JP3181337B2

JP3181337B2 - キトサンオリゴ糖混合物の製造方法、及びキチンオリゴ糖混合物の製造方法

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Publication number: JP3181337B2
Application number: JP31027591A
Authority: JP
Inventors: 義侑島居; 勝一木元; 勉古賀; 治良情野
Original assignee: Pias Corp
Current assignee: Pias Corp
Priority date: 1991-09-13
Filing date: 1991-09-13
Publication date: 2001-07-03
Anticipated expiration: 2016-07-03
Also published as: JPH0568580A

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はキトサンオリゴ糖混合物
の製造方法及びキチンオリゴ糖混合物の製造方法、さら
に詳しくは、キトサン又はキチンの部分分解物であるオ
リゴ糖のうち、比較的高重合度のオリゴ糖を高い収率で
得るためのキトサンオリゴ糖混合物及びキチンオリゴ糖
混合物を製造する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】一般に、キトサンの部分分解物であるキ
トサンオリゴ糖は、食品添加物，化粧品，医薬品等の用
途への開発が望まれており、特に、５糖以上の高級キト
サンオリゴ糖は、近年において抗菌性，抗腫瘍性，免疫
賦活性，植物エリシター活性等の種々の生理活性を有す
ることが見出されており、その付加価値や需要が高まっ
ている。

【０００３】また、このような高級キトサンオリゴ糖の
Ｎ−アセチル化物である高級キチンオリゴ糖は、上記高
級キトサンオリゴ糖と同様な生理活性を有する他、レク
チン阻害性にも優れ、またキチナーゼやリゾチームの基
質として非常に有用であるという特質を有する。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】しかし、このような５
糖以上の高級キトサンオリゴ糖や高級キチンオリゴ糖を
効率的に生産する方法は末だ確立されていない。特に７
糖以上の高級キトサンオリゴ糖，高級キチンオリゴ糖
は、調製が困難で現在市販されていないのが現状であ
る。

【０００５】尚、キトサナーゼ酵素的分解によるキトサ
ンオリゴ糖の生産は、キトサンが希酸に容易に溶解する
ため有効と認められ、現に２，３の報告があるが〔Ｍ．
ＩｚｕｍｅａｎｄＡ．Ｏｈｔａｋａｒａ，Ａｇｒｉ
ｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，５１，１１８９（１９８７）
／三好洋ら，第５回キチン・キトサンシンポジウム要旨
集ｐ９０（１９９１）〕、５糖以上のキトサンオリゴ糖
の収率は低い。

【０００６】また、リゾチームの糖転移反応を利用して
２糖から６糖，７糖等の高級キチンオリゴ糖を生産する
報告があるが〔碓氷泰市ら，第３回キチン・キトサンシ
ンポジウム要旨集ｐ３０（１９８８）〕、２糖のキチン
オリゴ糖は現在のところ価格が高いのでコストの面で問
題がある。

【０００７】さらに、キトサナーゼによるキトサン分解
反応を、酵素反応のみを用いるいわゆるバッチ法で行う
と、２〜５糖を主に生産し、５糖以上の高級キトサンオ
リゴ糖の生産性は低い。

【０００８】本発明は、上述のような問題点をすべて解
決するためになされたもので、高級キトサンオリゴ糖，
高級キチンオリゴ糖を大量に連続生産可能ならしめるこ
とを課題とする。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明は、このような課
題を解決せんとしてキトサンオリゴ糖混合物の製造方法
及びキチンオリゴ糖混合物の製造方法としてなされたも
ので、キトサンオリゴ糖混合物の製造方法としての特徴
は、膜を透過するキトサンオリゴ糖の混合物中に５〜18
糖の高級キトサンオリゴ糖を40重量％以上含有し、且つ
８〜18糖の高級キトサンオリゴ糖を含有しうるように膜
透過率が調整された限外濾過器内で、キトサン分解活性
を有する酵素によるキトサン分解反応を行って５〜18糖
の高級キトサンオリゴ糖を含有するキトサンオリゴ糖混
合物を生成した後、そのキトサンオリゴ糖混合物を限外
濾過器外へ除去し、次にその除去分に相当するキトサン
溶液を前記限外濾過器内に供給し、その後、前記キトサ
ン分解反応，前記キトサンオリゴ糖混合物の除去，及び
前記キトサン溶液の供給を連続的に繰り返して５〜18糖
の高級キトサンオリゴ糖を含有するキトサンオリゴ糖混
合物を製造することにある。また、他のキトサンオリゴ
糖混合物の製造方法の特徴は、膜を透過するキトサンオ
リゴ糖の混合物の生成還元糖が100 〜600(mg・Ｄ−グル
コサミン／ｇ）となるように膜透過率が調整された限外
濾過器内で、キトサン分解活性を有する酵素によるキト
サン分解反応を行って５〜18糖の高級キトサンオリゴ糖
を含むキトサンオリゴ糖混合物を生成した後、そのキト
サンオリゴ糖混合物を限外濾過器外へ除去し、次にその
除去分のキトサン溶液を前記限外濾過器内に供給し、そ
の後、前記キトサン分解反応，前記キトサンオリゴ糖混
合物の除去，及び前記キトサン溶液の供給を連続的に繰
り返して５〜18糖の高級キトサンオリゴ糖を含有するキ
トサンオリゴ糖混合物を製造することにある。

【００１０】また、キチンオリゴ糖混合物の製造方法と
しての特徴は、上記のようなキトサンオリゴ糖混合物の
製造方法で生成されるキトサンオリゴ糖をＮ−アセチル
化して７〜18糖の水難溶性の高級キチンオリゴ糖を含有
するキチンオリゴ糖混合物を製造すること、又は上記の
ようなキトサンオリゴ糖混合物の製造方法で生成される
キトサンオリゴ糖をＮ−アセチル化した後、水に溶解す
るとともにアセトンで処理して４〜７糖の高級キチンオ
リゴ糖を含有するキチンオリゴ糖混合物を製造すること
にある。

【００１１】ここで、酵素反応の基質として用いるキト
サンは、可溶状態であるキトサン溶液であればよいが、
特に分子量５０００〜２０００００の低分子キトサンを
用いることによって粘度の低い高濃度のキトサン溶液の
調製が可能となり、高級キトサンオリゴ糖の収率が著し
く高まるという利点がある。

【００１２】また、用いる緩衝液は酢酸−酢酸ナトリウ
ム緩衝液が好ましいが、これも特に限定されるものでは
ない。

【００１３】さらに、キトサン溶液のｐＨは酵素の至適
ｐＨ付近であればよく、特に限定されない。

【００１４】また、キトサンの濃度も限定されないが、
高濃度３％以上が好ましい。

【００１５】さらに限外濾過器の種類も限定されるもの
ではなく、また限外濾過膜の材質も問わない。要は、酵
素を透過させず、キトサンオリゴ糖を透過させる膜を用
いればよいのである。

【００１６】さらに、酵素はキトサナーゼが好ましい
が、脱アセチル化度５０〜１００％のキトサン分解性が
良いものであればよく、たとえばリゾチーム，キチナー
ゼ，セルラーゼを用いることも可能であり、その種類は
特に限定されない。

【００１７】尚、本発明の製造方法によって得られるキ
トサンオリゴ糖の組成比の経時的な変化はほとんど見ら
れなかった。また、限外濾過膜の透過速度は徐々に減少
するが、これは酵素活性の低下よりもむしろ膜のよごれ
によるものであり、膜を洗浄することによって解消でき
る。

【００１８】

【実施例】以下、本発明の実施例について説明する。実施例１５％低分子キトサン〔脱アセチル化度約９０％，分子量
１．６×１０^４〜１．７×１０^５／共和油脂（株）製〕
溶液４００ｍｌ（ｐＨ５．２）にバチルスｓｐ．ＰＩ−
７Ｓ（微工研菌寄第９８４３号）由来の粗キトサナーゼ
液６８ｍｌ（６Ｕ／ｍｌ）を加え、３７℃での酵素反応
を限外濾過器内で行った。粗キトサナーゼ溶液として
は、培養濾液を限外濾過器で濃縮したものを用いた。

【００１９】次に、生成オリゴ糖を素早く反応系外へ除
去し、その減少分に相当する５％低分子キトサン溶液を
加えた。

【００２０】限外濾過器は日本ミリポアリミテッド株式
会社のＭｉｎｉｔａｎＵｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏ
ｎＳｙｓｔｅｍを用い、限外濾過膜は、分画分子量１
００００，濾過面積は６００ｃｍ^２，圧力は２０ｐｓｉ
に調整した。

【００２１】操作時間は透過液が出始めてから８０時間
行った。

【００２２】またキトサンオリゴ糖の分析はＨＰＬＣで
行った。各時間毎の透渦膜液の乾燥物（キトサン分解
物）に含まれるキトサンオリゴ糖の組成比をＨＰＬＣで
求めたところ、ほぼ一定であり経時的変化は見られなか
った。また、透過膜液のｐＨをアルカリ性にしても沈澱
はほとんど生じなかった。

【００２３】膜透過速度は徐々に減少し、その分，キト
サンオリゴ糖の生産量も徐々に減少する傾向が認められ
た。ちなみに、１８時間目から８０時間目の減少率は２
６％であった。

【００２４】さらにＨＰＬＣはカラムとしてＴＳＫｇｅ
ｌａｍｉｄｅ−８０（４．６×２５ｃｍ），溶出液と
してアセトニトリル／５０ｍＭリン酸（４：６）を用い
ることによって行った。流速は０．７ｍｌ／ｍｉｎに調
整した。

【００２５】上記実施例１によって得られた１時間目か
ら１０時間目の全膜透過液２１００ｍｌをエバポレータ
ーで濃縮後、凍結乾燥することによって固形のキトサン
オリゴ糖混合物１０８ｇを得た。Ｓｃｈａｌｅｓ法で求
めた生成還元糖は３３０（ｍｇ・Ｄ−グルコサミン／
ｇ）であった。

【００２６】ＨＰＬＣで分析したところ２糖：２．０
％，３糖：１３．３％，４糖：１３．１％，５糖：１
８．７％，６糖：１８．０％，７糖：１４．１％，８
糖：９．７％，９糖：５．５％，１０糖：４．１％，１
１糖：１．５％が含まれており、５糖以上の高級キトサ
ンオリゴ糖の含有量は７１．６％であった。その分析結
果は図１に示す。図１において、チャートの各ピーク付
近に付された２〜１１の数字は、それぞれ２糖，…１１
糖のピークを示す。

【００２７】尚、上記実施例１で用いたキトサナーゼの
生産能を有するバチルスｓｐ．ＰＩ−７Ｓ（微工研菌寄
第９８４３号）は、本発明者等が採取した菌株で、その
菌学的性質は次のとおりである。（Ａ）形態学的性質（ａ）菌の形態桿菌（ｂ）芽胞楕円形，膨出（ｃ）運動性あり（ｄ）グラム染色性不定（Ｂ）次の各培地における生育状態（ａ）肉汁寒天培地３７℃で２４〜９６時間培養を行ったところ、全周縁が
突円状のコロニーが形成され、時間の経過とともに盛り
上がってきた。色は、２４時間培養時においてほぼ白濁
色であるが、４８時間培養時以降から薄黄色又は黄色を
帯びてきた。生育状態は陽性と認められた。（ｂ）肉汁液体攪拌培地好気性であり、３７℃で２４時間培養を行ったところ、
白濁色となった。生育状態は陽性と認められた。（Ｃ）嫌気下での発育発育せず（Ｄ）生理学的性質（ａ）カタラーゼの生成＋（ｂ）ＶＰ反応＋Ｗ（ｃ）ＶＰブロスでのｐＨ４．８（ｄ）グルコースからのガスの産性 − （ｅ）酸の産性グルコース＋アラビノース − キシロース − マンニット＋（ｆ）ゼラチンの液化＋（ｇ）デンプンの分解＋（ｈ）チロシンの分解 − （ｉ）クエン酸の利用性 − （ｊ）卵黄反応 − （ｋ）硝酸塩の還元 − （ｌ）インドール産生 − （ｍ）ｐＨ５．７での生育＋（ｎ）５％ＮａＣｌ存在下の生育 − （ｏ）７％ＮａＣｌ存在下の生育 − （ｐ）５０℃での生育 − 尚、上記において＋は陽性、−は陰性、＋Ｗは弱陽性を
それぞれ意味する。この菌株については、昭和６３年１
月２８日に工業技術院微生物工業技術研究所にすでに寄
託している。

【００２８】実施例２上記実施例１で得られたキトサンオリゴ糖混合物をメタ
ノール６５００ｍｌで溶解し、その操作で溶解しないメ
タノール不溶物３５ｇを得た。ＨＰＬＣで分析したとこ
ろ、３糖：３．３％，４糖：４．３％，５糖：９．０
％，６糖：１２．６％，７糖：１４．３％，８糖：１
４．９％，９糖：１４．０％，１０糖：１３．１％，１
１糖：８．３％，１２糖：５．９％含まれており、５糖
以上の高級キトサンオリゴ糖の含有量は９２．３％であ
った。その分析結果は図２に示す。図２において、チャ
ートの各ピーク付近に付された３〜１２の数字は、それ
ぞれ３糖，…１２糖のピークを示す。このように、メタ
ノール不溶物とすることによって、キトサンオリゴ糖混
合物中の高級キトサンオリゴ糖の含有量が向上すること
が認められた。

【００２９】実施例３酵素としてバチルスｓｐ．ＰＩ−７Ｓ（微工研菌寄第９
８４３号）由来の粗キトサナーゼ６８ｍｌ（９Ｕ／ｍ
ｌ）を用いて実施例１と同じ方法でキトサンオリゴ糖生
産を行った。１時間目から１０時間目の膜透過液をエバ
ポレーターで濃縮後、凍結乾燥することによってキトサ
ンオリゴ糖混合物１１９ｇを得た。Ｓｃｈａｌｅｓ法で
求めた生成還元糖は３８０（ｍｇ・Ｄ−グルコサミン／
ｇ）であった。

【００３０】ＨＰＬＣで分析したところ、２糖：５．０
％，３糖：１５．７％，４糖：１９．７％，５糖：２
２．０％，６糖：１８．０％，７糖：１０．１％，８
糖：４．８％，９糖：２．９％，１０糖：１．８％が含
まれており、５糖以上の高級キトサンオリゴ糖の含有量
は５９．６％であった。

【００３１】実施例４上記実施例１で得られたキトサンオリゴ糖混合物１２ｇ
をメタノール１２０ｍｌ，蒸留水７５ｍｌで溶解し、氷
冷下で無水酢酸４３ｍｌを加え８時間放置した。エタノ
ール−アセトン混合液（１：１）１０００ｍｌを添加
し、沈澱を採取するとともに酢酸を除去し凍結乾燥する
ことによってキチンオリゴ糖１０．２ｇを得た。尚、Ｉ
Ｒ分析によって生成物がキチンオリゴ糖であることを確
認した。その分析結果は図４に示す。

【００３２】次に、蒸留水３００ｍｌを加え、不溶物と
して２．２ｇを得た。得られた上清液にアセトン９００
ｍｌを加えることにより、沈澱として４．１ｇを得た。

【００３３】ＨＰＬＣにて分析したところ、４糖：９．
７％，５糖：６０．３％，６糖：３０．０％が含まれて
いた。その分析結果を図３に示す。図３において、チャ
ートの各ピーク付近に付された４〜６の数字は、それぞ
れ４糖，５糖，６糖のピークである。

【００３４】尚、ＨＰＬＣとしては、ＴＳＫｇｅｌａ
ｍｉｄｅ−８０（４．６×２５ｃｍ），溶出液としてア
セトニトリル／水（６：４）を用いることによって行っ
た。流速は０．７ｍｌ／ｍｉｎに調整した。

【００３５】比較例５％低分子キトサン溶液２１００ｍｌ（ｐＨ５．２）に
粗キトサナーゼ６８ｍｌ（６Ｕ／ｍｌ）を加え、３７゜
Ｃで１０時間攪拌しながらバッチ法で酵素反応を行っ
た。反応後、酵素反応液を分画分子量１００００の限外
濾過膜によって酵素及び末分解のキトサンを除いた後、
濃縮後、凍結乾燥を行うことによってキトサンオリゴ糖
６９ｇを得た。

【００３６】上記オリゴ糖をＨＰＬＣで分析したとこ
ろ、２糖：２２．９％，３糖：３５．１％，４糖：２
６．５％，５糖：１５．５％であり、６糖以上は含まれ
ていなかった。

【００３７】

【発明の効果】叙上のように、本発明は膜透過率を最大
に調整した限外濾過器を用いてキトサンとキトサンオリ
ゴ糖混合物とを濾別し、５〜18糖の高級キトサンオリゴ
糖を含有するキトサンオリゴ糖混合物を反応系外に除去
した後、その除去分のキトサン溶液を前記限外濾過器内
に供給し、この作業を連続的に繰り返して５〜18糖の高
級キトサンオリゴ糖を含有するキトサンオリゴ糖混合物
を製造する方法であるため、高級キトサンオリゴ糖の２
次的分解が阻害されて限外濾過器外で得られる５〜18糖
の高級キトサンオリゴ糖の収率が高まり、このような高
級キトサンオリゴ糖を高い含有率で含有するキトサン混
合物の製造を大量に行うことができるという効果があ
る。

【００３８】特に、本発明では、従来のバッチ法等では
得られ難かった５糖以上の高級キトサンオリゴ糖を高収
率で大量に製造しうるため、優れた種々の生理活性を有
する５糖以上の高級キトサンオリゴ糖を実用に供するこ
とができるという実益がある。

【００３９】さらに、上記のような方法で得られたキト
サンオリゴ糖混合物をＮ−アセチル化することによって
高級キチンオリゴ糖を含有するキチンオリゴ糖混合物を
製造することができ、キトサンオリゴ糖に近似した生理
活性を有するキチンオリゴ糖をも大量に得ることができ
るという効果がある。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１のＨＰＬＣの分析チャート。

【図２】実施例２のＨＰＬＣの分析チャート。

【図３】実施例４のＨＰＬＣの分析チャート。

【図４】実施例４のＩＲの分析チャート。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献特開平４−108396（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12P 19/26 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】膜を透過するキトサンオリゴ糖の混合物中
に５〜18糖の高級キトサンオリゴ糖を40重量％以上含有
し、且つ８〜18糖の高級キトサンオリゴ糖を含有しうる
ように膜透過率が調整された限外濾過器内で、キトサン
分解活性を有する酵素によるキトサン分解反応を行って
５〜18糖の高級キトサンオリゴ糖を含有するキトサンオ
リゴ糖混合物を生成した後、そのキトサンオリゴ糖混合
物を限外濾過器外へ除去し、次にその除去分に相当する
キトサン溶液を前記限外濾過器内に供給し、その後、前
記キトサン分解反応，前記キトサンオリゴ糖混合物の除
去，及び前記キトサン溶液の供給を連続的に繰り返して
５〜18糖の高級キトサンオリゴ糖を含有するキトサンオ
リゴ糖混合物を製造することを特徴とするキトサンオリ
ゴ糖混合物の製造方法。
【請求項２】膜を透過するキトサンオリゴ糖の混合物の
生成還元糖が100 〜600(mg・Ｄ−グルコサミン／ｇ）と
なるように膜透過率が調整された限外濾過器内で、キト
サン分解活性を有する酵素によるキトサン分解反応を行
って５〜18糖の高級キトサンオリゴ糖を含有するキトサ
ンオリゴ糖混合物を生成した後、そのキトサンオリゴ糖
混合物を限外濾過器外へ除去し、次にその除去分のキト
サン溶液を前記限外濾過器内に供給し、その後、前記キ
トサン分解反応，前記キトサンオリゴ糖混合物の除去，
及び前記キトサン溶液の供給を連続的に繰り返して５〜
18糖の高級キトサンオリゴ糖を含有するキトサンオリゴ
糖混合物を製造することを特徴とするキトサンオリゴ糖
混合物の製造方法。
【請求項３】前記生成されるキトサンオリゴ糖混合物を
乾燥して得られる固形物に重量５〜25倍量のメタノール
を加え不溶物として５〜18糖の高級キトサンオリゴ糖を
70重量％以上含有するキトサンオリゴ糖混合物を製造す
る請求項１又は２記載のキトサンオリゴ糖混合物の製造
方法。
【請求項４】前記キトサン分解活性を有する酵素がキト
サナーゼであり、且つそのキトサナーゼが、バチルスs
p.PI-7S（微工研菌寄第9843号）由来のキトサナーゼで
ある請求項１乃至３のいずれかに記載のキトサンオリゴ
糖混合物の製造方法。
【請求項５】請求項１乃至４のいずれかに記載のキトサ
ンオリゴ糖混合物の製造方法で生成されるキトサンオリ
ゴ糖をＮ−アセチル化して７〜18糖の高級キチンオリゴ
糖を含有するキチンオリゴ糖混合物を製造することを特
徴とするキチンオリゴ糖混合物の製造方法。
【請求項６】請求項１乃至４のいずれかに記載のキトサ
ンオリゴ糖混合物の製造方法で生成されるキトサンオリ
ゴ糖をＮ−アセチル化した後、水に溶解するとともにア
セトンで処理して４〜７糖の高級キチンオリゴ糖を含有
するキチンオリゴ糖混合物を製造することを特徴とする
キチンオリゴ糖混合物の製造方法。