JP3399595B2 - εーポリーＬーリジンの製造方法 - Google Patents
εーポリーＬーリジンの製造方法Info
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Polyamides (AREA)
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、重合度２〜２４のε−
ポリ−Ｌ−リジンの製造方法に関する。さらに詳しく
は、重合度２５以上のε−ポリ−Ｌ−リジンをε−生産
菌であるストレプトマイセス・アルブラス・サブスピ−
シ−ズ・リジノポリメラス（Streptomyces albulus sub
sp. lysinopolymerus）の休止菌体もしくはストレプト
マイセス・アルブラス・サブスピ−シ−ズ・リジノポリ
メラス（Streptomyces albulus sub sp. lysinopolymer
us）の粗酵素液で分解することを特徴とする重合度２〜
２４のε−ポリ−Ｌ−リジンの製造方法に関する。
ポリ−Ｌ−リジンの製造方法に関する。さらに詳しく
は、重合度２５以上のε−ポリ−Ｌ−リジンをε−生産
菌であるストレプトマイセス・アルブラス・サブスピ−
シ−ズ・リジノポリメラス（Streptomyces albulus sub
sp. lysinopolymerus）の休止菌体もしくはストレプト
マイセス・アルブラス・サブスピ−シ−ズ・リジノポリ
メラス（Streptomyces albulus sub sp. lysinopolymer
us）の粗酵素液で分解することを特徴とする重合度２〜
２４のε−ポリ−Ｌ−リジンの製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】重合度２５〜３５のε−ポリ−Ｌ−リジ
ンは、グラム陽性菌、グラム陰性菌、真菌、酵母等の種
々の菌類に対し抗菌作用を有していることが知られてお
り、そのような特性に基づいて食品保存料として使用さ
れている。また、牛乳ホエイタンパク質との反応により
常温でゲルを形成することから、食品の物性改良剤とし
ての利用が提案されている。
ンは、グラム陽性菌、グラム陰性菌、真菌、酵母等の種
々の菌類に対し抗菌作用を有していることが知られてお
り、そのような特性に基づいて食品保存料として使用さ
れている。また、牛乳ホエイタンパク質との反応により
常温でゲルを形成することから、食品の物性改良剤とし
ての利用が提案されている。
【０００３】しかしながら、牛乳ホエイタンパク質のゲ
ル化は、高濃度のタンパク質懸濁液にε−ポリ−Ｌ−リ
ジンを高濃度に添加しなければ実用上満足できる物性を
有するゲルは作製できず、また、反応時間も長時間が必
要となる。そこで重合度５〜２４程度の低重合度のε−
ポリ−Ｌ−リジンを用いることによりタンパク質濃度お
よびε−ポリ−Ｌ−リジン濃度が低くても必要十分な物
性を持ち、短時間でゲルを作製することのできる方法が
提案されている。しかし、これに用いる低重合度のε−
ポリ−Ｌ−リジンは、従来、酸もしくはアルカリによる
加水分解反応によって得ていたが、酸やアルカリによる
加水分解反応による方法では加水分解反応の制御、加水
分解後の生成物の精製が非常に困難であり、また、重合
度の制御が難しく、重合度分布が広くなるなどの問題点
がある。
ル化は、高濃度のタンパク質懸濁液にε−ポリ−Ｌ−リ
ジンを高濃度に添加しなければ実用上満足できる物性を
有するゲルは作製できず、また、反応時間も長時間が必
要となる。そこで重合度５〜２４程度の低重合度のε−
ポリ−Ｌ−リジンを用いることによりタンパク質濃度お
よびε−ポリ−Ｌ−リジン濃度が低くても必要十分な物
性を持ち、短時間でゲルを作製することのできる方法が
提案されている。しかし、これに用いる低重合度のε−
ポリ−Ｌ−リジンは、従来、酸もしくはアルカリによる
加水分解反応によって得ていたが、酸やアルカリによる
加水分解反応による方法では加水分解反応の制御、加水
分解後の生成物の精製が非常に困難であり、また、重合
度の制御が難しく、重合度分布が広くなるなどの問題点
がある。
【０００４】また、アスペルギルス属の産生する中性プ
ロテアーゼを用いてε−ポリ−Ｌ−リジンを加水分解す
る方法も知られている（特開平４−２８７６９３号公
報）が、加水分解に要する時間が２４〜４０時間と長時
間必要であり、反応条件もｐＨ７付近に限られているた
め、加水分解反応を行う場合、基質であるε−ポリ−Ｌ
−リジンが強い塩基性を示すため酵素タンパク質と結合
したり、加水分解物である重合度が２〜２４のε−ポリ
−Ｌ−リジンも酵素タンパク質と結合して、目的とする
重合度２〜２４のε−ポリ−Ｌ−リジンの収率が著しく
低下することがある。
ロテアーゼを用いてε−ポリ−Ｌ−リジンを加水分解す
る方法も知られている（特開平４−２８７６９３号公
報）が、加水分解に要する時間が２４〜４０時間と長時
間必要であり、反応条件もｐＨ７付近に限られているた
め、加水分解反応を行う場合、基質であるε−ポリ−Ｌ
−リジンが強い塩基性を示すため酵素タンパク質と結合
したり、加水分解物である重合度が２〜２４のε−ポリ
−Ｌ−リジンも酵素タンパク質と結合して、目的とする
重合度２〜２４のε−ポリ−Ｌ−リジンの収率が著しく
低下することがある。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、食品物
性改良効果の高い重合度２４以下のε−ポリ−Ｌ−リジ
ンを容易にかつ効率的に得る方法について鋭意研究し
た。その結果、重合度２５〜３５のε−ポリ−Ｌ−リジ
ンまたはそれ以上の重合度を有するε−ポリ−Ｌ−リジ
ンをε−ポリ−Ｌ−リジン生産菌であるストレプトマイ
セス・アルブラス・サブスピーシーズ・リジノポリメラ
ス（Streptomyces albulus sub sp. lysinopolymerus）
の休止菌体もしくは粗酵素液を用いて加水分解するする
ことにより、重合度２４以下のε−ポリ−Ｌ−リジンを
容易に、かつ効率よく得ることができることを見いだ
し、本発明を完成した。以上の記述から明かなように、
本発明の目的は重合度２４以下のε−ポリ−Ｌ−リジン
を容易にしかも効率よく製造する方法を提供することで
ある。なお、ε−ポリ−Ｌ−リジンは、下記の化１で表
される。
性改良効果の高い重合度２４以下のε−ポリ−Ｌ−リジ
ンを容易にかつ効率的に得る方法について鋭意研究し
た。その結果、重合度２５〜３５のε−ポリ−Ｌ−リジ
ンまたはそれ以上の重合度を有するε−ポリ−Ｌ−リジ
ンをε−ポリ−Ｌ−リジン生産菌であるストレプトマイ
セス・アルブラス・サブスピーシーズ・リジノポリメラ
ス（Streptomyces albulus sub sp. lysinopolymerus）
の休止菌体もしくは粗酵素液を用いて加水分解するする
ことにより、重合度２４以下のε−ポリ−Ｌ−リジンを
容易に、かつ効率よく得ることができることを見いだ
し、本発明を完成した。以上の記述から明かなように、
本発明の目的は重合度２４以下のε−ポリ−Ｌ−リジン
を容易にしかも効率よく製造する方法を提供することで
ある。なお、ε−ポリ−Ｌ−リジンは、下記の化１で表
される。
【化１】
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明は下記の構成を有
する。 （１）平均重合度２５以上のε−ポリ−Ｌ−リジンをε
−ポリ−Ｌ−リジン生産菌であるストレプトマイセス・
アルブラス・サブスピ−シ−ズ・リジノポリメラス（St
reptomyces albulus sub sp. lysinopolymerus）の休止
菌体で分解することを特徴とする重合度２〜２４のε−
ポリ−Ｌ−リジンの製造方法。 （２）平均重合度２５以上のε−ポリ−Ｌ−リジンをε
−ポリ−Ｌ−リジン生産菌であるストレプトマイセス・
アルブラス・サブスピ−シ−ズ・リジノポリメラス（St
reptomyces albulus sub sp. lysinopolymerus）の粗酵
素液で分解することを特徴とする重合度２〜２４のε−
ポリ−Ｌ−リジンの製造方法。 （３）ストレプトマイセス・アルブラス・サブスピ−シ
−ズ・リジノポリメラス（Streptomyces albulus sub s
p. lysinopolymerus）の粗酵素液がε−ポリ−Ｌ−リジ
ン分解酵素を含む粗酵素液である前記第２項記載のε−
ポリ−Ｌ−リジンの製造方法。
する。 （１）平均重合度２５以上のε−ポリ−Ｌ−リジンをε
−ポリ−Ｌ−リジン生産菌であるストレプトマイセス・
アルブラス・サブスピ−シ−ズ・リジノポリメラス（St
reptomyces albulus sub sp. lysinopolymerus）の休止
菌体で分解することを特徴とする重合度２〜２４のε−
ポリ−Ｌ−リジンの製造方法。 （２）平均重合度２５以上のε−ポリ−Ｌ−リジンをε
−ポリ−Ｌ−リジン生産菌であるストレプトマイセス・
アルブラス・サブスピ−シ−ズ・リジノポリメラス（St
reptomyces albulus sub sp. lysinopolymerus）の粗酵
素液で分解することを特徴とする重合度２〜２４のε−
ポリ−Ｌ−リジンの製造方法。 （３）ストレプトマイセス・アルブラス・サブスピ−シ
−ズ・リジノポリメラス（Streptomyces albulus sub s
p. lysinopolymerus）の粗酵素液がε−ポリ−Ｌ−リジ
ン分解酵素を含む粗酵素液である前記第２項記載のε−
ポリ−Ｌ−リジンの製造方法。
【０００７】本発明に用いられる重合度２５以上のε−
ポリ−Ｌ−リジンは、例えば特開昭５９−２０３５９号
公報に記載のε−ポリ−Ｌ−リジン生産菌であるストレ
プトマイセス属に属するストレプトマイセス・アルブラ
ス・サブスピ−シ−ズ・リジノポリメラス（Streptomyc
es albulus sub sp. lysinopolymerus）を培地に培養
し、得られた培養物からε−ポリ−Ｌ−リジンを分離、
採取することによって得ることができる。また、原料で
あるε−ポリ−Ｌ−リジンは、その大半が重合度２５以
上であれば良く、単一の重合度のみからなるものでも、
種々の重合度物の混合物であっても良い。また、重合度
２４以下のε−ポリ−Ｌ−リジンを少量含有したもので
もかまわない。
ポリ−Ｌ−リジンは、例えば特開昭５９−２０３５９号
公報に記載のε−ポリ−Ｌ−リジン生産菌であるストレ
プトマイセス属に属するストレプトマイセス・アルブラ
ス・サブスピ−シ−ズ・リジノポリメラス（Streptomyc
es albulus sub sp. lysinopolymerus）を培地に培養
し、得られた培養物からε−ポリ−Ｌ−リジンを分離、
採取することによって得ることができる。また、原料で
あるε−ポリ−Ｌ−リジンは、その大半が重合度２５以
上であれば良く、単一の重合度のみからなるものでも、
種々の重合度物の混合物であっても良い。また、重合度
２４以下のε−ポリ−Ｌ−リジンを少量含有したもので
もかまわない。
【０００８】本発明に用いるε−ポリ−Ｌ−リジン生産
菌としては、ストレプトマイセス・アルブラス・サブス
ピ−シ−ズ・リジノポリメラス（Streptomyces albulus
subsp. lysinopolymerus）を挙げることができ、好ま
しくは、ストレプトマイセス・アルブラス・サブスピ−
シ−ズ・リジノポリメラス（Streptomyces albulus sub
sp. lysinopolymerus）Ｎｏ．３４６−Ｄ株（微工研条
寄第３８３４号）もしくはストレプトマイセス・アルブ
ラス・サブスピ−シ−ズ・リジノポリメラス（Streptom
yces albulus sub sp. lysinopolymerus）Ｎｏ．１１０
１１Ａ−１株（微工研条寄第１１０９号）が挙げられ
る。
菌としては、ストレプトマイセス・アルブラス・サブス
ピ−シ−ズ・リジノポリメラス（Streptomyces albulus
subsp. lysinopolymerus）を挙げることができ、好ま
しくは、ストレプトマイセス・アルブラス・サブスピ−
シ−ズ・リジノポリメラス（Streptomyces albulus sub
sp. lysinopolymerus）Ｎｏ．３４６−Ｄ株（微工研条
寄第３８３４号）もしくはストレプトマイセス・アルブ
ラス・サブスピ−シ−ズ・リジノポリメラス（Streptom
yces albulus sub sp. lysinopolymerus）Ｎｏ．１１０
１１Ａ−１株（微工研条寄第１１０９号）が挙げられ
る。
【０００９】ストレプトマイセス・アルブラス・サブス
ピ−シ−ズ・リジノポリメラス（Streptomyces albulus
sub sp. lysinopolymerus）Ｎｏ．３４６−Ｄ株および
Ｎｏ．１１０１１Ａ−１株は次のような菌学的性質を有
する。 （１）形態学的性質 シュークロース・硝酸塩寒天培地上で３０℃、１０日間
生育したＮｏ．３４６−Ｄ株およびＮｏ．１１０１１Ａ
−１株の気菌糸および基生菌糸を顕微鏡で観察した結果
を次に示す。 胞子形成菌糸の分枝法および形態：単純分枝、閉鎖ら
せん状（ｃｌｏｓｅｄｓｐｉｒａｌ） 胞子の数：数１０個 胞子の表面構造および大きさ：胞子は円ないし楕円形
で大きさは約１．２〜１．５μであり、その表面構造は
スパイニー（ｓｐｉｎｙ）である。 鞭毛胞子、菌核および胞子のうの有無存在が認められ
ない。 胞子柄の着生位置：気菌糸上
ピ−シ−ズ・リジノポリメラス（Streptomyces albulus
sub sp. lysinopolymerus）Ｎｏ．３４６−Ｄ株および
Ｎｏ．１１０１１Ａ−１株は次のような菌学的性質を有
する。 （１）形態学的性質 シュークロース・硝酸塩寒天培地上で３０℃、１０日間
生育したＮｏ．３４６−Ｄ株およびＮｏ．１１０１１Ａ
−１株の気菌糸および基生菌糸を顕微鏡で観察した結果
を次に示す。 胞子形成菌糸の分枝法および形態：単純分枝、閉鎖ら
せん状（ｃｌｏｓｅｄｓｐｉｒａｌ） 胞子の数：数１０個 胞子の表面構造および大きさ：胞子は円ないし楕円形
で大きさは約１．２〜１．５μであり、その表面構造は
スパイニー（ｓｐｉｎｙ）である。 鞭毛胞子、菌核および胞子のうの有無存在が認められ
ない。 胞子柄の着生位置：気菌糸上
【００１０】（２）各種培地上における生育状態
下記の各種培地上における性状はそれぞれ３０℃で１０
〜１４日間培養後の観察結果である。その結果を表１お
よび表２に示した。
〜１４日間培養後の観察結果である。その結果を表１お
よび表２に示した。
【００１１】
【表１】
【００１２】
【表２】
【００１３】（３）生理的性質
Ｎｏ．３４６−Ｄ株（微工研条寄第３８３４号）および
Ｎｏ．１１０１１Ａ−１株（微工研条寄第１１０９号）
の生理的性質は次の通りである。 生育温度範囲 約１５〜４０℃。生育最適温度：３０℃付近。 ゼラチンの液化、澱粉の加水分解および脱脂牛乳のペ
プトン化：すべて陽性。 脱脂牛乳の凝固：陰性。 メラニン様色素の生成：チロシン培地では褐色の色素
を生成する。 細胞壁組成：細胞壁組成成分中のジアミノピメリン酸
の型についてベッカー（Ｂｅｃｋｅｒ）らの方法に［ア
プライド・マクロバイオロジー第１３巻第２３６頁（１
９６５年）参照］により分析した結果、Ｌ，Ｌ型であっ
た。
Ｎｏ．１１０１１Ａ−１株（微工研条寄第１１０９号）
の生理的性質は次の通りである。 生育温度範囲 約１５〜４０℃。生育最適温度：３０℃付近。 ゼラチンの液化、澱粉の加水分解および脱脂牛乳のペ
プトン化：すべて陽性。 脱脂牛乳の凝固：陰性。 メラニン様色素の生成：チロシン培地では褐色の色素
を生成する。 細胞壁組成：細胞壁組成成分中のジアミノピメリン酸
の型についてベッカー（Ｂｅｃｋｅｒ）らの方法に［ア
プライド・マクロバイオロジー第１３巻第２３６頁（１
９６５年）参照］により分析した結果、Ｌ，Ｌ型であっ
た。
【００１４】（４）各種炭素源の同化性について表３に
示した。
示した。
【表３】
【００１５】本発明においては、これら何れの菌株を用
いても重合度２〜２４のε−ポリ−Ｌ−リジンを製造す
ることができる。
いても重合度２〜２４のε−ポリ−Ｌ−リジンを製造す
ることができる。
【００１６】休止菌体を用いる方法では、増殖を抑制さ
せた状態の菌を用いて加水分解反応を行わせる方法であ
り、該加水分解反応に用いる休止菌体は、ε−ポリ−Ｌ
−リジン生産菌であるストレプトマイセス・アルブラス
・サブスピ−シ−ズ・リジノポリメラス（Streptomyces
albulus sub sp. lysinopolymerus）を培養し、菌を十
分生育させる。この後、該菌を遠心分離により回収し、
回収された菌を湿菌体重量の２〜３倍量の０．１Ｍ程度
のリン酸ナトリウム緩衝液もしくはリン酸ナトリウム・
生理食塩水緩衝液等で２〜３回繰り返し洗浄することに
よって得ることができる。
せた状態の菌を用いて加水分解反応を行わせる方法であ
り、該加水分解反応に用いる休止菌体は、ε−ポリ−Ｌ
−リジン生産菌であるストレプトマイセス・アルブラス
・サブスピ−シ−ズ・リジノポリメラス（Streptomyces
albulus sub sp. lysinopolymerus）を培養し、菌を十
分生育させる。この後、該菌を遠心分離により回収し、
回収された菌を湿菌体重量の２〜３倍量の０．１Ｍ程度
のリン酸ナトリウム緩衝液もしくはリン酸ナトリウム・
生理食塩水緩衝液等で２〜３回繰り返し洗浄することに
よって得ることができる。
【００１７】上記の休止菌体を用いるε−ポリ−Ｌ−リ
ジンの加水分解反応は、原料である重合度２５以上のε
−ポリ−Ｌ−リジンを水溶液または水分散液の形態で行
うのが良い。該加水分解反応は、得られた菌体をリン酸
緩衝液（ｐＨ５〜９）に懸濁させ、重合度２５以上のε
−ポリ−Ｌ−リジンを該液に加える。この後、３０℃、
３００ｒｐｍ程度で撹拌下、５〜２０時間加水分解反応
を行う。該加水分解反応の反応時間は、必要とするεε
−ポリ−Ｌ−リジンの重合度によって異なるため、反応
中に経時的に反応液を採取して、目的とする重合度のε
−ポリ−Ｌ−リジンの割合をペア−ドイオンクロマトグ
ラフィ−法等によって分析し、加水分解反応の状況を確
認し、反応の継続、停止等の措置をとることが望まし
い。一般的には重合度２５以上のε−ポリ−Ｌ−リジン
が約８０重量％以上消失する段階まで反応を行う。
ジンの加水分解反応は、原料である重合度２５以上のε
−ポリ−Ｌ−リジンを水溶液または水分散液の形態で行
うのが良い。該加水分解反応は、得られた菌体をリン酸
緩衝液（ｐＨ５〜９）に懸濁させ、重合度２５以上のε
−ポリ−Ｌ−リジンを該液に加える。この後、３０℃、
３００ｒｐｍ程度で撹拌下、５〜２０時間加水分解反応
を行う。該加水分解反応の反応時間は、必要とするεε
−ポリ−Ｌ−リジンの重合度によって異なるため、反応
中に経時的に反応液を採取して、目的とする重合度のε
−ポリ−Ｌ−リジンの割合をペア−ドイオンクロマトグ
ラフィ−法等によって分析し、加水分解反応の状況を確
認し、反応の継続、停止等の措置をとることが望まし
い。一般的には重合度２５以上のε−ポリ−Ｌ−リジン
が約８０重量％以上消失する段階まで反応を行う。
【００１８】本発明に用いる粗酵素液の調製は、ε−ポ
リ−Ｌ−リジン生産菌であるストレプトマイセス・アル
ブラス・サブスピ−シ−ズ・リジノポリメラス（Strept
omyces albulus sub sp. lysinopolymerus）を培養し菌
を十分に生育させる。この後、菌を遠心分離等により回
収する。回収した菌を緩衝液に懸濁させ、超音波等によ
り菌体を破砕し、破砕懸濁物を除去し、粗酵素液とす
る。この粗酵素液を透析、限外ろ過、核酸除去等で部分
精製を行っても良い。また、この粗酵素液を担体等に固
定化して使用しても良い。本法により調製された粗酵素
液は、タンパク質濃度としては、１〜５ｍｇ／ｍｌ程度
のものが得られる。
リ−Ｌ−リジン生産菌であるストレプトマイセス・アル
ブラス・サブスピ−シ−ズ・リジノポリメラス（Strept
omyces albulus sub sp. lysinopolymerus）を培養し菌
を十分に生育させる。この後、菌を遠心分離等により回
収する。回収した菌を緩衝液に懸濁させ、超音波等によ
り菌体を破砕し、破砕懸濁物を除去し、粗酵素液とす
る。この粗酵素液を透析、限外ろ過、核酸除去等で部分
精製を行っても良い。また、この粗酵素液を担体等に固
定化して使用しても良い。本法により調製された粗酵素
液は、タンパク質濃度としては、１〜５ｍｇ／ｍｌ程度
のものが得られる。
【００１９】この粗酵素液によるε−ポリ−Ｌ−リジン
の加水分解反応は、原料である重合度２５以上のε−ポ
リ−Ｌ−リジンを水に溶解させた水溶液または水に分散
させた水分散液の形態で行うのが良い。加水分解反応の
条件は、得られた粗酵素液中のε−ポリ−Ｌ−リジン分
解酵素の活性および必要とするε−ポリ−Ｌ−リジンの
重合度等によって異なるが、一般的には、ｐＨ５〜９、
反応温度は約２８〜４０℃、反応時間５〜２０時間加水
分解反応を行うのが良い。反応終了は、一般的には重合
度２５以上のε−ポリ−Ｌ−リジンが約８０重量％以上
消失する段階まで行う。
の加水分解反応は、原料である重合度２５以上のε−ポ
リ−Ｌ−リジンを水に溶解させた水溶液または水に分散
させた水分散液の形態で行うのが良い。加水分解反応の
条件は、得られた粗酵素液中のε−ポリ−Ｌ−リジン分
解酵素の活性および必要とするε−ポリ−Ｌ−リジンの
重合度等によって異なるが、一般的には、ｐＨ５〜９、
反応温度は約２８〜４０℃、反応時間５〜２０時間加水
分解反応を行うのが良い。反応終了は、一般的には重合
度２５以上のε−ポリ−Ｌ−リジンが約８０重量％以上
消失する段階まで行う。
【００２０】２５以上の重合度を有するε−ポリ−Ｌ−
リジンは、本発明の休止菌体による加水分解反応または
粗酵素液による加水分解反応により加水分解されて、次
第に重合度が２４以下の低重合度ε−ポリ−Ｌ−リジン
になる。このとき、加水分解が過度に行われると最終的
にはアミノ酸であるＬ−リジンになり、目的とする重合
度２〜２４のε−ポリ−Ｌ−リジンが得られなかった
り、得られても収率が低くなる。したがって、加水分解
反応に際しては、加水分解反応の途中で経時的に反応液
を採取して、目的とする重合度が２〜２４のε−ポリ−
Ｌ−リジンの割合をペア−ドイオンクロマトグラフィ−
法やメチルオレンジとの複合体の形成によって分析を行
い、加水分解反応の状況を確認し、反応の継続、停止等
の措置を行うのが望ましい。ペア−ドイオンクロマトグ
ラフィ−法ではε−ポリ−Ｌ−リジンのＬ−リジン１残
基ごとの存在量が測定できるが分析に時間がかかる。ま
た、メチルオレンジとの複合体形成による方法はイツア
キ（Ｉｔｚｈａｋｉ）の方法によりε−ポリ−Ｌ−リジ
ンを定量することができ、重合度が１０程度以下のε−
ポリ−Ｌ−リジンがメチルオレンジと複合体を形成しな
いことを利用して簡便に測定できる方法である。
リジンは、本発明の休止菌体による加水分解反応または
粗酵素液による加水分解反応により加水分解されて、次
第に重合度が２４以下の低重合度ε−ポリ−Ｌ−リジン
になる。このとき、加水分解が過度に行われると最終的
にはアミノ酸であるＬ−リジンになり、目的とする重合
度２〜２４のε−ポリ−Ｌ−リジンが得られなかった
り、得られても収率が低くなる。したがって、加水分解
反応に際しては、加水分解反応の途中で経時的に反応液
を採取して、目的とする重合度が２〜２４のε−ポリ−
Ｌ−リジンの割合をペア−ドイオンクロマトグラフィ−
法やメチルオレンジとの複合体の形成によって分析を行
い、加水分解反応の状況を確認し、反応の継続、停止等
の措置を行うのが望ましい。ペア−ドイオンクロマトグ
ラフィ−法ではε−ポリ−Ｌ−リジンのＬ−リジン１残
基ごとの存在量が測定できるが分析に時間がかかる。ま
た、メチルオレンジとの複合体形成による方法はイツア
キ（Ｉｔｚｈａｋｉ）の方法によりε−ポリ−Ｌ−リジ
ンを定量することができ、重合度が１０程度以下のε−
ポリ−Ｌ−リジンがメチルオレンジと複合体を形成しな
いことを利用して簡便に測定できる方法である。
【００２１】通常、該加水分解反応は、上述したよう
に、原料である重合度２５以上のε−ポリ−Ｌ−リジン
の約８０重量％以上が加水分解された時点で加水分解反
応を停止させるのが良い。該加水分解反応の停止の方法
は、加熱やその他の適当な方法で酵素を失活させるか、
もしくは休止菌体の場合、塩酸等を添加し、ｐＨを酸性
（ｐＨ４以下）にしたのち、菌体を遠心分離やろ過等で
除去することによっても反応を停止させることができ
る。加熱により反応を停止させる場合は、一般に８０〜
１００℃に加熱するのが良い。この場合に目的物である
低重合度のε−ポリ−Ｌ−リジンは、加熱による変性、
分解等の影響をほとんど受けない。
に、原料である重合度２５以上のε−ポリ−Ｌ−リジン
の約８０重量％以上が加水分解された時点で加水分解反
応を停止させるのが良い。該加水分解反応の停止の方法
は、加熱やその他の適当な方法で酵素を失活させるか、
もしくは休止菌体の場合、塩酸等を添加し、ｐＨを酸性
（ｐＨ４以下）にしたのち、菌体を遠心分離やろ過等で
除去することによっても反応を停止させることができ
る。加熱により反応を停止させる場合は、一般に８０〜
１００℃に加熱するのが良い。この場合に目的物である
低重合度のε−ポリ−Ｌ−リジンは、加熱による変性、
分解等の影響をほとんど受けない。
【００２２】次に、ε−ポリ−Ｌ−リジン生産菌である
ストレプトマイセス・アルブラス・サブスピ−シ−ズ・
リジノポリメラス（Streptomyces albulus sub sp. lys
inopolymerus）１１０１１Ａ−１株（微工研条寄第１１
０９号）の粗酵素液を用いた加水分解反応について説明
する。まず、ストレプトマイセス・アルブラス・サブス
ピ−シ−ズ・リジノポリメラス（Streptomyces albulus
sub sp. lysinopolymerus）１１０１１Ａ−１株（微工
研条寄第１１０９号）をε−ポリ−Ｌ−リジン生産条件
において培養し、菌体を遠心分離により回収した。この
菌体を超音波破砕機により破砕し、遠心分離により粗酵
素液（タンパク質濃度６ｍｇ／ｍｌ）を得る。重合度２
５〜３５のε−ポリ−Ｌ−リジンを濃度１０ｍｇ／ｍｌ
になるようにリン酸緩衝液もしくはクエン酸緩衝液（ｐ
Ｈ５〜９）３ｍｌに溶解し、粗酵素液２ｍｌを加え、３
０℃で加水分解反応を行う。５〜２０時間反応を行った
のち、加熱処理を行い反応を停止させると、原料として
用いたε−ポリ−Ｌ−リジンの約９０〜９９重量％が加
水分解されて、重合度２〜２４のε−ポリ−Ｌ−リジン
を約８０重量％以上含有する生成物が得られる。
ストレプトマイセス・アルブラス・サブスピ−シ−ズ・
リジノポリメラス（Streptomyces albulus sub sp. lys
inopolymerus）１１０１１Ａ−１株（微工研条寄第１１
０９号）の粗酵素液を用いた加水分解反応について説明
する。まず、ストレプトマイセス・アルブラス・サブス
ピ−シ−ズ・リジノポリメラス（Streptomyces albulus
sub sp. lysinopolymerus）１１０１１Ａ−１株（微工
研条寄第１１０９号）をε−ポリ−Ｌ−リジン生産条件
において培養し、菌体を遠心分離により回収した。この
菌体を超音波破砕機により破砕し、遠心分離により粗酵
素液（タンパク質濃度６ｍｇ／ｍｌ）を得る。重合度２
５〜３５のε−ポリ−Ｌ−リジンを濃度１０ｍｇ／ｍｌ
になるようにリン酸緩衝液もしくはクエン酸緩衝液（ｐ
Ｈ５〜９）３ｍｌに溶解し、粗酵素液２ｍｌを加え、３
０℃で加水分解反応を行う。５〜２０時間反応を行った
のち、加熱処理を行い反応を停止させると、原料として
用いたε−ポリ−Ｌ−リジンの約９０〜９９重量％が加
水分解されて、重合度２〜２４のε−ポリ−Ｌ−リジン
を約８０重量％以上含有する生成物が得られる。
【００２３】ついで上記反応溶液を、単に噴霧乾燥、凍
結乾燥、その他適当な乾燥法により乾燥すれば重合度２
〜２４のε−ポリ−Ｌ−リジンを大量に含む粉体が得ら
れる。また、より純度の高い生成物を得たい場合は、上
記で得た重合度２〜２４の重合度のε−ポリ−Ｌ−リジ
ンを含む反応液を、イオン交換法、限外ろ過法、ゲルろ
過法等の分離手段を用いることにより、目的とする重合
度２〜２４のε−ポリ−Ｌ−リジンを重合度別に単独も
しくは任意の重合度のもののみを含む混合物として分離
回収することができる。
結乾燥、その他適当な乾燥法により乾燥すれば重合度２
〜２４のε−ポリ−Ｌ−リジンを大量に含む粉体が得ら
れる。また、より純度の高い生成物を得たい場合は、上
記で得た重合度２〜２４の重合度のε−ポリ−Ｌ−リジ
ンを含む反応液を、イオン交換法、限外ろ過法、ゲルろ
過法等の分離手段を用いることにより、目的とする重合
度２〜２４のε−ポリ−Ｌ−リジンを重合度別に単独も
しくは任意の重合度のもののみを含む混合物として分離
回収することができる。
【００２４】本発明の方法は、酸もしくはアルカリを用
いた加水分解反応と異なり、重合度分布が制御しやす
く、かつ塩類の夾雑が少ない重合度２〜２４のε−ポリ
−Ｌ−リジンを製造することができる。また、アスペル
ギルス属が産生する中性プロテアーゼによる反応と異な
りｐＨを５〜９の範囲において反応させることができ、
特に酸性（ｐＨ５〜６）において反応させることができ
るため、酵素タンパク質や菌体への吸着および複合物の
生成がなく、高収率で目的とする重合度２〜２４のε−
ポリ−Ｌ−リジンを製造できる。
いた加水分解反応と異なり、重合度分布が制御しやす
く、かつ塩類の夾雑が少ない重合度２〜２４のε−ポリ
−Ｌ−リジンを製造することができる。また、アスペル
ギルス属が産生する中性プロテアーゼによる反応と異な
りｐＨを５〜９の範囲において反応させることができ、
特に酸性（ｐＨ５〜６）において反応させることができ
るため、酵素タンパク質や菌体への吸着および複合物の
生成がなく、高収率で目的とする重合度２〜２４のε−
ポリ−Ｌ−リジンを製造できる。
【００２５】本発明においてε−ポリ−Ｌ−リジンの重
合度を測定する方法としては、ペア−ドイオンクロマト
グラフィ−法を用いるのが好ましい。例えば、逆相クロ
マトグラフィ用カラム（L-Colum:化学品検査協会製：内
経４．６mm、長さ２６cm）を用いて、溶離液として１０
ｍＭリン酸水素ナトリウム、１００ｍＭ過塩素酸ナトリ
ウム、１０ｍＭオクタンスルフォン酸ナトリウムを含む
水溶液（Ａ液）と１０ｍＭリン酸水素ナトリウム、１０
０ｍＭ過塩素酸ナトリウム、１０ｍＭオクタンスルフォ
ン酸ナトリウムを含むアセトニトリル５０容量％水溶液
（Ｂ液）を使用する。ε−ポリ−Ｌ−リジンの水溶液を
該カラムに供し、Ａ液とＢ液の混合液中において４０分
間でＢ液の濃度が５０重量％から７５重量％まで直線的
に増加する濃度勾配で１．０ｍｌ／分流速で溶出させ
る。この溶出液を波長２１５ｎｍの紫外線吸収スペクト
ルで検出する。この結果、ε−ポリ−Ｌ−リジンは、Ｌ
−リジン１残基ごとに分離されたピ−クとして検出さ
れ、これにより、供したε−ポリ−Ｌ−リジンの平均重
合度を求めることができる。
合度を測定する方法としては、ペア−ドイオンクロマト
グラフィ−法を用いるのが好ましい。例えば、逆相クロ
マトグラフィ用カラム（L-Colum:化学品検査協会製：内
経４．６mm、長さ２６cm）を用いて、溶離液として１０
ｍＭリン酸水素ナトリウム、１００ｍＭ過塩素酸ナトリ
ウム、１０ｍＭオクタンスルフォン酸ナトリウムを含む
水溶液（Ａ液）と１０ｍＭリン酸水素ナトリウム、１０
０ｍＭ過塩素酸ナトリウム、１０ｍＭオクタンスルフォ
ン酸ナトリウムを含むアセトニトリル５０容量％水溶液
（Ｂ液）を使用する。ε−ポリ−Ｌ−リジンの水溶液を
該カラムに供し、Ａ液とＢ液の混合液中において４０分
間でＢ液の濃度が５０重量％から７５重量％まで直線的
に増加する濃度勾配で１．０ｍｌ／分流速で溶出させ
る。この溶出液を波長２１５ｎｍの紫外線吸収スペクト
ルで検出する。この結果、ε−ポリ−Ｌ−リジンは、Ｌ
−リジン１残基ごとに分離されたピ−クとして検出さ
れ、これにより、供したε−ポリ−Ｌ−リジンの平均重
合度を求めることができる。
【００２６】
【実施例】以下、本発明の試験例及び実施例を用いその
詳細を説明する。なお、本実施例は本発明をなんら限定
するものではない。 実施例１ ε−ポリ−Ｌ−リジン生産菌ストレプトマイセス・アル
ブラス・サブスピ−シ−ズ・リジノポリメラス（Strept
omyces albulus sub sp. lysinopolymerus）Ｎｏ．１１
０１１Ａ−１株（微工研条寄第１１０９号）を表１記載
の培地に接種し、３０℃で４８時間振とう培養を行っ
た。培養後、菌体を遠心分離（１０，０００ｇ１５分
間）により回収し、湿菌体重量の３倍量の０．１Ｍリン
酸ナトリウム・生理食塩水緩衝液（ｐＨ７）で３回洗浄
を行ったのち、０．１Ｍリン酸ナトリウム・生理食塩水
緩衝液１０ｍｌに懸濁させ菌体懸濁液とした。ついで、
重合度２５〜３５のε−ポリ−Ｌ−リジン１００ｍｇと
上記の菌体懸濁液（ＯＤ６６０ｎｍ：６．６）２ｍｌを
０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７）８ｍｌに加
え、３０℃、３００ｒｐｍで１０時間振とうし反応を行
った。反応終了後、塩酸０．０４Ｍを加え遠心分離を行
い菌体を除去した。該液を噴霧乾燥し、粉末９２．７ｍ
ｇを得た。この粉末を水に溶解し、逆相クロマトグラフ
ィー用カラムを用いたペア−ドイオンクロマトグラフィ
−（カラム：L-colum:化学品検査協会製：内径４．６ｍ
ｍ、長さ２５ｃｍ）に供した。ついで１０ｍＭリン酸水
素ナトリウム、１００ｍＭ過塩素酸ナトリウム、１０ｍ
Ｍオクタンスルフォンサンナトリウムを含む水溶液（Ａ
液）と１０ｍＭリン酸水素ナトリウム、１００ｍＭ過塩
素酸ナトリウム、１０ｍＭオクタンスルフォン酸ナトリ
ウムを含むアセトニトリル５０容量％水溶液（Ｂ液）を
使用して、Ａ液とＢ液の混合液中において、４０分間で
Ｂ液の濃度が５０％から７５％まで直線的に増加する濃
度勾配で１．０ｍｌ／分の流速で溶出させた。この溶出
液を波長２１５ｎｍの紫外線吸収スペクトル法で検出し
た。図１に反応前のε−ポリ−Ｌ−リジンを、図２に反
応後の試料のクロマトグラムを示した。この結果、実施
例１で得られた粉末中には、重合度２〜２４のε−ポリ
−Ｌ−リジンが約７０重量％含まれていた。
詳細を説明する。なお、本実施例は本発明をなんら限定
するものではない。 実施例１ ε−ポリ−Ｌ−リジン生産菌ストレプトマイセス・アル
ブラス・サブスピ−シ−ズ・リジノポリメラス（Strept
omyces albulus sub sp. lysinopolymerus）Ｎｏ．１１
０１１Ａ−１株（微工研条寄第１１０９号）を表１記載
の培地に接種し、３０℃で４８時間振とう培養を行っ
た。培養後、菌体を遠心分離（１０，０００ｇ１５分
間）により回収し、湿菌体重量の３倍量の０．１Ｍリン
酸ナトリウム・生理食塩水緩衝液（ｐＨ７）で３回洗浄
を行ったのち、０．１Ｍリン酸ナトリウム・生理食塩水
緩衝液１０ｍｌに懸濁させ菌体懸濁液とした。ついで、
重合度２５〜３５のε−ポリ−Ｌ−リジン１００ｍｇと
上記の菌体懸濁液（ＯＤ６６０ｎｍ：６．６）２ｍｌを
０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７）８ｍｌに加
え、３０℃、３００ｒｐｍで１０時間振とうし反応を行
った。反応終了後、塩酸０．０４Ｍを加え遠心分離を行
い菌体を除去した。該液を噴霧乾燥し、粉末９２．７ｍ
ｇを得た。この粉末を水に溶解し、逆相クロマトグラフ
ィー用カラムを用いたペア−ドイオンクロマトグラフィ
−（カラム：L-colum:化学品検査協会製：内径４．６ｍ
ｍ、長さ２５ｃｍ）に供した。ついで１０ｍＭリン酸水
素ナトリウム、１００ｍＭ過塩素酸ナトリウム、１０ｍ
Ｍオクタンスルフォンサンナトリウムを含む水溶液（Ａ
液）と１０ｍＭリン酸水素ナトリウム、１００ｍＭ過塩
素酸ナトリウム、１０ｍＭオクタンスルフォン酸ナトリ
ウムを含むアセトニトリル５０容量％水溶液（Ｂ液）を
使用して、Ａ液とＢ液の混合液中において、４０分間で
Ｂ液の濃度が５０％から７５％まで直線的に増加する濃
度勾配で１．０ｍｌ／分の流速で溶出させた。この溶出
液を波長２１５ｎｍの紫外線吸収スペクトル法で検出し
た。図１に反応前のε−ポリ−Ｌ−リジンを、図２に反
応後の試料のクロマトグラムを示した。この結果、実施
例１で得られた粉末中には、重合度２〜２４のε−ポリ
−Ｌ−リジンが約７０重量％含まれていた。
【００２７】
【表４】
【００２８】実施例２
ε−ポリ−Ｌ−リジン生産菌であるストレプトマイセス
・アルブラス・サブスピ−シ−ズ・リジノポリメラス
（Streptomyces albulus sub sp. lysinopolymerus）Ｎ
ｏ．１１０１１Ａ−１株（微工研条寄第１１０９号）を
表１記載の培地に接種し、３０℃、７２時間振とう培養
を行った。培養後、菌体を遠心分離（１０，０００ｇ１
５分間）により回収した。回収した菌体湿重量５ｇを
０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７）２０ｍｌに
懸濁し、５℃で２０分間超音波破砕を行い、遠心分離
（１０，０００ｇ２０分間）を行った。上澄液を０．１
Ｍリン酸ナトリウム緩衝液に対し透析を行い、再度遠心
分離（１０，０００ｇ２０分間）を行い、この上澄液を
粗酵素液（タンパク質濃度６．９８ｍｇ／ｍｌ）とし
た。重合度２５〜３５のε−ポリ−Ｌ−リジン５０ｍｇ
と上記粗酵素液３ｍｌを０．１Ｍクエン酸ナトリウム緩
衝液（ｐＨ５）２ｍｌに溶解した。反応は、３０℃、８
０ｒｐｍの振とう条件で行った。反応３時間目、６時間
目にそれぞれ反応液０．５ｍｌをサンプリングし、実施
例１に準拠したペア−ドイオンクロマトグラフィ−法を
用いて重合度を調べた。この結果を図３および図４に示
した。また、１２時間加水分解反応を行ったのち、反応
液を加熱処理して反応を停止させ、遠心分離（１０，０
００Ｇ ２分間）したのち、上澄み液を噴霧乾燥し、粉
末６０ｍｇを得た。得られた粉末を水に溶解し、実施例
１に準拠した条件でペ−ドイオンクロマトグラフィ−に
供した。この結果を図５に示した。この結果、実施例２
で得られた粉末状生成物中には重合度２〜２４のε−ポ
リ−Ｌ−リジンが、約６０重量％含まれていた。
・アルブラス・サブスピ−シ−ズ・リジノポリメラス
（Streptomyces albulus sub sp. lysinopolymerus）Ｎ
ｏ．１１０１１Ａ−１株（微工研条寄第１１０９号）を
表１記載の培地に接種し、３０℃、７２時間振とう培養
を行った。培養後、菌体を遠心分離（１０，０００ｇ１
５分間）により回収した。回収した菌体湿重量５ｇを
０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７）２０ｍｌに
懸濁し、５℃で２０分間超音波破砕を行い、遠心分離
（１０，０００ｇ２０分間）を行った。上澄液を０．１
Ｍリン酸ナトリウム緩衝液に対し透析を行い、再度遠心
分離（１０，０００ｇ２０分間）を行い、この上澄液を
粗酵素液（タンパク質濃度６．９８ｍｇ／ｍｌ）とし
た。重合度２５〜３５のε−ポリ−Ｌ−リジン５０ｍｇ
と上記粗酵素液３ｍｌを０．１Ｍクエン酸ナトリウム緩
衝液（ｐＨ５）２ｍｌに溶解した。反応は、３０℃、８
０ｒｐｍの振とう条件で行った。反応３時間目、６時間
目にそれぞれ反応液０．５ｍｌをサンプリングし、実施
例１に準拠したペア−ドイオンクロマトグラフィ−法を
用いて重合度を調べた。この結果を図３および図４に示
した。また、１２時間加水分解反応を行ったのち、反応
液を加熱処理して反応を停止させ、遠心分離（１０，０
００Ｇ ２分間）したのち、上澄み液を噴霧乾燥し、粉
末６０ｍｇを得た。得られた粉末を水に溶解し、実施例
１に準拠した条件でペ−ドイオンクロマトグラフィ−に
供した。この結果を図５に示した。この結果、実施例２
で得られた粉末状生成物中には重合度２〜２４のε−ポ
リ−Ｌ−リジンが、約６０重量％含まれていた。
【００２９】実施例３
ε−ポリ−Ｌ−リジン生産菌であるストレプトマイセス
・アルブラス・サブスピ−シ−ズ・リジノポリメラス
（Streptomyces albulus sub sp. lysinopolymerus）Ｎ
ｏ．３４６−Ｄ株（微工研条寄第３８３４号）を表１記
載の培地に接種し、３０℃４８時間振とう培養を行っ
た。培養後、菌体を遠心分離（１０，０００ｇ１５分
間）により回収し、湿菌体重量の３倍量の０．１Ｍリン
酸ナトリウム・生理食塩水緩衝液（ｐＨ７）で３回洗浄
を行ったのち、０．１Ｍリン酸ナトリウム・生理食塩水
緩衝液１０ｍｌに懸濁させ菌体懸濁液とした。ついで重
合度２５〜３５のε−ポリ−Ｌ−リジン１００ｍｇと上
記の菌体懸濁液（ＯＤ６６０ｎｍ：６．６）２ｍｌをク
エン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５）に加え、３０℃、３
００ｒｐｍで１０時間振とうし、加水分解反応を行っ
た。反応終了後、塩酸０．０４Ｍを加え遠心分離を行い
菌体を除去した。該液を噴霧乾燥し、粉末９３．５ｍｇ
を得た。この粉末を水に溶解し、実施例１に準拠した条
件で逆相クロマトグラフィー用カラムを用いたペア−ド
イオンクロマトグラフィ−に供し、重合度２〜２４のε
−ポリ−Ｌ−リジン含量を測定した。この結果、実施例
３で得られた粉末中には、重合度２〜２４のε−ポリ−
Ｌ−リジンが約８０重量％含まれていた。
・アルブラス・サブスピ−シ−ズ・リジノポリメラス
（Streptomyces albulus sub sp. lysinopolymerus）Ｎ
ｏ．３４６−Ｄ株（微工研条寄第３８３４号）を表１記
載の培地に接種し、３０℃４８時間振とう培養を行っ
た。培養後、菌体を遠心分離（１０，０００ｇ１５分
間）により回収し、湿菌体重量の３倍量の０．１Ｍリン
酸ナトリウム・生理食塩水緩衝液（ｐＨ７）で３回洗浄
を行ったのち、０．１Ｍリン酸ナトリウム・生理食塩水
緩衝液１０ｍｌに懸濁させ菌体懸濁液とした。ついで重
合度２５〜３５のε−ポリ−Ｌ−リジン１００ｍｇと上
記の菌体懸濁液（ＯＤ６６０ｎｍ：６．６）２ｍｌをク
エン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５）に加え、３０℃、３
００ｒｐｍで１０時間振とうし、加水分解反応を行っ
た。反応終了後、塩酸０．０４Ｍを加え遠心分離を行い
菌体を除去した。該液を噴霧乾燥し、粉末９３．５ｍｇ
を得た。この粉末を水に溶解し、実施例１に準拠した条
件で逆相クロマトグラフィー用カラムを用いたペア−ド
イオンクロマトグラフィ−に供し、重合度２〜２４のε
−ポリ−Ｌ−リジン含量を測定した。この結果、実施例
３で得られた粉末中には、重合度２〜２４のε−ポリ−
Ｌ−リジンが約８０重量％含まれていた。
【００３０】実施例４
ε−ポリ−Ｌ−リジン生産菌であるストレプトマイセス
・アルブラス・サブスピ−シ−ズ・リジノポリメラス
（Streptomyces albulus sub sp. lysinopolymerus）Ｎ
ｏ．３４６−Ｄ株（微工研条寄第３８３４号）を表１記
載の培地に接種し、３０℃で７２時間振とう培養を行っ
た。培養後、菌体を遠心分離（１０，０００ｇ１５分
間）により回収した。回収した菌体５ｇ（湿重量）を
０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７）２０ｍｌに
懸濁し、５℃で２０分間超音波破砕を行い、遠心分離
（１０，０００ｇ２０分間）し、ついで０．１Ｍリン酸
ナトリウム緩衝液に対して透析を行ったのち、遠心分離
（１０，０００ｇ ２０分間）を行い、得られた上澄液
を粗酵素液（タンパク質濃度６．０１ｍｇ／ｍｌ）とし
た。重合度２５〜３５のε−ポリ−Ｌ−リジン５０ｍｇ
と上記粗酵素液３ｍｌを０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝
液（ｐＨ７）２ｍｌに溶解した。反応は、３０℃、８０
ｒｐｍの振とう条件で行った。１２時間反応後、９０℃
で１０分間加熱処理して反応を停止させ、遠心分離（１
０，０００ｇ ２分間）したのち、上澄液を噴霧乾燥し
て粉末６７ｍｇを得た。得られた粉末を水に溶解し、実
施例１に準拠した条件でペア−ドイオンクロマトグラフ
ィ−に供した。この結果、実施例４で得られた粉末状生
成物中には重合度２〜２４のε−ポリ−Ｌ−リジンが、
約５８重量％含まれていた。
・アルブラス・サブスピ−シ−ズ・リジノポリメラス
（Streptomyces albulus sub sp. lysinopolymerus）Ｎ
ｏ．３４６−Ｄ株（微工研条寄第３８３４号）を表１記
載の培地に接種し、３０℃で７２時間振とう培養を行っ
た。培養後、菌体を遠心分離（１０，０００ｇ１５分
間）により回収した。回収した菌体５ｇ（湿重量）を
０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７）２０ｍｌに
懸濁し、５℃で２０分間超音波破砕を行い、遠心分離
（１０，０００ｇ２０分間）し、ついで０．１Ｍリン酸
ナトリウム緩衝液に対して透析を行ったのち、遠心分離
（１０，０００ｇ ２０分間）を行い、得られた上澄液
を粗酵素液（タンパク質濃度６．０１ｍｇ／ｍｌ）とし
た。重合度２５〜３５のε−ポリ−Ｌ−リジン５０ｍｇ
と上記粗酵素液３ｍｌを０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝
液（ｐＨ７）２ｍｌに溶解した。反応は、３０℃、８０
ｒｐｍの振とう条件で行った。１２時間反応後、９０℃
で１０分間加熱処理して反応を停止させ、遠心分離（１
０，０００ｇ ２分間）したのち、上澄液を噴霧乾燥し
て粉末６７ｍｇを得た。得られた粉末を水に溶解し、実
施例１に準拠した条件でペア−ドイオンクロマトグラフ
ィ−に供した。この結果、実施例４で得られた粉末状生
成物中には重合度２〜２４のε−ポリ−Ｌ−リジンが、
約５８重量％含まれていた。
【００３１】比較例１
重合度２５〜３５のε−ポリ−Ｌ−リジン５０ｍｇを
０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７）５ｍｌに溶
解した液に、デナチームＡＰ［長瀬産業（株）社製：ア
スペルギルスオリゼー(Aspergillus oryzae)産生の中性
プロテアーゼ］５ｍｇを添加して、４０℃で１２時間加
水分解反応を行ったのち、反応液を９０℃で１０分間加
熱処理して反応を停止させ、遠心分離（１０，０００ｇ
２分間）したのち、上澄液を噴霧乾燥して粉末５１ｍ
ｇを得た。得られた粉末を水に溶解し、実施例１に準拠
した条件でペア−ドイオンクロマトグラフィ−に供し
た。このクロマトグラムを図６に示した。また、この結
果、比較例１で得られた粉末状生成物中には重合度２〜
２４のε−ポリ−Ｌ−リジンが約３８重量％含まれてい
た。
０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７）５ｍｌに溶
解した液に、デナチームＡＰ［長瀬産業（株）社製：ア
スペルギルスオリゼー(Aspergillus oryzae)産生の中性
プロテアーゼ］５ｍｇを添加して、４０℃で１２時間加
水分解反応を行ったのち、反応液を９０℃で１０分間加
熱処理して反応を停止させ、遠心分離（１０，０００ｇ
２分間）したのち、上澄液を噴霧乾燥して粉末５１ｍ
ｇを得た。得られた粉末を水に溶解し、実施例１に準拠
した条件でペア−ドイオンクロマトグラフィ−に供し
た。このクロマトグラムを図６に示した。また、この結
果、比較例１で得られた粉末状生成物中には重合度２〜
２４のε−ポリ−Ｌ−リジンが約３８重量％含まれてい
た。
【００３２】比較例２
重合度２５〜３５のε−ポリ−Ｌ−リジン５０ｍｇを
０．１Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５）５ｍｌに
溶解した液に、デナチームＡＰ５ｍｇを添加して、４０
℃で１２時間加水分解反応を行ったのち、反応液を９０
℃で１０分間加熱処理して反応を停止させ、遠心分離
（１０，０００ｇ ２分間）したのち、上澄液を噴霧乾
燥して粉末５２ｍｇを得た。得られた粉末を水に溶解
し、実施例１に準拠した条件でペア−ドイオンクロマト
グラフィ−に供した。このクロマトグラムを図７に示し
た。またこの結果、比較例２で得られた粉末状生成物中
には重合度２〜２４のε−ポリ−Ｌ−リジンは全く含ま
れておらず、加水分解反応は進行していないことが認め
られた。
０．１Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５）５ｍｌに
溶解した液に、デナチームＡＰ５ｍｇを添加して、４０
℃で１２時間加水分解反応を行ったのち、反応液を９０
℃で１０分間加熱処理して反応を停止させ、遠心分離
（１０，０００ｇ ２分間）したのち、上澄液を噴霧乾
燥して粉末５２ｍｇを得た。得られた粉末を水に溶解
し、実施例１に準拠した条件でペア−ドイオンクロマト
グラフィ−に供した。このクロマトグラムを図７に示し
た。またこの結果、比較例２で得られた粉末状生成物中
には重合度２〜２４のε−ポリ−Ｌ−リジンは全く含ま
れておらず、加水分解反応は進行していないことが認め
られた。
【００３３】比較例３
重合度２５〜３５のε−ポリ−Ｌ−リジン５０ｍｇを水
５ｍｌに溶解した水溶液に塩酸５ｍｌを加え、１００℃
で３時間加水分解反応を行ったのち、６Ｎ水酸化ナトリ
ウム水溶液を添加して中和した。冷却後、該液を噴霧乾
燥して粉末３．５ｇを得た。得られた該粉末を水１０ｍ
ｌに溶解し、６Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を加えてｐＨ
を９に調整する。この液にメタノ−ル３倍量を添加し、
沈澱をガラスファイバ−ろ紙で除去した。ろ液を噴霧乾
燥して粉末１．２ｇを得た。得られた粉末を水に溶解
し、実施例１に準拠した条件でペア−ドイオンクロマト
グラフィ−に供した。この結果、該粉末状生成物中には
重合度２〜２４のε−ポリ−Ｌ−リジンが約２．２重量
％含まれていたが、１回の塩酸処理によって、重合度２
〜２４のε−ポリ−Ｌ−リジンの約３７重量％が塩に吸
着されて失われてしまった。
５ｍｌに溶解した水溶液に塩酸５ｍｌを加え、１００℃
で３時間加水分解反応を行ったのち、６Ｎ水酸化ナトリ
ウム水溶液を添加して中和した。冷却後、該液を噴霧乾
燥して粉末３．５ｇを得た。得られた該粉末を水１０ｍ
ｌに溶解し、６Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を加えてｐＨ
を９に調整する。この液にメタノ−ル３倍量を添加し、
沈澱をガラスファイバ−ろ紙で除去した。ろ液を噴霧乾
燥して粉末１．２ｇを得た。得られた粉末を水に溶解
し、実施例１に準拠した条件でペア−ドイオンクロマト
グラフィ−に供した。この結果、該粉末状生成物中には
重合度２〜２４のε−ポリ−Ｌ−リジンが約２．２重量
％含まれていたが、１回の塩酸処理によって、重合度２
〜２４のε−ポリ−Ｌ−リジンの約３７重量％が塩に吸
着されて失われてしまった。
【００３４】
【発明の効果】本発明の方法は、酸もしくはアルカリを
用いた加水分解反応と異なり、重合度分布が制御しやす
く、かつ塩類の夾雑が少ない重合度２〜２４のε−ポリ
−Ｌ−リジンを効率よくかつ容易に製造することができ
る。また、アスペルギルス属が産生する中性プロテアー
ゼによる反応と異なりｐＨを５〜９の範囲において反応
させることができ、特に酸性（ｐＨ５〜６）領域におい
て反応させることができるため、酵素タンパク質や菌体
への吸着および複合物の生成がなく、高収率で目的とす
る重合度２〜２４のε−ポリ−Ｌ−リジンを製造でき
る。
用いた加水分解反応と異なり、重合度分布が制御しやす
く、かつ塩類の夾雑が少ない重合度２〜２４のε−ポリ
−Ｌ−リジンを効率よくかつ容易に製造することができ
る。また、アスペルギルス属が産生する中性プロテアー
ゼによる反応と異なりｐＨを５〜９の範囲において反応
させることができ、特に酸性（ｐＨ５〜６）領域におい
て反応させることができるため、酵素タンパク質や菌体
への吸着および複合物の生成がなく、高収率で目的とす
る重合度２〜２４のε−ポリ−Ｌ−リジンを製造でき
る。
【００３５】
【図１】図１は重合度２５〜３５のε−ポリ−Ｌ−リジ
ンを含む液をペア−ドイオンクロマトグラフィ−に供
し、溶出させた時の溶出液を波長２１５ｎｍの紫外線吸
収スペクトルで検出したクロマトグラムを示す図であ
る。
ンを含む液をペア−ドイオンクロマトグラフィ−に供
し、溶出させた時の溶出液を波長２１５ｎｍの紫外線吸
収スペクトルで検出したクロマトグラムを示す図であ
る。
【図２】図２は実施例１で得た加水分解物を水に溶解し
た液をペア−ドイオンクロマトグラフィ−に供し、溶出
させた時の溶出液を波長２１５ｎｍの紫外線吸収スペク
トルで検出したクロマトグラムを示す図である。
た液をペア−ドイオンクロマトグラフィ−に供し、溶出
させた時の溶出液を波長２１５ｎｍの紫外線吸収スペク
トルで検出したクロマトグラムを示す図である。
【図３】図３は実施例２で加水分解反応中の反応時間３
時間目の反応液をペア−ドイオンクロマトグラフィ−に
供し、溶出させた時の溶出液を波長２１５ｎｍの紫外線
吸収スペクトルで検出したクロマトグラムを示す図であ
る。
時間目の反応液をペア−ドイオンクロマトグラフィ−に
供し、溶出させた時の溶出液を波長２１５ｎｍの紫外線
吸収スペクトルで検出したクロマトグラムを示す図であ
る。
【図４】図４は実施例２で加水分解反応中の反応時間６
時間目の反応液をペア−ドイオンクロマトグラフィ−に
供し、溶出させた時の溶出液を波長２１５ｎｍの紫外線
吸収スペクトルで検出したクロマトグラムを示す図であ
る。
時間目の反応液をペア−ドイオンクロマトグラフィ−に
供し、溶出させた時の溶出液を波長２１５ｎｍの紫外線
吸収スペクトルで検出したクロマトグラムを示す図であ
る。
【図５】図５は実施例２で得た加水分解物を水に溶解し
た液をペア−ドイオンクロマトグラフィ−に供し、溶出
させた時の溶出液を波長２１５ｎｍの紫外線吸収スペク
トルで検出したクロマトグラムを示す図である。
た液をペア−ドイオンクロマトグラフィ−に供し、溶出
させた時の溶出液を波長２１５ｎｍの紫外線吸収スペク
トルで検出したクロマトグラムを示す図である。
【図６】図６は比較例１で得た加水分解物を水に溶解し
た液をペア−ドイオンクロマトグラフィ−に供し、溶出
させた時の溶出液を波長２１５ｎｍの紫外線吸収スペク
トルで検出したクロマトグラムを示す図である。
た液をペア−ドイオンクロマトグラフィ−に供し、溶出
させた時の溶出液を波長２１５ｎｍの紫外線吸収スペク
トルで検出したクロマトグラムを示す図である。
【図７】図７は比較例２の反応終了後得られた粉末を水
に溶解した液をペア−ドイオンクロマトグラフィ−に供
し、溶出させた時の溶出液を波長２１５ｎｍの紫外線吸
収スペクトルで検出したクロマトグラムを示す図であ
る。
に溶解した液をペア−ドイオンクロマトグラフィ−に供
し、溶出させた時の溶出液を波長２１５ｎｍの紫外線吸
収スペクトルで検出したクロマトグラムを示す図であ
る。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 大城 隆
鳥取県鳥取市北園１丁目152
(72)発明者 上林 祥晃
鳥取県鳥取市湖山町北２丁目128 湖月
荘
(72)発明者 平木 純
神奈川県横浜市金沢区乙舳町10番１ー
104号
(72)発明者 溝上 香子
神奈川県横浜市金沢区乙舳町10番２ー
2101号
(56)参考文献 特開 平４−287693（ＪＰ，Ａ)
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C12P 13/00 - 13/24
ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ)
ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (3)
- 【請求項１】 平均重合度２５以上のε−ポリ−Ｌ−リ
ジンをε−ポリ−Ｌ−リジン生産菌であるストレプトマ
イセス・アルブラス・サブスピ−シ−ズ・リジノポリメ
ラス（Streptomyces albulus sub sp. lysinopolymeru
s）の休止菌体で分解することを特徴とする重合度２〜
２４のε−ポリ−Ｌ−リジンの製造方法。 - 【請求項２】 平均重合度２５以上のε−ポリ−Ｌ−リ
ジンをε−ポリ−Ｌ−リジン生産菌であるストレプトマ
イセス・アルブラス・サブスピ−シ−ズ・リジノポリメ
ラス（Streptomyces albulus sub sp. lysinopolymeru
s）の粗酵素液で分解することを特徴とする重合度２〜
２４のε−ポリ−Ｌ−リジンの製造方法。 - 【請求項３】 ストレプトマイセス・アルブラス・サブ
スピ−シ−ズ・リジノポリメラス（Streptomyces albul
us sub sp. lysinopolymerus）の粗酵素液がε−ポリ−
Ｌ−リジン分解酵素を含む粗酵素液である請求項２記載
のε−ポリ−Ｌ−リジンの製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP23236793A JP3399595B2 (ja) | 1993-08-25 | 1993-08-25 | εーポリーＬーリジンの製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP23236793A JP3399595B2 (ja) | 1993-08-25 | 1993-08-25 | εーポリーＬーリジンの製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0767675A JPH0767675A (ja) | 1995-03-14 |
| JP3399595B2 true JP3399595B2 (ja) | 2003-04-21 |
Family
ID=16938111
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP23236793A Expired - Fee Related JP3399595B2 (ja) | 1993-08-25 | 1993-08-25 | εーポリーＬーリジンの製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3399595B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP4132569B2 (ja) | 2000-05-01 | 2008-08-13 | 富士フイルム株式会社 | スリッタ刃 |
| JP2002330797A (ja) * | 2001-05-08 | 2002-11-19 | Chisso Corp | ε−ポリ−Ｌ−リジンの製造法 |
-
1993
- 1993-08-25 JP JP23236793A patent/JP3399595B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0767675A (ja) | 1995-03-14 |
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