JP3033774B2 - 成人ｔ細胞白血病ウィルス抗体検出用間接凝集反応試薬 - Google Patents
成人ｔ細胞白血病ウィルス抗体検出用間接凝集反応試薬Info
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- JP3033774B2 JP3033774B2 JP2169742A JP16974290A JP3033774B2 JP 3033774 B2 JP3033774 B2 JP 3033774B2 JP 2169742 A JP2169742 A JP 2169742A JP 16974290 A JP16974290 A JP 16974290A JP 3033774 B2 JP3033774 B2 JP 3033774B2
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は成人Ｔ細胞白血病ウィルス（以下HTLV−Ｉと
記す）を界面活性剤で処理して得られる成分とHTLV−Ｉ
を構成するenv gp−21蛋白質を感作した担体粒子を用い
るHTLV−Ｉ抗体検出用間接凝集反応試薬に関する。
記す）を界面活性剤で処理して得られる成分とHTLV−Ｉ
を構成するenv gp−21蛋白質を感作した担体粒子を用い
るHTLV−Ｉ抗体検出用間接凝集反応試薬に関する。
HTLV−Ｉは白血病の一種であるＴ細胞リンパ腫をひき
おこす原因ウィルスとして知られており、このウィルス
感染の有無を検査することは臨床上、疫学上及び輸血の
際において重要である。
おこす原因ウィルスとして知られており、このウィルス
感染の有無を検査することは臨床上、疫学上及び輸血の
際において重要である。
HTLV−Ｉ感染の有無を検査する方法としては、間接凝
集免疫測定法、螢光抗体法、酵素免疫測定法、放射免疫
測定法などが開発されており、その中でも間接凝集免疫
測定法は、測定を簡便かつ安価に測定することができる
点で優れている。HTLV−Ｉの測定に用いる間接凝集反応
試薬として、HTLV−Ｉを界面活性剤で処理し、得られる
成分を感作した担体粒子を用いる検査試薬（特開昭60−
44870号）がすでに知られている。
集免疫測定法、螢光抗体法、酵素免疫測定法、放射免疫
測定法などが開発されており、その中でも間接凝集免疫
測定法は、測定を簡便かつ安価に測定することができる
点で優れている。HTLV−Ｉの測定に用いる間接凝集反応
試薬として、HTLV−Ｉを界面活性剤で処理し、得られる
成分を感作した担体粒子を用いる検査試薬（特開昭60−
44870号）がすでに知られている。
しかしながら。従来の試薬は、測定に際し、検体が抗
体過剰である場合に、陽性検体であっても凝集が起こら
ないプロゾーン現象を生じることがあった。そのため、
陽性検体であっても陰性と判定されてしまう偽陰性の問
題を生じていた。
体過剰である場合に、陽性検体であっても凝集が起こら
ないプロゾーン現象を生じることがあった。そのため、
陽性検体であっても陰性と判定されてしまう偽陰性の問
題を生じていた。
本発明者等は、従来の欠点を克服すべく検討した結
果、HTLV−Ｉを構成する蛋白質の１つであるenv gp−21
蛋白質とHTLV−Ｉを界面活性剤で処理して得られる成分
を感作した担体粒子を用いるHTLV−Ｉ抗体検出用間接凝
集反応試薬がプロゾーン現象を抑制しうることを見出し
本発明を完成した。
果、HTLV−Ｉを構成する蛋白質の１つであるenv gp−21
蛋白質とHTLV−Ｉを界面活性剤で処理して得られる成分
を感作した担体粒子を用いるHTLV−Ｉ抗体検出用間接凝
集反応試薬がプロゾーン現象を抑制しうることを見出し
本発明を完成した。
本発明はHTLV−Ｉを界面活性剤で処理して得られる成
分とHTLV−Ｉを構成するenv gp−21蛋白質を感作した担
体粒子を用いるHTLV−Ｉ抗体検出用間接凝集反応試薬で
ある。
分とHTLV−Ｉを構成するenv gp−21蛋白質を感作した担
体粒子を用いるHTLV−Ｉ抗体検出用間接凝集反応試薬で
ある。
HTLV−Ｉを界面活性剤で処理して得られる成分を製造
するにあたっては、まずHTLV−Ｉ抗原を取得する必要が
あるが、HTLV−Ｉ抗原の取得するには、株化細胞を培養
し、培養液から細胞を分離してこの細胞から分離するか
又は培養上清からHTLV−Ｉを分離することにより取得す
ることができる。被化細胞としては、例えば、MT−２、
HUT−102等を用いることができる。
するにあたっては、まずHTLV−Ｉ抗原を取得する必要が
あるが、HTLV−Ｉ抗原の取得するには、株化細胞を培養
し、培養液から細胞を分離してこの細胞から分離するか
又は培養上清からHTLV−Ｉを分離することにより取得す
ることができる。被化細胞としては、例えば、MT−２、
HUT−102等を用いることができる。
培養液から細胞を分離してこの細胞から分離するに
は、培養後の培養液を遠心して集めた沈渣をトリス−塩
酸緩衝液−NaCl−EDTA、リン酸緩衝生理食塩溶液などで
洗浄した後、界面活性剤で処理することにより細胞及び
ウィルスを破壊して、この破壊した細胞及びウィルスの
遠心による沈殿物を除いた上清をウィルス抗原として用
いることができる。
は、培養後の培養液を遠心して集めた沈渣をトリス−塩
酸緩衝液−NaCl−EDTA、リン酸緩衝生理食塩溶液などで
洗浄した後、界面活性剤で処理することにより細胞及び
ウィルスを破壊して、この破壊した細胞及びウィルスの
遠心による沈殿物を除いた上清をウィルス抗原として用
いることができる。
また、培養上清からウィルスを取得する場合には、超
遠心密度勾配法によってHTLV−Ｉ画分を分離すればHTLV
−Ｉのみを分離することができ、この方法によればHTLV
−Ｉを高純度で取得することができる。分離したウィル
スは、通常、界面活性剤で破壊して抗原として用いる
が、ウィルスの増殖機能を失わせるだけでウィルス自体
を破壊することなく抗原として使用することもできる。
遠心密度勾配法によってHTLV−Ｉ画分を分離すればHTLV
−Ｉのみを分離することができ、この方法によればHTLV
−Ｉを高純度で取得することができる。分離したウィル
スは、通常、界面活性剤で破壊して抗原として用いる
が、ウィルスの増殖機能を失わせるだけでウィルス自体
を破壊することなく抗原として使用することもできる。
また、HTLV−Ｉを構成するenv gp−21蛋白質を取得す
るには、前記HTLV−Ｉを界面活性剤により処理して得ら
れる成分をレクチンクロマトグラフィーで精製すること
により得ることができる。
るには、前記HTLV−Ｉを界面活性剤により処理して得ら
れる成分をレクチンクロマトグラフィーで精製すること
により得ることができる。
上記抗原取得の際、使用することのできる界面活性剤
としては、ノニデットP40、トライトンΧ100等を挙げる
ことができる。
としては、ノニデットP40、トライトンΧ100等を挙げる
ことができる。
HTLV−Ｉを界面活性剤で処理して得られる成分及びen
v gp−21蛋白質を担体粒子に感作する方法は、化学結合
を生成させることにより行なう方法又は物理吸着によっ
て行なう方法を挙げることができ、例えば、タンニン
酸、グルタールアルデヒド、ビスジアゾベンジジン、ト
リレンジイソシアナート、ジフロロジニトロベンゼン、
カルボジイミド類、キノン類、塩化クロム等のいわゆる
カップリング剤を使用する方法により達成することがで
きる。
v gp−21蛋白質を担体粒子に感作する方法は、化学結合
を生成させることにより行なう方法又は物理吸着によっ
て行なう方法を挙げることができ、例えば、タンニン
酸、グルタールアルデヒド、ビスジアゾベンジジン、ト
リレンジイソシアナート、ジフロロジニトロベンゼン、
カルボジイミド類、キノン類、塩化クロム等のいわゆる
カップリング剤を使用する方法により達成することがで
きる。
試薬を調製するにあたっては、HTLV−Ｉを界面活性剤
で処理して得られる成分とenv gp−21蛋白質を所定量混
合し、上記方法を用いて同時に感作することにより行な
うことができる他、まず、HTLV−Ｉを界面活性剤で処理
して得られる成分又はenv gp−21蛋白質のいずれか一方
を感作し、次いで他方を感作するというように別々に感
作することにより行なうこともできる。さらに、それぞ
れの抗原成分のみからなる担体粒子を調製し、両担体粒
子を混合することにより本願発明の試薬とすることもで
きる。
で処理して得られる成分とenv gp−21蛋白質を所定量混
合し、上記方法を用いて同時に感作することにより行な
うことができる他、まず、HTLV−Ｉを界面活性剤で処理
して得られる成分又はenv gp−21蛋白質のいずれか一方
を感作し、次いで他方を感作するというように別々に感
作することにより行なうこともできる。さらに、それぞ
れの抗原成分のみからなる担体粒子を調製し、両担体粒
子を混合することにより本願発明の試薬とすることもで
きる。
担体粒子としては、ヒト、羊、ニワトリ等の動物の赤
血球、セラチア菌などの微生物菌体、ゼラチン粒子（特
開昭57−153658号）、ポリスチレンラテックス、カオリ
ン、炭末など、間接凝集免疫測定で用いられる粒子を使
用することができる。
血球、セラチア菌などの微生物菌体、ゼラチン粒子（特
開昭57−153658号）、ポリスチレンラテックス、カオリ
ン、炭末など、間接凝集免疫測定で用いられる粒子を使
用することができる。
実施例１ HTLV−Ｉ産生株化細胞であるHUT−102細胞を、ウシ胎
児血清を10％含有するRPMI−1640培地に接種し、５％炭
酸ガスを含む空気中で37℃、４日間培養した。この培養
液を20を3000rpmで10分間遠心して細胞を除去して上
清液を得た。この上清液を予め連続ゾーナルローター内
に作成した20〜55％の蔗糖密度勾配に重層し、循環しな
がら30000rpmで超遠心分離を行った。得られたウィルス
画分を再び遠心チューブ内に作成した20〜55％の連続密
度勾配に重層し、スイングローターにより25000rpmにて
４時間超遠心分離を行った。得られたウィルス画分を45
000rpmにて60分間遠心してウィルスを沈殿させ、この沈
殿に0.5％ノニデット−P40含リン酸緩衝生理食塩液を加
えた。沈殿を浮遊させ、氷水中で30分間攪拌して溶解さ
せ、13000rpm30分間遠心分離して得られた上清をHTLV−
Ｉ抗原とした。
児血清を10％含有するRPMI−1640培地に接種し、５％炭
酸ガスを含む空気中で37℃、４日間培養した。この培養
液を20を3000rpmで10分間遠心して細胞を除去して上
清液を得た。この上清液を予め連続ゾーナルローター内
に作成した20〜55％の蔗糖密度勾配に重層し、循環しな
がら30000rpmで超遠心分離を行った。得られたウィルス
画分を再び遠心チューブ内に作成した20〜55％の連続密
度勾配に重層し、スイングローターにより25000rpmにて
４時間超遠心分離を行った。得られたウィルス画分を45
000rpmにて60分間遠心してウィルスを沈殿させ、この沈
殿に0.5％ノニデット−P40含リン酸緩衝生理食塩液を加
えた。沈殿を浮遊させ、氷水中で30分間攪拌して溶解さ
せ、13000rpm30分間遠心分離して得られた上清をHTLV−
Ｉ抗原とした。
調製したHTLV−Ｉ抗原350ml（400μg/ml）を10mlトリ
ス−塩酸緩衝液（pH8.3）で透析し、10000rpmで10分間
高速遠心分離して得られた上清をトリス−塩酸緩衝液
（pH8.3）で平衡化したレンチル−レクチンアフィニテ
ィーカラムに充填し、前記緩衝液で洗浄した後、メチル
αＤマンノシドで溶出し、吸光度280nmの吸収を示す部
分を分取した。更に、得られた溶画分を10mMトリス−塩
酸緩衝液（pH8.3）で透析し、精製されたenv gp−21蛋
白質9mgを得た。
ス−塩酸緩衝液（pH8.3）で透析し、10000rpmで10分間
高速遠心分離して得られた上清をトリス−塩酸緩衝液
（pH8.3）で平衡化したレンチル−レクチンアフィニテ
ィーカラムに充填し、前記緩衝液で洗浄した後、メチル
αＤマンノシドで溶出し、吸光度280nmの吸収を示す部
分を分取した。更に、得られた溶画分を10mMトリス−塩
酸緩衝液（pH8.3）で透析し、精製されたenv gp−21蛋
白質9mgを得た。
実施例２ ゼラチン粒子を、タンニン酸5ppmを含むpH7.2のリン
酸緩衝生理食塩水（以下、PBSと略記する。）中に粒子
濃度が2.5％になるように分散し、37℃で15分間加温し
た。次いで、粒子を遠心分離して生理食塩０で充分洗浄
した。得られた粒子をPBSに５％の濃度で分散し、この
分散液を実施例１で得られたenv gp−21蛋白質と混合
し、混合液を37℃で40分間加温して感作ゼラチン粒子を
調製した。同様の方法により、HTLV−Ｉ抗原のみが感作
されたゼラチン粒子を調製した。調製した感作粒子のそ
れぞれを1:1の比率で混合し、HTLV−Ｉ抗体検出用試薬
とした。
酸緩衝生理食塩水（以下、PBSと略記する。）中に粒子
濃度が2.5％になるように分散し、37℃で15分間加温し
た。次いで、粒子を遠心分離して生理食塩０で充分洗浄
した。得られた粒子をPBSに５％の濃度で分散し、この
分散液を実施例１で得られたenv gp−21蛋白質と混合
し、混合液を37℃で40分間加温して感作ゼラチン粒子を
調製した。同様の方法により、HTLV−Ｉ抗原のみが感作
されたゼラチン粒子を調製した。調製した感作粒子のそ
れぞれを1:1の比率で混合し、HTLV−Ｉ抗体検出用試薬
とした。
実施例３ 実施例１の方法により得られたenv gp−21蛋白質及び
HTLV−Ｉ抗原を5:1の比率で混合し、該混合物を実施例
２と同じ方法によりゼラチン粒子に感作し、HTLV−Ｉ抗
体検出用試薬とした。
HTLV−Ｉ抗原を5:1の比率で混合し、該混合物を実施例
２と同じ方法によりゼラチン粒子に感作し、HTLV−Ｉ抗
体検出用試薬とした。
比較例１ 実施例２で調製された試薬及び従来法により調製した
試薬を用い、HTLV−Ｉ抗体の偽陰性検体について間接凝
集反応テストを行った。得られた結果を下表に示す。
試薬を用い、HTLV−Ｉ抗体の偽陰性検体について間接凝
集反応テストを行った。得られた結果を下表に示す。
比較例２ 実施例２で調製された粒子及び従来法により調製した
粒子を用い、抗体過剰のHTLV−Ｉ抗体について間接凝集
反応テストを行った。
粒子を用い、抗体過剰のHTLV−Ｉ抗体について間接凝集
反応テストを行った。
得られた結果を下表に示す。
〔発明の効果〕 本願発明の間接凝集反応試薬は、HTLV−Ｉ抗体の検査
において、従来の間接凝集反応試薬ではプロゾーン現象
により陰性と判定される可能性のある検体についても陽
性として適正に判定することができ、加えて測定感度も
高いという特徴を有するものである。従って、本願発明
により、HTLV−Ｉ抗体検査の検査制度を大幅に向上する
ことができる。
において、従来の間接凝集反応試薬ではプロゾーン現象
により陰性と判定される可能性のある検体についても陽
性として適正に判定することができ、加えて測定感度も
高いという特徴を有するものである。従って、本願発明
により、HTLV−Ｉ抗体検査の検査制度を大幅に向上する
ことができる。
フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭60−44870（ＪＰ，Ａ) 特開 昭59−35143（ＪＰ，Ａ) 特開 昭63−277970（ＪＰ，Ａ) 特開 平２−1559（ＪＰ，Ａ) Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，63（11）（1989) ｐ4952−4957 Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，142（３) （1989）ｐ971−978
Claims (2)
- 【請求項１】成人Ｔ細胞白血病ウィルスを界面活性剤で
処理して得られる成分と成人Ｔ細胞白血病ウィルスのen
v gp−21蛋白質を感作した担体粒子を用いる成人Ｔ細胞
白血病ウィルス抗体検出用間接凝集反応試薬。 - 【請求項２】担体粒子がゼラチンである請求項（１）の
試薬。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2169742A JP3033774B2 (ja) | 1990-06-29 | 1990-06-29 | 成人ｔ細胞白血病ウィルス抗体検出用間接凝集反応試薬 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2169742A JP3033774B2 (ja) | 1990-06-29 | 1990-06-29 | 成人ｔ細胞白血病ウィルス抗体検出用間接凝集反応試薬 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0460458A JPH0460458A (ja) | 1992-02-26 |
| JP3033774B2 true JP3033774B2 (ja) | 2000-04-17 |
Family
ID=15892007
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2169742A Expired - Fee Related JP3033774B2 (ja) | 1990-06-29 | 1990-06-29 | 成人ｔ細胞白血病ウィルス抗体検出用間接凝集反応試薬 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3033774B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2752355C1 (ru) * | 2020-08-18 | 2021-07-26 | Михаил Сергеевич Беллавин | Снегоуборочное устройство |
-
1990
- 1990-06-29 JP JP2169742A patent/JP3033774B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４２（３）（１９８９）ｐ９７１−９７８ |
| Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６３（１１）（１９８９）ｐ４９５２−４９５７ |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2752355C1 (ru) * | 2020-08-18 | 2021-07-26 | Михаил Сергеевич Беллавин | Снегоуборочное устройство |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0460458A (ja) | 1992-02-26 |
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