約1mlの層容量を有する
カラム３個からなった。カラム物質は、製造元の記録に
よりブロムシアン−活性化されたセファロース4B（Phar
macia LKB）から製造された、抗体−結合したもしくは
グリシン−結合した小粒からなった。抗体としては、K^d
−特異性抗体20−８−4S（IgG 2a、kappa;25）又はD^b−
特異性抗体B22−249それぞれ5mgを小球1mlに結合させ
た。細胞抽出物の上澄を、先ず、グリシン−結合した小
球を有するカラムに、次いで、抗−K^d−小球を有するカ
ラムに、かつ次いで、偽沈降（Scheinpraezipitation）
のために抗−D^b−小球上に導いた。

小球を、全ての３個のカラムから除去し、かつ0.1％
トリフルオロ酢酸と共に15分間渦動させた（文献;7）。
上澄を真空遠心分離により乾燥させ、かつ逆相HPLCによ
り、スーパーパック（Superpac）PepSカラム（C2/C18;5
μｍ粒子、4.0×250mm、ファルマシア（Pharmacia）LK
B）及びファルマシアLKB−装置の使用下で分離した（文
献;4）。溶離剤：溶液Ａ H₂O中の0.1％トリフルオロ酢
酸（v/v）、溶液Ｂ アセトニトリル中の0.1％トリフル
オロ酢酸。

図1a及びｂ中に示したクロマトグラフィー分離のため
に、次の勾配を使用した： ０〜５分、A100％ ５〜40分、B60％まで直線的に増大 40〜45分、B60％ 45〜50分、B0％まで減少 流速:1ml/分、フラクション量:1ml。

個々のフラクションを集め、かつ真空遠心分離により
乾燥させた。

図１は、免疫沈降され、かつトリフルオロ酢酸処理さ
れたK^d−分子のHPLC−分離を示す。図1aは、抗−K^d（実
線）もしくは抗−D^b（点線）を用いてP815−ライゼート
から沈降させた、TFA処理した物質のHPLC−特徴を示
す。フラクション20〜28の間で、目標対立遺伝子特異性
ペプチド混合物である不均一物質が、僅かな量溶離す
る。

フラクション20〜28は、K^d−バッチ（Ansatz）から
も、偽沈降によっても集められた。双方のバッチを、エ
ドマン分解法の使用下で自動的に配列決定した（Edmann
等、Eur.J.Biochem.1:80〜91（1967））。このエドマン
分解を、オンラインPTH−アミノ酸分析機120A（Applied
Biosystems,Foster City,CA,94404,USA）を備えたタン
パク質シークエンサー477A中で実施した。ガラス繊維フ
ィルターを、バイオプレーン・プラス（BioPrene Plu
s）1mgで被覆し、かつ前循環（praezyklisiert）させな
かった。この配列決定を、標準プログラム BEGIN−１
及びNORMAL−１（Applied Biosystems）の使用下に実施
した。システインは修飾されず、かつ従って確認されな
かった。

エドマン法は、それぞれクロマトグラフィーにより同
定されるＮ−末端の逐次誘導体化及びアミノ酸除去を包
含する。ペプチドの錯体混合物を配列決定することは異
例であるので、配列決定装置から直接得られたデータを
提示する。第1a表及びｂは、K^d−溶離したペプチドに関
する、２種の配列決定試験からの結果を示す。第1c表
は、P815−ライゼートのD^b−特異性抗体での偽溶離の配
列決定結果を示す。K^d−溶離したペプチドは、１〜９の
各位置に明らかなアミノ酸形を１個有し、偽溶離した物
質は、それぞれの基の吸収量を減少しながら、それぞれ
のサイクルにおいて、例外なく、同じ形のアミノ酸形を
示している。K^d−溶離したペプチドにおいては、前又は
前の前のサイクルと比較して50％より多いピークが絶対
量で示され、重要とみなされ、かつ下線を引いた。最初
の位置は、評価することが困難である。それというの
も、前のサイクルが存在せず、かつ更に、HPLC−プール
（Pool）中に存在する、全ての遊離アミノ酸がこの位置
で確認されるからである。第２の位置に関して、以前の
サイクルと比較してその頻度が明らかに高い固有の基
は、チロシン（例えば第1a表で60.9pmolから875.6pmol
に）である。（僅かな）ピークを示す他の固有の基は、
Tyrに類似した側鎖を有するフェニルアラニンである。
このことは、天然のK^d−拘束インフルエンザ−エピトー
プ（TYQRTRALVの配列を有する）と他のK^d−拘束ペプチ
ドとの比較から、位置２のチロシン基を考慮した場合に
得られる仮定を裏付けする。これに反して、続く位置３
〜８に関して特徴的である、定義されたアミノ酸基は存
在しない。個々の位置において、14個までの種々異なる
基が見つけられる。位置９には、Ile及びLeuが見つけら
れる。位置10にシグナルピークはなく、このことは、多
くのK^d−結合した自己ペプチドが９個より長い基でない
ことを示唆している。従って、天然のK^d−拘束インフル
エンザ−ペプチドは、ノナペプチド（Nonapeptid）（文
献;4）である。この結果から、由来する共通配列形を、
第1c表中に示す。大抵、目に付くのは、位置２のTyr、
及び位置９のIle又はLeuであり、他の全ての位置には、
より多数の基が見られる。このモチーフと、K^d−拘束エ
ピトープを含有するペプチド配列との比較は、そのほと
んどがK^d−拘束共通モノマーモチーフに良好に合致する
ことを示す（第1d表）。

図1bのフラクション29中で矢印を付したピーク及び偽
沈降の相当するフラクションを、高い溶解性下に新たに
クロマトグラフィーにかけたが、その際、フラクション
容量は0.5mlであった（図1c）。急な特異的なピーク
は、直接配列決定により決定されたアミノ酸配列SYFPEI
THIを有するペプチドであった。合成SYFPEITHI−ペプチ
ドとの天然細胞ペプチドの同一性は、共溶離（Coelutio
n）によりHPLCで証明された（図1c）。この配列は、フ
ラクション20〜28のプールからの共通モチーフに合致し
（図1a、ｂ）、このことにより、特異なK^d−拘束ペプチ
ドモチーフ（第1d表）の存在が証明される。

＊K^d−拘束Ｔ−細胞エピトープを含有することで知られ
ているペプチドを、そのTyr−基により合致させた。自
然にプロセシングされることが知られているペプチドに
は下線を引いた。

例２ K^b−及びD^b−分子からのペプチドの溶離 EL4−腫瘍細胞（Ｈ−2^b）からのデタージェント−ラ
イゼート（Detergenz−Lysate）を、例えば例１で記載
したようなK^b−特異性及びD^b−特異性抗体を用いて免疫
沈降させた。D^b−抗体としてはB22−249（例１参照）
を、及びK^b−抗体としてはK9−178（IgG 2a、Ｋ、27）
を使用した。MHC−分子から解離したペプチドを、逆相H
PLCにより分離した。K^b−もD^b−物質も、例１からのK^d
−物質にいくらか相当する特徴を有して溶離され、その
際、しかしながら、フラクション20〜28の間で溶離され
た不均一物質は明らかな相違を生じた。

D^b−拘束ペプチドモチーフ D^b−バッチからの集めたフラクション20〜28を配列決
定した（第2a、ｂ表）。位置２〜４は、多くの基を含有
した。これに反して、サイクル５は、Asnに関する強い
シグナルを示した。従って、D^b−溶離された自己ペプチ
ドの位置５の優勢基は、Asnである。Aspに関する弱いシ
グナルは、配列決定条件下でAsnがAspへ加水分解するこ
とに起因する。位置６〜８は、異なる証明可能な基５〜
14個を含有した。位置９は、Metに関する強いシグナル
を有し、Ileに関する中間のシグナル及びLeuに関する弱
いシグナルを有した（全て疎水性）。（D^b−拘束エピト
ープ中のMet又はIleの条件は、既に記載されている。17
参照）。位置10にはシグナルがなく、このことは、D^b−
提示された自己ペプチドがノナペプチドであることを示
唆している。この結果により決定された共通モチーフを
第2c表中に示す。このモチーフと、天然のD^b−拘束ペプ
チド及びD^b−拘束エピトープを含有する他のペプチドと
の比較は、位置５のAsnが、D^b−拘束ペプチドモチーフ
の不変のアンカー基でありうることを示す。D^b−拘束エ
ピトープの他の基は、第２のアンカー位置のように見え
る（Met、Ile又はLeuを有する）位置９以外、著しく異
なっている。

K^b−拘束ペプチドモチーフ K^b−バッチからの集めたフラクション20〜28を配列決
定した（第3a、ｂ表）。位置３は、Tyrに関する強いシ
グナル及びProに関する弱いシグナルを有する。位置４
は、５個の基に関する弱いシグナルを示した。Phe及びT
yrに関する強いシグナルが、これらの双方の基を位置５
で優勢にする。次の双方の位置は、５個もしくは３個の
シグナルを含有する。位置８はLueに関する強いシグナ
ル、Metに関する中間のシグナル及びIle及びValに関す
る弱いシグナルを示した。位置９は、何かの基に関する
ピークは示さず、このことは、８量体である（文献;5）
公知のK^b−拘束天然のペプチドの長さと合致する。K^b−
拘束共通モチーフの分析及びエピトープとの比較は、２
個のアンカー位置を示す：位置５のTyr又はPhe（双方と
も類似の芳香族側鎖を有する）及び位置８のLeu、Met、
Ile又はVal（全て同様の疎水性側鎖を有する）。

例３ HLA−A2.1−拘束ペプチドモチーフ HLA−A2.1−MHC−分子（文献;45）を有するヒトJY−
細胞のデタージェント−ライゼートを、A2−特異性抗体
（BB7.2、IgG2b、文献箇所28）を用いて免疫沈降させ
た。A2−分子から解離されたペプチドを、HPLCにより分
離した。フラクション20〜28を集め、かつ前記のように
配列決定した（第４表）。第２の位置は、Leuに関する
強いシグナル及びMetに関する中間のシグナルを有し
た。位置３〜５には、それぞれ６〜８個の基が見られ
た。位置６は、Val、Leu、Ile及びThrを有した。引き続
く２個の位置は、それぞれ３個のシグナルを示した。位
置９は、強いVal−及び弱いLeu−シグナルを示した。位
置10は、１個の基のピークも示さず、このことは、A2−
拘束エピトープがノナペプチドであることを示唆してい
る。位置２のLeu又はMet及び位置９のVal又はLeuは、ア
ンカー基であるように見える。A2−拘束エピトープを有
する公知のペプチドのいくつかが、モチーフと合致しう
る一方、これは、他のものにおいては部分的に可能であ
るに過ぎない（第4c表）。A2−分子の多くの変法の現存
は、いくつかのペプチドとモチーフとのこの劣悪な合致
の原因である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 レチュケ，オーラフ ドイツ連邦共和国 Ｄ−7400 チュービ ンゲン フンツカプフクリンゲ 42 (72)発明者 ステファノヴィッチ，シュテファン ドイツ連邦共和国 Ｄ−7400 チュービ ンゲン シュールシュトラーセ 18 (72)発明者 ユング，ギュンター ドイツ連邦共和国 Ｄ−7400 チュービ ンゲン オプ デア グラーフェンハル デ ５ (56)参考文献 Ｃｅｌｌ，44（1986）ｐ．959−968 Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，166（1987) ｐ．678−692 Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，171（1990) ｐ．763−773 Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，169（1989) ｐ．603−612 Ｃｅｌｌ，62（1990）ｐ．563−567 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ 86（1989）ｐ．9514−9518 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) G01N C07K A61K ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (8)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】クラスＩ又はIIの主要組織適合性遺伝子複
   合体（MHC）の分子の対立遺伝子特異性ペプチドモチー
   フを決定する方法において、 （ａ）MHC−分子を含有する細胞の細胞溶解により細胞
   抽出物を得、 （ｂ）MHC−分子を、その上に存在するペプチド混合物
   と共に、免疫沈降により細胞抽出物から分離し、 （ｃ）MHC−分子及び他のタンパク質成分からのペプチ
   ド混合物を分離し、 （ｄ）個々のペプチド又は／及びその混合物を配列決定
   し、かつ （ｅ）得られた、殊に混合物の配列決定、又は一連の固
   有ペプチドの配列決定の情報から、対立遺伝子特異性ペ
   プチドモチーフを引き出すことを特徴とする、クラスＩ
   又はIIの主要組織適合性遺伝子複合体（MHC）の分子の
   対立遺伝子特異性ペプチドモチーフを決定する方法。
2. 【請求項２】クラスＩのMHC−分子上のペプチドモチー
   フを決定する、請求項１記載の方法。
3. 【請求項３】Ｈ−2K^d−、Ｈ−K^b−、Ｈ−2D^b−、Ｈ−2K
   ^k、Ｈ−2K^m′又はHLA＊0201又はHLA−Ａ＊0205−分子の
   ペプチドモチーフを決定する、請求項２記載の方法。
4. 【請求項４】免疫沈降のために、MHC−分子に対して特
   異的である抗体を使用する、請求項１から３のいずれか
   １項記載の方法。
5. 【請求項５】固相結合した抗体を使用する、請求項４記
   載の方法。
6. 【請求項６】MHC−分子及び他のタンパク質成分からの
   ペプチド混合物の分離をクロマトグラフィーにより行
   う、請求項１から５までのいずれか１項記載の方法。
7. 【請求項７】分離を逆相−HPLCで行う、請求項６記載の
   方法。
8. 【請求項８】分離を、トリフルオロ酢酸/H₂O−トリフル
   オロ酢酸／アセトニトリル−勾配で行う、請求項７記載
   の方法。