JP3267783B2 - Ｃｄ３４結合因子およびその製造法 - Google Patents
Ｃｄ３４結合因子およびその製造法Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ヒト造血幹細胞に発現
しているＣＤ３４抗原と特異的に結合し、造血幹細胞に
作用を与え、造血幹細胞の増殖を促進、維持させる機能
を有する分子量１４ｋＤの、名称がＣＤ３４Ｌｐ１４で
ある蛋白質およびその製造法に関する。
しているＣＤ３４抗原と特異的に結合し、造血幹細胞に
作用を与え、造血幹細胞の増殖を促進、維持させる機能
を有する分子量１４ｋＤの、名称がＣＤ３４Ｌｐ１４で
ある蛋白質およびその製造法に関する。
【０００２】本蛋白質は造血幹細胞の増殖を促進、維持
させる機能を有することによって、白血病等の造血器腫
瘍、他家・自家骨髄移植、癌患者の放射線療法・化学療
法に伴う血球減少症、再生不良性貧血等の診断薬、およ
び治療薬としての用途を有する。
させる機能を有することによって、白血病等の造血器腫
瘍、他家・自家骨髄移植、癌患者の放射線療法・化学療
法に伴う血球減少症、再生不良性貧血等の診断薬、およ
び治療薬としての用途を有する。
【０００３】
【従来の技術】ＣＤ３４抗原は、分子量１０５〜１２０
ＫＤの糖蛋白質で骨髄単核細胞中の約１〜３％に発現し
ている他、血管内皮細胞の一部や造血微小環境を構成す
るストローマ細胞の前駆細胞にも発現が認められる。
ＫＤの糖蛋白質で骨髄単核細胞中の約１〜３％に発現し
ている他、血管内皮細胞の一部や造血微小環境を構成す
るストローマ細胞の前駆細胞にも発現が認められる。
【０００４】このＣＤ３４抗原を発現しているといわれ
ている造血幹細胞は、赤血球・顆粒球・巨核球・血小板
・Ｔリンパ球・Ｂリンパ球などの成熟血液細胞をつくり
だす能力（多分化能）を有するとともに、自己再生能を
もつ細胞として定義される。したがって、造血幹細胞を
純化することは、造血機構とその調節因子について調べ
る上で必須であるばかりでなく、造血系疾患の診断、治
療の進展にとって重要であり、特に骨髄移植においては
直接その技術が応用されようとしている。
ている造血幹細胞は、赤血球・顆粒球・巨核球・血小板
・Ｔリンパ球・Ｂリンパ球などの成熟血液細胞をつくり
だす能力（多分化能）を有するとともに、自己再生能を
もつ細胞として定義される。したがって、造血幹細胞を
純化することは、造血機構とその調節因子について調べ
る上で必須であるばかりでなく、造血系疾患の診断、治
療の進展にとって重要であり、特に骨髄移植においては
直接その技術が応用されようとしている。
【０００５】ＣＤ３４陽性細胞中に造血幹細胞が含まれ
ることは以下に述べる実験で証明された。抗ＣＤ３４抗
体カラムを用いてＣＤ３４陽性細胞を分離し、放射線照
射したヒヒに対して、３．２〜４．４×１０6／ｋｇの
ＣＤ３４陽性細胞を移植した結果、ヒヒの造血系が回復
した。一方、１０倍量のＣＤ３４陰性細胞を移植しても
造血系の回復は認められなかった。また、ＦＡＣＳを用
いた単細胞培養法によってＣＤ３４陽性細胞の３７％が
ｉｎ ｖｉｔｒｏでコロニーを形成し、そのうちの１％
が混合コロニーを形成することが示された。
ることは以下に述べる実験で証明された。抗ＣＤ３４抗
体カラムを用いてＣＤ３４陽性細胞を分離し、放射線照
射したヒヒに対して、３．２〜４．４×１０6／ｋｇの
ＣＤ３４陽性細胞を移植した結果、ヒヒの造血系が回復
した。一方、１０倍量のＣＤ３４陰性細胞を移植しても
造血系の回復は認められなかった。また、ＦＡＣＳを用
いた単細胞培養法によってＣＤ３４陽性細胞の３７％が
ｉｎ ｖｉｔｒｏでコロニーを形成し、そのうちの１％
が混合コロニーを形成することが示された。
【０００６】臨床においては、この造血幹細胞を抗ＣＤ
３４抗体を用いて純化し、放射線治療、あるいは化学療
法後の患者に対して自家移植することが行われ始めてお
り、この自家移植によって造血系の回復が見られたと報
告されている。また、自家移植における移植細胞の前処
理として、抗ＣＤ３４抗体を用いて正常造血幹細胞を採
取する（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）こと
によって悪性細胞を減らすことに効果を発揮することが
できる。この自家造血幹細胞移植は今後、大量化学療法
や放射線治療の支持療法として重要になると考えられ
る。
３４抗体を用いて純化し、放射線治療、あるいは化学療
法後の患者に対して自家移植することが行われ始めてお
り、この自家移植によって造血系の回復が見られたと報
告されている。また、自家移植における移植細胞の前処
理として、抗ＣＤ３４抗体を用いて正常造血幹細胞を採
取する（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）こと
によって悪性細胞を減らすことに効果を発揮することが
できる。この自家造血幹細胞移植は今後、大量化学療法
や放射線治療の支持療法として重要になると考えられ
る。
【０００７】しかし、いずれにしても、抗ＣＤ３４抗体
を用いて造血幹細胞（ＣＤ３４陽性細胞）を純化するだ
けではその量を増やすことはできない。骨髄中、末梢血
中の非常に僅かな存在である造血幹細胞の数を増加させ
ることができれば、その採取量を減少させ、患者への負
担を軽減させることが可能になる。
を用いて造血幹細胞（ＣＤ３４陽性細胞）を純化するだ
けではその量を増やすことはできない。骨髄中、末梢血
中の非常に僅かな存在である造血幹細胞の数を増加させ
ることができれば、その採取量を減少させ、患者への負
担を軽減させることが可能になる。
【０００８】しかるに、これまでに報告されている増殖
因子は造血幹細胞を特異的に増殖させる機能において、
充分であるとは言いがたい。例えばＳｔｅｍ ｃｅｌｌ
ｆａｃｔｏｒであっても前駆細胞に対しては増殖因子
として機能するが、自己再生能を有する未文化な造血幹
細胞に対する作用としては不明確である。
因子は造血幹細胞を特異的に増殖させる機能において、
充分であるとは言いがたい。例えばＳｔｅｍ ｃｅｌｌ
ｆａｃｔｏｒであっても前駆細胞に対しては増殖因子
として機能するが、自己再生能を有する未文化な造血幹
細胞に対する作用としては不明確である。
【０００９】このように、ヒトの造血幹細胞の増殖因子
として充分に満足できるものは知られていない。また、
本発明は、分子量１４ｋＤを示すＣＤ３４結合因子に関
するものであるが、このようなリガンドの分離に成功し
た例は従来全く知られていないし、ましてやこのような
リガンドに造血幹細胞に対する作用機能があることを確
認した例も全く知られておらず、本発明が最初である。
として充分に満足できるものは知られていない。また、
本発明は、分子量１４ｋＤを示すＣＤ３４結合因子に関
するものであるが、このようなリガンドの分離に成功し
た例は従来全く知られていないし、ましてやこのような
リガンドに造血幹細胞に対する作用機能があることを確
認した例も全く知られておらず、本発明が最初である。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】このような従来技術に
おいて、従来、造血幹細胞のマーカーとして考えられ、
その機能については未知であったＣＤ３４抗原の機能に
関する報告がなされた結果、なんらかのシグナル伝達に
関与し、造血幹細胞の増殖に関与している可能性が示唆
された。すなわち、ＴＰＡ処理によってＣＤ３４抗原の
セリン残基がリン酸化されること、抗ＣＤ３４抗体を骨
髄単核細胞あるいはＣＤ３４陽性細胞のメチルセルロー
ス培養系に添加するとコロニー形成が抑制されることが
示された。
おいて、従来、造血幹細胞のマーカーとして考えられ、
その機能については未知であったＣＤ３４抗原の機能に
関する報告がなされた結果、なんらかのシグナル伝達に
関与し、造血幹細胞の増殖に関与している可能性が示唆
された。すなわち、ＴＰＡ処理によってＣＤ３４抗原の
セリン残基がリン酸化されること、抗ＣＤ３４抗体を骨
髄単核細胞あるいはＣＤ３４陽性細胞のメチルセルロー
ス培養系に添加するとコロニー形成が抑制されることが
示された。
【００１１】よって、このＣＤ３４抗原に対する結合因
子（リガンド）がＣＤ３４抗原との結合を介して造血幹
細胞の増殖に関与することが予測される。すなわち、Ｃ
Ｄ３４抗原結合因子が造血幹細胞増殖因子である可能性
が考えられ、本発明者らはこの点にはじめて着目した。
子（リガンド）がＣＤ３４抗原との結合を介して造血幹
細胞の増殖に関与することが予測される。すなわち、Ｃ
Ｄ３４抗原結合因子が造血幹細胞増殖因子である可能性
が考えられ、本発明者らはこの点にはじめて着目した。
【００１２】一方、ＣＤ３４抗原に結合する蛋白質とし
ては接着因子として知られているＬ−Ｓｅｌｅｃｔｉｎ
が既に報告されている。しかし、この場合のＣＤ３４抗
原は造血幹細胞に発現されるものではなく、さらにＬ−
Ｓｅｌｅｃｔｉｎは分子量９０ｋＤであり、造血幹細胞
の増殖に必要な造血微小環境を構成するストローマ細胞
に発現されているか否か、あるいは造血幹細胞に対して
作用するか否かについては明らかにされていない。
ては接着因子として知られているＬ−Ｓｅｌｅｃｔｉｎ
が既に報告されている。しかし、この場合のＣＤ３４抗
原は造血幹細胞に発現されるものではなく、さらにＬ−
Ｓｅｌｅｃｔｉｎは分子量９０ｋＤであり、造血幹細胞
の増殖に必要な造血微小環境を構成するストローマ細胞
に発現されているか否か、あるいは造血幹細胞に対して
作用するか否かについては明らかにされていない。
【００１３】本発明は、このような技術の現状において
なされたものであって、上記着目したところにしたが
い、従来分離はおろかその存在も確認されてはいないＣ
Ｄ３４抗原結合因子を分離するだけでなく、造血幹細胞
の増殖調整機能を確認し、そして更にそれを有効に利用
する目的でなされたものである。
なされたものであって、上記着目したところにしたが
い、従来分離はおろかその存在も確認されてはいないＣ
Ｄ３４抗原結合因子を分離するだけでなく、造血幹細胞
の増殖調整機能を確認し、そして更にそれを有効に利用
する目的でなされたものである。
【００１４】つまり本発明の主題は、ヒト造血幹細胞に
発現しているＣＤ３４抗原と特異的に結合し、造血幹細
胞に作用を与え、造血幹細胞の増殖を促進、維持させる
機能を有する蛋白質を提供することを目的としたもので
ある。
発現しているＣＤ３４抗原と特異的に結合し、造血幹細
胞に作用を与え、造血幹細胞の増殖を促進、維持させる
機能を有する蛋白質を提供することを目的としたもので
ある。
【００１５】
【課題を解決するための手段】本発明は、上記目的を達
成するためになされたものであって、ＣＤ３４抗原を発
現している造血幹細胞の増殖を促進、維持させる機能を
有する蛋白質に関するものである。
成するためになされたものであって、ＣＤ３４抗原を発
現している造血幹細胞の増殖を促進、維持させる機能を
有する蛋白質に関するものである。
【００１６】そのため、本発明者らは先ず、ヒトＣＤ３
４抗原ｃＤＮＡをヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）ＧのＦｃ
領域のｃＤＮＡと接続させこれを動物細胞発現用ベクタ
ーに組み込み、これを細胞Ｂａｌｂ／３Ｔ３に、形質導
入し、形質導入細胞（トランスフェクタント）を作製し
た（ＣＤ３４−Ｉｇ／３Ｔ３）。次にこの細胞株を大量
に培養し、その培養上清からＣＤ３４−Ｉｇキメラ蛋白
質を抗ＣＤ３４モノクローナル抗体を利用して、精製し
て得る。このようにして得られたＣＤ３４−Ｉｇキメラ
蛋白質を用いて、ヒト胎児肺由来正常繊維芽細胞株（Ｈ
ＦＬ−III、理化学研究所、細胞開発銀行、Ｃｅｌｌ
Ｎｏ．ＲＣＢ０５２３）の溶解物から分子量１４ｋＤの
蛋白質を分離、精製することに成功し、そして更に、本
蛋白質が、ＣＤ３４抗原に結合する蛋白質（接着因子）
として知られているＬ−セレクチンとは、分子量、細胞
起源及び作用のすべての面において全く相違するところ
から、従来未知の物質と認め、これをＣＤ３４Ｌｐ１４
と新たに命名し、更に検討の結果、本発明を完成した。
４抗原ｃＤＮＡをヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）ＧのＦｃ
領域のｃＤＮＡと接続させこれを動物細胞発現用ベクタ
ーに組み込み、これを細胞Ｂａｌｂ／３Ｔ３に、形質導
入し、形質導入細胞（トランスフェクタント）を作製し
た（ＣＤ３４−Ｉｇ／３Ｔ３）。次にこの細胞株を大量
に培養し、その培養上清からＣＤ３４−Ｉｇキメラ蛋白
質を抗ＣＤ３４モノクローナル抗体を利用して、精製し
て得る。このようにして得られたＣＤ３４−Ｉｇキメラ
蛋白質を用いて、ヒト胎児肺由来正常繊維芽細胞株（Ｈ
ＦＬ−III、理化学研究所、細胞開発銀行、Ｃｅｌｌ
Ｎｏ．ＲＣＢ０５２３）の溶解物から分子量１４ｋＤの
蛋白質を分離、精製することに成功し、そして更に、本
蛋白質が、ＣＤ３４抗原に結合する蛋白質（接着因子）
として知られているＬ−セレクチンとは、分子量、細胞
起源及び作用のすべての面において全く相違するところ
から、従来未知の物質と認め、これをＣＤ３４Ｌｐ１４
と新たに命名し、更に検討の結果、本発明を完成した。
【００１７】本発明によれば、繊維芽細胞、内皮細胞と
いったストローマ細胞のほか、ＣＤ３４結合因子を含有
する細胞を培養し、得られた培養物を上記したキメラ蛋
白質、モノ（ポリ）クローナル抗体その他ＣＤ３４結合
因子と特異的に結合する物質で処理することにより、Ｃ
Ｄ３４結合因子を効率的に製造することができる。
いったストローマ細胞のほか、ＣＤ３４結合因子を含有
する細胞を培養し、得られた培養物を上記したキメラ蛋
白質、モノ（ポリ）クローナル抗体その他ＣＤ３４結合
因子と特異的に結合する物質で処理することにより、Ｃ
Ｄ３４結合因子を効率的に製造することができる。
【００１８】本発明に係るＣＤ３４結合因子である分子
量１４ｋＤの蛋白質は、ＣＤ３４抗原に特異的に結合
し、造血幹細胞に作用を与えるため、造血幹細胞を処理
すれば該細胞の増殖による各種血液細胞の増殖、分化の
維持、促進のほか、各種の調整も可能となる。
量１４ｋＤの蛋白質は、ＣＤ３４抗原に特異的に結合
し、造血幹細胞に作用を与えるため、造血幹細胞を処理
すれば該細胞の増殖による各種血液細胞の増殖、分化の
維持、促進のほか、各種の調整も可能となる。
【００１９】こうして得られた分子量１４ｋＤの蛋白質
は、造血幹細胞を含むＣＤ３４陽性細胞の増殖に関する
機能を調べるための試験、および該蛋白質を発現してい
るストローマ細胞の機能を調べるための試験に供するこ
とができる。
は、造血幹細胞を含むＣＤ３４陽性細胞の増殖に関する
機能を調べるための試験、および該蛋白質を発現してい
るストローマ細胞の機能を調べるための試験に供するこ
とができる。
【００２０】さらに、ひいては白血病等の造血器腫瘍、
他家・自家骨髄移植、癌患者の放射線療法・化学療法に
伴なう血球減少症、再生不良性貧血等の診断薬、および
治療薬に用いることができる。
他家・自家骨髄移植、癌患者の放射線療法・化学療法に
伴なう血球減少症、再生不良性貧血等の診断薬、および
治療薬に用いることができる。
【００２１】本蛋白質は、種々の形態で投与される。そ
の投与形態としては例えば錠剤、カプセル剤、顆粒剤、
散剤、シロップ剤等による経口投与または注射剤（静脈
内、筋肉内、皮下）、点滴剤、座剤等による非経口投与
をあげることができる。これらの各種製剤は、常法に従
って主薬に賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味矯臭
剤、溶解補助剤、懸濁剤、コーティング剤などの医薬の
製剤技術分野において通常使用しうる既知の補助剤を用
いて製剤化することができる。その使用量は症状、年
令、体重、投与方法および剤形等によって異なるが、通
常は成人に対して１回約０．１ｍｇ乃至１，０００ｍｇ
を投与することができる。また、本蛋白質はヒト細胞由
来であるため、本来、安全であってマウスに対して５０
０ｍｇ／体重１ｋｇを経口投与しても急性毒性は認めら
れなかった。
の投与形態としては例えば錠剤、カプセル剤、顆粒剤、
散剤、シロップ剤等による経口投与または注射剤（静脈
内、筋肉内、皮下）、点滴剤、座剤等による非経口投与
をあげることができる。これらの各種製剤は、常法に従
って主薬に賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味矯臭
剤、溶解補助剤、懸濁剤、コーティング剤などの医薬の
製剤技術分野において通常使用しうる既知の補助剤を用
いて製剤化することができる。その使用量は症状、年
令、体重、投与方法および剤形等によって異なるが、通
常は成人に対して１回約０．１ｍｇ乃至１，０００ｍｇ
を投与することができる。また、本蛋白質はヒト細胞由
来であるため、本来、安全であってマウスに対して５０
０ｍｇ／体重１ｋｇを経口投与しても急性毒性は認めら
れなかった。
【００２２】
【作用】ＣＤ３４抗原は骨髄有核細胞の約１〜３％に発
現されており、造血幹細胞、各種血球前駆細胞はこの画
分に含まれる。この画分を分離し、各種サイトカイン、
コロニー刺激因子などの存在下でｉｎ ｖｉｔｒｏ培養
した後、半固形培地でコロニー形成能を調べる試験によ
って、造血幹細胞、および各種血球前駆細胞の増殖に対
する機能を調べることが可能である。このような試験に
よって本発明で与えられる分子量１４ｋＤの蛋白質、Ｃ
Ｄ３４Ｌｐ１４が造血幹細胞に発現するＣＤ３４抗原に
結合し、その増殖を維持、促進する機能を有することを
示すことができる。
現されており、造血幹細胞、各種血球前駆細胞はこの画
分に含まれる。この画分を分離し、各種サイトカイン、
コロニー刺激因子などの存在下でｉｎ ｖｉｔｒｏ培養
した後、半固形培地でコロニー形成能を調べる試験によ
って、造血幹細胞、および各種血球前駆細胞の増殖に対
する機能を調べることが可能である。このような試験に
よって本発明で与えられる分子量１４ｋＤの蛋白質、Ｃ
Ｄ３４Ｌｐ１４が造血幹細胞に発現するＣＤ３４抗原に
結合し、その増殖を維持、促進する機能を有することを
示すことができる。
【００２３】
【実施例】以下に実施例を示し、本発明をより具体的に
説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるもので
はない。
説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるもので
はない。
【００２４】
【実施例１：免疫沈降】ＣＤ３４−Ｉｇキメラ蛋白質を
用いて免疫沈降を行った。
用いて免疫沈降を行った。
【００２５】その方法を以下に述べる。ヒト胎児肺由来
正常繊維芽細胞株（ＨＦＬ−III、理化学研究所、細胞
開発銀行、Ｃｅｌｌ Ｎｏ．ＲＣＢ０５２３）をプレー
トにまき込み、８０％コンフルエントになるまで３７℃
で培養する。メチオニン、システイン不含培地（ＤＭＥ
（−Ｍｅｔ，−Ｃｙｓ））で洗浄後、35Ｓ放射線標識用
培地（Ｔｒａｎｓ−35Ｓ）を加え、３７℃で１６〜１８
時間培養した。細胞を洗浄後、Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅ
ｒ（０．１％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００，１０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓＨＣｌ，０．１５Ｍ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＰＭＳ
Ｆ，１ｍＭ ＥＤＴＡ）を加え、よく溶解する。氷冷で
６０分放置後、Ｔｕｂｅに移し、遠心（１５０００ｒｐ
ｍ，５ｍｉｎ）、上清を分取し、Ｌｙｓａｔｅとした。
Ｌｙｓａｔｅ中の非特異結合物質をｈｕｍａｎ Ｉｇ−
Ｆｃ ｆｒａｃｔｉｏｎ−ＰｒｏｔｅｉｎＧ−Ｓｅｐｈ
ａｒｏｓｅ ４Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ファルマシア）を
用いて除去した後（４℃、３時間）、さらにＰｒｏｔｅ
ｉｎＧ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ
（ファルマシア）を用いて非特異結合物質を除去し（４
℃、２時間）、遠心（１５０００ｒｐｍ，１ｍｉｎ）し
上清を分取した。
正常繊維芽細胞株（ＨＦＬ−III、理化学研究所、細胞
開発銀行、Ｃｅｌｌ Ｎｏ．ＲＣＢ０５２３）をプレー
トにまき込み、８０％コンフルエントになるまで３７℃
で培養する。メチオニン、システイン不含培地（ＤＭＥ
（−Ｍｅｔ，−Ｃｙｓ））で洗浄後、35Ｓ放射線標識用
培地（Ｔｒａｎｓ−35Ｓ）を加え、３７℃で１６〜１８
時間培養した。細胞を洗浄後、Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅ
ｒ（０．１％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００，１０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓＨＣｌ，０．１５Ｍ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＰＭＳ
Ｆ，１ｍＭ ＥＤＴＡ）を加え、よく溶解する。氷冷で
６０分放置後、Ｔｕｂｅに移し、遠心（１５０００ｒｐ
ｍ，５ｍｉｎ）、上清を分取し、Ｌｙｓａｔｅとした。
Ｌｙｓａｔｅ中の非特異結合物質をｈｕｍａｎ Ｉｇ−
Ｆｃ ｆｒａｃｔｉｏｎ−ＰｒｏｔｅｉｎＧ−Ｓｅｐｈ
ａｒｏｓｅ ４Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ファルマシア）を
用いて除去した後（４℃、３時間）、さらにＰｒｏｔｅ
ｉｎＧ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ
（ファルマシア）を用いて非特異結合物質を除去し（４
℃、２時間）、遠心（１５０００ｒｐｍ，１ｍｉｎ）し
上清を分取した。
【００２６】ＣＤ３４−Ｉｇキメラ蛋白質との反応（４
℃、１６〜１８時間）後、ＰｒｏｔｅｉｎＧ−Ｓｅｐｈ
ａｒｏｓｅを加え、４℃で３時間、ゆっくり回転させ
た。ＰｒｏｔｅｉｎＧ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを洗浄後、
ＳＤＳサンプルバッファー（０．１Ｍ ＴｒｉｓＨＣｌ
（ｐＨ６．８），０．１６％グリセロール，３．２％Ｓ
ＤＳ，０．００２％Ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ Ｂｌｕ
ｅ，０．０８％２−Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）
を加え、１０分間煮沸、遠心（１５０００ｒｐｍ，１ｍ
ｉｎ）し、電気泳動用のサンプルとした。これをＳＤＳ
−ＰＡＧＥで泳動後、ゲルを乾燥し、オートラジオグラ
フィーを行い、検出した。その結果、ＣＤ３４−Ｉｇキ
メラ蛋白質はＣＤ３４抗原結合因子である分子量１４ｋ
Ｄの蛋白質、ＣＤ３４Ｌｐ１４と特異的に結合した。
（図１）
℃、１６〜１８時間）後、ＰｒｏｔｅｉｎＧ−Ｓｅｐｈ
ａｒｏｓｅを加え、４℃で３時間、ゆっくり回転させ
た。ＰｒｏｔｅｉｎＧ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを洗浄後、
ＳＤＳサンプルバッファー（０．１Ｍ ＴｒｉｓＨＣｌ
（ｐＨ６．８），０．１６％グリセロール，３．２％Ｓ
ＤＳ，０．００２％Ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ Ｂｌｕ
ｅ，０．０８％２−Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）
を加え、１０分間煮沸、遠心（１５０００ｒｐｍ，１ｍ
ｉｎ）し、電気泳動用のサンプルとした。これをＳＤＳ
−ＰＡＧＥで泳動後、ゲルを乾燥し、オートラジオグラ
フィーを行い、検出した。その結果、ＣＤ３４−Ｉｇキ
メラ蛋白質はＣＤ３４抗原結合因子である分子量１４ｋ
Ｄの蛋白質、ＣＤ３４Ｌｐ１４と特異的に結合した。
（図１）
【００２７】
【実施例２：各種細胞株における免疫沈降】実施例１で
述べた方法を用いて各種細胞株におけるＣＤ３４抗原結
合因子である分子量１４ｋＤの蛋白質、ＣＤ３４Ｌｐ１
４の発現を調べた。その結果、ヒト胎児肺由来正常繊維
芽細胞株（ＨＦＬ−Ｉ、理化学研究所、細胞開発銀行、
Ｃｅｌｌ Ｎｏ．ＲＣＢ０５２１）、ヒト正常臍帯静脈
内皮細胞（ＨＵＶ−ＥＣｌ，理化学研究所、細胞開発銀
行、Ｃｅｌｌ Ｎｏ．ＲＣＢ０６９６）においても存在
が認められた。（図２）
述べた方法を用いて各種細胞株におけるＣＤ３４抗原結
合因子である分子量１４ｋＤの蛋白質、ＣＤ３４Ｌｐ１
４の発現を調べた。その結果、ヒト胎児肺由来正常繊維
芽細胞株（ＨＦＬ−Ｉ、理化学研究所、細胞開発銀行、
Ｃｅｌｌ Ｎｏ．ＲＣＢ０５２１）、ヒト正常臍帯静脈
内皮細胞（ＨＵＶ−ＥＣｌ，理化学研究所、細胞開発銀
行、Ｃｅｌｌ Ｎｏ．ＲＣＢ０６９６）においても存在
が認められた。（図２）
【００２８】
【実施例３：トリプシン処理に対する抵抗性】培養プレ
ート上でトリプシンを作用させた後、プレートから細胞
をはがしてよく洗浄した後、実施例１で述べた方法を用
いて免疫沈降を行い、ＣＤ３４抗原結合因子である分子
量１４ｋＤの蛋白質、ＣＤ３４Ｌｐ１４がトリプシン処
理による影響を受けるか否か、また、細胞に結合してい
る蛋白質であるか否かを調べた。その結果、トリプシン
処理を行った後でもＣＤ３４Ｌｐ１４の存在を確認し
た。この結果から（１）トリプシン耐性の蛋白質である
こと、（２）細胞結合性の蛋白質であることが示唆され
た。（図３）
ート上でトリプシンを作用させた後、プレートから細胞
をはがしてよく洗浄した後、実施例１で述べた方法を用
いて免疫沈降を行い、ＣＤ３４抗原結合因子である分子
量１４ｋＤの蛋白質、ＣＤ３４Ｌｐ１４がトリプシン処
理による影響を受けるか否か、また、細胞に結合してい
る蛋白質であるか否かを調べた。その結果、トリプシン
処理を行った後でもＣＤ３４Ｌｐ１４の存在を確認し
た。この結果から（１）トリプシン耐性の蛋白質である
こと、（２）細胞結合性の蛋白質であることが示唆され
た。（図３）
【００２９】
【発明の効果】本発明によってはじめて、ＣＤ３４抗原
に特異的に結合する１４ｋＤの蛋白質が分離された。こ
の蛋白質は、造血幹細胞に作用を与え、該細胞の増殖を
調整する機能を有する。したがって、本蛋白質は、例え
ば造血幹細胞増殖因子として各種の血液系疾患の予防、
治療剤に利用される。
に特異的に結合する１４ｋＤの蛋白質が分離された。こ
の蛋白質は、造血幹細胞に作用を与え、該細胞の増殖を
調整する機能を有する。したがって、本蛋白質は、例え
ば造血幹細胞増殖因子として各種の血液系疾患の予防、
治療剤に利用される。
【図１】35Ｓ−メチオニンで生合成標識したヒト胎児肺
由来正常繊維芽細胞株の溶解物に対してＣＤ３４−Ｉｇ
キメラ蛋白質を用いて免疫沈降を行った図面である。
由来正常繊維芽細胞株の溶解物に対してＣＤ３４−Ｉｇ
キメラ蛋白質を用いて免疫沈降を行った図面である。
【図２】実施例１の図１と同様な方法でヒト胎児肺由来
正常繊維芽細胞株（ＨＦＬ−Ｉ、理化学研究所、細胞開
発銀行、Ｃｅｌｌ Ｎｏ．ＲＣＢ０５２１）とヒト正常
臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶ−ＥＣｌ，理化学研究所、細
胞開発銀行、ＣｅｌｌＮｏ．ＲＣＢ０６９６）について
免疫沈降を行った図面である。
正常繊維芽細胞株（ＨＦＬ−Ｉ、理化学研究所、細胞開
発銀行、Ｃｅｌｌ Ｎｏ．ＲＣＢ０５２１）とヒト正常
臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶ−ＥＣｌ，理化学研究所、細
胞開発銀行、ＣｅｌｌＮｏ．ＲＣＢ０６９６）について
免疫沈降を行った図面である。
【図３】培養プレート上でトリプシンを作用させた後、
実施例１の図１と同様の方法で免疫沈降を行った図面で
ある。
実施例１の図１と同様の方法で免疫沈降を行った図面で
ある。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 石井 香 埼玉県入間市下藤沢566−６ ハピラス 武蔵藤沢102 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C07K 14/00 - 14/825 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (2)
- 【請求項１】 ストローマ細胞を培養し、得られた培養
物についてＣＤ３４抗原蛋白質カラム処理し、ＣＤ３４
抗原に特異的に結合し、下記の性質を有する蛋白質ＣＤ
３４Ｌｐ１４を分離、採取することを特徴とする蛋白質
ＣＤ３４Ｌｐ１４の製造法。 （１）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により
分子量１４ｋＤを示す。 （２）造血幹細胞に発現しているＣＤ３４抗原と特異的
に結合し、造血幹細胞の増殖、分化を調節するレギュレ
ーターとしての機能を有する。 （３）細胞ＨＦＬ−IIIを培養し、得られた培養物から
生産することが可能である。 - 【請求項２】 下記の性質を有する蛋白質ＣＤ３４Ｌｐ
１４。 （１）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により
分子量１４ｋＤを示す。 （２）造血幹細胞に発現しているＣＤ３４抗原と特異的
に結合し、造血幹細胞の増殖、分化を調節するレギュレ
ーターとしての機能を有する。 （３）細胞ＨＦＬ−IIIを培養し、得られた培養物から
生産することが可能である。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP34944593A JP3267783B2 (ja) | 1993-12-28 | 1993-12-28 | Ｃｄ３４結合因子およびその製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP34944593A JP3267783B2 (ja) | 1993-12-28 | 1993-12-28 | Ｃｄ３４結合因子およびその製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07196691A JPH07196691A (ja) | 1995-08-01 |
| JP3267783B2 true JP3267783B2 (ja) | 2002-03-25 |
Family
ID=18403803
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP34944593A Expired - Lifetime JP3267783B2 (ja) | 1993-12-28 | 1993-12-28 | Ｃｄ３４結合因子およびその製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3267783B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2452501C2 (ru) * | 2010-08-31 | 2012-06-10 | Александр Владимирович Балюра | Сенситин для эритроцитарного диагностикума для диагностики злокачественных новообразований и способ его получения, эритроцитарный диагностикум для диагностики злокачественных новообразований и способ его получения и способ диагностики наличия злокачественных новообразований с использованием указанного эритроцитарного диагностикума |
| CN105254717B (zh) * | 2015-08-18 | 2018-08-24 | 中山大学 | 与cd34分子特异性结合的多肽及其应用 |
-
1993
- 1993-12-28 JP JP34944593A patent/JP3267783B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH07196691A (ja) | 1995-08-01 |
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