JP3337362B2 - コラーゲンゲル、コラーゲンシートおよびその製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、医療の分野におい
て、皮膚や骨などの生体組織への補填材、軟膏・湿布の
基材、創傷被覆材、粘着材、止血材、癒着防止材、ドッ
ラグデリバリーシステムのキャリアー等として利用する
ことが可能な細胞侵入性、生分解性、止血性、透明性、
薬剤の徐放性を有する水不溶性のコラーゲンゲル、コラ
ーゲンシートおよびその製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ゼラチンは動物の骨や皮などを構成する
主要蛋白質であるコラーゲンを加水分解して得られる水
溶性蛋白質で、ハイドロゲル及びハイドロコロイドの性
質を有する材料として医療の分野でも古くから利用され
てきた。ゼラチンにおいて特に注目すべき特性はそのゾ
ル-ゲル変換能であり、ゼラチン粉末を水中で膨潤させ
た後、３７℃以上に加温するとゼラチンは溶解し粘性の
あるゾルとなる。これを冷却すると弾性のあるゲルにな
り、３７℃以上に再加温すると再びゾルに戻る。このよ
うな性質を利用してゼラチンは胃で溶解されるようなカ
プセル剤として多用されており、多量に生産され安価に
入手することが可能な非常に有用な材料である。一方、
ゼラチンはそのゾル-ゲル変換能故に生体に適用したと
き容易に溶融、分解し、比較的長期の形態保持性を要求
される補填材や創傷被覆材の材料にはそのままの形態で
は不適当であるために、アルデヒド類を用いて架橋形成
させて用いることもあるが、このような処理により得ら
れた材料はゼラチンとしての本来の特性を失うだけでな
く、生体親和性も損なわれていることが多い。

【０００３】近年、アルギン酸ナトリウムやカルボキシ
メチルセルロースナトリウム等の高分子が、その高吸水
性や水溶液に粘稠性を付与する性質のために創傷被覆
材、粘着材等として主に体表面で利用されるようになっ
てきた。これらの特性は生分解しないことであり、した
がって生体内に長期間の留まることとなり組織治癒の妨
げとなる可能性が懸念される。

【０００４】一方、キチン・キトサンが生分解性材料と
して注目されている。キチン質はカニ、エビ等の甲殻類
の殻、蚕等の昆虫の甲皮、イカ等の軟体動物の殻など自
然界に広く分布する豊富な天然資源であり、キチン・キ
トサンは主にカニ、エビ食品加工場で廃棄される殻から
精製され市販されている。キチン・キトサンは動物体内
でリゾチーム酵素で加水分解されるという特徴を持つだ
けでなく、血液と接すると凝血を促進し、皮膚欠損創に
適用すると結合組織再生を促進すると言われている。ま
た、キチンは水に不溶であるがメタスルホン酸や蟻酸を
含むヘキサフルオロアセトン等に可溶であり、キトサン
は水に不溶であるが希有機酸に可溶であるため、適当な
溶媒に溶かし、単独で膜・繊維材料として形成され、生
分解性外科用縫合糸、生分解性カプセル、創傷被覆材な
どとして広く利用されている有用な材料である。しか
し、キチン・キトサンはその物理化学的性状から、その
ままではハイドロゲルやハイドロコロイドを形成させる
ことが困難なため、種々の親水化処理や架橋処理等の二
次加工を受けて初めて軟膏・湿布基材や粘着剤として利
用することができるようになる。

【０００５】以上のような問題を解決する手段としてヒ
アルロン酸等のグリコサミノグリカン、フィブリン、コ
ラーゲン等の蛋白質などの生分解性の生体由来材料がハ
イドロゲルやハイドロコロイドとして医療の分野で取り
上げられるようになってきた。しかし、ヒアルロン酸や
フィブリンは高価であるため大量生産に不向きであると
いう問題があるだけでなく、ヒアルロン酸は生体に適用
したとき容易に溶融、分解し、比較的長期の形態保持性
を要求される補填材や創傷被覆材の材料にはそのままの
形態では不適当であり、フィブリンは原料が主に人血で
あるためウィルス感染性が危険があるいった問題があ
る。

【０００６】コラーゲンは動物の真皮、腱、骨、筋膜等
に豊富に含まれ、また、異種動物由来のものでも酵素処
理によりアテロコラーゲンとすると免疫原性を低下させ
ることが可能であるために多量に生産されて比較的安価
に入手することが可能な有用な材料であるが、生理的条
件下で再線維を形成して水に不溶性になるという特性が
あり、そのままではハイドロゲルやハイドロコロイドと
して用いることができず、キチン・キトサンと同様に種
々の親水化処理や架橋処理を必要とする。メチル化やサ
クシニル化により生理的条件下でも可溶性のコラーゲン
はそのままでは形態保持性が悪いために、グルタールア
ルデヒド等の架橋剤により化学架橋を導入することによ
り形態保持性は向上するが、コラーゲンの特性であると
もいえる生体親和性が著しく損なわれる。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上述した公
知技術の問題点を鑑みて、生体親和性、細胞侵入性、生
分解性、止血性、透明性、薬剤の徐放性を有する水不溶
性のコラーゲンゲル得ることを目的とする。

【０００８】

【課題を解決するための手段】上記課題は以下の本発明
により達成される。 （１）乾燥重量の２０から２００倍の水分を吸収するこ
とができる水不溶性のコラーゲンゲルである。 （２）アテロコラーゲン溶液を金属イオンを０.１ｍＭ
以上と架橋促進剤によって処理することにより得られる
上記（１）に記載のコラーゲンゲルである。 （３）前記金属イオンが、銅イオンまたは鉄イオンであ
る上記（１）乃至（２）に記載のコラーゲンゲルであ
る。 （４）前記架橋促進剤がアスコルビン酸、トコフェロー
ル類、または過酸化水素である上記（１）乃至（３）に
記載のコラーゲンゲルである。

【０００９】（５）上記（１）乃至（４）に記載のコラ
ーゲンゲルを乾燥することにより得られる得られるコラ
ーゲンシートである。 （６）アテロコラーゲン溶液に金属イオンを０.１ｍＭ
以上と架橋促進剤を添加し作用させた後、キレート剤を
添加することによって得られるコラーゲンゲルの製造方
法である。 （７）前記金属イオンが、銅イオンまたは鉄イオンであ
る上記（６）に記載のコラーゲンゲルの製造方法であ
る。 （８）前記架橋促進剤がアスコルビン酸、トコフェロー
ル類、または過酸化水素である上記（６）乃至（７）に
記載のコラーゲンゲルの製造方法である。

【００１０】本発明のコラーゲンゲルは、アテロコラー
ゲン本来の特性を生かしながら乾燥重量の２０から２０
０倍の水分を吸収するので創傷表面の浸出液や血液を吸
収するため、優れた細胞侵入性、生分解性、止血性を有
し、また薬剤を混入した際には優れた薬剤の徐放性を有
する。また、透明性にも優れているため医療用途に用い
る際に患部の状態が確認できる。

【００１１】

【発明の実施の形態】本発明のコラーゲンゲルを得るた
めの製造方法は、（１）アテロコラーゲン溶液への金属
イオンの添加、（２）アテロコラーゲン溶液への架橋促
進剤の添加、（３）アテロコラーゲン酸性溶液の中和の
３つの操作により構成されているが、３つの操作の順序
は問わない。

【００１２】上記の製造方法においてアテロコラーゲン
酸性溶液のｐＨは２〜５が好ましく、特にｐＨ２.５〜
３.５が好ましい。また、アテロコラーゲン酸性溶液の
中和は水酸化ナトリウム等のアルカリやリン酸ナトリウ
ム、トリス塩酸、ヘペス等の緩衝剤を加えることにより
行い、溶液を中和した後のｐＨは５〜９が好ましく、特
にｐＨ６〜８が好ましい。

【００１３】上記の製造方法においてアテロコラーゲン
の溶液に金属イオンと架橋促進剤を作用させるときのア
テロコラーゲンの含有率は０.１〜１０％、特に０.２〜
０.５％が好適である。また、金属イオンの濃度は０.１
ｍＭ以上、特に０.１〜１ｍＭが好適である。さらに、
架橋促進剤の濃度は０.０１〜１００ｍＭ、特に０.１〜
１０ｍＭが好適である。

【００１４】上記の製造方法においてアテロコラーゲン
の溶液に金属イオンと架橋促進剤を作用させるときの温
度範囲は０〜４５℃が好ましく、特に２０〜４０℃が好
ましい。

【００１５】本発明に使用するアテロコラーゲンは、特
に限定されず、ウシ、ブタ、ニワトリ等動物の真皮、
腱、骨、筋膜等コラーゲンが豊富に含まれる組織を原料
とし、プロクターゼ又はペプシンにより分子末端の抗原
性の高いテロペプチド領域を除去したアテロコラーゲン
タイプI、III及びVが好適である。

【００１６】本発明に使用する金属イオンは特に限定し
ないが、銅イオンと鉄イオンが好ましい。また、本発明
に使用する架橋促進剤は特に限定しないが、アスコルビ
ン酸、トコフェロール類、または過酸化水素が好まし
い。

【００１７】また、上記の製造方法においてアテロコラ
ーゲンの酸性溶液に金属イオンと架橋促進剤を１分〜２
４時間作用させた後、ＥＤＴＡ、ジメチルカプロール、
ペニシラミン等のキレート剤を添加しても、本発明のコ
ラーゲンゲルは得られる。

【００１８】上記の製造方法により得られたコラーゲン
ゲルは、４５〜１００℃で熱変性させても良く、また濃
縮して用いても良い。

【００１９】また、本発明のコラーゲンゲルは、風乾ま
たは凍結乾燥することにより粉末状、スポンジ状及びフ
ィルムシート状として用いても良い。

【００２０】ここで本発明に用いるアテロコラーゲン、
本発明のコラーゲンゲル、およびその製造方法について
さらに詳細に説明する。アテロコラーゲンは、ウシ、ブ
タ、ニワトリ等動物の真皮、腱、骨、筋膜等コラーゲン
が豊富に含まれる組織を原料とし、プロクターゼ又はペ
プシンにより分子末端の抗原性の高いテロペプチド領域
を除去して得られ、ｐＨ２〜４の酸性溶液に溶解して粘
稠な溶液となる。

【００２１】このアテロコラーゲンの酸性溶液を生理的
ｐＨ、イオン強度、温度にすると、アテロコラーゲンは
再構成され、生体内での状態と類似した線維を形成し、
溶液は白濁した懸濁液となる。再構成されたアテロコラ
ーゲンは再線維化アテロコラーゲンと呼ばれ、そのとき
の過程は溶液の濁度を経時的に測定することにより知る
ことができる。

【００２２】例えば、アテロコラーゲンを０.３（ｗ／
ｖ）％の含有率で含むｐＨ２〜３の塩酸溶液に氷浴中で
食塩とリン酸ナトリウムを含む緩衝液を加え、終濃度が
０.２７％アテロコラーゲン、３０ｍＭ Ｎａ₂ＨＰＯ₄、
１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７〜８の溶液に調製した。
これを３７℃の恒温槽に浸漬する前に、終濃度が０.１
ｍＭになるように塩化第二銅溶液を加え、さらに、終濃
度が１ｍＭになるようにアスコルビン酸溶液を加えた
後、３７℃の恒温槽に浸漬した。すると、１時間以上加
温しても溶液は白濁した懸濁液とはならなず、半透明な
粘弾性のある材料を含む懸濁液となった。図１の▲はそ
のときの溶液の濁度を示したものである。したがって、
金属イオンとアスコルビン酸などの架橋促進剤を用いる
ことにより透明性に優れたコラーゲンゲルが得られるこ
とがわかる。

【００２３】一方比較例として、アテロコラーゲンを
０.３（ｗ／ｖ）％の含有率で含むｐＨ２〜３の塩酸溶
液に氷浴中で食塩とリン酸ナトリウムを含む緩衝液を加
え、終濃度が０.２７％アテロコラーゲン、３０ｍＭ
Ｎａ₂ＨＰＯ₄、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７〜８の溶
液に調製した。調製直後のこの溶液の濁度は０である
が、この溶液を３７℃の恒温槽に浸漬して加温し始める
と、アテロコラーゲンが再線維化アテロコラーゲンを構
成するにつれ、溶液の濁度は徐々に上昇し、約１時間で
平衡に達した。図１の●はそのときの溶液の濁度を示し
たものである。

【００２４】次に、金属イオンの濃度について検討し
た。図２は塩化第二銅溶液の添加量を変化させたときの
濁度変化を示したものであり、塩化第二銅溶液の添加に
より懸濁液の濁度が急激に低下する様子が観察される。
すなわち、金属イオンを０.１ｍＭ以上にすることによ
り透明性に優れたコラーゲンゲルが得られることがわか
る。

【００２５】次に、上記図１の本発明のコラーゲンゲル
（▲）と比較例（●）の懸濁液を３０００ｒｐｍ、１０
分間の遠心分離により水層を完全に分離した後、それぞ
れの保水性を調べるために乾燥し、含水率（％）（式、
含水率＝（乾燥前重量／乾燥後重量）×１００により）
を求めた。すると、比較例の含水率が２２％であるのに
対し、本発明のコラーゲンゲルの含水率は１８５％であ
り、高吸水性を有することが明らかになった。また、図
３は塩化第二銅溶液の添加量を変化させたときの含水率
の変化を示したものであり、塩化第二銅溶液の添加によ
り材料の含水性が急激に上昇することがわかる。

【００２６】さらに、上記の本発明のコラーゲンゲルと
比較例を遠心分離や凍結乾燥により濃縮した後、大過剰
量の冷ｐＨ２.５塩酸溶液中に浸漬し、４℃冷蔵庫中で
１晩攪拌した。これらの浸漬溶液を３０００ｒｐｍ、１
０分間遠心分離することにより、酸可溶性コラーゲンを
上清として分離し、上清溶液中のコラーゲン含有量
（Ｓ）を測定した。また、残査中の酸不溶性コラーゲン
含有量（Ｐ）を測定した。上清溶液中の酸可溶性コラー
ゲン含有量（Ｓ）と残査中の酸不溶性コラーゲン含有量
（Ｐ）の和が全コラーゲン量（Ａ＝Ｓ＋Ｐ）であり、全
コラーゲン量に占める酸不溶性コラーゲン含有率（％）
（式、含有率＝（酸不可溶性コラーゲン量／全コラーゲ
ン量）×１００により）を求め、これを架橋度とした。
その結果、比較例の架橋度が０であるのに対し、本発明
のコラーゲンゲルの架橋度は約８７％であり、高度に架
橋されていることがわかった。

【００２７】また、塩化第二銅溶液の添加量を変化させ
たときの架橋度変化を求めた。その結果、図４に示す通
り、塩化第二銅溶液の添加により材料の架橋度が急激に
上昇することがわかった。

【００２８】以上より、本発明のコラーゲンゲルは、再
線維化せずに分子間架橋したアテロコラーゲンであり、
アテロコラーゲン溶液に銅イオンなどの金属イオンとア
スコルビン酸などの架橋促進剤を作用させることにより
アテロコラーゲン分子間に架橋が導入され、高吸水性、
透明性に優れたハイドロゲルが得られる。

【００２９】また、図５に示すように、金属イオンとし
て銅イオンの代わりに鉄イオンを添加してもアテロコラ
ーゲン分子間に架橋が導入され、高吸水性のハイドロゲ
ルが形成されることがわかった。

【００３０】さらに、図６に示すように、架橋促進剤と
してアスコルビン酸の代わりに過酸化水素やα-トコフ
ェロール類を添加してもアテロコラーゲン分子間に架橋
が導入され、高吸水性のハイドロゲルが形成されること
がわかった。

【００３１】

【実施例】以下に実施例を示し、本発明をさらに具体的
に説明する。 （実施例１）アテロコラーゲン粉末（高研（株）製）を
０.３（ｗ／ｖ）％の含有率で含むｐＨ２〜３の塩酸溶
液に氷浴中で食塩とリン酸ナトリウムを含む緩衝液を加
え、終濃度が０.２７％アテロコラーゲン、３０ｍＭ
Ｎａ₂ＨＰＯ₄、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７〜８のコ
ラーゲン溶液を調製した。このコラーゲン溶液に終濃度
がそれぞれ０.１ｍＭになるように塩化第二銅溶液とア
スコルビン酸溶液を加えた。このコラーゲン溶液を３７
℃の恒温槽に４時間浸漬すると、コラーゲン溶液は半透
明なハイドロゲルを含む懸濁液となった。この懸濁液に
終濃度が１０ｍＭになるようにＥＤＴＡ溶液を添加した
後、３０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離を数回行い、
沈査を回収することにより乾燥重量の約１００倍の水分
を含むハイドロゲル状のコラーゲンゲル（１）を得た。

【００３２】得られたコラーゲンゲルをシャーレに５ｍ
ｍ厚に流し込み、凍結乾燥することによりスポンジ状シ
ート（１）に加工した。得られたスポンジ状シート
（１）を３７℃に加温した生理的食塩水に浸漬すると、
スポンジ構造を保ちながら直ちに自重の約３０倍の食塩
水を含み、透明化した。また、スポンジ状シート（１）
の架橋度測定を行った結果、架橋度は約８０％であっ
た。

【００３３】（比較例１）アテロコラーゲン粉末（高研
（株）製）を０.３（ｗ／ｖ）％の含有率で含むｐＨ２
〜３の塩酸溶液に氷浴中で食塩とリン酸ナトリウムを含
む緩衝液を加え、終濃度が０.２７％アテロコラーゲ
ン、３０ｍＭ Ｎａ₂ＨＰＯ₄、１００ｍＭ ＮａＣｌ、
ｐＨ７〜８のコラーゲン溶液を調製した。このコラーゲ
ン溶液を３７℃の恒温槽に４時間浸漬し、線維化アテロ
コラーゲンの懸濁液を得た。この懸濁液に終濃度がそれ
ぞれ０.１ｍＭになるように塩化第二銅溶液とアスコル
ビン酸溶液を加え、３０分間静置した後、終濃度が１０
ｍＭになるようにＥＤＴＡ溶液を添加した。その後この
懸濁液に、３０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離を数回
行い、沈査を回収することにより乾燥重量の約１０倍の
水分を含むコラーゲンゲル（Ａ）を得た。

【００３４】得られたコラーゲンゲル（Ａ）を実施例１
のコラーゲンゲル（１）と同じコラーゲン濃度に希釈し
た後、シャーレに５ｍｍ厚に流し込み、凍結乾燥するこ
とによりスポンジ状シート（Ａ）に加工した。得られた
スポンジ状シート（Ａ）を３７℃に加温した生理的食塩
水に浸漬すると、スポンジ構造を保ちながら直ちに自重
の約７倍の食塩水を吸収した。また、このスポンジ状シ
ート（Ａ）の架橋度測定を行った結果、架橋度は約７０
％であった。

【００３５】（試験例１）ラット皮下埋入試験 上記の実施例１で得られた本発明のコラーゲンゲル
（１）からなるスポンジ状シート（１）を補填材、癒着
防止剤、ドラッグデリバリーシステムのキャリアーに想
定したときの、細胞侵入性及び生体内に留置したときの
分解速度を明らかにするために、ラット背部に皮下埋入
し、埋入後経時的に埋入物とその周囲組織の組織標本を
作製して検索した。体重１８０〜２００ｇのＳｐｒａｇ
ｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ系ラットの背部皮膚をネンブタール
麻酔下で除毛した後、背部皮膚中央部に骨格筋筋膜に達
する長さ１ｃｍの切り傷を作製し、その切り傷から皮膚
と骨格筋筋膜の間に切り込みを入れ、皮下ポケットを作
製した。

【００３６】そのポケットに上記の実施例１で得られた
スポンジ状シート（１）を１ｃｍ角に切断して挿入した
後、背部中央部の切り傷を縫合閉鎖することによりスポ
ンジ状シート（１）を埋入した。経時的に摘出したスポ
ンジ状シートの組織標本を観察した結果、本発明のスポ
ンジ状シート（１）は、強い炎症反応や材料周囲への皮
包形成を認めずに線維芽細胞と毛細血管が侵入しており
生体親和性に優れていることが明らかになった。また、
本発明のスポンジ状シート（１）は埋入後徐々に減少し
て４週目にはほとんど消失し、生分解性を有することが
明らかになった。

【００３７】一方、比較例１のコラーゲンゲル（Ａ）か
らなるスポンジ状シート（Ａ）を同様に皮下埋入し経時
的に観察したところ、埋入後１〜２週間でスポンジ状シ
ート内に石灰沈着と炎症細胞の侵入が観察された。ま
た、スポンジ状シート（Ａ）は埋入後４週間でも大部分
が残存し、本発明のスポンジ状シート（１）と比較して
生体親和性に劣るだけではなく、生分解速度も遅いこと
が明らかになった。

【００３８】（試験例２）ラット全層皮膚欠損創への移
植試験 上記の実施例１で得られた本発明のコラーゲンゲル
（１）からなるスポンジ状シート（１）を創傷被覆材に
想定したときの操作性及び創傷治癒効果を調べるため
に、ラット背部の全層皮膚欠損創への移植を試みた。体
重１８０〜２００ｇのＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ系
ラットの背部皮膚をネンブタール麻酔下で除毛した後、
背部皮膚に２×２ｃｍの皮筋を温存した欠損創を作製
し、充分に止血した。その欠損創にスポンジ状シート
（１）を２ｃｍ角に切断して適用し、周囲を創縁に縫合
固定することにより移植した。その後、移植部をバイオ
クルーシブとエラスチコンテープ（ジョンソンアンドジ
ョンソン社製）で被覆保護した。

【００３９】欠損創適用時、スポンジ状シート（１）は
透明性に優れ、創面の観察が充分に行えるだけではな
く、形態保持性に優れ、創縁に容易に縫合することがで
きた。また、欠損創からの浸出液を充分に吸収するだけ
でなく、創面への密着性も良好であった。また、経時的
な組織治癒性を病理組織学的に観察した結果、スポンジ
状シート（１）は、強い炎症反応や過剰な肉芽組織の増
殖のない、良好な線維芽細胞と毛細血管の侵入が認めら
れ、移植後１週目には創周囲からの表皮伸展が開始し
た。

【００４０】一方、比較例１のコラーゲンゲル（Ａ）か
らなるスポンジ状シート（Ａ）を同様に欠損部に移植し
た。欠損創適用時、スポンジ状シート（Ａ）は不透明な
ため、創面の観察ができず、さらに浸出液を吸収し難い
ため、適用後厚みが著しく低下した。また、経時的な組
織治癒性を病理組織学的に観察した結果、本発明のスポ
ンジ状シート（１）と比べ大きな差異は認められなかっ
たが、線維芽細胞と毛細血管の侵入および表皮伸展がわ
ずかに遅延していた。

【００４１】以上の試験例１及び２より、本発明のコラ
ーゲンゲル、およびそれからなるスポンジ状シートは含
水性が高いだけではなく、細胞侵入性にも優れた材料で
あることが明らかになった。また、コラーゲン自体が生
体内に自己組織と同様に取り込まれその後徐々に分解さ
れるため、１度生体に適用すれば他の高分子ハイドロゲ
ル材料のように交換の必要がないことが明らかになっ
た。

【００４２】（試験例３）全血凝固時間に及ぼす影響 １０mg乾燥重量の上記のコラーゲンゲル（１）、コラー
ゲンゲル（Ａ）及びヘリスタット（マリオン）を添加し
た１２×７５ｍｍガラス試験管に採取直後のラット全血
液を管壁を伝わらせて静かに添加した後、室温で３０秒
ごとに試験管を傾け、血液が凝固するまでの時間を測定
した。なお、何も加えなかった血液を対照として用い
た。その結果を下記の表１に示す。

【００４３】

【表１】

【００４４】（試験例４）臓器欠損創における止血効果 体重４５０〜５００ｇのＨａｒｔｌｅｙ系モルモットの
背部皮膚をネンブタール麻酔下で除毛した後、背部より
尿管及び動静脈を付けたままで腎臓を摘出した。その腎
臓に皮質に達する欠損創を作製し、欠損部の血液をガー
ゼで拭い、スポンジ状シート（１）を１ｃｍ角に切断し
たものを欠損部に軽く押しつけて適用した。約３０秒間
軽く圧迫した後、５分間観察した。その結果、スポンジ
状シート（１）は血液を良く吸収し、適用後３分以内で
欠損創からの出血が止まった。

【００４５】一方、スポンジ状シート（Ａ）及びヘリス
タットを欠損創に適用すると、欠損創からの出血が止ま
るのに適用後４分以上の時間を要した。

【００４６】（実施例２）アテロコラーゲン粉末（高研
（株）製）を０.３（ｗ／ｖ）％の含有率で含むｐＨ２
〜３の塩酸溶液に氷浴中で食塩とリン酸ナトリウムを含
む緩衝液を加え、終濃度が０.２７％アテロコラーゲ
ン、３０ｍＭ Ｎａ２HＰＯ４、１００ｍＭＮａＣｌ、ｐ
Ｈ７〜８のコラーゲン溶液を調製した。このコラーゲン
溶液に終濃度がそれぞれ０.１ｍＭになるように塩化第
二銅溶液とアスコルビン酸溶液を加えた。このコラーゲ
ン溶液を３７℃の恒温槽に４時間浸漬すると、コラーゲ
ン溶液は半透明なハイドロゲルを含む懸濁液となった。
この懸濁液に終濃度が１０ｍＭになるようにＥＤＴＡ溶
液を添加した後、３０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離
を数回行い、沈査を回収することにより乾燥重量の約１
００倍の水分を含むハイドロゲル状のコラーゲンゲルを
得た。得られたコラーゲンゲルを凍結乾燥した後、適量
の蒸留水を加えて４％の濃度に調製し、６０℃の恒温槽
に３０分間浸漬してコラーゲンに熱変性を施しコラーゲ
ンゲル（２）を得た。このコラーゲンゲル（２）の架橋
度測定を行ったところ、架橋度は約９０％であった。

【００４７】（比較例２）アテロコラーゲン粉末（高研
（株）製）に適量の蒸留水を加えて４％の濃度に調製し
た。これを６０℃の恒温槽に３０分間浸漬し、コラーゲ
ンに熱変性を行いコラーゲンゲル（Ｂ）を得た。このコ
ラーゲンゲル（Ｂ）の架橋度測定を行ったところ、架橋
度は０％であった。

【００４８】（試験例４）粘度測定 上記のコラーゲンゲル（２）とコラーゲンゲル（Ｂ）の
粘度を回転粘度計を用いて測定した。下記の表２に示す
ように、２０℃で測定すると、どちらのコラーゲンゲル
も粘度が高すぎて測定を行えなかった。しかし、３７℃
で測定するとコラーゲンゲル（Ｂ）の粘度が１３１ｃＰ
であるのに対し、コラーゲンゲル（２）の粘度は４４８
ｃＰであり、優位に高い粘性を示した。

【００４９】

【表２】

【００５０】（実施例３）アテロコラーゲン粉末（高研
（株）製）を０.３（ｗ／ｖ）％の含有率で含むｐＨ２
〜３の塩酸溶液に氷浴中で食塩とリン酸ナトリウムを含
む緩衝液を加え、終濃度が０.２７％アテロコラーゲ
ン、３０ｍＭ Ｎａ２HＰＯ４、１００ｍＭＮａＣｌ、ｐ
Ｈ７〜８のコラーゲン溶液を調製した。このコラーゲン
溶液に終濃度がそれぞれ０.１ｍＭになるように塩化第
二銅溶液とアスコルビン酸溶液を加えた。さらに、この
コラーゲン溶液に終濃度が１ｍｇ／ｍｌになるようにブ
ドウ糖を添加した後、３７℃の恒温槽に４時間浸漬し、
半透明なハイドロゲルを含む懸濁液を得た。この懸濁液
に終濃度が１０ｍＭになるようにＥＤＴＡ溶液を添加し
た後、３０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離を数回行
い、沈査を回収することにより乾燥重量の約１００倍の
水分を含むハイドロゲル状のコラーゲンゲル（３）を得
た。

【００５１】得られたコラーゲンゲル（３）を３７℃に
加温した大過剰量の生理的食塩水に浸漬し、経時的に生
理的食塩水中のブドウ糖濃度をグルコースＢ−テストワ
コー（和光純薬工業(株)）を用いて測定することにより
コラーゲンゲル（３）からのブドウ糖の放出速度を調べ
た。その結果を図７に示す。図７の曲線に示す通り、コ
ラーゲンゲル（３）中のブドウ糖は生理的食塩水に浸漬
後、徐々に放出し、２時間目までにほぼ全量が放出され
ることが明らかになった。

【００５２】（実施例４）アテロコラーゲン粉末（高研
（株）製）を０.３（ｗ／ｖ）％の含有率で含むｐＨ２
〜３の塩酸溶液に氷浴中で食塩とリン酸ナトリウムを含
む緩衝液を加え、最終濃度が０.２７％アテロコラーゲ
ン、３０ｍＭ Ｎａ２HＰＯ４、１００ｍＭＮａＣｌ、ｐ
Ｈ７〜８のコラーゲン溶液を調製した。このコラーゲン
溶液に終濃度がそれぞれ０.１ｍＭになるように塩化第
二銅溶液とアスコルビン酸溶液を加えた。さらに、この
コラーゲン溶液に終濃度が１〜１０μｇ／ｍｌになるよ
うにヘパリンを添加した後、３７℃の恒温槽に４時間浸
漬し、半透明なハイドロゲルを含む懸濁液を得た。この
懸濁液に終濃度が１０ｍＭになるようにＥＤＴＡ溶液を
添加した後、３０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離を数
回行い、沈査を回収することにより乾燥重量の約１００
倍の水分を含むハイドロゲル状のコラーゲンゲル（４）
を得た。

【００５３】アテロコラーゲンとヘパリンはイオン結合
することが知られており、コラーゲンゲル（４）に結合
しているヘパリン結合量を、遠心分離上清中のヘパリン
含有量をテストチームヘパリンＳ（第一化学薬品(株)）
を用いて測定し逆算して求めた。その結果を図８に示
す。図８に示すように、１〜１０μｇ／ｍｌの濃度範囲
でアテロコラーゲン溶液に添加したヘパリンのほぼ全量
がアテロコラーゲンに結合し、アテロコラーゲン溶液へ
の銅とアスコルビン酸の添加はアテロコラーゲンへのヘ
パリンの結合を妨げないことが分かった。

【００５４】また、コラーゲンゲル（４）の架橋度測定
を行うと、架橋度は約８０％であり、アテロコラーゲン
溶液へのヘパリンの添加はハイドロゲルの形成を妨げな
いことが分かった。

【００５５】また、コラーゲンゲル（４）を３７℃に加
温した生理的食塩水に浸漬し、経時的に生理的食塩水中
のヘパリン濃度を測定することにより、ヘパリンの放出
速度を調べた。結果を図９に示す。図９に示すように２
４時間浸漬してもヘパリンはほとんど放出されなかっ
た。

【００５６】また、コラーゲンゲル（４）を３７℃に加
温したラットから得られた新鮮な血清中に浸漬し、経時
的に血清を採取して加熱及びプロナーゼ処理を施した後
の血清中のヘパリン濃度を測定することにより、ヘパリ
ンの放出速度を調べた。その結果を図１０に示す。図１
０の曲線に示されるように、コラーゲンゲル（４）中の
ヘパリンは徐放されることが明らかになった。

【００５７】さらに、コラーゲンゲル（４）を試験例１
で述べた方法でラットの皮下に埋入し、３日後に取り出
して材料中のヘパリン含有量を調べると、残存量は埋入
前の初めの約５６％であった。

【００５８】

【発明の効果】本発明のコラーゲンゲルおよびコラーゲ
ンシートは、細胞侵入性と生分解性を有し、生体親和性
に優れるだけでなく、高い止血性、薬剤の徐放性、透明
性を有し、水不溶性で乾燥重量の２０〜２００倍の水分
を吸収することができ、補填材、軟膏・湿布の基材、創
傷被覆材、粘着材、止血材、癒着防止材、ドッラグデリ
バリーシステムのキャリアー等として利用することが可
能である。また、本発明の製造方法により上記のコラー
ゲンゲルおよびコラーゲンシートを得ることができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】アテロコラーゲン溶液に銅イオンとアスコルビ
ン酸を添加して（▲）加熱した場合と、添加せず（●）
に加温した場合の濁度の経時的変化を示す。

【図２】アテロコラーゲン溶液に添加する銅イオンの濃
度の違いによる濁度の変化を示す。

【図３】アテロコラーゲン溶液に添加する銅イオンの濃
度を変化させて得られたコラーゲンゲルの含水率を示
す。

【図４】 アテロコラーゲン溶液に添加する銅イオンの
濃度を変化させて得られたコラーゲンゲルの架橋度を示
す。

【図５】アテロコラーゲン溶液に添加する鉄イオンの濃
度を変化させて得られたコラーゲンゲルの架橋度を示
す。

【図６】アテロコラーゲン溶液に添加する各種架橋促進
剤の濃度を変化させて得られたコラーゲンゲルの架橋度
を示す。

【図７】コラーゲンゲルからの薬物（ブドウ糖）の放出
量の経時的変化を示す。

【図８】添加したヘパリンのコラーゲンゲルへの結合量
を示す。

【図９】コラーゲンゲルからの薬物（ヘパリン）の放出
量の経時的変化を示す。

【図１０】コラーゲンゲルからの薬物（ヘパリン）の血
清中への放出量の経時的変化を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) A61L 15/00 - 33/18 A61K 47/00 - 47/48 C08L 89/04 C08H 1/00 ＣＡ／ＢＩＯＳＩＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／Ｅ ＭＢＡＳＥ（ＳＴＮ)

Claims (3)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】0.1〜１ｍＭの銅イオンまたは鉄イオンと
   0.01〜100ｍＭのアスコルビン酸、トコフェロール類ま
   たは過酸化水素から選ばれる架橋促進剤により処理され
   たことを特徴とする乾燥重量の２０から200倍の水分を
   吸収する水不溶性のコラーゲンゲル。
2. 【請求項２】請求項１に記載のコラーゲンゲルを乾燥す
   ることにより得られるコラーゲンシート。
3. 【請求項３】コラーゲン溶液中の銅イオンまたは鉄イオ
   ン濃度を0.1〜１ｍＭに調整し、アスコルビン酸、トコ
   フェロール類または過酸化水素から選ばれる架橋促進剤
   の濃度を0.01〜100ｍＭに調整した後、加温しキレート
   剤を添加することを特徴とする乾燥重量の２０から200
   倍の水分を吸収する水不溶性のコラーゲンゲルの製造方
   法。