JP3149947B2 - 流量免疫センサ方法と装置 - Google Patents
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Description
【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は検査対象物の一部分を検出する連続的かつ相
対的に瞬間的な抗体に基づく方法と，その方法を導くこ
とを可能にする流量免疫センサ装置に関する。
対的に瞬間的な抗体に基づく方法と，その方法を導くこ
とを可能にする流量免疫センサ装置に関する。
背景技術 今日，健康と安全のために，環境，または，それら自
身が危険であり，あるいは危険でありうる材料と関連す
る試料における一部分の存在を迅速に検出することを可
能にすることが必要である。これらの一部分は薬品内，
食料品内，あるいは，人体の流体の試料内に存在しう
る。さらにこれらの一部分は空気中または水中に存在し
うる。かかる一部分はここでは検査対象物（target）ま
たは検査対象物の一部分（target moiety）として参照
される。
身が危険であり，あるいは危険でありうる材料と関連す
る試料における一部分の存在を迅速に検出することを可
能にすることが必要である。これらの一部分は薬品内，
食料品内，あるいは，人体の流体の試料内に存在しう
る。さらにこれらの一部分は空気中または水中に存在し
うる。かかる一部分はここでは検査対象物（target）ま
たは検査対象物の一部分（target moiety）として参照
される。
検査対象物はたとえば食料品の中に有毒材料として存
在するもの，または，空気中または給水内に有毒媒体と
して存在するものであり，健康に対してある危険を及ぼ
す可能性がある。さらに検査対象物はたとえば爆発性お
よび不法な薬品によってしみ出される蒸気であり，人間
の福祉にとってある危険の存在を示す化学品でありう
る。またさらに検査対象物は，特定の構成物または動物
の体内の流体の内部に見出される代謝物でありうる。こ
れらの後者の検査対象物は病気の存在または単純に健康
状態を示すことができる。
在するもの，または，空気中または給水内に有毒媒体と
して存在するものであり，健康に対してある危険を及ぼ
す可能性がある。さらに検査対象物はたとえば爆発性お
よび不法な薬品によってしみ出される蒸気であり，人間
の福祉にとってある危険の存在を示す化学品でありう
る。またさらに検査対象物は，特定の構成物または動物
の体内の流体の内部に見出される代謝物でありうる。こ
れらの後者の検査対象物は病気の存在または単純に健康
状態を示すことができる。
研究所における条件下では検査対象物の一部分を検出
するため種々の検査方法が利用でき，あるいは，提案さ
れている。食料または水の内部における有毒物はバッチ
ごとに行われる化学的検査によって検出される。さら
に，空気または水の内部の有毒物は連続的なプロセスに
よって検出できるが，現在のところ，これらのプロセス
はその目的を遂行するために相当多くの検査対象物の試
料を必要とする。さらにそれらの検査は相互間を識別せ
ず，または，多くの検査対象物に対して盲目である。多
くのバッチ検査は体内流体の代謝物または構成物の検出
および同定のために存在する。これらの検査の多くのも
のが実質的に瞬間的な答えを提供せず，または，迅速な
「あなたが待機している間の答え（while−you−wait a
nswers）」を提供しない。
するため種々の検査方法が利用でき，あるいは，提案さ
れている。食料または水の内部における有毒物はバッチ
ごとに行われる化学的検査によって検出される。さら
に，空気または水の内部の有毒物は連続的なプロセスに
よって検出できるが，現在のところ，これらのプロセス
はその目的を遂行するために相当多くの検査対象物の試
料を必要とする。さらにそれらの検査は相互間を識別せ
ず，または，多くの検査対象物に対して盲目である。多
くのバッチ検査は体内流体の代謝物または構成物の検出
および同定のために存在する。これらの検査の多くのも
のが実質的に瞬間的な答えを提供せず，または，迅速な
「あなたが待機している間の答え（while−you−wait a
nswers）」を提供しない。
ここでは，検査に提供されているまたは導入されてい
る試料について２分または３分以内の答えを提供する検
査として，実時間検査が規定される。環境から試料を除
去し，複数のハンドリングおよび転送動作に対してそれ
を対象化するに要する検査は，読みを展開する時間また
は培養時間（incubation time）とともに，実時間検査
とは考えない。実例として，流れている空気または水の
流れから試料を除去し，検査によって指示される条件が
環境内の条件を示すように１分以内で答えを提供するも
のは，実時間検査と考えられる。
る試料について２分または３分以内の答えを提供する検
査として，実時間検査が規定される。環境から試料を除
去し，複数のハンドリングおよび転送動作に対してそれ
を対象化するに要する検査は，読みを展開する時間また
は培養時間（incubation time）とともに，実時間検査
とは考えない。実例として，流れている空気または水の
流れから試料を除去し，検査によって指示される条件が
環境内の条件を示すように１分以内で答えを提供するも
のは，実時間検査と考えられる。
今日，非常に関心のある２つの分野が薬品の検出およ
び爆発性材料の検出である。これら２つの形式の材料を
検出することに関する化学的な問題は顕著に異なるが，
物理的な問題はしばしば同じである。両者はともに実時
間検査を要求する。同様にまた，試料ごとの（sample−
by−sample）状況における一部分の存在を検出する実時
間方法の必要性が存在し，試料は迅速に特徴づけられ，
適切な行動がとられる。このことは犯罪現場における簡
単な品質検査となり得る。薬品としての試料，血液とし
ての試料，または，精液としての試料を同定する。
び爆発性材料の検出である。これら２つの形式の材料を
検出することに関する化学的な問題は顕著に異なるが，
物理的な問題はしばしば同じである。両者はともに実時
間検査を要求する。同様にまた，試料ごとの（sample−
by−sample）状況における一部分の存在を検出する実時
間方法の必要性が存在し，試料は迅速に特徴づけられ，
適切な行動がとられる。このことは犯罪現場における簡
単な品質検査となり得る。薬品としての試料，血液とし
ての試料，または，精液としての試料を同定する。
テロリズムの行動として，爆弾が海外航空機内または
建造物内に配設される。爆発性装置は通常小さく隠され
ており，包囲され空間に制限されている。そのような行
動に対する防御としては，隠蔽場所内の爆発性材料を検
出することを要求する。同様に，不法な薬品（ドラッ
グ）が小さく隠されて，包囲されて，そして，空間に制
限されて，国内，建造物内，または他の保管場所に密か
に導き入れられる。多くのドラッグおよび爆発物の蒸気
圧力は，非常に少量でも空気をサンプリングすることに
よって検出することができるものである。特定の検査対
象物の検査対象物蒸気のそのような非常に少量の検出
は，識別し検出する装置，検査方法および材料を要求す
る。
建造物内に配設される。爆発性装置は通常小さく隠され
ており，包囲され空間に制限されている。そのような行
動に対する防御としては，隠蔽場所内の爆発性材料を検
出することを要求する。同様に，不法な薬品（ドラッ
グ）が小さく隠されて，包囲されて，そして，空間に制
限されて，国内，建造物内，または他の保管場所に密か
に導き入れられる。多くのドラッグおよび爆発物の蒸気
圧力は，非常に少量でも空気をサンプリングすることに
よって検出することができるものである。特定の検査対
象物の検査対象物蒸気のそのような非常に少量の検出
は，識別し検出する装置，検査方法および材料を要求す
る。
グリフィス（Griffith）らに与えられた米国特許第4,
818,870号は「スニファ（sniffer）」装置を用いた空気
サンプリングプローブを記述する。これらの装置はドラ
ッグおよび爆発物からの蒸気を検出することを試みてい
る。グリフィスの発明における検出装置は質量分析器で
ある。米国特許第4,866,439号は電子捕捉検出装置を用
いて爆発物を検出する手段を開示する。米国特許第4,84
9,628号，第4,776,409号および第4,884,839号は，イオ
ン源またはフォトイオン検出器を用いる大気サンプリン
グ装置を記述する。米国特許第4,360,776号において，
バウマン（Bauman）は検査対象媒体物（target agent）
を検出するため，電子スピン共鳴法における抗体の使用
を記述する。
818,870号は「スニファ（sniffer）」装置を用いた空気
サンプリングプローブを記述する。これらの装置はドラ
ッグおよび爆発物からの蒸気を検出することを試みてい
る。グリフィスの発明における検出装置は質量分析器で
ある。米国特許第4,866,439号は電子捕捉検出装置を用
いて爆発物を検出する手段を開示する。米国特許第4,84
9,628号，第4,776,409号および第4,884,839号は，イオ
ン源またはフォトイオン検出器を用いる大気サンプリン
グ装置を記述する。米国特許第4,360,776号において，
バウマン（Bauman）は検査対象媒体物（target agent）
を検出するため，電子スピン共鳴法における抗体の使用
を記述する。
モノクローナル抗体技術は驚くほど近代化学および医
療分析技術を変化させてきた。モノクローナル抗体技術
が非常に特定的な大量に利用できる抗体に適用されてい
るから，抗体を被覆したサポートを包含しているコラム
が抗原を精製するために一般的に使用できる。
療分析技術を変化させてきた。モノクローナル抗体技術
が非常に特定的な大量に利用できる抗体に適用されてい
るから，抗体を被覆したサポートを包含しているコラム
が抗原を精製するために一般的に使用できる。
ELISA（Enzyme Linked ImmunoSorbant Assays）など
の抗体基準検出システムおよび放射性免疫分析検査が開
発されており，良好な抗体の特異的選択性および感度を
もたらしている。しかしながら，感度はよいがこれらの
技法は時間がかかり，通常，複数のマニュプレータ，お
よび／または，添加試薬を必要とする。抗体は，それら
の本来の特性としての感度および選択性に起因してバイ
オセンサにおける検出素子として使用する自然の候補で
ある。
の抗体基準検出システムおよび放射性免疫分析検査が開
発されており，良好な抗体の特異的選択性および感度を
もたらしている。しかしながら，感度はよいがこれらの
技法は時間がかかり，通常，複数のマニュプレータ，お
よび／または，添加試薬を必要とする。抗体は，それら
の本来の特性としての感度および選択性に起因してバイ
オセンサにおける検出素子として使用する自然の候補で
ある。
抗体と一体化されているバイオセンサは免疫センサと
して分類されている。これまで多くの免疫センサが報告
された（Ivesら,Applied Biotechnology Laboratory,
1989,3月10日;Andradeら，米国特許第4,368,047号（198
3）;Placeら,Biosensor,1,321,（1985）;Trombergら,An
al.Chem.,59,1226（1987）;Thompson,R.B.およびF.S.Li
gler）。NRLメモランダム報告書（6182,1988）に開示の
ものは抗体と抗原との会合に依存しており，大きな分子
を検出するための直接結合またはサンドイッチ分析物と
して，または，小さい分子を検出する競合分析（compet
ition assays）として，構成されている。
して分類されている。これまで多くの免疫センサが報告
された（Ivesら,Applied Biotechnology Laboratory,
1989,3月10日;Andradeら，米国特許第4,368,047号（198
3）;Placeら,Biosensor,1,321,（1985）;Trombergら,An
al.Chem.,59,1226（1987）;Thompson,R.B.およびF.S.Li
gler）。NRLメモランダム報告書（6182,1988）に開示の
ものは抗体と抗原との会合に依存しており，大きな分子
を検出するための直接結合またはサンドイッチ分析物と
して，または，小さい分子を検出する競合分析（compet
ition assays）として，構成されている。
ELISAの広範囲の使用およびアフィニティークロマト
グラフィー固溶体インターフェースにおける抗原・抗体
結合の動力学の理論的な考察を刺激している（Lew,J.Im
munol.Methods,72,171,（1984）,Lundstromら,J.Theor.
Biol.,110,195（1984）,Nygrenら,J.Immunol.Methods,1
01,63,（1987）,Stenbergら,J.Immunol.Methods,113,3,
（1988））。抗原と抗体との会合速度は，固定化された
成分の密度，抗体親和性，基質の立体構造，および，遊
離している成分の濃度の関数であるように決定される。
上記引用した研究においては，抗原が表面に結合され，
抗体が溶液内で自由となる。
グラフィー固溶体インターフェースにおける抗原・抗体
結合の動力学の理論的な考察を刺激している（Lew,J.Im
munol.Methods,72,171,（1984）,Lundstromら,J.Theor.
Biol.,110,195（1984）,Nygrenら,J.Immunol.Methods,1
01,63,（1987）,Stenbergら,J.Immunol.Methods,113,3,
（1988））。抗原と抗体との会合速度は，固定化された
成分の密度，抗体親和性，基質の立体構造，および，遊
離している成分の濃度の関数であるように決定される。
上記引用した研究においては，抗原が表面に結合され，
抗体が溶液内で自由となる。
多変数システムのために，上記引用したStenbergら
は，表面反応が拡散速度に比較して速い場合に限り，マ
クロスコープ的な粒子の表面における抗体と抗原との会
合速度が，質量の拡散移動によって制限されることを示
している。拡散が制限されている領域において，その速
度は球体の半径に反比例する。
は，表面反応が拡散速度に比較して速い場合に限り，マ
クロスコープ的な粒子の表面における抗体と抗原との会
合速度が，質量の拡散移動によって制限されることを示
している。拡散が制限されている領域において，その速
度は球体の半径に反比例する。
上記において引用したIvesら（1989）は，それが平衡
的な交換反応であるという仮定において，過剰な非標識
抗原による標識抗原の置換を簡単に討議している。抗原
が一価で低分子重量であるとき,Ivesらは交換に15〜20
分を要することを結論づけている。
的な交換反応であるという仮定において，過剰な非標識
抗原による標識抗原の置換を簡単に討議している。抗原
が一価で低分子重量であるとき,Ivesらは交換に15〜20
分を要することを結論づけている。
抗原・抗体相互作用においては，通常，解離速度が結
合の強さを決定すると考えられている。固定化された抗
原からのIgGとFab′抗体の分離については,10-4〜10-5s
ec-1の範囲の速度定数が得られている（Liuら,IEEE Tr
ans.of Biomedical Eng.,Vol.BME−33,No.2,1986,2
月；上記引用したNygren,1987;Masonら,Biochem.J.,18
7,1（1980）;Werthenら,J.Immunol.Methods,115,71（19
88））。免疫分析のこの代表的な時間間隔のために，結
合体はそれゆえ不可逆であると考えられている。
合の強さを決定すると考えられている。固定化された抗
原からのIgGとFab′抗体の分離については,10-4〜10-5s
ec-1の範囲の速度定数が得られている（Liuら,IEEE Tr
ans.of Biomedical Eng.,Vol.BME−33,No.2,1986,2
月；上記引用したNygren,1987;Masonら,Biochem.J.,18
7,1（1980）;Werthenら,J.Immunol.Methods,115,71（19
88））。免疫分析のこの代表的な時間間隔のために，結
合体はそれゆえ不可逆であると考えられている。
上記引用したNygrenの研究（1987）において，数時間
の間にわたって，固定化された抗原に結合された抗体の
解離が見られたのは，過剰な抗原の存在においてのみで
あった。過剰な遊離抗原の付加による抗体アフィニティ
ーカラムに結合された抗原の置換もまた知られている。
の間にわたって，固定化された抗原に結合された抗体の
解離が見られたのは，過剰な抗原の存在においてのみで
あった。過剰な遊離抗原の付加による抗体アフィニティ
ーカラムに結合された抗原の置換もまた知られている。
Aizawaらは,Transducers,'87,783（1988）で，自由な
抗原をマイクロモル程度の量を用いて固定化された抗原
からのペルオキシダーゼで標識されたIgG抗体の「注目
すべき」置換を報告している。Aizawaらの報告は不完全
である。その理由は，時間だけでなく自由抗原に対する
抗体の比率が報告されなかったからである。
抗原をマイクロモル程度の量を用いて固定化された抗原
からのペルオキシダーゼで標識されたIgG抗体の「注目
すべき」置換を報告している。Aizawaらの報告は不完全
である。その理由は，時間だけでなく自由抗原に対する
抗体の比率が報告されなかったからである。
ヒット・アンド・ラン式免疫分析（Wardenら,Anal.Bi
ochem.,162,363（1987）もまた，カラムの支持体で行わ
れる免疫分析である。このヒット・アンド・ラン式免疫
分析の問題は，連続的な流量システムでないことであ
る。抗原がカラムに導入されたとき，そこに５分間残る
ことが許可される。したがって,5分周期において，試料
の１つのコラム容積のみが検査できる。またこの期間の
間，流速よりも拡散が抗原・抗体の遭遇の数を決定す
る。さらに加えて，抗原がカラムに固定化され，蛍光標
識されたIgGのFab′フラグメント（部分）がそれに結合
される。このFab′フラグメントは平衡的な結合状態で
あるように要求され，その結果として，それが絶えず個
別の固定化された抗原に結合し，解離し，そして再び結
合する。抗原を含む試料が導入されたとき，解離したFa
b′フラグメントが５分周期にわたってそれに結合し，
可溶な蛍光性複合体が蛍光検出器の下流に流れる。
ochem.,162,363（1987）もまた，カラムの支持体で行わ
れる免疫分析である。このヒット・アンド・ラン式免疫
分析の問題は，連続的な流量システムでないことであ
る。抗原がカラムに導入されたとき，そこに５分間残る
ことが許可される。したがって,5分周期において，試料
の１つのコラム容積のみが検査できる。またこの期間の
間，流速よりも拡散が抗原・抗体の遭遇の数を決定す
る。さらに加えて，抗原がカラムに固定化され，蛍光標
識されたIgGのFab′フラグメント（部分）がそれに結合
される。このFab′フラグメントは平衡的な結合状態で
あるように要求され，その結果として，それが絶えず個
別の固定化された抗原に結合し，解離し，そして再び結
合する。抗原を含む試料が導入されたとき，解離したFa
b′フラグメントが５分周期にわたってそれに結合し，
可溶な蛍光性複合体が蛍光検出器の下流に流れる。
抗体が不法な薬品および爆発物の検出に適用されてい
る。米国特許第4,353,886号において,Lukensらは，麻酔
性（睡眠性）蒸気に関するフィールド検査を記述してい
る。その検査はテストプレートに装着した抗体を使用
し，蒸気を検出する。この検査はバッチ形式のシステム
であり，異なるプレートの露出と展開を必要とする。こ
のシステムは環境を連続的に監視することができない。
る。米国特許第4,353,886号において,Lukensらは，麻酔
性（睡眠性）蒸気に関するフィールド検査を記述してい
る。その検査はテストプレートに装着した抗体を使用
し，蒸気を検出する。この検査はバッチ形式のシステム
であり，異なるプレートの露出と展開を必要とする。こ
のシステムは環境を連続的に監視することができない。
薬品を単独で，またはグループのいずれかで検出する
ための，種々の技法が開発されている。米国特許第4,23
5,864号において,Kaulらは，一緒に発見された複数の薬
品を検出し同定する方法を記述している。放射性ラベル
されたエクゴニン誘導体を用いて，従来のラジオイムノ
アッセイでコカインを検出する。種々の不法な薬品用の
抗体を調製する方法がよく知られており，あるものは商
業的なソースから利用可能である。
ための，種々の技法が開発されている。米国特許第4,23
5,864号において,Kaulらは，一緒に発見された複数の薬
品を検出し同定する方法を記述している。放射性ラベル
されたエクゴニン誘導体を用いて，従来のラジオイムノ
アッセイでコカインを検出する。種々の不法な薬品用の
抗体を調製する方法がよく知られており，あるものは商
業的なソースから利用可能である。
抗体を用いる現存する技法は連続的に環境を監視する
ための能力を有せず，または，実時間における応答を提
供しない。現存するシステムは直接結合，競合的結合ま
たは平衡交換反応に依存する半バッチ処理である。
ための能力を有せず，または，実時間における応答を提
供しない。現存するシステムは直接結合，競合的結合ま
たは平衡交換反応に依存する半バッチ処理である。
発明の開示 したがって，本発明の目的は，実時間で検査対象物を
検出する方法である。
検出する方法である。
付加的には，本発明の目的は，検査対象物を検出する
ため，実時間で環境を監視する方法である。
ため，実時間で環境を監視する方法である。
本発明の他の目的は，少量の検査対象介在物を良好な
感度で検出する方法である。
感度で検出する方法である。
さらに本発明の他の目的は，実時間で検査対象物を検
出することが可能な可搬式免疫センサである。
出することが可能な可搬式免疫センサである。
本発明のさらなる目的は，連続流量モードにおいて実
時間で動作する免疫センサである。
時間で動作する免疫センサである。
本発明の他の目的は，実時間で，高分子量および低分
子量（例，ハプテン）の検査対象物の両者を検出するこ
とが可能な免疫センサである。
子量（例，ハプテン）の検査対象物の両者を検出するこ
とが可能な免疫センサである。
本発明のこれらおよび付加的な目的は検査対象物の一
部分を検出する下記の方法によって達成されるのであ
り，その方法は，（ａ）検査対象物に特異的な抗体を提
供する段階，（ｂ）抗体の結合サイトを，ラベルされた
検査対象物により飽和させる段階，（ｃ）飽和された抗
体を通過させた検査対象物を含む媒体を流す段階，
（ｄ）それにより，検査対象物をラベルされた抗原と置
換する段階，および，（ｅ）置換されたラベルされた抗
原を，ラベルに応じた検出器を用いて検出する段階を具
備する。
部分を検出する下記の方法によって達成されるのであ
り，その方法は，（ａ）検査対象物に特異的な抗体を提
供する段階，（ｂ）抗体の結合サイトを，ラベルされた
検査対象物により飽和させる段階，（ｃ）飽和された抗
体を通過させた検査対象物を含む媒体を流す段階，
（ｄ）それにより，検査対象物をラベルされた抗原と置
換する段階，および，（ｅ）置換されたラベルされた抗
原を，ラベルに応じた検出器を用いて検出する段階を具
備する。
また本発明は流量免疫センサによって達成され，この
免疫センサは，免疫センサを通して試料を移動させるた
め免疫センサ通して流れている液体ストリーム，液体ス
トリームに試料を導入する受容手段，免疫センサを通る
液体ストリームを移動させる流量制御手段，試料受容手
段に接続された交換器であってその中において試料が検
査対象物のラベルされた抗原と接触され，そして，存在
する任意の検査対象物がラベルされた抗原と置換できる
もの，遊離した状態のラベルされた任意の抗原を検出す
るための交換器に接続された検出装置，および，検出装
置から排出される排気物を処分しまたは回収する検出装
置に接続された処分手段を具備する。
免疫センサは，免疫センサを通して試料を移動させるた
め免疫センサ通して流れている液体ストリーム，液体ス
トリームに試料を導入する受容手段，免疫センサを通る
液体ストリームを移動させる流量制御手段，試料受容手
段に接続された交換器であってその中において試料が検
査対象物のラベルされた抗原と接触され，そして，存在
する任意の検査対象物がラベルされた抗原と置換できる
もの，遊離した状態のラベルされた任意の抗原を検出す
るための交換器に接続された検出装置，および，検出装
置から排出される排気物を処分しまたは回収する検出装
置に接続された処分手段を具備する。
交換器は支持体を包含するチャンバを具備する。抗体
は支持体に固定化される。その抗体は特異的に高感度で
検査対象物を認識する。ラベルされた抗原は固定化され
た抗体に結合する。ここでは当該技術において使用され
る任意のラベルが使用できるが，放射性または蛍光ラベ
ルが好適である。ラベルされた抗原は検査対象物の存在
において置換されうる。
は支持体に固定化される。その抗体は特異的に高感度で
検査対象物を認識する。ラベルされた抗原は固定化され
た抗体に結合する。ここでは当該技術において使用され
る任意のラベルが使用できるが，放射性または蛍光ラベ
ルが好適である。ラベルされた抗原は検査対象物の存在
において置換されうる。
検出装置はラベルの各形式ごとに異なる。ラベルが放
射性ラベルであるとき，検出器は少なくとも放射能検出
器を包含し，その放射能検出器は検出された放射線の量
を表示する。蛍光ラベルが使用されるとき，検出装置
は，少なくとも，蛍光性色素でラベルされた抗原を，蛍
光させるために励起する光源と，発生された蛍光を検出
し，蛍光強度を表示する読み出し手段を包含する。
射性ラベルであるとき，検出器は少なくとも放射能検出
器を包含し，その放射能検出器は検出された放射線の量
を表示する。蛍光ラベルが使用されるとき，検出装置
は，少なくとも，蛍光性色素でラベルされた抗原を，蛍
光させるために励起する光源と，発生された蛍光を検出
し，蛍光強度を表示する読み出し手段を包含する。
装置はまた，液体ストリームを形成しその方法と装置
を通して試料を輸送する液体を保持する容器を包含す
る。最後に，免疫センサはその装置を流れる流体を処理
しまたはリサイクルさせる手段を包含する。
を通して試料を輸送する液体を保持する容器を包含す
る。最後に，免疫センサはその装置を流れる流体を処理
しまたはリサイクルさせる手段を包含する。
図面の簡単な記述 本発明のより完全な理解が下記の好適実施例の記述お
よび添付図面に関連づけて得られるのであり，これらの
図面において，異なる図面における類似の符号は同じ構
造または要素を示す。各々の図面における表記は図解的
なものであり，実際の寸法または詳細な比率を示してい
るものではない。
よび添付図面に関連づけて得られるのであり，これらの
図面において，異なる図面における類似の符号は同じ構
造または要素を示す。各々の図面における表記は図解的
なものであり，実際の寸法または詳細な比率を示してい
るものではない。
図１は本発明の実施例を形成する装置の平面図であ
る。
る。
図２は本発明の実施例の交換器の詳細な図面である。
図３は自由な抗原によるラベルされた抗原の置換を図
解するチャートである。
解するチャートである。
図４は抗体密度の効果を信号発生に基づいて示すグラ
フである。
フである。
図５はモデル抗原の検出の感度を図解するストリップ
チャート記録の再生である。
チャート記録の再生である。
発明を実施する形態 抗体は，それらの本来の特異性により，バイオセンサ
における検出素子として使用するための自然な候補であ
る。抗体が使用されているバイオセンサは免疫センサと
して分類される。
における検出素子として使用するための自然な候補であ
る。抗体が使用されているバイオセンサは免疫センサと
して分類される。
本発明の方法と免疫センサは，既存の方法に関係する
メカニズムとは異なるメカニズムを介して動作するもの
と信じられている。用語「免疫センサ」はここでは，そ
れが装置またはデバイスに組み込まれるとき，本発明の
一部をさすものとして，使用される。
メカニズムとは異なるメカニズムを介して動作するもの
と信じられている。用語「免疫センサ」はここでは，そ
れが装置またはデバイスに組み込まれるとき，本発明の
一部をさすものとして，使用される。
固定化された抗体に対する抗原の結合は，最初の数時
間内は基本的に不可逆であるように考えられている（St
enbergら,J.Immunol.Methods,113,p.3（1988））。した
がって，（抗体のモルに対して相対的に）少量の抗原が
液体の連続的な流れの中で検出されることがわかったこ
とは驚きであった。
間内は基本的に不可逆であるように考えられている（St
enbergら,J.Immunol.Methods,113,p.3（1988））。した
がって，（抗体のモルに対して相対的に）少量の抗原が
液体の連続的な流れの中で検出されることがわかったこ
とは驚きであった。
本発明の方法においては，ラベルされた抗原の置換
が，非平衡状態においても数秒間で起こる。本発明の方
法の反応メカニズムは，定常状態の系における固定化さ
れた抗原と抗体との複合体についての反応メカニズムに
は従わないことが想定される。検出方法は，予め結合が
形成されているラベルされた複合物に対する，類似また
は同等な抗原サイトによる置換に基づいており，ただ単
にカラムに対する抗原の結合に基づくものでない。置換
反応は従来技術の単純な平衡状態の結合を必ずしも反映
しない。それは，検査対象分子には，抗体とラベルされ
た抗原との複合体の近傍において，平衡状態に達するま
での十分な時間が与えられていないためである。本発明
の方法と免疫センサは，抗体と抗原との会合に代えて，
抗体の結合サイトからの抗原の解離に基づいたものであ
る。
が，非平衡状態においても数秒間で起こる。本発明の方
法の反応メカニズムは，定常状態の系における固定化さ
れた抗原と抗体との複合体についての反応メカニズムに
は従わないことが想定される。検出方法は，予め結合が
形成されているラベルされた複合物に対する，類似また
は同等な抗原サイトによる置換に基づいており，ただ単
にカラムに対する抗原の結合に基づくものでない。置換
反応は従来技術の単純な平衡状態の結合を必ずしも反映
しない。それは，検査対象分子には，抗体とラベルされ
た抗原との複合体の近傍において，平衡状態に達するま
での十分な時間が与えられていないためである。本発明
の方法と免疫センサは，抗体と抗原との会合に代えて，
抗体の結合サイトからの抗原の解離に基づいたものであ
る。
先に引用したIvesらは，非標識抗原による標識抗原の
置換について，平衡状態での交換反応であるという仮定
に基づいて，簡単に議論している。抗原が１価で低分子
量である限り,Ivesらは交換が15〜20分以内で完了に到
達することを結論している。ここで記述するシステムに
おいては，置換は数秒で起こる。
置換について，平衡状態での交換反応であるという仮定
に基づいて，簡単に議論している。抗原が１価で低分子
量である限り,Ivesらは交換が15〜20分以内で完了に到
達することを結論している。ここで記述するシステムに
おいては，置換は数秒で起こる。
本発明の方法および，流量免疫センサということもで
きる免疫センサの目的は，特定的な化学物または微生物
学的な試料（抗原）の存在に関する環境を連続的に監視
することにより検査対象物の存在をほとんど瞬間的に指
示することを提供することにある。その方法と免疫セン
サは複数の化学品または試料を同時に監視するのに使用
できる。
きる免疫センサの目的は，特定的な化学物または微生物
学的な試料（抗原）の存在に関する環境を連続的に監視
することにより検査対象物の存在をほとんど瞬間的に指
示することを提供することにある。その方法と免疫セン
サは複数の化学品または試料を同時に監視するのに使用
できる。
本発明は疑いのある材料の流れが連続するということ
が期待されている状況に限定されない。本発明の概念
は，「流れ（stream,ストリーム）」として流れている
中から試料を取り出して事象とは分離してそれを分析す
ることに代えて，実時間で変化を監視することを可能に
することにある。もちろん，本発明の方法とデバイス
は,1つの特定的な試料の，また，試料ごとに液体流量ス
トリームの中に注入することにより，複数の別個な試料
の分析または検査に使用することができる。換言すれ
ば，単一または複数の試料がこの発明の免疫センサにお
いてこの発明の方法によって処理されて，それらの試料
の迅速な分析が行われる。
が期待されている状況に限定されない。本発明の概念
は，「流れ（stream,ストリーム）」として流れている
中から試料を取り出して事象とは分離してそれを分析す
ることに代えて，実時間で変化を監視することを可能に
することにある。もちろん，本発明の方法とデバイス
は,1つの特定的な試料の，また，試料ごとに液体流量ス
トリームの中に注入することにより，複数の別個な試料
の分析または検査に使用することができる。換言すれ
ば，単一または複数の試料がこの発明の免疫センサにお
いてこの発明の方法によって処理されて，それらの試料
の迅速な分析が行われる。
一般的に，本発明の方法は，試料受容手段から交換領
域を介して液体のストリームを流させることを含み，交
換領域はラベルされた抗原を含み，その抗原は，検査対
象物に対して特異的な固定化されている抗体に結合され
ている。抗原および抗体はそれらが流れている液体には
反応しないようものを用いる。交換領域を通過する流路
に続けて，液体は，ラベルされた抗原が存在すれば，ラ
ベルを検出することが可能な検出装置を通過する。
域を介して液体のストリームを流させることを含み，交
換領域はラベルされた抗原を含み，その抗原は，検査対
象物に対して特異的な固定化されている抗体に結合され
ている。抗原および抗体はそれらが流れている液体には
反応しないようものを用いる。交換領域を通過する流路
に続けて，液体は，ラベルされた抗原が存在すれば，ラ
ベルを検出することが可能な検出装置を通過する。
この方法を動作させるため，試料が液体の流れの中に
注入され，交換領域を通過する。あるいは，試料は，液
体の容積内に分散させられ，この液体の容積が試料とし
て流れている流れの中に導入される。さらに他の実施例
においては，試料が液体の容積の中に分散させられ，こ
の液体の容積が液体が流れているストリームとして使用
される。もし，試料が検査対象物を含む場合，その検査
対象物はラベルされた抗原と置換し，置換されたラベル
されている抗原は，液体の中を流れて検出装置を通過し
て検出される。試料を有するまたは試料を有しない液体
は検出装置から処分領域または適切に処理される再生領
域に流れる。
注入され，交換領域を通過する。あるいは，試料は，液
体の容積内に分散させられ，この液体の容積が試料とし
て流れている流れの中に導入される。さらに他の実施例
においては，試料が液体の容積の中に分散させられ，こ
の液体の容積が液体が流れているストリームとして使用
される。もし，試料が検査対象物を含む場合，その検査
対象物はラベルされた抗原と置換し，置換されたラベル
されている抗原は，液体の中を流れて検出装置を通過し
て検出される。試料を有するまたは試料を有しない液体
は検出装置から処分領域または適切に処理される再生領
域に流れる。
本発明において使用される液体は水，バッファ，およ
び，水性希釈試料（aqueous sample diluents）であ
る。好適なバッファはたとえば，リン酸緩衝溶液（PBS
緩衝液;phosphate−buffered salin），ホウ酸緩衝生理
食塩水（botate−buffered saline）,TRISサリン,Alsei
ver緩衝液，およびリンガー液などである。生物学的に
利用される緩衝液については，「Buffers」（Donald G
uoffrey,American Hoechst Corporation,La Jolla,C
A（1983））に一般的に記述されている。液体が検査対
象物および処理過程に使用される試薬のための溶媒であ
る限り，そして，液体が検査対象物と，または本発明の
方法の試薬と，または免疫センサ装置の構成要素と，化
学的に反応しない限り，本発明に対して，明確な液体は
臨界的ではない。
び，水性希釈試料（aqueous sample diluents）であ
る。好適なバッファはたとえば，リン酸緩衝溶液（PBS
緩衝液;phosphate−buffered salin），ホウ酸緩衝生理
食塩水（botate−buffered saline）,TRISサリン,Alsei
ver緩衝液，およびリンガー液などである。生物学的に
利用される緩衝液については，「Buffers」（Donald G
uoffrey,American Hoechst Corporation,La Jolla,C
A（1983））に一般的に記述されている。液体が検査対
象物および処理過程に使用される試薬のための溶媒であ
る限り，そして，液体が検査対象物と，または本発明の
方法の試薬と，または免疫センサ装置の構成要素と，化
学的に反応しない限り，本発明に対して，明確な液体は
臨界的ではない。
本発明の方法における液体流れの流速は,1分間当たり
0.1〜2.0ミリリットルの間にあるべきであるが，好適に
は,1分間当たり0.3〜0.8ミリリットルの間である。最適
な流速は，ラベルされた抗原の測定可能な量の置換を発
生させるのに充分な範囲内で，交換器に検査対象物が滞
留する時間が最短となるようなものである。
0.1〜2.0ミリリットルの間にあるべきであるが，好適に
は,1分間当たり0.3〜0.8ミリリットルの間である。最適
な流速は，ラベルされた抗原の測定可能な量の置換を発
生させるのに充分な範囲内で，交換器に検査対象物が滞
留する時間が最短となるようなものである。
本発明において使用するために適用可能な抗体の拡張
範囲は商業的に有効であり，または，文献として利用可
能な調合（preparation）の方法の記述からなされる。L
inscottのディレトクリィ（“Linscott's Directory",
40 Glen Drive,Mill Valley,CA 94941）は，商業的
に利用可能な抗体の完全な単一のリストを提供する。そ
の文献に記載された任意の抗体は広範囲の検査対象物を
同定のため本発明の方法および免疫センサに使用され
る，または，適合される。
範囲は商業的に有効であり，または，文献として利用可
能な調合（preparation）の方法の記述からなされる。L
inscottのディレトクリィ（“Linscott's Directory",
40 Glen Drive,Mill Valley,CA 94941）は，商業的
に利用可能な抗体の完全な単一のリストを提供する。そ
の文献に記載された任意の抗体は広範囲の検査対象物を
同定のため本発明の方法および免疫センサに使用され
る，または，適合される。
その方法は体液の特定の成分を検出するために使用で
きる。特定の成分としてはたとえば，チロキシン，高密
度リポ蛋白質，低密度リポ蛋白質，コレステロール，ア
ルブミン，α−１ 抗トリプシン，β−２ ミクログロ
ブリン，セルロプラスミン,C1阻害物質,Clqおよび他の
補体成分,C−反応性蛋白質，α−２−肝蛋白質，クリオ
フィブリノーゲン，フェリチン，ミエリン塩基性蛋白
質，トランスフェリン，インシュリン，ヒト絨毛性性腺
刺激ホルモン，卵胞ホルモン（エストロゲン），黄体ホ
ルモン（プロゲステロン），または髄膜炎菌等の病原菌
由来の抗原，例えば，インフルエンザ菌，髄膜炎菌，肺
炎桿菌，百日咳菌，ボレリア・ブルグドルフエリ（Borr
elia burgdorferi）（リメの病原菌（Lyme's diseas
e）），ブドウ状球菌，連鎖球菌などがある。
きる。特定の成分としてはたとえば，チロキシン，高密
度リポ蛋白質，低密度リポ蛋白質，コレステロール，ア
ルブミン，α−１ 抗トリプシン，β−２ ミクログロ
ブリン，セルロプラスミン,C1阻害物質,Clqおよび他の
補体成分,C−反応性蛋白質，α−２−肝蛋白質，クリオ
フィブリノーゲン，フェリチン，ミエリン塩基性蛋白
質，トランスフェリン，インシュリン，ヒト絨毛性性腺
刺激ホルモン，卵胞ホルモン（エストロゲン），黄体ホ
ルモン（プロゲステロン），または髄膜炎菌等の病原菌
由来の抗原，例えば，インフルエンザ菌，髄膜炎菌，肺
炎桿菌，百日咳菌，ボレリア・ブルグドルフエリ（Borr
elia burgdorferi）（リメの病原菌（Lyme's diseas
e）），ブドウ状球菌，連鎖球菌などがある。
本発明の方法と免疫センサの重要な機能は，決定が実
時間で行われることにある。このことは，体液，およ
び，テオフィリン，ジゴキシン,L−ドーパ，インシュリ
ン，コカインとその代謝物，大麻代謝物，ヘロインまた
はモルヒネ代謝物などの治療薬および乱用（誤用）して
いる薬品の試料の瞬間的な評価を可能にする。これらの
治療薬および乱用されている薬は適切な抗体およびラベ
ルされた抗原を包含している交換器を介して流れるスト
リームの中に試料を注入または溶解させることにより試
料ごとに監視できる。
時間で行われることにある。このことは，体液，およ
び，テオフィリン，ジゴキシン,L−ドーパ，インシュリ
ン，コカインとその代謝物，大麻代謝物，ヘロインまた
はモルヒネ代謝物などの治療薬および乱用（誤用）して
いる薬品の試料の瞬間的な評価を可能にする。これらの
治療薬および乱用されている薬は適切な抗体およびラベ
ルされた抗原を包含している交換器を介して流れるスト
リームの中に試料を注入または溶解させることにより試
料ごとに監視できる。
最も大事なことは，危険な材料の蒸気および不法なド
ラッグ,TNT,RDX,PETN,または他の爆発物などの種々の爆
発物，または，生物学的または化学的媒体，毒素，ニト
ロベンゼン，イソチオシアネート，および，その他の水
および大気汚染物の痕跡や蒸気を検出するため，包囲し
ている空気または水などの環境が，連続的に監視され得
ることである。
ラッグ,TNT,RDX,PETN,または他の爆発物などの種々の爆
発物，または，生物学的または化学的媒体，毒素，ニト
ロベンゼン，イソチオシアネート，および，その他の水
および大気汚染物の痕跡や蒸気を検出するため，包囲し
ている空気または水などの環境が，連続的に監視され得
ることである。
本発明の方法と免疫センサは，醗酵処理または酵素に
よる物質の変換の監視にも使用できる。
よる物質の変換の監視にも使用できる。
本発明の方法の主要な利益は，流れる流体以外の試薬
が，もし「ヒット」として参照されるポジティブな結果
が検出されない限り，使い果たされないことにある。こ
の方法を自動化する装置の適切な設計によると，「ヒッ
ト」が存在するまでバッファが繰り返して使用できる。
「ヒット」に続けて交換領域が置換される，または再生
される。
が，もし「ヒット」として参照されるポジティブな結果
が検出されない限り，使い果たされないことにある。こ
の方法を自動化する装置の適切な設計によると，「ヒッ
ト」が存在するまでバッファが繰り返して使用できる。
「ヒット」に続けて交換領域が置換される，または再生
される。
交換領域を再生するため，ラベルされた抗原を過剰に
含む流体が交換領域に導入される。ラベルされた抗原が
ラベルされていない検査対象物と交換し，抗体の結合サ
イトを飽和させる。再生は平衡的な交換反応であるか
ら，ラベルされた抗原のバッファ内濃度はできるだけ高
くするべきであり，交換領域内のラベルされた抗原の滞
留時間は完全な交換を促進させるべくできるだけ長くす
るべきである。
含む流体が交換領域に導入される。ラベルされた抗原が
ラベルされていない検査対象物と交換し，抗体の結合サ
イトを飽和させる。再生は平衡的な交換反応であるか
ら，ラベルされた抗原のバッファ内濃度はできるだけ高
くするべきであり，交換領域内のラベルされた抗原の滞
留時間は完全な交換を促進させるべくできるだけ長くす
るべきである。
この方法と免疫センサは抗原抗体間の結合の可逆性に
依存する。ラベルされた抗原の複合体は，水溶性が維持
されている限り，種々の化学組成を有し得る。ラベルさ
れた分子の抗原サイトは検出されるべき抗原と同一であ
る必要はない。ラベルされた抗原に対する，抗体との結
合を阻害しないが結合の親和性を減少させるような修飾
は，置換反応を実際に強調させうるし，その結果とし
て，システムの感度を向上させ得る。
依存する。ラベルされた抗原の複合体は，水溶性が維持
されている限り，種々の化学組成を有し得る。ラベルさ
れた分子の抗原サイトは検出されるべき抗原と同一であ
る必要はない。ラベルされた抗原に対する，抗体との結
合を阻害しないが結合の親和性を減少させるような修飾
は，置換反応を実際に強調させうるし，その結果とし
て，システムの感度を向上させ得る。
「展開」時間なしで迅速に検出され得る任意のラベル
が使用できる。ラベルは，放射性ラベル，蛍光性色素，
色素，電子能動性（electroactive）グループおよび電
子スピンラベルを包含するが，これらに限定されない。
好適なものは，放射性ラベルおよび蛍光ラベルである。
放射性廃棄物の処分の困難性により，蛍光ラベルが最も
好適である。
が使用できる。ラベルは，放射性ラベル，蛍光性色素，
色素，電子能動性（electroactive）グループおよび電
子スピンラベルを包含するが，これらに限定されない。
好適なものは，放射性ラベルおよび蛍光ラベルである。
放射性廃棄物の処分の困難性により，蛍光ラベルが最も
好適である。
蛍光ラベルされた抗原複合体の２つの特徴は感度を最
大にするために臨界的である。まず，蛍光性抗原複合体
はカラムマトリクスにまたは流量経路内の任意の組成に
直接固着させてはならない。第２に，最も高い感度のた
めに，蛍光ラベルされた分子ごとにただ１つの抗原サイ
トが好適である。複数の抗原サイトを包含する複合体を
用いてもよいが，感度はさほど良好でない。
大にするために臨界的である。まず，蛍光性抗原複合体
はカラムマトリクスにまたは流量経路内の任意の組成に
直接固着させてはならない。第２に，最も高い感度のた
めに，蛍光ラベルされた分子ごとにただ１つの抗原サイ
トが好適である。複数の抗原サイトを包含する複合体を
用いてもよいが，感度はさほど良好でない。
流量免疫センサの原理的な部分は，（１）対象とする
抗原に対して選択的に生物学的認識する，固定化された
抗体を包含するコラムおよび支持体，（２）ラベルされ
た抗原複合体，および，（３）流量監視システムまたは
検出器である。もちろん，完全に動作可能な免疫センサ
装置を構成させるには接続管，ポンプおよび弁などの補
助的な装置を必要とするが，ひとたび本発明の原理が理
解されれば，補助的な装置などの接続手段は通常の方法
で行われる。特定的な構成要素は，本発明の方法の試薬
を干渉しないまたは汚染しない材料で製造されなければ
ならない。必要とされているので，そして，そのような
デバイスについての知られている従来の方法のように，
コンピュータハードウエアおよびソフトウエアがそのシ
ステムを自動化するのに付加できる。
抗原に対して選択的に生物学的認識する，固定化された
抗体を包含するコラムおよび支持体，（２）ラベルされ
た抗原複合体，および，（３）流量監視システムまたは
検出器である。もちろん，完全に動作可能な免疫センサ
装置を構成させるには接続管，ポンプおよび弁などの補
助的な装置を必要とするが，ひとたび本発明の原理が理
解されれば，補助的な装置などの接続手段は通常の方法
で行われる。特定的な構成要素は，本発明の方法の試薬
を干渉しないまたは汚染しない材料で製造されなければ
ならない。必要とされているので，そして，そのような
デバイスについての知られている従来の方法のように，
コンピュータハードウエアおよびソフトウエアがそのシ
ステムを自動化するのに付加できる。
図１はそのシステムの異なる構成を示すために使用さ
れる図解図である。流体は容器11に収容されている。流
体は容器11から流れて管22を通ってそして適切な制御弁
21を通って適切なポンプ19に流れ込む。ポンプ19はその
システムを汚染させることなしにそのシステムを介して
定常的な流速で比較的少量の液体を移動させることが可
能な形式のものである。
れる図解図である。流体は容器11に収容されている。流
体は容器11から流れて管22を通ってそして適切な制御弁
21を通って適切なポンプ19に流れ込む。ポンプ19はその
システムを汚染させることなしにそのシステムを介して
定常的な流速で比較的少量の液体を移動させることが可
能な形式のものである。
試料受容手段13もまた管15を介して弁21に接続されて
いる。受容手段は免疫センサの適用に依存して複数の形
態をとり得る。１つの実施例において,13は流体容器で
あり得り，その容器の中で試料が溶解されそのシステム
としての装置内に，または，より少量の液体において，
シリンジまたは注入ループによって容器11から到来する
液体の流れに加算される試料としての装置内に供給され
る。他の代替実施例においては，試料受容手段は，液体
「自動採取器（sipper）」または（ミッドウェスト研究
所によって製造されたSpincon などの）空気サンプリ
ング装置の形態であり得り，この装置は環境を連続的に
監視し，環境の試料を管22を流れる液体ストリームの中
に持ち込む。
いる。受容手段は免疫センサの適用に依存して複数の形
態をとり得る。１つの実施例において,13は流体容器で
あり得り，その容器の中で試料が溶解されそのシステム
としての装置内に，または，より少量の液体において，
シリンジまたは注入ループによって容器11から到来する
液体の流れに加算される試料としての装置内に供給され
る。他の代替実施例においては，試料受容手段は，液体
「自動採取器（sipper）」または（ミッドウェスト研究
所によって製造されたSpincon などの）空気サンプリ
ング装置の形態であり得り，この装置は環境を連続的に
監視し，環境の試料を管22を流れる液体ストリームの中
に持ち込む。
ポンプ19から流体が弁23を介して管25a,b,および／ま
たは,cに流れる。弁23は転換（diverter）弁であり得
り，カラム35とカラム31またはダンプ45の間の流量を切
り換える，または，他の代替実施例においては，スプリ
ッタ弁であり得り，この弁は液体流量を35と31との間に
分割する。カラム31は絶対的に必要ではないが，誤った
正の信号に対する対照（コントロール）の観点から好適
な実施例である。ドレイン45は管25cおよび43を介して
弁23に接続され，カラム35および31から流れる流量を転
換する，または，システムをドレインする手段として存
在する。免疫センサの好適な形態において，弁23は交換
カラム35と対照（コントロール）カラム31との間の試料
を分離する。交換カラム35および対照カラム31はある特
定的な形状としては必要とされないが，管，カラムまた
は任意の形状の容器であり得り，この容器が支持体33を
包含し，液体ストリームのための通路を提供し，支持体
とこの支持体に固定化されている抗体とを接触させる。
たは,cに流れる。弁23は転換（diverter）弁であり得
り，カラム35とカラム31またはダンプ45の間の流量を切
り換える，または，他の代替実施例においては，スプリ
ッタ弁であり得り，この弁は液体流量を35と31との間に
分割する。カラム31は絶対的に必要ではないが，誤った
正の信号に対する対照（コントロール）の観点から好適
な実施例である。ドレイン45は管25cおよび43を介して
弁23に接続され，カラム35および31から流れる流量を転
換する，または，システムをドレインする手段として存
在する。免疫センサの好適な形態において，弁23は交換
カラム35と対照（コントロール）カラム31との間の試料
を分離する。交換カラム35および対照カラム31はある特
定的な形状としては必要とされないが，管，カラムまた
は任意の形状の容器であり得り，この容器が支持体33を
包含し，液体ストリームのための通路を提供し，支持体
とこの支持体に固定化されている抗体とを接触させる。
それが試料とラベルづけされた抗原との間の良好な接
触時間を許可し，この免疫センサまたは方法におけるラ
ベル，検査対象物または他の材料と相互に作用をしない
限り，これらのカラム35および31の容積の形状は臨界的
ではない。好適には，ガラス，テフロンまたはステンレ
ススチールなどの化学的に不活性で硬い材料で製造され
たカラムを使用することが好適である。カラム内に保持
されている液体の容量は臨界的ではないが，交換可能な
微小カラムを使用するには，好適な構造としては容積が
0.1〜0.5mlであることが好適である。流量免疫センサは
小型に可搬式に製造できる。ほぼ200μｌベッド容積の
カラムが多くの適用に対して充分である。
触時間を許可し，この免疫センサまたは方法におけるラ
ベル，検査対象物または他の材料と相互に作用をしない
限り，これらのカラム35および31の容積の形状は臨界的
ではない。好適には，ガラス，テフロンまたはステンレ
ススチールなどの化学的に不活性で硬い材料で製造され
たカラムを使用することが好適である。カラム内に保持
されている液体の容量は臨界的ではないが，交換可能な
微小カラムを使用するには，好適な構造としては容積が
0.1〜0.5mlであることが好適である。流量免疫センサは
小型に可搬式に製造できる。ほぼ200μｌベッド容積の
カラムが多くの適用に対して充分である。
支持体33は分析される材料に対して中性的である材料
で製造されなければならず，この支持体は誤ったポジテ
ィブな信号または誤ったネガティブな信号を生成しな
い。好適な材料は,Sigmaから提供されているセファロー
ス（Sepharose ）などの，活性化されたポリサッカラ
イドビーズである。とりわけ他の適切な材料はシリコ
ン，ガラスビーズ，中空のファイバまたは活性化された
ポリマーである。支持体は交換コラム35および対照コラ
ム31の両者内に存在する。さらなる代替実施例において
は，中空のファイバまたは毛細管の束が管と支持体とし
て同時に提供されうる。サポートとして作用する管の表
面面積と流体を通過させる通路として作用する束におけ
るまたはその周囲における通路である。
で製造されなければならず，この支持体は誤ったポジテ
ィブな信号または誤ったネガティブな信号を生成しな
い。好適な材料は,Sigmaから提供されているセファロー
ス（Sepharose ）などの，活性化されたポリサッカラ
イドビーズである。とりわけ他の適切な材料はシリコ
ン，ガラスビーズ，中空のファイバまたは活性化された
ポリマーである。支持体は交換コラム35および対照コラ
ム31の両者内に存在する。さらなる代替実施例において
は，中空のファイバまたは毛細管の束が管と支持体とし
て同時に提供されうる。サポートとして作用する管の表
面面積と流体を通過させる通路として作用する束におけ
るまたはその周囲における通路である。
抗体37は支持体33に結合されており，ラベルされた抗
原39により飽和されている。交換コラム35は対象物用の
抗体および抗原を包含する。対照カラム31は試料には含
まれていない検査対象物用の抗体および抗原を包含す
る。一方，交換コラム35および対照コラム31の両者にお
いて，ラベル，支持体，および，コラム材料は同じであ
る。
原39により飽和されている。交換コラム35は対象物用の
抗体および抗原を包含する。対照カラム31は試料には含
まれていない検査対象物用の抗体および抗原を包含す
る。一方，交換コラム35および対照コラム31の両者にお
いて，ラベル，支持体，および，コラム材料は同じであ
る。
図１および図２に図解したように，その動作におい
て，検査対象物抗原が交換コラム35に入り込み，抗体37
からラベルされた抗原39を置換する。置換されたラベル
された抗原39はコラム35から流出し，管40を通ってその
存在が検出される検出器41に至る。廃棄物45は管43に伝
導され，処分され，適切に，リサイクルされる。同時
に，対照試料は対照コラム31を通り，非応答抗体に接触
し，それから管40aを通って流れて第２の検出器41aに到
り，この検出器にはなんの信号も期待されない。流れて
いる対照用液体は処分され得り，または,43および45を
通ってコラム35を通って流れる液体に対するものと同様
にリサイクルされる。
て，検査対象物抗原が交換コラム35に入り込み，抗体37
からラベルされた抗原39を置換する。置換されたラベル
された抗原39はコラム35から流出し，管40を通ってその
存在が検出される検出器41に至る。廃棄物45は管43に伝
導され，処分され，適切に，リサイクルされる。同時
に，対照試料は対照コラム31を通り，非応答抗体に接触
し，それから管40aを通って流れて第２の検出器41aに到
り，この検出器にはなんの信号も期待されない。流れて
いる対照用液体は処分され得り，または,43および45を
通ってコラム35を通って流れる液体に対するものと同様
にリサイクルされる。
検出器41とその同様な装置41aは蛍光光度計，分光光
度計，放射線検出器，または電極でありうるが，好適に
は，フローセル，および，流量制御，データ処理および
信号発生用のマイクロコンピュータが設けられた蛍光光
度計が望ましい。
度計，放射線検出器，または電極でありうるが，好適に
は，フローセル，および，流量制御，データ処理および
信号発生用のマイクロコンピュータが設けられた蛍光光
度計が望ましい。
カラム内で反応物の置換の実行は下記の段階を包含す
る：固体の支持体33に固定された抗体がまず過剰な抗原
に露出される。この過剰な抗原はラベルされており，そ
の結果としてラベルされた分子が抗体の利用可能な結合
サイトを占有する。抗体で被覆された支持体およびラベ
ルされた抗原が200μｌのカラムに装填され，ベースラ
インが安定になるまでバッファで洗浄される。このシス
テムに用いる代表的な流速は0.3〜0.8ml（ミリリット
ル）／分である。（ラベルされていない）抗原を含む検
査用試料がカラム全体を通過し，ラベルされた抗原が固
定されている抗体の結合サイトから遊離し，試料内の抗
原の濃度に比例した信号が発生される。その信号はフロ
ーセルを設けた検出器を介してラベルされた複合体の流
量ダウンストリームとして検出される。
る：固体の支持体33に固定された抗体がまず過剰な抗原
に露出される。この過剰な抗原はラベルされており，そ
の結果としてラベルされた分子が抗体の利用可能な結合
サイトを占有する。抗体で被覆された支持体およびラベ
ルされた抗原が200μｌのカラムに装填され，ベースラ
インが安定になるまでバッファで洗浄される。このシス
テムに用いる代表的な流速は0.3〜0.8ml（ミリリット
ル）／分である。（ラベルされていない）抗原を含む検
査用試料がカラム全体を通過し，ラベルされた抗原が固
定されている抗体の結合サイトから遊離し，試料内の抗
原の濃度に比例した信号が発生される。その信号はフロ
ーセルを設けた検出器を介してラベルされた複合体の流
量ダウンストリームとして検出される。
コラムは小さく，安価に，そして，交換可能に設計さ
れているため，廃棄可能であり，また，ラベルされた抗
原を過剰に流すことによってカラムを再生することも可
能である。この回復収容能力は溶解されている標準（ス
タンダード）の抗原を導入することによりそのシステム
の周期的な検査を可能にし，ポジティブな信号が発生さ
れることを確実にする。無関係な抗体およびそれに対応
するラベルされた分子を含むカラムは誤ったポジティブ
な信号の対照とするために使用できる（図１のカラム3
1）。試料の流れは，それが交換カラムを通過すると
き，分離され（図1,弁23）この対照コラムを通過する。
抗体から抗原の非特異的な遊離をもたらしうる任意の因
子（すなわち，熱，有機溶媒）は対照コラムおよび交換
コラムから信号を発生し得る。
れているため，廃棄可能であり，また，ラベルされた抗
原を過剰に流すことによってカラムを再生することも可
能である。この回復収容能力は溶解されている標準（ス
タンダード）の抗原を導入することによりそのシステム
の周期的な検査を可能にし，ポジティブな信号が発生さ
れることを確実にする。無関係な抗体およびそれに対応
するラベルされた分子を含むカラムは誤ったポジティブ
な信号の対照とするために使用できる（図１のカラム3
1）。試料の流れは，それが交換カラムを通過すると
き，分離され（図1,弁23）この対照コラムを通過する。
抗体から抗原の非特異的な遊離をもたらしうる任意の因
子（すなわち，熱，有機溶媒）は対照コラムおよび交換
コラムから信号を発生し得る。
そのデバイスの現在の改定版はスペクトロビジョン
（Spectrovision）から得られるブリーフケースサイズ
の蛍光光度計と一体化されているが，そのデバイスのそ
の部分はさらに小型に製造できる。小型のレーザも蛍光
光度計に一体化でき，感度を向上させる。オプションと
して，マイクロコンピュータを付加して弁およびポンプ
を制御し，データを処理し，出力データを発生できる。
（Spectrovision）から得られるブリーフケースサイズ
の蛍光光度計と一体化されているが，そのデバイスのそ
の部分はさらに小型に製造できる。小型のレーザも蛍光
光度計に一体化でき，感度を向上させる。オプションと
して，マイクロコンピュータを付加して弁およびポンプ
を制御し，データを処理し，出力データを発生できる。
抗原の存在のための連続的なストリームを監視するこ
とに加えて，交換カラムは大量の離散的な試料の自動分
析に関連づけて使用できる。たとえば，自動化された試
料シッパー（sippers）が存在し,96−ウェル・マイクロ
タイタ・プレートまたは並べられた管から流体を吸入す
ることができ，それらを流体の流れに導入できる。上記
した免疫センサに関連させて使用するとき，大量の離散
的な試料は非常に迅速にスクリーニングできる。
とに加えて，交換カラムは大量の離散的な試料の自動分
析に関連づけて使用できる。たとえば，自動化された試
料シッパー（sippers）が存在し,96−ウェル・マイクロ
タイタ・プレートまたは並べられた管から流体を吸入す
ることができ，それらを流体の流れに導入できる。上記
した免疫センサに関連させて使用するとき，大量の離散
的な試料は非常に迅速にスクリーニングできる。
本発明のこの免疫センサは，小さな分子を検出する競
合する免疫センサを魅力的に交代させる複数の特徴を有
している。第１に，ピコモル程度の抗原が最速度0.8ミ
リリットル／分程度の連続的な流速で検出できる。流れ
を停止させるべき絶対的な要求は存在しないから，抗原
置換反応が起こる。第２に，現れない信号が測定される
多くの競合する免疫センサに対して，置換反応は信号を
発生する。小さく，減少する信号を検出するよりもこの
装置の信号を検出することが容易である。第３に，この
センサ自体が比較的小型に製造でき，そして，大量の試
料を連続的に監視しまたはスクリーニングすることに都
合がよい。付加する試薬，実施のための混合工程，また
は，分析作業期間に行うべき操作が存在しない。最後
に，さらにこの方法と免疫センサとは，小さなならびに
大きな分子を含む広範囲の検査対象物の検出に適してい
る。
合する免疫センサを魅力的に交代させる複数の特徴を有
している。第１に，ピコモル程度の抗原が最速度0.8ミ
リリットル／分程度の連続的な流速で検出できる。流れ
を停止させるべき絶対的な要求は存在しないから，抗原
置換反応が起こる。第２に，現れない信号が測定される
多くの競合する免疫センサに対して，置換反応は信号を
発生する。小さく，減少する信号を検出するよりもこの
装置の信号を検出することが容易である。第３に，この
センサ自体が比較的小型に製造でき，そして，大量の試
料を連続的に監視しまたはスクリーニングすることに都
合がよい。付加する試薬，実施のための混合工程，また
は，分析作業期間に行うべき操作が存在しない。最後
に，さらにこの方法と免疫センサとは，小さなならびに
大きな分子を含む広範囲の検査対象物の検出に適してい
る。
本発明の記述によれば，下記の実施例が特定的な技法
を包含する本発明の特定的な適用を図解するように得ら
れるのであり，その技法は本発明を遂行するために使用
される。これらの特定的な実施例はこの適用において記
述した本発明の範囲を制限することを意図しない。
を包含する本発明の特定的な適用を図解するように得ら
れるのであり，その技法は本発明を遂行するために使用
される。これらの特定的な実施例はこの適用において記
述した本発明の範囲を制限することを意図しない。
実施例１ ジニトロフェノール（DNP）の検出 標準的な手続きを用いて抗体がトレシルクロライド化
セファロース4B（tresyl chloride−activated Sepharo
se 4B）（Sigma Chemical Co.Louis.MO.）に結合され
た。支持体に結合した蛋白質の量は,AhmadおよびSaleem
uddinによる，クマシーブルー分析を改良した固体支持
体上の蛋白質濃度決定法（Anal.Biochem.148,533〜541,
（1985））に従って決定された。固定化された抗体の利
用可能な抗原結合サイトを，放射ラベルまたはフルオレ
セインにより修飾されたDNP複合体と，少なくとも一晩,
4℃において振盪培養器でセファロースと振盪培養する
ことにより反応させた。これらの実施例において，その
結合体は，（名称を「Novel Sulfonated Oligomeric
Carriers for Fluorescent or Chemiluminescent
Labeling of Ligands」とするBredehorst,Ligler,K
usterbeckおよびVogelによる特許出願に関連して記述さ
れている）テトラ硫酸化インシュリンＡ鎖に結合されて
いるDNPからなっていた。DNP結合体は,3対１の抗体に対
するDNPのモル比率で付加された。使用に先立って直後
に，何本かのスラリーが除去され,30秒間マイクロ遠心
分離機で回転させられ，上清が除去され，そして，セフ
ァロースが0.1％ v/v Triton Ｘ−100（10mMフォス
フェート,0.15Mサリン，これは分析を通じて使用される
システムバッファである）を有するPBSバッファ内で再
び懸濁させられた。貯蔵するため,0.1％ v/vのアジ化
ナトリューム（sodium azide）が媒体に付加されて，バ
クテリアの成長を禁止させた。
セファロース4B（tresyl chloride−activated Sepharo
se 4B）（Sigma Chemical Co.Louis.MO.）に結合され
た。支持体に結合した蛋白質の量は,AhmadおよびSaleem
uddinによる，クマシーブルー分析を改良した固体支持
体上の蛋白質濃度決定法（Anal.Biochem.148,533〜541,
（1985））に従って決定された。固定化された抗体の利
用可能な抗原結合サイトを，放射ラベルまたはフルオレ
セインにより修飾されたDNP複合体と，少なくとも一晩,
4℃において振盪培養器でセファロースと振盪培養する
ことにより反応させた。これらの実施例において，その
結合体は，（名称を「Novel Sulfonated Oligomeric
Carriers for Fluorescent or Chemiluminescent
Labeling of Ligands」とするBredehorst,Ligler,K
usterbeckおよびVogelによる特許出願に関連して記述さ
れている）テトラ硫酸化インシュリンＡ鎖に結合されて
いるDNPからなっていた。DNP結合体は,3対１の抗体に対
するDNPのモル比率で付加された。使用に先立って直後
に，何本かのスラリーが除去され,30秒間マイクロ遠心
分離機で回転させられ，上清が除去され，そして，セフ
ァロースが0.1％ v/v Triton Ｘ−100（10mMフォス
フェート,0.15Mサリン，これは分析を通じて使用される
システムバッファである）を有するPBSバッファ内で再
び懸濁させられた。貯蔵するため,0.1％ v/vのアジ化
ナトリューム（sodium azide）が媒体に付加されて，バ
クテリアの成長を禁止させた。
ベット容積500μｌ（マイクロリットル）を有するカ
ラムを用いて放射性免疫分析が行われた。ベット容積20
0μｌの調製されたセファロースを有するカラムを用い
て蛍光免疫分析が行われた。カラムは7mmの内径を有
し，カラムの外部はガラスフリットである。バッファの
流れは，カラムの下流に，そして，適用可能な場合に
は，蛍光光度計の下流に接続されたペリスタポンプを用
いて確立された。それぞれの種々のカラム溶出液が集め
られたとき，これらはシンチレーションカウンタまたは
200マイクロリットルキュベットを装着したSLM 8000蛍
光光度計で分析された。連続的に監視するため，カラム
溶出液は,8マイクロリットルのフローセルおよび900Vに
設定された高電圧の光電子増倍管を設けたSpectrovisio
n蛍光光度計に導かれた。SLM 8000およびSpectrovisio
n蛍光光度計の両者には発光用に515nmのバンドパスフィ
ルタが設けられた。
ラムを用いて放射性免疫分析が行われた。ベット容積20
0μｌの調製されたセファロースを有するカラムを用い
て蛍光免疫分析が行われた。カラムは7mmの内径を有
し，カラムの外部はガラスフリットである。バッファの
流れは，カラムの下流に，そして，適用可能な場合に
は，蛍光光度計の下流に接続されたペリスタポンプを用
いて確立された。それぞれの種々のカラム溶出液が集め
られたとき，これらはシンチレーションカウンタまたは
200マイクロリットルキュベットを装着したSLM 8000蛍
光光度計で分析された。連続的に監視するため，カラム
溶出液は,8マイクロリットルのフローセルおよび900Vに
設定された高電圧の光電子増倍管を設けたSpectrovisio
n蛍光光度計に導かれた。SLM 8000およびSpectrovisio
n蛍光光度計の両者には発光用に515nmのバンドパスフィ
ルタが設けられた。
最も正確に置換を定量化するため，ラベルされたDNP
がヨウ化（iodinated）DNP結合体を用いた自由抗原によ
ってカラムから移送されうること示す初期研究を示す。
図３に示すデータは低レベルの自由抗原によってラベル
された抗原の置換を示す。第２および第３の抗原の導入
の後は，置換されたラベルされた抗原の量は減少する
が，しかしながら依然として測定可能である。
がヨウ化（iodinated）DNP結合体を用いた自由抗原によ
ってカラムから移送されうること示す初期研究を示す。
図３に示すデータは低レベルの自由抗原によってラベル
された抗原の置換を示す。第２および第３の抗原の導入
の後は，置換されたラベルされた抗原の量は減少する
が，しかしながら依然として測定可能である。
検出感度を向上させるために，装置を動作させる，な
らびに，ラベルされた抗原を生成する条件が試験され
た。試験されたシステム変数は固体支持体の上の抗体の
密度および流速を含んだ。増加した信号はより高い抗体
密度でみられ，その結果として，固定化された抗原密度
が高いことも判った（図４）。このことはたぶん，抗体
／ラベルされた抗原複合体に遭遇している遊離抗原のも
っともな増加を反映している。この特別な抗原／抗体結
合体の最適な流速はほぼ0.3ミリリットル／分であった
（表−１）。0.5ミリリットル／分においては，カラム
の流体下流内にはラベルされた抗原はより少なく検出さ
れた。流速を減少させると，増加した蛍光性抗原が検出
されたが，流速が0.1ミリリットル／分に接近したと
き，ラベルされた抗原は大きな容積にわたって分散し，
蛍光ピークが広がり，信号対ノイズ分解能が正確でなく
なった。
らびに，ラベルされた抗原を生成する条件が試験され
た。試験されたシステム変数は固体支持体の上の抗体の
密度および流速を含んだ。増加した信号はより高い抗体
密度でみられ，その結果として，固定化された抗原密度
が高いことも判った（図４）。このことはたぶん，抗体
／ラベルされた抗原複合体に遭遇している遊離抗原のも
っともな増加を反映している。この特別な抗原／抗体結
合体の最適な流速はほぼ0.3ミリリットル／分であった
（表−１）。0.5ミリリットル／分においては，カラム
の流体下流内にはラベルされた抗原はより少なく検出さ
れた。流速を減少させると，増加した蛍光性抗原が検出
されたが，流速が0.1ミリリットル／分に接近したと
き，ラベルされた抗原は大きな容積にわたって分散し，
蛍光ピークが広がり，信号対ノイズ分解能が正確でなく
なった。
システムを充分利用させるため，ラベルされた抗原の
置換が特異的な検査対象物抗原の存在にのみ起こること
が重要である。反応の特異性を確定するため，インシュ
リン，グリシン，リシン，スクロース,0.1％ Triton
Ｘ−100,および牛血清アルブミンを包含する混合物が交
換器に導入された。ラベルされた抗原は全くこれらでは
置換されなかった。
置換が特異的な検査対象物抗原の存在にのみ起こること
が重要である。反応の特異性を確定するため，インシュ
リン，グリシン，リシン，スクロース,0.1％ Triton
Ｘ−100,および牛血清アルブミンを包含する混合物が交
換器に導入された。ラベルされた抗原は全くこれらでは
置換されなかった。
代表的な実験においては，セファロース に結合され
たアンチDNPがまず放射ラベルされたDNP結合体と混合さ
れた。洗浄の後,500μｌのベッド容積のカラムが準備さ
れ，リシンに結合されたDNP（DNPリシン）がバッファス
トリームに導入され，放射能の決定のための溶出液が分
取されて集められた。試料の寸法は全体で4ngから12ng
のカラムに装填されたDNPリシンの範囲にあった（表−
２）。4ngのDNPリシンにおいて，信号は2xのバックグラ
ンド以下であり，これはこの分析の下限であるように決
定された。
たアンチDNPがまず放射ラベルされたDNP結合体と混合さ
れた。洗浄の後,500μｌのベッド容積のカラムが準備さ
れ，リシンに結合されたDNP（DNPリシン）がバッファス
トリームに導入され，放射能の決定のための溶出液が分
取されて集められた。試料の寸法は全体で4ngから12ng
のカラムに装填されたDNPリシンの範囲にあった（表−
２）。4ngのDNPリシンにおいて，信号は2xのバックグラ
ンド以下であり，これはこの分析の下限であるように決
定された。
400μｌの分画が集められ，その放射能がシンチレー
ションカウンタによって決定された。ピークの放射能が
報告された。
ションカウンタによって決定された。ピークの放射能が
報告された。
放射ラベルされたシグナル分子を用いた対象物抗原の
検出と同様に，蛍光色素でラベルされたシグナル分子が
またこの分析装置を用いることができる。セファロース
に結合された抗DNP抗体のカラムが準備された。放射
ラベルに代えて，シグナル分子としてフルオレセイン・
DNP結合体が用いられた。再び量を変化させたDNPリシン
が（0.3ミリリットル／分で）装置に導入され，ならび
に,DNPが存在しないリシンが特異性の対照として導入さ
れ，それらの結果を表−３に示す。これらの試験におい
て反復して行われた最小の検出可能な試料の寸法は200
μｌにおいて20ngのDNPリシンであった。
検出と同様に，蛍光色素でラベルされたシグナル分子が
またこの分析装置を用いることができる。セファロース
に結合された抗DNP抗体のカラムが準備された。放射
ラベルに代えて，シグナル分子としてフルオレセイン・
DNP結合体が用いられた。再び量を変化させたDNPリシン
が（0.3ミリリットル／分で）装置に導入され，ならび
に,DNPが存在しないリシンが特異性の対照として導入さ
れ，それらの結果を表−３に示す。これらの試験におい
て反復して行われた最小の検出可能な試料の寸法は200
μｌにおいて20ngのDNPリシンであった。
最後に，フルオレセイン/DNP/抗原／抗体ペア（抗体
親和力は10-7である）を用いて流量構成における装置の
感度水準は,0.35ミリリットル／分の最適流速を用いて
決定された。図５は代表的な試験を示す。抗原はできる
だけ低い,0.2ミリリットルにおける5ng（14x10-12モ
ル）の濃度で検出され得る。抗原のより高い濃度が予め
動作したものからラベルされた抗原の排出が現れる点に
いたるまで大きな釣り合った応答を発生した。しかしな
がら，注目すべきことは，予め25,50,100および250ngの
抗原を付加した後,250ngの試料が付加されたとき，顕著
なポジティブな信号が依然として発生されたことであ
る。
親和力は10-7である）を用いて流量構成における装置の
感度水準は,0.35ミリリットル／分の最適流速を用いて
決定された。図５は代表的な試験を示す。抗原はできる
だけ低い,0.2ミリリットルにおける5ng（14x10-12モ
ル）の濃度で検出され得る。抗原のより高い濃度が予め
動作したものからラベルされた抗原の排出が現れる点に
いたるまで大きな釣り合った応答を発生した。しかしな
がら，注目すべきことは，予め25,50,100および250ngの
抗原を付加した後,250ngの試料が付加されたとき，顕著
なポジティブな信号が依然として発生されたことであ
る。
実施例２ トリニトロトルエン（TNT）の検出 TNTに特異的なマウス・モノクローナルIgG抗体がセフ
ァロース に固定化された。利用可能な抗原結合サイト
がフルオレセイン化されたTNTにより飽和された。この
支持体は200μｌのベッド容積カラムを製造するのに使
用された。pH 7.6,0.1％ v/v Triton Ｘ−100を含
むPBSバッファ（10mMリン酸）のバッファ流量が確立さ
れた。溶出液がSpectron可搬式蛍光光度計に導入され，
この蛍光光度計の出力がストリップチャート記録装置に
記録された。安定なベースラインが得られた後,8μg/ミ
リリットルで200μｌのリシン試料が装置のヘッドに装
填され，この装置との特異的な親和性が検査されたが，
信号は得られなかった。次に,PBS−Triton内に200ngのT
NTを含む新鮮に準備された溶液の200μｌの試料がカラ
ムに導入された。２倍のベースラインよりも大きな信号
が一貫して発生された。その結果を表−４に要約する。
ァロース に固定化された。利用可能な抗原結合サイト
がフルオレセイン化されたTNTにより飽和された。この
支持体は200μｌのベッド容積カラムを製造するのに使
用された。pH 7.6,0.1％ v/v Triton Ｘ−100を含
むPBSバッファ（10mMリン酸）のバッファ流量が確立さ
れた。溶出液がSpectron可搬式蛍光光度計に導入され，
この蛍光光度計の出力がストリップチャート記録装置に
記録された。安定なベースラインが得られた後,8μg/ミ
リリットルで200μｌのリシン試料が装置のヘッドに装
填され，この装置との特異的な親和性が検査されたが，
信号は得られなかった。次に,PBS−Triton内に200ngのT
NTを含む新鮮に準備された溶液の200μｌの試料がカラ
ムに導入された。２倍のベースラインよりも大きな信号
が一貫して発生された。その結果を表−４に要約する。
この例示は本発明のアプローチが水性試料内のTNTを
特定的に検出できることを実証している。
特定的に検出できることを実証している。
蛍光を用いた連続流量における対象物の検出。流量比
率は0.32ミリリットル／分であり，ベッド容積は200μ
ｌであった。
率は0.32ミリリットル／分であり，ベッド容積は200μ
ｌであった。
実施例３ コカインの検出 コカインを検出するため，抗コカイン抗体（Bio Des
ign）およびフルオレセイン化されたベンゾイルエクゴ
ニンを用いて，上記のように,200μｌのベッド容積のカ
ラムが確立された。Spectrovisionおよび８μｌのフロ
ーセルを用いた連続的な流量条件下で，分析が行われ
た。種々のコカイン濃度および試料の容積がカラムに適
用された。表−４に要約したそれらの結果は,40ng未満
のコカインの検査対象物の量が免疫センサによって，信
号対ノイズ比率が5:1以上で，流量の流れに試料の導入
後に20秒以内で，検出できる。
ign）およびフルオレセイン化されたベンゾイルエクゴ
ニンを用いて，上記のように,200μｌのベッド容積のカ
ラムが確立された。Spectrovisionおよび８μｌのフロ
ーセルを用いた連続的な流量条件下で，分析が行われ
た。種々のコカイン濃度および試料の容積がカラムに適
用された。表−４に要約したそれらの結果は,40ng未満
のコカインの検査対象物の量が免疫センサによって，信
号対ノイズ比率が5:1以上で，流量の流れに試料の導入
後に20秒以内で，検出できる。
カラムベッド容積は抗体被覆された200μｌのセファ
ロース であり，バッファ流速は0.72ミリリットル／分
であった。
ロース であり，バッファ流速は0.72ミリリットル／分
であった。
本発明の免疫センサにおいて，蛍光性色素の付加また
は蛋白質の分解による抗体の修飾は必要ではない。その
ような修飾は，抗体活性の損失を招く可能性があり，抗
体親和性に影響を与える可能性がある。また，ヒット・
アンド・ラン装置が依存する（Gieseら，同書）ような
弱い抗体／抗原相互作用は，あまり発生しない。連続的
な流体系においては，ラベルされた一部分がカラムから
絶えず遊離して洗浄されるためである。
は蛋白質の分解による抗体の修飾は必要ではない。その
ような修飾は，抗体活性の損失を招く可能性があり，抗
体親和性に影響を与える可能性がある。また，ヒット・
アンド・ラン装置が依存する（Gieseら，同書）ような
弱い抗体／抗原相互作用は，あまり発生しない。連続的
な流体系においては，ラベルされた一部分がカラムから
絶えず遊離して洗浄されるためである。
明瞭なように，本発明の種々の修正および変形形態が
上述した技法に照らして可能である。したがって，添付
した特許請求の範囲において，本発明が特定的に記述し
た以外のものも実用化されることが理解されうる。
上述した技法に照らして可能である。したがって，添付
した特許請求の範囲において，本発明が特定的に記述し
た以外のものも実用化されることが理解されうる。
フロントページの続き (72)発明者 カスターベック，アン ダブリュー. アメリカ合衆国，22042，バージニア州, フォールズチャーチ，クインシー プレ イス 6428 (72)発明者 ウエンホフ，グレゴリー エイ. アメリカ合衆国，22110，バージニア州, マナサス，アパートメント 203，レジ メント ドライブ ７階 10323 (56)参考文献 特開 昭63−21560（ＪＰ，Ａ) 米国特許4277560（ＵＳ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 33/543 G01N 35/02
Claims (19)
- 【請求項１】（ａ）検査対象物に抗体特定物を提供する
段階， （ｂ）検査対象物のラベルされた類似のもの（analog）
に抗体の結合サイトを露出させてラベルされた抗原／抗
体複合物を形成する段階， （ｃ）ラベルされた抗原／抗体複合物を通過させて検査
対象物を含む液体媒体を流す段階， （ｄ）検査対象物をラベルされた類似物に置換させる段
階， （ｅ）置換されたラベルされた類似物を検出する段階，
および， （ｆ）ラベルされた抗原／抗体複合物を通過し，置換さ
れたラベルされた類似物が検出されない液体媒体を回収
し，再利用する段階 を具備する検査対象物の一部分を検出する方法。 - 【請求項２】検査対象物が，チロキシン，高密度リポ蛋
白，低密度リポ蛋白，コレステロール，アルブミン，α
−１ 抗トリプシン，β−２ ミクログロブリン，セル
ロプラスミン,C1阻害物質,Clq,C−反応性蛋白質，α−
２−肝蛋白質，クリオフィブリノーゲン，フェリチン，
ミエリン塩基性蛋白質，トランスフェリン，インシュリ
ン，ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン，卵胞ホルモン（エス
トロゲン），黄体ホルモン（プロゲステロン），または
髄膜炎菌等の病原菌由来の抗原，例えば，インフルエン
ザ菌，髄膜炎菌，肺炎桿菌，百日咳菌,Borroliaブルグ
ドルフエリ，ブドウ状球菌，連鎖球菌，テオフィリン，
ジゴキシン,L−ドーパ，インシュリン，コカインとその
代謝物，大麻代謝物，ヘロインまたはモルヒネ代謝物,T
NT,RDX,RETNまたは他の爆発物，生物学的戦争媒体，化
学的戦争媒体，トキシン，ニトロベンゼン，イソチオシ
アネート，水および大気汚染物，醗酵処理の要素，およ
び，基質の酵素による転換物からなるグループから選択
される請求項１記載の方法。 - 【請求項３】ラベルされた抗原／抗体複合体が水溶性で
あり，分子あたり１つの抗原反応サイトを有する請求項
１記載の方法。 - 【請求項４】ラベルされた複合体のラベルが，放射化ラ
ベル，蛍光性色素，色素，電子能動グループおよび電子
スピンラベルからなるグループから選択される請求項３
記載の方法。 - 【請求項５】ラベルされた複合体のラベルが，放射化ラ
ベルおよび蛍光性色素からなるグループから選択される
請求項４記載の方法。 - 【請求項６】液体媒体が水，バッファ，および，水性希
釈試料からなるグループから選択される請求項1,3〜５
のいずれかに記載の方法。 - 【請求項７】バッファが,PBSバッファ，ほう素バッファ
処理サリン,TRISサリン,Alseiverの溶液，および,Ringe
r液からなるグループから選択される請求項６記載の方
法。 - 【請求項８】液体媒体はほぼ0.1〜2.0ミリリットル／分
の比率で流れる請求項1,3,6のいずれかに記載の方法。 - 【請求項９】液体媒体はほぼ0.3〜0.8ミリリットル／分
の比率で流れる請求項８記載の方法。 - 【請求項１０】流量免疫センサであって，該センサが， 試料を収集する試料収集手段， 試料収集手段に接続された交換器であって下記のものを
具備するもの， 単一のチエンバ， チエンバ内の支持媒体， 媒体に固定化された抗体であって，該抗体が検査対象物
の特定性と感度を認識するもの， 抗体と抗原・抗体複合物を形成し，検査対象物によって
容易に置換されるラベルされた抗原， 収集装置への接続点からの最大流量経路距離の点におい
て交換器に接続された検出装置， 液体を収容する容器， 収集手段，収集装置，および，検出装置を介してそれぞ
れ液体を連続的に流す流量手段， 検出装置に接続され，検出装置から到来する廃棄物を処
分する、または検出装置から到来する検査対象物によっ
て置換されたラベルされた抗原を含有しない液体を再利
用のために収集する処分手段 を具備する流量免疫センサ。 - 【請求項１１】液体が水，バッファ，および，水性希釈
試料からなるグループから選択される請求項10記載のセ
ンサ。 - 【請求項１２】バッファが,PESバッファ，ほう素バッフ
ァ処理サリン,TRISサリン,Alseiverの溶液，および,Rin
ger液からなるグループから選択される請求項11記載の
センサ。 - 【請求項１３】ラベルされた抗原のラベルが，放射化ラ
ベル，蛍光性色素，色素，電子能動グループおよび電子
スピンラベルからなるグループから選択される請求項10
〜12のいずれかに記載のセンサ。 - 【請求項１４】ラベルされた抗原のラベルが，放射化ラ
ベルおよび蛍光性色素からなるグループから選択される
請求項10または12記載のセンサ。 - 【請求項１５】検出器が放射能を測定する手段および検
出された放射能の量を表示する手段を具備する請求項10
または14記載のセンサ。 - 【請求項１６】検出装置が少なくとも， 蛍光性色素を励起させて光を発生させる放射源，およ
び， 発生された光の量を検出し，読み出された光の量の指示
を表示する読み出す手段 を包含する請求項10または14記載のセンサ。 - 【請求項１７】ラベルされた抗原／抗体複合物を含有す
る検査対象物用交換器，および，この検査対象物用交換
器に並列に設けられた，検査対象物と異なる抗原／抗体
複合物を含有する対照用交換器を有する請求項10,11,14
〜16のいずれかに記載のセンサ。 - 【請求項１８】各交換器がほぼ0.1〜0.5ミリリットルの
容積を有する請求項10,16,17のいずれかに記載のセン
サ。 - 【請求項１９】支持体が，活性化されたポリサッカライ
ドビーズ，シリカビーズ，グラスビーズ，中空ファイ
バ，および，活性化されたポリマーからなるグループか
ら選択される請求項10,13,16,18のいずれかに記載のセ
ンサ。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US486,024 | 1990-02-23 | ||
| US07/486,024 US5183740A (en) | 1990-02-23 | 1990-02-23 | Flow immunosensor method and apparatus |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05504625A JPH05504625A (ja) | 1993-07-15 |
| JP3149947B2 true JP3149947B2 (ja) | 2001-03-26 |
Family
ID=23930306
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP50473091A Expired - Fee Related JP3149947B2 (ja) | 1990-02-23 | 1991-02-21 | 流量免疫センサ方法と装置 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5183740A (ja) |
| EP (1) | EP0517757B1 (ja) |
| JP (1) | JP3149947B2 (ja) |
| KR (1) | KR0171392B1 (ja) |
| CA (1) | CA2076748C (ja) |
| DE (1) | DE69131274T2 (ja) |
| DK (1) | DK0517757T3 (ja) |
| WO (1) | WO1991013354A1 (ja) |
Families Citing this family (121)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5376551A (en) * | 1991-03-12 | 1994-12-27 | University Of Utah Research Foundation | Apparatus for using fluorescently labeled ligands in studying interaction of a native ligand and its receptor |
| US5527686A (en) * | 1991-07-29 | 1996-06-18 | Serex, Inc. | Differential binding affinities and dissociation assays based thereon |
| US5370842A (en) * | 1991-11-29 | 1994-12-06 | Canon Kabushiki Kaisha | Sample measuring device and sample measuring system |
| DE4208732C2 (de) * | 1992-03-18 | 1995-04-27 | Abion Ohg | Einwegreaktionsgefäß für die Festphasenimmunanalytik und Verfahren zur Messung von über Immunreaktionen bestimmbaren Komponenten |
| DE4216696C2 (de) * | 1992-04-10 | 1995-01-26 | Deutsche Aerospace | Verfahren und Vorrichtung zur Empfindlichkeits- und Selektivitätssteigerung bei Immuno-Assays, Molekül-Rezeptor-, DNA-komplementär-DNA- und Gast-Wirtsmolekül-Wechselwirkungs-Assays |
| JPH0610900A (ja) * | 1992-04-27 | 1994-01-21 | Canon Inc | 液体移動方法及び移動装置ならびにこれを利用した測定装置 |
| US6664114B1 (en) | 1992-08-03 | 2003-12-16 | Sapidyne Instruments, Inc. | Solid phase assay for detection of ligands |
| US5372783A (en) * | 1992-08-03 | 1994-12-13 | Sapidyne, Inc. | Assay system |
| DE4229591C1 (de) * | 1992-09-04 | 1994-03-24 | Draegerwerk Ag | Immunologisches Verfahren zur Bestimmung eines Analyten |
| WO1994020855A1 (en) * | 1993-03-04 | 1994-09-15 | Sapidyne, Inc. | Assay flow apparatus and method |
| US5354654A (en) * | 1993-07-16 | 1994-10-11 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy | Lyophilized ligand-receptor complexes for assays and sensors |
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